ตัวอย่าง การทำพีซีอาร์

คูม่ ือการตรวจโรคสตั ว์นา้ ดว้ ยเทคนคิ PCR-version 1 ศนู ยว์ ิจัยสุขภาพสัตวน์ า้ สงขลา กองวจิ ัยและพัฒนาสุขภาพสตั ว์นา้ กรมประมง ปี 2561 คู่มือการตรวจโรคสตั ว์น้าดว้ ยเทคนคิ PCR Manual for Aquatic Animal’s Disease Diagnosis Using PCR Techniques จดั ท้าโดย หอ้ งปฏบิ ตั ิการ PCR ศนู ย์วิจัยสุขภาพสัตว์น้าสงขลา กองวจิ ยั และพฒั นาสุขภาพสตั ว์น้า กรมประมง ปี 2561

คมู่ ือการตรวจโรคสตั ว์นา้ ด้วยเทคนิค PCR-version 1 ศูนยว์ จิ ัยสุขภาพสตั วน์ า้ สงขลา กองวิจัยและพัฒนาสขุ ภาพสัตว์น้า กรมประมง ปี 2561 สารบัญ เร่ือง หนา้ บทนำ 1 กำรเกบ็ ตวั อยำ่ งสตั วน์ ำเพ่อื ตรวจวินจิ ฉัยโรคด้วยเทคนิค PCR 2 ตำรำงสรปุ อวัยวะและระยะกุ้งสำหรับส่งตรวจดว้ ยเทคนคิ PCR 3 กำรรวมตวั อยำ่ ง (Pool sample) สำหรบั ตรวจวนิ ิจฉัยโรคดว้ ย PCR 3 ข้อแนะนำในกำรเก็บตัวอย่ำงสง่ ตรวจดว้ ยเทคนิค PCR 4 หลักกำรเตรียมตวั อยำ่ งเพื่อตรวจวินจิ ฉัยโรคสัตวน์ ำดว้ ยเทคนิค PCR 5 วิธกี ำรตรวจโรค: ห้องปฏิบัติกำรศูนย์สขุ ภำพสตั ว์นำสงขลำ 6 กำรเกบ็ ตวั อยำ่ งสำหรับตรวจโรคด้วยเทคนคิ PCR 7 กำรเตรยี มตวั อยำ่ งสำหรับตรวจโรคด้วยเทคนคิ PCR 9 9 - กำรเตรียมตัวอยำ่ งกงุ้ 14 - กำรเตรียมตวั อยำ่ งปลำ 15 - กำรเตรียมตัวอยำ่ งหอย 17 กำรตรวจเชือทม่ี ีสำรพันธกุ รรมเป็น DNA 18 - กำรสกัด DNA โดยกำรใชค้ วำมร้อนด้วยวิธกี ำรต้ม (Boiling) 19 - กำรสกัด DNA จำกตัวอย่ำงดว้ ย DNAZol® reagent 20 กำรตรวจเชือ Vibrio parahaemolyticus สำยพนั ธ์ุ VpAHPND ดว้ ย Multiplex PCR 22 กำรตรวจเชอื Vibrio parahaemolyticus สำยพนั ธ์ุ VpAHPND ด้วย nested PCR 26 กำรตรวจเชือ Microsporidian (Enterocytozoon hepatopenaei; EHP) ดว้ ย nested PCR (SSU-PCR) 29 กำรตรวจเชอื Microsporidian (Enterocytozoon hepatopenaei; EHP) ด้วย nested PCR (SPW pimer) 32 กำรตรวจเชือตัวแดงดวงขำว (WSSV) ดว้ ย nested PCR 36 กำรตรวจเชอื ไอเอชเอชเอน็ วี (IHHNV) ด้วยเทคนิค PCR 38 กำรตรวจเชอื Penaeus monodon-type baculovirus (MBV) และ Baculovirus penaei (BP) ด้วยเทคนคิ Multiplex PCR 40 กำรตรวจเชือ Shrimp hemocyte iridescent virus (SHIV) ดว้ ย nested PCR 43 กำรตรวจวินิจฉยั เชือ NHPB ดว้ ยเทคนคิ PCR 45 กำรตรวจเชืออริ โิ ดไวรัส (Red sea bream Iridovirus; RSIV) ด้วยเทคนิค PCR

คูม่ อื การตรวจโรคสตั ว์น้าดว้ ยเทคนคิ PCR-version 1 ศูนยว์ ิจัยสุขภาพสตั วน์ า้ สงขลา กองวิจยั และพัฒนาสุขภาพสัตวน์ า้ กรมประมง ปี 2561 เรอื่ ง หนา้ กำรตรวจเชอื ปรสิต Perkinsus Genus, P. marinus และ P.olseni 48 ด้วยเทคนิค PCR กำรตรวจเชือทม่ี ีสำรพนั ธุกรรมเปน็ RNA 52 กำรสกดั RNA จำกตวั อย่ำงดว้ ย Trizol reagent 54 กำรตรวจเชอื Covert mortality nodavirus (CMNV) ดว้ ย nest RT-PCR 55 กำรตรวจเชอื หวั เหลอื ง (YHV) ดว้ ย nested RT-PCR 58 กำรตรวจเชือทอร่ำซินโดรม (TSV) ดว้ ย RT-PCR 60 กำรตรวจเชอื ไอเอม็ เอน็ วี (IMNV) ดว้ ย nested PCR (ชดุ kit IMNV IQ 2000) 63 กำรตรวจเชือไอเอม็ เอน็ วี (IMNV) ด้วย nested PCR (OIE) 66 กำรตรวจเชือ MrNV ดว้ ย nested RT-PCR 68 กำรตรวจเชือ XSV ด้วย nested RT-PCR 72 กำรตรวจเชอื MrNV และ XSV ดว้ ย multiplex RT-PCR 75 กำรตรวจเชือ PvNV ด้วย nested RT-PCR 77 กำรตรวจเชอื วเี อน็ เอ็น (VNN) ดว้ ย RT-PCR 80 82 กำรตรวจเชือ TiLV ดว้ ย RT-PCR (Eyngor et al., 2014) 85 88 กำรตรวจเชอื TiLV ดว้ ย Semi-nested RT-PCR (Dong et al., 2017) 90 ภำคผนวก 1 กำรเตรยี มสำรเคมี 91 ภำคผนวก 2 วิธีกำรลดปัญหำกำรปนเปอ้ื นงำนพซี ีอำร์ 94 ภำคผนวก 3 เทคนคิ ปลอดเชอื (Aseptic technique) 95 ภำคผนวก 4 กำรลำ้ งอปุ กรณ์สำหรับงำน PCR 97 ภำคผนวก 5 ปญั หำกำรรันเจล ภำคผนวก 6 ตัวอยำ่ งแบบบนั ทึกกำรแปลผลกำรทดสอบ

คู่มือการตรวจโรคสตั ว์น้าด้วยเทคนิค PCR-version 1 ศนู ยว์ ิจยั สขุ ภาพสัตว์น้าสงขลา กองวิจยั และพัฒนาสุขภาพสัตวน์ า้ กรมประมง ปี 2561 บทนา้ กำรตรวจวินิจฉัยโรคสัตว์นำ (Disease diagnosis) มีหลำยระดับตังแต่กำรตรวจเบืองต้น โดยตรวจสอบจำกลักษณะภำยนอกหรือรอยโรค (Gross sign) กำรทดสอบกำรติดเชือ (Bioassay) กำรตรวจโดยใช้เครื่องมือทำงวิทยำศำสตร์ เช่น กล้องจุลทรรศน์ กำรตรวจโดยใช้เทคนิคทำง อณูชีวโมเลกุล เช่น in situ hybridization, Antibody based assay, Polymerase Chain Reaction (PCR) ไปจนถงึ กำรหำลำดับเบสของยนี เชอื ที่สนใจ (Sequencing) ระดบั กำรตรวจโรคแบ่งเป็น 3 levels ตำมควำมถูกตอ้ งและน่ำเชอ่ื ถือของผลกำรตรวจ Level I: กำรสงั เกตพฤติกรรม อำกำรป่วยภำยนอกหรอื รอยโรคของสตั วน์ ำ และขอ้ มูล ส่ิงแวดล้อม (Environmental data) ของบอ่ เลียงหรือฟำร์มเลียง  Hehavior (พฤตกิ รรมกำรว่ำยนำ กำรกินอำหำร)  Gross sign (อำกำรภำยนอกหรือรอยโรค เช่นรอยแผล ตกเลือด ท้องบวม รยำงค์หรอื ครบี กร่อน)  Feeding (อัตรำกำรกนิ อำหำร ลกั ษณะกำรกินอำหำร)  Environmental data (คุณภำพนำ ดิน สภำพอำกำศ) Level II: ใช้เทคนิคเฉพำะทำงและใช้เคร่ืองมือวิทยำศำสตร์ช่วยในกำรตรวจวิเครำะห์ เช่น เทคนคิ ทำง ปรสิต แบคทีเรีย เชอื รำ เนือเยอ่ื ซงึ่ ตอ้ งมคี วำมชำนำญและผ่ำนกำรฝึกฝนทำงเทคนิค ไมส่ ำมำรถตรวจไดท้ บ่ี อ่ หรอื ฟำร์ม  Parasitology (ปรสิต)  Bacteriology (แบคทีเรยี )  Mycology (เชอื รำ)  Histopathology (เนอื เย่ือ)  Bioassay (กำรทดสอบกำรตดิ เชอื ) Level III: ใช้เทคนิคระดับสูงในกำรตรวจวินิจฉัย (advanced diagnostic) เช่น immunology and biomolecular ส่วนใหญ่เก่ียวข้องกำรกับกำรตรวจระดับสำรพันธุกรรม ต้องมี ควำมชำนำญและได้รับกำรฝึกฝนทำงเทคนคิ ไม่สำมำรถตรวจไดท้ ี่บ่อหรอื ฟำรม์  PCR (PCR, RT-PCR, realtime PCR)  in situ hybridization (DNA probe)  Electron microscope  ELISA (Antibody) 1

คมู่ ือการตรวจโรคสัตว์นา้ ด้วยเทคนคิ PCR-version 1 ศูนยว์ ิจยั สขุ ภาพสัตว์นา้ สงขลา กองวิจยั และพัฒนาสุขภาพสัตวน์ า้ กรมประมง ปี 2561 การเกบ็ ตัวอยา่ งสตั ว์น้าเพ่อื ตรวจวนิ ิจฉยั โรคด้วยเทคนิค PCR กำรเก็บตัวอย่ำงสัตว์นำเพื่อตรวจวินิจฉัยโรคต้องมีจำนวนมำกเพ่ือให้ผลกำรตรวจมีควำม น่ำเช่ือถอื โดยใชต้ ำรำงกำรสมุ่ ตวั อยำ่ งประกอบกำรตัดสนิ ใจ จำนวนตัวอย่ำงที่เก็บขึนอยู่กับควำมชุก ของโรค (Disease prevalence) กรณีควำมชุกของโรคสูง จำนวนตัวอย่ำงท่ีเก็บจะน้อยเพรำะ โอกำสท่ีจะตรวจพบโรคมีสูง หำกควำมชุกของโรคต่ำจำนวนตัวอย่ำงที่เก็บจะมำก เพื่อให้เพ่ิมควำม เป็นไปได้ที่จะตรวจพบโรค ดังนันโรคท่ีไม่เคยมีรำยงำน เช่น IMNV ควรใช้ควำมชุกของโรคที่ 1-2% สำหรับโรคที่เคยมีรำยงำนกำรเกิดโรคสำมำรถใช้ควำมชุกของโรคที่สูงขึนได้ เช่น 2.0% Prevalence สำหรบั ลูกก้งุ /ลกู ปลำ และ 5% Prevalence สำหรับกุ้ง/ปลำวยั รนุ่ และพอ่ แมพ่ ันธ์ุ ตารางการเก็บตวั อย่างตามเปอรเ์ ซ็นตค์ วามชกุ ของโรค จา้ นวน 0.5 ระดับความชุกของโรค (% Prevalence) 10.0 ประชากร 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 50 46 46 46 37 37 29 20 100 93 93 76 61 50 43 23 250 192 156 110 75 62 49 25 500 314 223 127 88 67 54 26 1000 448 256 136 92 69 55 27 2500 512 279 142 95 71 56 27 5000 562 288 145 96 71 57 27 10000 579 292 146 96 72 57 27 100000 594 296 147 97 72 57 27 1000000 596 297 147 97 72 57 27 >1000000 600 300 150 100 75 60 30 (ท่ีมา Ossiander, F. J. and G. Wedermeyer. 1973. Journal Fisheries Research Board of Canada 30: 1383-1384) 2

คมู่ ือการตรวจโรคสตั ว์นา้ ด้วยเทคนิค PCR-version 1 ศนู ยว์ จิ ยั สขุ ภาพสัตว์น้าสงขลา กองวิจัยและพัฒนาสขุ ภาพสตั ว์นา้ กรมประมง ปี 2561 ตารางสรุปอวยั วะและระยะกงุ้ สา้ หรบั สง่ ตรวจดว้ ยเทคนคิ PCR ข้อมูลจำกองค์กำรโรคระบำดสัตวร์ ะหว่ำงประเทศ Pathogens Methods Organs Larvae PLs Juvenile Adult WSSV PCR Pleopod, Gill, hemolymp d b a a IHHNV PCR, qPCR Pleopod, Gill, hemolymp a a a a YHV PCR lymphoid organ, gill aa aa TSV RT-PCR, Pleopod, hemolymp aa aa qRT-PCR IMNV Nested RT- Pleopod, hemolymp, lymphoid a a a a PCR organ qRT-PCR Pleopod, hemolymp, lymphoid d c a a organ NHPB PCR, qPCR Hepatopancreas, Faeces a a a a VpAHPND qPCR Hepatopancreas, Stomach, d a a a Faeces a = เป็นวิธกี ำรทแ่ี นะนำใหใ้ ช้เนือ่ งจำกมีควำมไว (sensitivity) ควำมจำเพำะ (specificity) สูง และสำมำรถดำเนนิ กำรได้งำ่ ย (availability, utility) b = เป็นวิธีมำตรฐำน (standard method) มคี วำมไวและควำมจำเพำะในระดับดี (good diagnostic sensitivity and specificity) c = เป็นวิธีกำรท่แี นะนำสำหรบั ใชใ้ นบำงสถำณกำรณ์ แตม่ ีข้อจำกัดของรำคำ ควำมถูกตอ้ งของผลหรอื ปจั จัยอน่ื ๆ ทที่ ำใหไ้ ม่เหมำะ กับกำรใช้ d = เป็นวธิ ที ี่ไม่แนะนำให้ใช้ การรวมตัวอย่าง (Pool sample) สา้ หรับตรวจวินจิ ฉยั โรคดว้ ย PCR 1. ลกู กงุ้ /ลกู ปลำ รวมตัวอย่ำงไดไ้ ม่เกนิ 50 ตวั /1 ตัวอยำ่ งทดสอบ (Test) 2. กงุ้ วัยรนุ่ /ปลำ รวมตวั อย่ำงไดไ้ มเ่ กิน 5 ตัว/1 ตวั อยำ่ งทดสอบ (Test) 3

คมู่ ือการตรวจโรคสัตว์น้าด้วยเทคนิค PCR-version 1 ศนู ยว์ จิ ยั สขุ ภาพสัตวน์ า้ สงขลา กองวจิ ยั และพัฒนาสขุ ภาพสัตว์น้า กรมประมง ปี 2561 ข้อแนะนา้ ในการเกบ็ ตวั อยา่ งส่งตรวจด้วยเทคนิค PCR 1. ลูกกุง้ ระยะโพสลาวาร์ (Post larva, PL) - สมุ่ ตวั อยำ่ งกงุ้ ใหก้ ระจำยทัว่ บ่อ ใหไ้ ดก้ ุง้ ไมน่ ้อยกวำ่ 200 ตวั /บ่อสำหรบั กุ้งระยะ PL 10 ขนึ ไป และไม่น้อยกว่ำ 300 ตวั /บ่อสำหรบั กงุ้ ระยะตำ่ กวำ่ PL10 - ใสต่ วั อย่ำงกงุ้ มีชวี ติ ในถุงพลำสติกท่มี ีนำทะเลสะอำด และอัดอำกำศ มดั ปำกถงุ ให้แน่น พรอ้ มกบั เขียนช่อื ฟำร์มและหมำยเลขบ่อแลว้ นำส่งหอ้ งปฏบิ ตั ิกำรทันที - กรณสี ง่ ตัวอย่ำงมีชวี ิต แช่เยน็ หรอื แชแ่ ข็ง เพ่ือตรวจด้วยเทคนคิ PCR สภำพตัวอย่ำงขณะส่งตรวจ ต้องอยู่ในสภำพปกติ (เนอื เยอ่ื ไม่เปือ่ ยยยุ่ ไมเ่ น่ำเสยี ไมม่ ีกลน่ิ ผดิ ปกติ) - กรณีตรวจเชือไวรสั สำมำรถเกบ็ ตัวอย่ำงโดยกำรแช่แขง็ หรือดองใน 95% เอทำนอลไดแ้ ลว้ นำสง่ ห้องปฏิบตั กิ ำร 2. กุ้งวยั ร่นุ (Juvenile) - สุ่มตัวอยำ่ งกงุ้ ใหก้ ระจำยทั่วบ่อ กรณกี งุ้ ปว่ ยใหเ้ ลอื กตวั อย่ำงกงุ้ ทีแ่ สดงอำกำรของโรคใหไ้ ด้กงุ้ ไม่ นอ้ ยกวำ่ 10 ตัว/บ่อ - ใสต่ ัวอยำ่ งกุ้งมีชีวติ ในถุงพลำสตกิ ทีม่ ีนำทะเลสะอำด และอัดอำกำศ มัดปำกถงุ ใหแ้ น่น พรอ้ มกับ เขยี นช่ือฟำรม์ และหมำยเลขบอ่ กรณเี ป็นตวั อย่ำงก้งุ สดให้ใสใ่ นถงุ พลำสตกิ สะอำดพรอ้ มกบั เขียนชื่อ ฟำร์มและหมำยเลขบ่อ - กรณีส่งตัวอย่ำงมชี วี ติ แชเ่ ยน็ หรอื แช่แขง็ เพื่อตรวจด้วยเทคนิค PCR สภำพตวั อย่ำงขณะส่ง ตรวจต้องอยใู่ นสภำพปกติ (เนอื เยื่อไม่เป่ือยยยุ่ ไม่เน่ำเสยี ไมม่ กี ลิน่ ผิดปกต)ิ - กรณีตรวจเชือไวรสั สำมำรถเกบ็ ตัวอย่ำงโดยกำรแช่แขง็ หรือดองใน 95% เอทำนอล ได้ แลว้ นำส่ง ห้องปฏิบัตกิ ำร 3. กงุ้ พ่อ-แม่พันธุ์ (Broodstocks) - กรณกี ้งุ มีชวี ติ ให้ใส่ตวั อย่ำงในถงุ พลำสตกิ ท่มี นี ำทะเลสะอำด และอัดอำกำศ มัดปำกถุงให้แนน่ พรอ้ มกบั เขียนชือ่ ฟำรม์ และหมำยเลขบอ่ และนำสง่ หอ้ งปฏบิ ัตกิ ำรทันที - กรณีตรวจเชอื ไวรสั สำมำรถสง่ เฉพำะตวั อย่ำงขำวำ่ ยนำของพ่อแมพ่ ันธ์ุได้ โดยกำรตดั ขำว่ำยนำของ กุ้งแตล่ ะตวั ใสห่ ลอดทส่ี ะอำดแลว้ นำไปแช่เย็น หรือแชแ่ ข็ง พรอ้ มกบั เขยี นชอ่ื ฟำร์มและหมำยเลขบ่อ โดยสภำพตวั อยำ่ งขณะส่งตรวจต้องปกติ สด และไมม่ กี ล่นิ ผดิ ปกติ หรอื ดองใน 95 % แอลกอฮออล์ แล้วนำสง่ ห้องปฏบิ ตั กิ ำร - กรณีตรวจเชอื กอ่ โรคตับวำยเฉยี บพลัน (VPAHPND) สำมำรถสง่ ตัวอย่ำงขกี งุ้ โดยเก็บขีกุ้งทเี่ พงิ่ ถ่ำย ใหมๆ่ ใส่ถงุ หรอื ภำชนะที่สะอำด แล้วนำไปแช่เย็น หรอื แช่แขง็ พรอ้ มกับเขียนชอื่ ฟำร์มและ หมำยเลขบ่อ แลว้ นำส่งหอ้ งปฏิบตั กิ ำร - กรณสี ง่ ตวั อยำ่ งมชี วี ิต แช่เย็น หรือแช่แข็ง เพื่อตรวจดว้ ยเทคนิค PCR สภำพตวั อยำ่ งขณะสง่ ตรวจ ต้องอยูใ่ นสภำพปกติ (เนอื เย่ือไม่เปอื่ ยยุ่ย ไม่เนำ่ เสยี ไมม่ ีกลนิ่ ผิดปกติ) 4

คู่มอื การตรวจโรคสัตว์นา้ ดว้ ยเทคนิค PCR-version 1 ศูนยว์ จิ ยั สขุ ภาพสตั ว์นา้ สงขลา กองวิจัยและพัฒนาสขุ ภาพสตั วน์ ้า กรมประมง ปี 2561 4. อาหารมีชีวติ - เกบ็ ตัวอย่ำงอำหำรมีชีวิตไมน่ อ้ ยกว่ำ 5 กรัม ใสใ่ นถุงพลำสตกิ ใหมๆ่ หรือภำชนะที่สะอำดปรำศจำก เชอื เพอื่ ป้องกนั กำรปนเปือ้ นจำกเชือภำยนอก พรอ้ มกับเขยี นชอื่ ฟำร์มและหมำยเลขบ่อ และนำสง่ ห้องปฏิบัติกำร - กรณีสง่ ตัวอยำ่ งมชี ีวติ แชเ่ ย็น หรอื แช่แขง็ เพื่อตรวจด้วยเทคนคิ PCR สภำพตัวอย่ำงขณะสง่ ตรวจ ตอ้ งอยู่ในสภำพปกติ (เนอื เย่อื ไม่เปอ่ื ยยยุ่ ไมเ่ นำ่ เสยี ไมม่ ีกลน่ิ ผดิ ปกติ) 5. ดนิ - เก็บตัวอย่ำงดิน บ่อละ 3 - 4 จุด (เก็บจำกกลำงบ่อ และริมบ่อ ตังแต่พืนบ่อจนลึกลงไป ประมำณ 10 เซ็นติเมตร) รวมกันประมำณ 100 กรัม ใส่ในถุงพลำสติกใหม่ๆ หรือภำชนะท่ี สะอำดปรำศจำกเชือเพื่อป้องกันกำรปนเป้ือนจำกเชือภำยนอก แล้วนำไปแช่เย็น พร้อมกับเขียน ชอ่ื ฟำรม์ และหมำยเลขบอ่ และนำส่งหอ้ งปฏบิ ตั กิ ำร 6. น้า - กรณตี รวจเชือแบคทีเรียก่อโรคตับวำยเฉียบพลัน (VpAHPND) เก็บตัวอย่ำงนำใส่ภำชนะที่สะอำด ปริมำตรอย่ำงน้อย 300 มิลลิลิตร แล้วนำไปแช่เย็น พร้อมกับเขียนชื่อฟำร์มและหมำยเลขบ่อ และนำส่งหอ้ งปฏบิ ตั กิ ำรทันที หรือภำยใน 24 ชว่ั โมง 5

ค่มู ือการตรวจโรคสัตว์น้าดว้ ยเทคนิค PCR-version 1 ศนู ยว์ ิจัยสุขภาพสตั วน์ า้ สงขลา กองวจิ ยั และพัฒนาสุขภาพสตั วน์ ้า กรมประมง ปี 2561 หลักการเตรียมตัวอย่างเพอ่ื ตรวจวินิจฉัยโรคสัตว์น้าด้วยเทคนคิ PCR กำรตรวจโรคสตั วน์ ำด้วยเทคนคิ PCR เกยี่ วขอ้ งกับกำรสกัดสำรพันธุกรรม (DNA หรือ RNA) ของเชือ ทีต่ ้องกำรจำกตวั อย่ำงที่สง่ ตรวจ ซ่ึงเชือก่อโรคแตล่ ะโรคมีอวัยวะเปำ้ หมำยของเชอื ท่แี ตกตำ่ งกัน อวัยวะทใ่ี ชใ้ นกำร สกดั สำรพนั ธกุ รรมจงึ แตกต่ำงกัน ดังนันจึงจำเป็นต้องทรำบอวัยวะเป้ำหมำยของเชือและชนิดของสำรพันธุกรรม ของเชอื ท่ตี อ้ งกำรตรวจ ตารางท่ี 1 แสดงชนิดสำรพันธุกรรมเชือและอวัยวะท่ใี ชใ้ นกำรสกดั สำรพนั ธกุ รรม ชนิดเชอื ชนิดสารพนั ธุกรรม อวยั วะทใ่ี ช้ในการสกดั สารพันธกุ รรม WSSV dsDNA Gill, Pleopod IHHNV ssDNA Gill, Pleopod YHV/GAV ssRNA Gill, Pleopod, Lymphoid organ, Hemolymp TSV RNA Gill, Pleopod IMNV dsRNA Hemolymp, Lymphoid organ, Gill, Pleopod, Muscle CMNV RNA Gill, Hepatopancrease PvNV RNA Gill, Pleopod, Muscle MrNV/XSV RNA Gill, Pleopod SHIV dsDNA Hemolymph, cepharothorax MBV DNA Hepatopancrease, feces BP DNA Hepatopancrease, feces HPV DNA Hepatopancrease, feces NHPB DNA bacteria Hepatopancrease, feces VpAHPND DNA bacteria Stomach, feces, hepatopancrease Enterocytozoon DNA parasite Hepatopancrease, feces hepatopanaei (EHP) Perkinsus sp. DNA parasite Gill, Mantle VNN RNA virus Brain, Kidney, eye Red seabream Iridovirus DNA virus Spleen, Gill TiLV RNA virus Brain, liver, mucus 6

คูม่ อื การตรวจโรคสัตว์นา้ ด้วยเทคนคิ PCR-version 1 ศนู ยว์ ิจัยสขุ ภาพสตั ว์นา้ สงขลา กองวิจัยและพัฒนาสุขภาพสัตว์นา้ กรมประมง ปี 2561 วธิ ีการตรวจโรค: ห้องปฏบิ ตั ิการศูนย์วจิ ยั สุขภาพสัตวน์ า้ สงขลา Pathogen Types Organ Methods References OIE-listed shrimp diseases WSSV dsDNA virus Gill, Pleopod Nested PCR OIE (Lo et al., 1996) Gill, Pleopod PCR OIE (Tang et al., 2007) IHHNV ssDNA virus Gill, Pleopod Nested RT-PCR IQ2000 OIE (Poulos & Lightner, IMNV dsRNA virus 2006) OIE (Cowley et al., 2004) YHV/GAV ssRNA virus Gill, Pleopod, Nested RT-PCR Navarro et al. (2009) TSV RNA virus Gill, Pleopod RT-PCR (immproved OIE MrNV/XSV RNA virus Gill, Pleopod from OIE method) Inhouse-method modified VpAHPND DNA bacteria Stomach, Intestine from Tinwongger et al. Hepatopancrease RT-PCR (2014) Multiplex PCR OIE (Aranguren et al., 2010) NHPB DNA bacteria Hepatopancrease, Feces PCR OIE (Kurita et al., 1998.) OIE-listed fish diseases RSIV DNA virus Spleen, Gill PCR Non-OIE-listed shrimp diseases CMNV RNA virus Gill Nested RT-PCR Zhang et al., 2014 Hemolymph, Nested RT-PCR Liang et al., 2017 SHIV dsDNA virus Cepharothorax Gill, Pleopod, Muscle Nested RT-PCR Tang et al,. 2007 PvNV RNA virus Hepatopancrease, feces PCR OIE (Surachetpong et al., MBV DNA virus 2005) OIE (Wang et al., 1996) BP DNA virus Hepatopancrease, feces PCR Tangprasittipap et al. (2014) Enterocytozoon DNA parasitic Hepatopancrease Nested PCR hepatopanei fungi Non-OIE-listed fish disease VNN RNA virus Brain, Kidney, eye RT-PCR Roongkamnertwongsa et Brain, liver, Kidney, mucus al. (2005) TiLV RNA virus RT-PCR Eyngor et al. (2014) Semi nested RT-PCR Dong et al. (2017) OIE-listed Molluse diseases Perkinsus sp. DNA parasite Gill, Mantle PCR OIE Gill, Mantle PCR OIE Perkinsus olseni DNA parasite Gill, Mantle PCR OIE Perkinsus marinus DNA parasite 7

คู่มือการตรวจโรคสัตว์นา้ ดว้ ยเทคนิค PCR-version 1 ศนู ยว์ ิจยั สุขภาพสตั วน์ า้ สงขลา กองวิจยั และพัฒนาสุขภาพสตั วน์ า้ กรมประมง ปี 2561 การเก็บตวั อยา่ งสา้ หรับตรวจโรคด้วยเทคนิค PCR อปุ กรณแ์ ละเครื่องมอื : 1. หลอด Micro centrifuge tube 1.5 ml 2. กรรไกรผ่ำตัด 3. ปำกคบี 4. Aluminium foil 5. ตู้เย็น/ตู้แช่แขง็ สารเคมี: 1. 95% Ethanol 2. 70% Ethanol 3. RNA later การเก็บตวั อยา่ งและการรักษาสภาพตัวอยา่ งส้าหรบั ส่งตรวจ PCR 1. ตวั อย่ำงมชี ีวิต : ส่งหอ้ งปฏบิ ตั ิกำรทนั ที 2. ตัวอย่ำงแชเ่ ยน็ /แชแ่ ขง็ : สง่ หอ้ งปฏบิ ตั ิกำรภำยใน 24 ชวั่ โมง 3. ตวั อยำ่ งดองใน 95% Ethanol : เก็บที่อณุ หภูมิ 2-8oC (ตู้เยน็ )  ตอ้ งลำ้ งตัวอย่ำงดว้ ยนำกลนั่ ฆ่ำเชือ หลำยๆ ครัง ก่อนสกัด 4. ตวั อย่ำงเกบ็ ในสำรรกั ษำสภำพ RNA (RNA later) หรือสำรรกั ษำสภำพอ่ืนๆ : เกบ็ ที่  37oC (1 วนั )/4oC (1 เดอื น) /-20oC (นำนกวำ่ 6 เดอื น)  ไมต่ อ้ งลำ้ งตวั อย่ำงกอ่ นสกัด 8

คมู่ ือการตรวจโรคสตั ว์นา้ ดว้ ยเทคนิค PCR-version 1 ศูนยว์ จิ ัยสขุ ภาพสตั ว์น้าสงขลา กองวิจยั และพัฒนาสขุ ภาพสัตวน์ า้ กรมประมง ปี 2561 การเตรียมตวั อยา่ งส้าหรับตรวจโรคด้วยเทคนคิ PCR 1. การเตรยี มตวั อยา่ งกุง้ 1.1 ลกู กงุ้ ขนึ อยู่กับระยะหรืออายุกุ้ง  ลูกกุ้งระยะ nauplius, zoea และ < PL10 ใช้ตัวอยำ่ งกุ้งทังตวั  ลกู กุ้งระยะ >PL10 ต้องตัดสว่ นหวั ทงิ เพื่อเอำส่วนตากงุ้ ซ่ึงมสี ำรยบั ยงั ปฏิกิริยำ PCR ออก 1.2 กงุ้ เตม็ วยั (Juvenile & Broodstock) กำรเตรียมตัวอย่ำงสำหรับตรวจเชือด้วย PCR ต้องทรำบอวัยวะเป้ำหมำยของเชือ ซ่ึงเชือแต่ละชนิดมี อวัยวะเป้ำหมำยท่ีแตกต่ำงกัน อวัยวะเป้ำหมำยบำงอวัยวะนำมำใช้ได้ยำกเช่นปมประสำท กำรตรวจจึงต้องเลือก อวัยวะท่ีเหมำะสม เช่น เหงือก (Gill) ขำว่ำยนำ (Pleopod) เลือด (Hemolymp+Hemocytes) กล้ำมเนือ (Muscle) ลำไส้ (Gut/Intestine) ตับและตับอ่อน (Hepatopancrease) กระเพำะอำหำร (Stomach) เป็นต้น ขึนอยกู่ บั ชนดิ เชือทตี่ รวจ ภาพแสดงอวัยวะภายในและภายนอกของกุ้งทะเล ภาพแสดงองคป์ ระกอบของลา้ ตัวกงุ้ ทะเล 9

ค่มู อื การตรวจโรคสตั ว์น้าด้วยเทคนคิ PCR-version 1 ศนู ยว์ ิจัยสุขภาพสัตว์นา้ สงขลา กองวิจัยและพัฒนาสุขภาพสตั วน์ ้า กรมประมง ปี 2561 เหงือก (Gill): เป็นอวัยวะท่ีเหมำะสำหรับกำรตรวจเชือไวรัสหลำยชนิด ได้แก่ WSSV, IHHNV, YHV, TSV, IMNV, CMNV เป็นอวัยวะที่บดง่ำย เหงือกจึงเป็นอวัยวะที่เหมำะสำหรับกุ้งวัยรุ่นท่ีนำมำส่งตรวจ แต่ไม่ เหมำะสำหรับพอ่ แม่พนั ธแุ์ ละลกู กุ้ง การตดั เหงอื ก ขาว่ายน้า (Pleopod): เป็นอวัยวะท่ีเหมำะสำหรับกำรตรวจเชือที่เป็น systemic infection ได้แก่ WSSV, IHHNV, YHV, TSV, IMNV โดยจะมีส่วนของเปลือกติดมำด้วย ทำให้บดตัวอย่ำงยำกกว่ำเหงือก และ ปริมำณสำรพนั ธกุ รรมทสี่ กัดได้จะน้อยกวำ่ เหงอื ก (กรณใี ชป้ ริมำณตัวอยำ่ งเท่ำกัน) กำรตัดขำว่ำยนำเป็นเทคนิคที่ มีควำมสำคัญ เนอ่ื งจำกอำจมโี อกำสให้กงุ้ เกิดกำรติดเชอื ได้ โดยเฉพำะตวั อยำ่ งพ่อแม่พันธ์ุกุ้งซ่ีงส่วนใหญ่ใช้ขำว่ำย นำในกำรตรวจวินิจฉัย pleopod ประกอบด้วย protopod, exopod และ endopod กำรตัดขำว่ำยนำขึนอยู่กับ ขนำดนำหนักก้งุ โดยมขี ันตอนดังนี 1. ใช้กรรไกรผ่ำตดั และปำกคีบท่ผี ำ่ นกำรฆ่ำเชือ (Autoclave/70% alcohol) 2. ตดั ขำกงุ้ ใส่ในหลอดพลำสติก 1.5 ml ทผี่ ่ำนกำรฆำ่ เชือ โดยสำมำรถเก็บตวั อยำ่ งด้วยวิธกี ำรดังนี  แชเ่ ยน็ สง่ ตรวจภำยใน 24 ช่วั โมง  แช่แขง็ สง่ ตรวจโดยเร็วท่สี ุดเพอ่ื ปอ้ งกนั กำรเสียสภำพของสำรพันธกุ รรม  เก็บใน 95% เอธำนอล (Ethanol) และเกบ็ ในตู้เย็น สง่ ตรวจภำยใน 7 วนั 4. ให้ตัดขำว่ำยนำคูห่ ลังสดุ หรอื คู่อ่นื ๆ ทไี่ มใ่ ช่คู่แรก เน่อื งจำกกงุ้ ใชส้ ่วนของ pitasma ของขำว่ำยนำคู่ แรกในกำรผสมพนั ธ์ุ 5. ปลอ่ ยกุ้งทีต่ ัดขำแล้วในนำสะอำดท่ีมีปรมิ ำณมำกพอเพ่อื ป้องกันกำรกระโดด และควรมีสำรฆ่ำเชอื เชน่ ไอโอดีน เพื่อปอ้ งกนั กำรตดิ เชือ 10

คูม่ อื การตรวจโรคสัตว์นา้ ด้วยเทคนิค PCR-version 1 ศนู ยว์ จิ ัยสขุ ภาพสัตวน์ ้าสงขลา กองวิจยั และพัฒนาสุขภาพสตั วน์ ้า กรมประมง ปี 2561 การตดั ขาวา่ ย นา้ ภาพแสดงองคป์ ระกอบของรยางค์กงุ้ ทะเล 11

คมู่ อื การตรวจโรคสัตว์นา้ ดว้ ยเทคนคิ PCR-version 1 ศนู ยว์ ิจัยสขุ ภาพสัตว์น้าสงขลา กองวิจัยและพัฒนาสุขภาพสัตว์น้า กรมประมง ปี 2561 การเตรยี มตัวอย่างส้าหรับตรวจ Vibrio parahaemolyticus สายพันธุ์ VpAHPND กงุ้ : อวยั วะท่ีใช้ในการตรวจโรค Vibrio parahaemolyticus สายพันธุ์ก่อโรคตบั วายเฉียบพลัน VpAHPND 1. ลกู กุง้ (nauplius, zoea, post larvae) - ใชต้ ัวอย่ำงกุง้ ทงั ตัว ไมน่ อ้ ยกวำ่ 150 ตัว/ตวั อยำ่ งสำหรบั กงุ้ ระยะ Post larvae และไมน่ ้อยกวำ่ 0.1 กรมั สำหรบั Nauplius และ Zoea 2. กุง้ วัยรนุ่ (Juvenile shrimp) - ใช้กระเพำะอำหำร ลำไส้ หรือ ตับ โดยรวมอวัยวะจำกกงุ้ 5 ตัว/ตัวอยำ่ ง 3. พอ่ แม่พนั ธุ์ (Broodstock) - ขีก้งุ ควรเปน็ ขีกุ้งทใี่ หม่ เพง่ิ ออกมำจำกตวั กุง้ อาหารสด: เชน่ เพรียง หมกึ หอย หรือ อื่นๆ - เกบ็ ตวั อยำ่ งชนดิ ละประมำณ 20-50 กรมั - นำอำหำรแต่ละชนิดมำบดหรอื สับละเอยี ด ในภำชนะและอุปกรณท์ ผ่ี ่ำนกำรฆ่ำเชอื แล้ว - บม่ ตัวอย่ำงใน TSB + 1.5-3.0 % NaCl ดนิ : มวี ธิ กี ำรเกบ็ ดงั นี - เกบ็ ตวั อยำ่ งดินจำก 3-5 จดุ ทั่วบ่อ แต่ละจดุ บริเวณผิวและลกึ ลงไปไม่เกิน 10cm - จุดทเี่ ก็บควรเปน็ แนวเลน แนวหว่ำนอำหำร และมุมอบั ของบอ่ - นำดนิ บรรจุในถุงพลำสตกิ ทสี่ ะอำดแยกแต่ละจดุ บันทกึ ขอ้ มลู ชอ่ื ฟำร์ม บอ่ และจุดทเี่ กบ็ นา้ : มีวิธกี ำรเก็บดงั นี - เก็บตวั อยำ่ งนำจำก 3-5 จดุ ทวั่ บ่อรวมกนั - นำนำบรรจใุ นภำชนะท่สี ะอำด บนั ทกึ ข้อมูล ชือ่ ฟำร์ม บอ่ 12

ค่มู อื การตรวจโรคสตั ว์นา้ ดว้ ยเทคนคิ PCR-version 1 ศูนยว์ ิจัยสขุ ภาพสตั ว์น้าสงขลา กองวิจัยและพัฒนาสขุ ภาพสัตว์น้า กรมประมง ปี 2561 การเตรียมตวั อย่างสา้ หรับการตรวจ Vibrio parahaemolyticus สายพันธุ์ VpAHPND ตวั อยำ่ งกงุ้ /อำหำรมชี วี ติ /นำ/ ดิน  กงุ้ & อาหารมชี ีวิต: ชง่ั ตัวอยำ่ งบดละเอยี ด 0.1-1.0 กรัม + 0.9 - 9 ml TSB (1.5-3% NaCl) ในหลอด 1.5-15 ml น้า: ผสมตัวอยำ่ งนำ 0.1-1 ml + 0.9 - 9 ml TSB (1.5-3% NaCl) ในหลอด 1.5 -15 ml ดนิ : ตวั อยำ่ งดิน 1.0 กรัม + 5-9 ml TSB (1.5-3 % NaCl) ในหลอด 15 ml  บม่ ท่ี 28-30oC นำน 3-18 ชม. (จนตวั อยำ่ งมลี กั ษณะขุน่ )  ดดู ส่วน TSB ด้ำนบนใสห่ ลอด 1.5 ml  เหวย่ี งที่ 12,000 rpm นำน 5 นำที ทีอ่ ุณหภูมหิ ้อง  ทงิ สว่ นใส  นำสว่ นตะกอนไปสกัดดีเอน็ เอ 13

คมู่ ือการตรวจโรคสตั ว์นา้ ด้วยเทคนคิ PCR-version 1 ศนู ยว์ จิ ยั สุขภาพสตั ว์นา้ สงขลา กองวจิ ยั และพัฒนาสุขภาพสตั วน์ า้ กรมประมง ปี 2561 2. การเตรยี มตวั อยา่ งปลา อวัยวะหรือเนือเย่ือปลำที่ใช้ในกำรตรวจวินิจฉัยเชือไวรัสขึนอยู่กับชนิดเชือ เนื่องจำกเชือแต่ละชนิดมีอวัยวะ เป้ำหมำยของกำรตดิ เชอื แตกตำ่ งกัน 1. อริ โิ ดไวรสั (Red Seabream Iridovirus): มำ้ ม (Spleen)/เหงอื ก (Gill) 2. วเี อน็ เอ็น (VNN) : สมอง (Brain) /ตำ (Eye) 3. TiLV : สมอง, ตับ, ไตหนำ้ , หัวใจ, เหงอื ก, เมือก มา้ ม ตา สมอง ภาพแสดงอวยั วะของปลา 14

คูม่ อื การตรวจโรคสตั ว์น้าดว้ ยเทคนิค PCR-version 1 ศนู ยว์ ิจยั สุขภาพสัตวน์ า้ สงขลา กองวิจยั และพัฒนาสุขภาพสตั ว์นา้ กรมประมง ปี 2561 4. การเตรียมตวั อย่างหอย การเกบ็ ตวั อย่างหอย 1. ตัวอย่ำงสดหรือแช่นำแข็ง: ส่งห้องปฏบิ ัติกำรภำยใน 24 ชั่วโมง 2. ตวั อย่ำงแชแ่ ข็ง: สง่ ตวั อยำ่ งให้เรว็ ท่ีสดุ เพือ่ ปอ้ งกนั กำรเสียสภำพของสำรพนั ธกุ รรม 3. ตัวอย่ำงดองแอลกอฮอล์ : 90-100% Ethanol (PCR) 4. ตัวอย่ำงดอง Davidson’s solution สำหรับ (in-situ hybridisation and immuno-histochemistry) เนือเย่ือหอยที่เหมาะส้าหรับใช้ในการตรวจวินิจฉัยเชือปรสิต Perkinsus ด้วยเทคนิคพีซีอาร์ ได้แก่ 1. เหงอื ก (Gill) 2. แมนเทิล (Mantle) 3. ทำงเดินอำหำร (Intestine) 15

ค่มู อื การตรวจโรคสัตว์น้าดว้ ยเทคนิค PCR-version 1 ศนู ยว์ จิ ัยสขุ ภาพสัตวน์ ้าสงขลา กองวิจยั และพัฒนาสุขภาพสัตว์น้า กรมประมง ปี 2561 ภาพแสดงอวยั วะภายในของหอย 16

คูม่ ือการตรวจโรคสตั ว์น้าดว้ ยเทคนิค PCR-version 1 ศูนยว์ จิ ัยสขุ ภาพสัตวน์ ้าสงขลา กองวิจัยและพัฒนาสขุ ภาพสัตว์นา้ กรมประมง ปี 2561 การตรวจเชอื ทมี่ สี ารพันธุกรรมเป็น DNA ชนิดเชือ: 1. เชือแบคทเี รยี ก่อโรคตบั วำยเฉยี บพลัน (VpAHPND) 2. เชอื ไมโครสปอรเิ ดียนชนิด Enterocytozoon hepatopanaei (EHP) 3. เชอื ไวรสั ก่อโรคตวั แดงดวงขำว (WSSV) 4. เชือไวรัสกอ่ โรคแคระแกร็น (IHHNV) 5. เชือไวรสั MBV (Monodon Baculovirus) 6. เชือไวรสั BP (Baculovirus penaei) 7. เชือไวรัสกอ่ โรค SHIV (Shrimp Hemolymp Iridwscent virus) 8. เชือแบคทีเรียกอ่ โรคตบั อกั เสบ NHPB (Hepatobacter penaei) 9. เชืออริ โิ ดไวรสั ชนดิ RSIV (Read seabream iridovirus) 10. เชือปรสิต Perkinsus sp., P. marinus, P. olseni อปุ กรณแ์ ละเคร่ืองมอื : 1. หลอดไมโครเซนตรฟิ ิวส์หรือหลอด PCR (Micro centrifuge tube 1.5 ml, 0.5 ml, 0.2 ml) 2. เครื่องดดู จำ่ ยสำรอัตโนมตั ิ (Micropipette) 3. Pipette Tip (1000 µl, 200 µl) 4. Probe บดตัวอย่ำง 5. เครอ่ื งหมุนเหวย่ี ง (Centrifuge) แบบควบคุมอุณหภมู ิ 6. ตู้ปลอดเชือ (Laminar flow/PCR cabinet) 7. เคร่อื งเพ่มิ ปริมำณสำรพนั ธุกรรม (PCR machine or Thermocycler) 8. ชุดรนั เจล (Gel Electrophoresis set) 9. Microwave เครอื่ งอำ่ นผลเจล (UV transilluminator) 10. ตเู้ ยน็ /ตู้แช่แขง็ 11. เครอื่ งวดั ปรมิ ำฯสำรพันธุกรรม 12. Heat block/water bath สารเคมี สารสกดั DNA: 1. DNAZol® Reagent หรือสำรสกัดอ่นื ๆ - Absolute ethanol - 75% Ethanol - 8 mM NaOH 2. Spin column วธิ ีกำรสกดั ขึนอยูก่ บั ผผู้ ลิตแต่ละรำย 3. Auto extraction วธิ กี ำรสกัดขึนอยู่กบั ผผู้ ลติ แตล่ ะรำย 17

คู่มอื การตรวจโรคสตั ว์นา้ ด้วยเทคนิค PCR-version 1 ศนู ยว์ ิจยั สขุ ภาพสัตวน์ ้าสงขลา กองวิจยั และพัฒนาสขุ ภาพสตั วน์ า้ กรมประมง ปี 2561 สารทา้ ปฏกิ ริ ิยา PCR: 1. PCR master mix (2X, 5X, 10X ขนึ อยูก่ ับผ้ผู ลิต) เช่น  Quanta: AccuStart™ II GelTrack™ PCR SuperMix (95136)  KAPPA Bioscience: KAPA2G Fast HotStart ReadyMix PCR Kit (KK5603) 2. Primers  Operon (เยอรมัน), Sigma (USA/Sigapore), Eurogentec (เบลเยย่ี ม), Biolegio (เนเธอแลนด)์ , BioBasic (แคนำดำ)  อื่นๆ 3. DNA free water/DEPC treated water 4. TBE buffer 5. Agarose 6. Loading dye 7. SYBR® Safe DNA gel stain 18

คู่มอื การตรวจโรคสตั ว์นา้ ด้วยเทคนิค PCR-version 1 ศูนยว์ จิ ัยสขุ ภาพสัตว์น้าสงขลา กองวิจยั และพัฒนาสุขภาพสัตวน์ ้า กรมประมง ปี 2561 การสกัด DNA โดยวธิ ีการต้ม (Boiling) กำรสกดั DNA ดว้ ยวธิ กี ำรต้ม เปน็ วธิ กี ำรทีง่ ่ำย สะดวก รวดเร็ว แต่ไม่สำมำรถเก็บ Template ท่ีสกัดแล้วได้ นำน เนอ่ื งจำกไมไ่ ด้ผำ่ นขันตอนกำรแยกโปรตีนออกทำให้มสี ำรอืน่ เช่น protein เจอื ปนอยู่ กำรตม้ เหมำะกับ กำรสกดั ดเี อ็นเอจำกตวั อย่ำงทมี่ ีโครงสรำ้ งเซลลไ์ ม่ซับซ้อนมำก เชน่ แบคทเี รยี แกรมลบกลุ่มวบิ ริโอ ซึง่ ปัจจุบัน ใชว้ ธิ ีกำรนใี นกำรสกดั ดีเอ็นเอจำกตวั อย่ำง กุง้ ดิน นำ สำหรบั ตรวจเชอื VpAHPND Colony on TCBS/TSA หรอื pellet เชือแบคทเี รยี หลังกำรบ่ม  200 µl sterile ddH2O water  Vortex  ต้มทอี่ ณุ หภูมิ 100oC นำน 5 นำที (เครือ่ ง PCR/Water bath/Heating block)  เหวี่ยง 12,000 rpm 5 นำที  ดูดสว่ นใสใส่หลอด เก็บที่ -20 oC สำหรบั ตรวจเชอื VpAHPND 19

ค่มู อื การตรวจโรคสตั ว์น้าด้วยเทคนิค PCR-version 1 ศนู ยว์ จิ ยั สุขภาพสตั วน์ า้ สงขลา กองวจิ ยั และพัฒนาสขุ ภาพสตั ว์นา้ กรมประมง ปี 2561 การสกดั DNA จากตัวอย่างด้วย DNAZol® reagent (ลดปริมำณสำรสกัดจำก 1000 µl/ตย. 500 µl/ตย.) ตดั ตัวอย่ำงเปน็ ชนิ เลก็ ๆ  ชัง่ ตวั อยำ่ ง 305 mg ใสห่ ลอด Micro tube ขนำด 1.5 ml แชใ่ นนำแข็งเพ่ือรอบด  เติมสำร DNAZol® Reagent 500 µl และบดตวั อย่ำงโดยใชแ้ ทง่ แกว้ บดตัวอย่ำง (ไม่ควรบดตัวอยำ่ งนำนหรือแรงเกนิ ไป โดยทัว่ ไปประมำณ 5 - 10 ครงั ) Centrifuge ท่ี 10,000 rpm, 4oC, 10 นาที ดูดส่วนใสใส่หลอด Micro tube ขนำด 1.5 ml หลอดใหม่  ตกตะกอน DNA โดยเตมิ 100% Ethanol 250 µl ในหลอดตวั อย่ำงและพลกิ หลอดกลบั ไปมำเบำๆ 3-6 ครัง (ห้ำมแชเ่ ย็น)  วำงหลอดตวั อยำ่ งทีอ่ ณุ หภูมหิ อ้ ง 2 นำทจี ะได้ DNA สขี ำวขนุ่ เกำะกล่มุ (ถ้ำ DNA ไม่เกำะกลุ่ม ให้ Centrifuge ท่ี 10,000 rmp, 4oC, 5 นำท)ี ดูด Ethanol ท้งิ เติม 75% Ethanol 400 µl ในหลอดตัวอย่ำง แลว้ ล้ำงตะกอน DNA โดยกำรพลิกหลอดไปมำเบำๆ 3-6 ครัง แล้ววำงไว้ 1 นำที เพื่อใหต้ ะกอนดเี อน็ เอตกทกี่ ้นหลอด (ล้ำงครงั ที่ 1) ท้ิงส่วนใส เติม 75% Ethanol 400 µl ในหลอดตวั อยำ่ ง แล้วล้ำงตะกอน DNA โดยกำรพลิกหลอดไปมำเบำๆ 3-6 ครัง แล้ววำงไว้ 1 นำที เพอ่ื ให้ตะกอนดีเอ็นเอตกทีก่ น้ หลอด (ล้ำงครังท่ี 2) ทิ้งสว่ นใส วำงคว่ำหลอด 10 – 15 วินำที  ละลำย DNA ดว้ ย 8 mM NaOH 200 µl (ขนึ อย่กู บั ปริมำณตะกอน DNA) จนละลำยเป็นเนือเดียวกนั (ถ้ำมีตะกอนทีไ่ ม่สำมำรถละลำยได้ ให้ Centrifuge ที่ 10,000 xg, 4oC, 5 นำที และดดู สว่ นใสสำหรับใช้ตอ่ ไป)  เก็บ DNA Template ทีไ่ ด้ ในต้เู ยน็ ที่ช่วงอุณหภูมิ 2-8oC กรณที ดสอบในเดยี วกบั วนั ท่สี กดั ตัวอยำ่ ง หำกยังไมท่ ดสอบ หรือทดสอบเสรจ็ แล้วให้เกบ็ DNA Template ในต้แู ช่แข็ง ทอี่ ณุ หภูมไิ มส่ ูงกว่ำ -18oC 20

คูม่ อื การตรวจโรคสตั ว์น้าดว้ ยเทคนิค PCR-version 1 ศูนยว์ ิจยั สุขภาพสตั ว์นา้ สงขลา กองวจิ ยั และพัฒนาสุขภาพสตั วน์ า้ กรมประมง ปี 2561 การตรวจเชอื Vibrio parahaemolyticus สายพนั ธุ์ก่อโรคตับวายเฉยี บพลัน VpAHPND ด้วย Multiplex PCR หลักการ: โรคตับวำยเฉียบพลันเกิดจำกเชือแบคทีเรีย Vibrio parahaemolyticus สำยพันธ์ุท่ีมี พลำสมิด (Plasmid) เฉพำะซึ่งมียีนสร้ำงสำรพิษ ก่อให้เกิดกำรทำลำยตับ กำรตรวจต้องสกัดสำรพันธุกรรมคือดีเอ็นเอ (DNA) ของเชือแบคทีเรียนำมำตรวจด้วยเทคนิค multiplex PCR โดยใช้ primer 3-4 คู่ ตำมวิธีกำรที่ดัดแปลง มำจำก Tinwongger et al. (2014) การสกัดสารพันธุกรรม:  อวัยวะทใ่ี ชต้ รวจ: กระเพำะอำหำร ลำไส้ และตับและตับอ่อน o ลกู กุ้ง, กงุ้ ใหญ่, ดิน นา้ : สกัด DNA จำกตัวอยำ่ ง ตำมเอกสำรวธิ กี ำรเตรียมตวั อย่ำงตรวจ VpAHPND การท้าปฏกิ ิริยาPCR: Taget Product V. parahaemolyticus 897 bp Primers: Primer name Sequences (53) V. parahaemolyticus 500 bp Vp-flaE-79F 5-GCAGCTGATCAAAACGTTGAGT-3 ทีม่ ีพลำสมิดผิดปกติ Vp-flaE-34R 5-ATTATCGATCGTGCCACTCAC-3 V. parahaemolyticus 360 bp TUMSAT-Vp1F 5-CGCAGATTTGCTTTTGTGAA-3 ทีม่ พี ลำสมดิ สร้ำงสำรพิษ (Toxin) TUMSAT-Vp1R 5-AGAAGCTGGCCGAAGTGATA-3 TUMSAT-Vp3F 5-GTGTTGCATAATTTTGTGCA-3 TUMSAT-VP3R 5-TTGTACAGAAACCACGACTA-3 PCR mastermix: Volume (µl)/reaction Final concentration PCR components 5.60 - DNA free water 10.00 1X 2X Multiplex mastermix 2.40 10 µM F/R Mix Primer (V-flaE, Vp1, Vp3) 2.00 0.2 µM each DNA Template 20.00 Total Ref: 30 µl reaction mixture, 1 µl DNA template, 250 mM dNTP, 3 mM MgCl2, 0.6 µM primers and 0.01 unit Taq polymerase 21

คูม่ อื การตรวจโรคสัตว์นา้ ดว้ ยเทคนคิ PCR-version 1 ศูนยว์ ิจยั สขุ ภาพสัตวน์ า้ สงขลา กองวจิ ัยและพัฒนาสุขภาพสัตวน์ ้า กรมประมง ปี 2561 การเตรียม Primer:  เตรยี ม Stock primer: เติม DEPC water หรือ TE buffer ในหลอด primer ตำมปรมิ ำณท่กี ำหนดใน เอกสำรแนบทม่ี ำกบั primer (pmol/µ =µM)  100 µM แบง่ ใส่หลอด 1.5 ml  เก็บที่ -20oC  เตรยี ม Working primer: เตรยี ม working primer 3 คู่ คือ Vp-flaE F/R, TumsatVp1 (C4) F/R, Tumsat Vp-3 F/R จำก stock primer 100 µM primer ให้มีควำมเขม้ ขน้ 10 µM โดยเตรยี มแยกแต่ ละเส้น  เกบ็ ท่ี -20oC C1V1 = C2V2 100 µM VpFlaE x V1 = 10 µM x 500 µl V1= (10 µM x 500 µl)/100 µM = 50 µl + 450 µl DEPC water = 10 µM working primer  ผสม 10 µM primer แต่ละเสน้ ในปรมิ ำตรเทำ่ ๆ  ใช้ 2.40 µl/20 µl reaction = 0.2 µM final concentration PCR Profile: VpAHPND Cycle No. Temperature Time (37 min.) Initial denature 1 94C 3 min. Denature 94C 30 s Annealing 29 60C 30 s Extension 72C 30 s Final Extension 1 72C 5 min. Holding 15C  Ref. 95°C for 2 min, 28 cycles of 95°C for 30 s, 60°C 30 s, 72°C 30 s, 72°C for 2 min. (Tumsat VP3 Tm 56oC) การแปลผล: รนั เจล1.5% agarose gel 897 bp: Vibrio parahaemolyticus +ve 500 bp: Vibrio parahaemolyticus สำยพันธุ์ที่มีพลำสมดิ ผดิ ปกติ 360 bp: Vibrio parahaemolyticus สำยพนั ธ์ทุ ่มี ีพลำสมดิ สร้ำงสำรพษิ TINWONGGER S., PROESPRAIWONG P., THAWONSUWAN J., SRIWANAYOS P., KONGKUMNERD J., CHAWEEPACK T., MAVICHAK R., UNAJAK S., NOZAKI R., KONDO H. & HIRONO I. (2014). Development of PCR diagnosis method for shrimp acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) strain of Vibrio parahaemolyticus. Fish Pathol., 49, 159–164. 22

คู่มือการตรวจโรคสัตว์นา้ ดว้ ยเทคนิค PCR-version 1 ศนู ยว์ จิ ยั สุขภาพสัตวน์ ้าสงขลา กองวิจัยและพัฒนาสขุ ภาพสตั วน์ ้า กรมประมง ปี 2561 การตรวจเชอื Vibrio parahaemolyticus สายพนั ธ์ุกอ่ โรคตับวายเฉยี บพลัน (VpAHPND) ด้วย nested PCR หลกั การ: โรคตับวำยเฉียบพลันเกิดจำกเชือแบคทีเรีย Vibrio parahaemolyticus สำยพันธ์ุที่มี พลำสมิด (Plasmid) เฉพำะซ่ึงมียีนสร้ำงสำรพิษ ก่อให้เกิดกำรทำลำยตับ กำรตรวจต้องสกัดสำรพันธุกรรมคือดีเอ็นเอ (DNA) ของเชือแบคทีเรียนำมำตรวจด้วยเทคนิค nested PCR ตำมวิธีกำรของ Tangtip et al. (2015) ซึ่ง เหมำะสำหรบั ตวั อยา่ งแช่แข็งหรือดองแอลกอฮออล์ทไ่ี ม่สำมำรถ enrich เพ่ือเพิ่มปรมิ ำณแบคทเี รยี ได้ การสกดั สารพนั ธกุ รรม:  อวยั วะท่ใี ช้ตรวจ: กระเพำะอำหำร ลำไส้ และตบั และตบั อ่อน o ลูกกุ้ง, กุ้งใหญ่, ดิน น้า: สกัด DNA จำกตัวอย่ำง ตำมเอกสำรวิธีกำรเตรียมตัวอย่ำงตรวจเชือ VpAHPND การท้าปฏิกริ ยิ าPCR: Primers: Primer name Sequences (53) Taget Product Full ToxA gene 1269 bp AP4-F1 5-ATGAGTAACAATATAAAACATGAAAC-3 AP4-R1 5-ACGATTTCGACGTTCCCCAA-3 AP4-F2 5-TTGAGAATACGGGACGTGGG-3 209 bp ToxA & 230 bp AP4-R2 5-GTTAGTCATGTGAGCACCTTC-3 12 bp ToxB PCR mastermix: first step Volume (µl)/reaction Final concentration PCR components - 1X DNA free water 9.50 0.2 µM 2X mastermix 12.50 0.2 µM 100 ng/ul 10 µM Primer AP4-F1 0.50 10 µM Primer AP4-R1 0.50 DNA Template 2.00 Total 25.00 Ref: 25 µl reaction mixture, 200 mM dNTP, 3 mM MgCl2, 0.2 mM primers and 1.5 unit Taq polymerase การเตรียม Primer:  เตรียม Stock primer: เติม DEPC water ในหลอด primer ตำมปรมิ ำณที่กำหนดในเอกสำรแนบที่มำ กับ primer  100 µM แบง่ ใสห่ ลอด 1.5 ml  เกบ็ ที่ -20oC  เตรียม10 µM Primer: จำก Stock primer 100 µM 10 µL + 90 µL DEPC-treated water = 10 µM ดึงไปใช้ 0.5 µl/25 µl reaction = 0.2 µM final conc. 23

คู่มือการตรวจโรคสตั ว์น้าดว้ ยเทคนิค PCR-version 1 ศูนยว์ ิจยั สุขภาพสัตว์น้าสงขลา กองวจิ ัยและพัฒนาสขุ ภาพสตั วน์ า้ กรมประมง ปี 2561 PCR mastermix: nested Volume (µl)/reaction Final concentration PCR components 9.75 - DNA free water 12.50 1X 2X mastermix 10 µM Primer AP4-F2 0.375 0.15 µM 10 µM Primer AP4-R2 0.375 0.15 µM First step PCR product 2.00 2 µl Total 25.00 Ref: 25 µl reaction mixture, 200 mM dNTP, 3 mM MgCl2, 0.15 mM primers and 1.5 unit Taq polymerase การเตรยี ม Primer:  เตรยี ม 10 µM Primer: จำก Stock primer 100 µM 10 µL + 90 µL DEPC-treated water = 10 µM ดงึ ไปใช้ 0.375 µl/25 µl reaction = 0.15 µM final conc. PCR Profile: AP4 1269 Cycle No. Temperature Time (79 min.) 2 min. Initial denature 1 94C 30 s 30 s Denature 94C 90 s 2 min. Annealing 30 55C  Extension 72C Time (29 min.) 2 min. Final Extension 1 72C 20 s 20 s Holding 15C 20 s 2 min. Ref. 94°C for 2 min, 30 cycles of 94°C for 30 s, 55°C 30 s, 72°C 90 s, 72°C for 2 min.  PCR Profile: AP4 230 Cycle No. Temperature Initial denature 1 94C Denature 94C Annealing 25 55C Extension 72C Final Extension 1 72C Holding 15C Ref. 94°C for 2 min, 25 cycles of 94°C for 20 s, 55°C 20 s, 72°C 20 s, 72°C for 2 min. AP4 มคี วำมไวมำกกวำ่ AP3 100 เทำ่ (AP4 100 fg /AP3 10 pg) AP4 ตรวจเจอตัวอย่ำงที่ challenge เชอื 6 ชม. AP3 ตรวจเจอตัวอยำ่ งที่ challenge เชอื 12 ชม. 24

คมู่ ือการตรวจโรคสัตว์น้าดว้ ยเทคนิค PCR-version 1 ศนู ยว์ ิจยั สุขภาพสตั วน์ า้ สงขลา กองวจิ ัยและพัฒนาสุขภาพสัตวน์ ้า กรมประมง ปี 2561 การแปลผล: รนั 1.5% agarose gel VpAHPND +ve : 230 bp = 209 bp toxin A/ 12 bp toxin B = low level of infection : 1269, 230 bp high infection Residue : 1142 bp = AP4-F2+AP4-R1 : 357 bp = AP4-F1+AP4-R2 25

คมู่ อื การตรวจโรคสัตว์นา้ ด้วยเทคนคิ PCR-version 1 ศูนยว์ จิ ยั สุขภาพสตั วน์ า้ สงขลา กองวิจัยและพัฒนาสขุ ภาพสัตว์นา้ กรมประมง ปี 2561 Sirintip Dangtip, Ratchanok Sirikharin, Piyachat Sanguanrut, Siripong Thitamadee, Kallaya Sritunyalucksana, Suparat Taengchaiyaphum, Rapeepat Mavichak, Porranee Proespraiwong, Timothy W. Flegel. 2015. AP4 method for two-tube nested PCR detection of AHPND isolates of Vibrio parahaemolyticus. Aquaculture Reports (2): 158-162. 26

คมู่ ือการตรวจโรคสตั ว์นา้ ดว้ ยเทคนคิ PCR-version 1 ศูนยว์ จิ ัยสขุ ภาพสัตวน์ า้ สงขลา กองวิจัยและพัฒนาสุขภาพสัตวน์ า้ กรมประมง ปี 2561 การตรวจเชือปรสติ Microsporidian ชนิด Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) ดว้ ย nested PCR (SSU-PCR) หลกั การ: EHP เป็นเชือ parasitic fungi ในกลุ่ม Microsporidian อวัยวะเป้ำหมำยของเชือคือตับและตับอ่อน (hepatopancrease) กำรตรวจวินิจฉัยต้องสกัด DNA จำก hepatopancrease นำมำตรวจด้วย nested PCR โดยใช้ primer 2 คู่ ตำมวิธกี ำรของ Tangprasittipap et al. (2014) การสกัดสารพนั ธุกรรม:  อวยั วะท่ใี ชต้ รวจ: ตบั และตับออ่ น (Hepatopancrease), ขกี ุ้ง (Feces) o ลูกกงุ้ : สกดั DNA จำกลกู กุ้งทังตัวด้วยสำรสกัด DNA เชน่ DNAZol® Reagent หรอื สำรอ่ืนๆ o ก้งุ ใหญ:่ สกดั DNA จำกตับหรือขีกุง้ ด้วยสำรสกดั DNA เชน่ DNAZol® Reagent หรอื สำรอ่ืนๆ การท้าปฏกิ ริ ยิ า PCR: Primers: Product Primer name Sequences(53) EHF779 5-CAGCAGGCGCGAAAATTGTCCA-3 First step 779 bp EHR779 5-AAGAGATATTGTATTGCGCTTGCTG-3 EHF176 5-CAACGCGGGAAAACTTACCA-3 Nested 176 bp (226 bp residue) EHR176 5-ACCTGTTATTGCCTTCTCCCTCC-3 Internal EF1aS-F 5-ATGGTTGTCAACTTTGCC CC-3 control 500 bp EF1aS-R 5-TTGACCTCCTTGATCACACC-3 PCR master mix: First step PCR components: 1st step Volume (µl)/reaction Final concentration DNA free water 6.40 - 2x PCR Master mix 10.00 1X 10 µM Primer EHF779 0.40 0.2 µM 10 µM Primer EHR779 0.40 0.2 µM 10 µM Primer EF1aS-F 0.40 0.1 µM 10 µM Primer EF1aS-R 0.40 0.1 µM DNA Template 2.00 100 ng Total 20.00 Ref: 25 µl reaction mixture, 200 mM dNTP, 1.5 mM MgCl2, 0.1 mM primers and 0.625 unit Taq polymerase, 1 µl template 27

คมู่ อื การตรวจโรคสัตว์น้าดว้ ยเทคนคิ PCR-version 1 ศูนยว์ ิจัยสุขภาพสัตว์นา้ สงขลา กองวิจยั และพัฒนาสุขภาพสัตวน์ า้ กรมประมง ปี 2561 PCR master mix: nested PCR components: nested Volume (µl)/reaction Final concentration DNA free water 8.20 - 2x PCR Master mix 10.00 1X 10 µM Primer EHF176 0.40 0.2 µM 10 µM Primer EHR176 0.40 0.2 µM 1ststepPCR Product 1.00 - Total 20.00 Ref: 25 µl reaction mixture, 200 mM dNTP, 1.5 mM MgCl2, 0.1 mM primers and 0.625 unit Taq polymerase, 1 µl 1st step products การเตรียม Primer:  เตรียม10 M Primer: จำก Stock primer 100 µM 10 µL + 90 µL DEPC-treated water = 10 µM ดึงไปใช้ 0.4 µl/20 µl reaction = 0.2 µM final conc. PCR profile: First step EHP 779 Cycles Temperature Time ( 58 min.) 3 min. Initial denaturation 1 94°C 20 s 20 s Denaturation 94°C 45 s 5 min. Annealing 35 58°C  Extension 72°C Final extension 1 72°C Holding 15°C Ref. 94°C for 3 min, 35 cycles of 94°C 20 s, 58°C 20 s, 72°C 45 s, 72°C for 5 min. PCR profile: nested EHP 176 Cycles Temperature Time (43 min.) 3 min. Initial denaturation 1 94°C 20 s 20 s Denaturation 94°C 20 s 5 min. Annealing 35 64°C  Extension 72°C Final extension 1 72°C Holding 15°C Ref. 94°C for 3 min, 35 cycles of 94°C for 20 s, 64°C 20 s, 72°C 20 s, 72°C for 5 min. Tangprasittipap A, Srisala J, Chouwdee S, Somboon M, Chuchird N, Limsuwan C, et al. The microsporidian Enterocytozoon hepatopenaei is not the cause of white feces syndrome in whiteleg shrimp Penaeus (Litopenaeus) vannamei. BMC Vet Res. BMC Veterinary Research; 2013; 9: 139. doi: 10. 28

คมู่ ือการตรวจโรคสัตว์นา้ ดว้ ยเทคนิค PCR-version 1 ศูนยว์ ิจยั สขุ ภาพสตั วน์ ้าสงขลา กองวจิ ัยและพัฒนาสขุ ภาพสตั ว์น้า กรมประมง ปี 2561 การแปลผล: รนั เจล 1.5% agarose gel EHP +ve : 779 bp first step / 176 bp nested Internal control : 500 bp Residue : 226 bp ENF176+ ENR779 29

คู่มือการตรวจโรคสัตว์นา้ ด้วยเทคนคิ PCR-version 1 ศูนยว์ จิ ยั สขุ ภาพสตั วน์ า้ สงขลา กองวจิ ยั และพัฒนาสขุ ภาพสัตว์นา้ กรมประมง ปี 2561 การตรวจเชือ Microsporidian ชนิด Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) ดว้ ย nested PCR (SPW primer) หลกั การ: EHP เป็นเชือ parasitic fungi ในกลุ่ม Microsporidian อวัยวะเป้ำหมำยของเชือคือตับและตับอ่อน (hepatopancrease) กำรตรวจวินิจฉัยต้องสกัด DNA จำก hepatopancrease นำมำตรวจด้วย nested PCR โดยใช้ primer 2 คู่ ทม่ี ีควำมจำเพำะมำกขึนตำมวิธกี ำรของ Jaroenlak et al. (2016) การสกดั สารพนั ธุกรรม:  อวยั วะทใี่ ชต้ รวจ: ตับและตบั อ่อน (Hepatopancrease), ขกี ุ้ง (Feces) o ลกู กุ้ง: สกดั DNA จำกลูกก้งุ ทังตัวดว้ ยสำรสกดั DNA เช่น DNAZol® Reagentหรอื สำรอืน่ ๆ o กงุ้ ใหญ:่ สกดั DNA จำกตบั หรือขกี ุ้งด้วยสำรสกดั DNA เชน่ DNAZol® Reagentหรอื สำรอ่ืนๆ การทา้ ปฏกิ ิริยา PCR: Primers: Sequences (53) Product Primer name SWP_1F 5- TTGCAGAGTGTTGTTAAGGGTTT-3 First step 514 bp SWP_1R 5- CACGATGTGTCTTTGCAATTTTC-3 SWP_2F 5- TTGGCGGCACAATTCTCAAACA-3 Nested 148 bp (180 bp residue) SWP_2R 5- GCTGTTTGTCTCCAACTGTATTTGA-3 Internal Actin_F 5- CCTCGCTGGAGAAGTCCTAC-3 control 401 bp Actin_R 5- TGGTCCAGACTCGTCGTACTC-3 PCR master mix: First step Volume (µl)/reaction Final concentration PCR components: 1st step DNA free water 6.40 - 2x PCR Master mix 10.00 1X 10 µM Primer SWP_1F 0.40 0.2 µM 10 µM Primer SWP_1R 0.40 0.2 µM 10 µM Primer Actin_F 0.40 0.2 µM 10 µM Primer Actin_R 0.40 0.2 µM DNA Template 2.00 100 ng Total 20.00 Ref: 25 µl reaction mixture, 200 mM dNTP, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM primers and 0.5 unit Taq polymerase, 100 ng DNA 30

คูม่ อื การตรวจโรคสัตว์นา้ ดว้ ยเทคนิค PCR-version 1 ศนู ยว์ ิจยั สขุ ภาพสตั วน์ า้ สงขลา กองวจิ ัยและพัฒนาสขุ ภาพสัตวน์ า้ กรมประมง ปี 2561 PCR master mix: nested PCR components: nested Volume (µl)/reaction Final concentration DNA free water 8.20 - 2x PCR Master mix 10.00 1X 10 µM Primer SWP_2F 0.40 0.2 µM 10 µM Primer SWP_2R 0.40 0.2 µM 1ststepPCR Product 1.00 Total 20.00 Ref: 25 µl reaction mixture, 200 mM dNTP, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM primers and 0.5 unit Taq polymerase 1µl 1st step product การเตรยี ม Primer:  เตรยี ม10 M Primer: จำก Stock primer 100 µM 10 µL + 90 µL DEPC-treated water = 10 µM ดงึ ไปใช้ 0.4 µl/20 µl reaction = 0.2 µM final conc. PCR profile: First step EHP 514 Cycles Temperature Time (63 min.) 3 min. Initial denaturation 1 94°C 30 s 30 s Denaturation 94°C 45 s 5 min. Annealing 30 58°C  Extension 72°C Final extension 1 72°C Holding 15°C Ref. 95°C for 5 min, 30 cycles of 95°C 30 s, 58°C 30 s, 68°C 45 s, 72°C for 5 min. PCR profile: nested EHP 148 Cycles Temperature Time (43 min.) 3 min. Initial denaturation 1 94°C 30 s 30 s Denaturation 94°C 20 s 5 min. Annealing 20 64°C  Extension 72°C Final extension 1 72°C Holding 15°C Ref. 95°C for 5 min, 20 cycles of 95°C for 30 s, 64°C 30 s, 68°C 20 s, 72°C 5 min. Jaroenlak P, Sanguanrut P, Williams BAP, Stentiford GD, Flegel TW, Sritunyalucksana K, et al. (2016) A Nested PCR Assay to Avoid False Positive Detection of the Microsporidian Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) in Environmental Samples in Shrimp Farms. PLoS ONE 11(11): e0166320. doi:10.1371/journal.pone.0166320 31

คมู่ อื การตรวจโรคสตั ว์น้าด้วยเทคนคิ PCR-version 1 ศนู ยว์ ิจัยสขุ ภาพสัตวน์ ้าสงขลา กองวจิ ยั และพัฒนาสขุ ภาพสัตว์น้า กรมประมง ปี 2561 การแปลผล: รนั 1.5% agarose gel EHP +ve : 514 bp first step / 148 bp nested Internal control : 401 bp Residue : 180 bp SWP_2F + SWP_1R 32

ค่มู อื การตรวจโรคสัตว์นา้ ดว้ ยเทคนคิ PCR-version 1 ศูนยว์ ิจยั สขุ ภาพสัตวน์ า้ สงขลา กองวจิ ยั และพัฒนาสุขภาพสัตว์น้า กรมประมง ปี 2561 การตรวจเชอื ไวรัสตวั แดงดวงขาว (WSSV) ด้วย nested PCR หลักการ: เชือ White Spot Syndrome Virus (WSSV) เป็นสำเหตุของโรคดวงขำว (White Spot Disease; WSD) ซ่ึงมีสำรพันธุกรรมเป็น DNA สำยคู่ (dsDNA) กำรตรวจวินิจฉัยต้องสกัดสำรพันธุกรรมคือ DNA ออก จำกตัวอย่ำง หลังจำกนันนำไปผ่ำนขันตอนกำรเพิ่มปริมำณโดยปฏิกิริยำ Polymerase Chain Reaction (PCR) วธิ กี ำรตรวจวินิจฉัยที่ใช้คือ nested PCR (OIE, 2017; Lo et al., 1996a, Lo et al., 1996b) การสกัดสารพันธุกรรม:  อวยั วะทีใ่ ชต้ รวจ: เหงอื ก (Gill), ขำว่ำยนำ (Pleopod), เลอื ด (Hemolymp), เนอื เย่ือใต้เปลอื ก o ลกู กงุ้ : สกดั DNA จำกลูกกงุ้ ทังตัว ด้วย DNAZol Reagent หรือ สำรสกดั ดเี อน็ เออ่นื ๆ o กงุ้ ใหญ:่ สกดั DNA จำก Gill, Pleopod, Hemolymp, เนือเยอื่ ใตเ้ ปลอื ก ด้วย DNAZol Reagent หรือ สำรสกัดดเี อน็ เออน่ื ๆ การท้า PCR: Sequences (53) First step Product band 5-ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG-3 1447 bp Primers: 5-TAATGCGGGTGTAATGTTCTTACG-A-3 2000 copies 941 bp Primer name 5-GTAACTGCCCCTTCCATCTCCA-3 500 bp W146F1 5-TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT-3 Nested W146R1 5-ATGGTTGTCAACTTTGCCCC-3 W146F2 5-TTGACCTCCTTGATCACACC-3 20 copies W146R2 EF1aS-F Internal EF1aS-R control PCR master mix: First step PCR components: WSSV 1ststep Volume (µl)/reaction (1x) Final concentration DNA free water 2.20 - 2x PCR Master mix 5.00 1x 10 µM Primer W146F1 0.20 0.2 µM 10 µM Primer W146R1 0.20 0.2 µM 5 µM Primer EF1aS-F 0.20 0.1 µM 5 µM Primer EF1aS-R 0.20 0.1 µM DNA Template 2.00 100-300 ng Total 10.00 - Ref: 100 µl reaction mixture, 200 mM dNTP, 1.5 mM MgCl2, 100 pmol primers and 2 unit Taq polymerase, 1 µl 0.1-0.3 µg DNA template 33

คู่มือการตรวจโรคสตั ว์นา้ ด้วยเทคนคิ PCR-version 1 ศูนยว์ ิจยั สุขภาพสัตวน์ ้าสงขลา กองวิจัยและพัฒนาสขุ ภาพสตั วน์ า้ กรมประมง ปี 2561 PCR mastermix: nested PCR components: WSSV nested Volume (µl)/reaction (1x) Final concentration DNA free water 1.50 - 2x PCR Master mix 12.50 1x 10 µM Primer W146F2 0.50 0.2 µM 10 µM Primer W146R2 0.50 0.2 µM 1ststepPCR Product 10.00 - Total 25.00 - Ref: 100 µl reaction mixture, 200 mM dNTP, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM primers and 2.5 unit Taq polymerase, 10 µl first step product การเตรยี ม Primer:  เตรยี ม 10 µM Primer: จำก Stock primer 100 µM 10 µL + 90 µL DEPC-treated water = 10 µM ดงึ ไปใช้ 0.2 µl/10 µl reaction และ 0.5 µl/25 µl reaction = 0.2 µM final conc.  เตรียม 5 µM Primer: จำก Stock primer 100 µM 5 µL + 95 µL DEPC-treated water = 5 µM ดึงไปใช้ 0.2 µl/10 µl reaction (0.1 µM final conc.) PCR profile: First step WSSV1447 Cycle No. Temperature Time (43.5 min.) Initial denaturation 1 94oC 3 min. Denature 94oC 30 s Annealing 15 60oC 30 s Extension 72oC 30 s Final Extension 1 72oC 3 min. Holding 15oC  Ref. 1 cycle of 94°C 4 min, 55oC 1 min., 72oC 2 min., 39 cycles of 94°C for 1 min., 55°C 1 min., 72°C 3 min., 72°C for 5 min. PCR profile: nested WSSV941 Cycle No. Temperature Time (36 min.) Initial denaturation 1 94oC 3 min. Denature 94oC 30 s Annealing 30 60oC 30 s Extension 72oC 30 s Final Extension 1 72oC 3 min. Holding 15oC  Ref. 1 cycle of 94°C 4 min., 55oC 1 min., 72oC 2 min., 39 cycles of 94°C 1 min., 55°C 1 min., 72°C 3 min., 72°C for 5 min. 34

คมู่ ือการตรวจโรคสตั ว์นา้ ด้วยเทคนิค PCR-version 1 ศนู ยว์ จิ ัยสขุ ภาพสัตวน์ า้ สงขลา กองวิจัยและพัฒนาสขุ ภาพสตั ว์น้า กรมประมง ปี 2561 การแปลผล: รนั 1.5% agarose gel WSSV +ve : 1447 bp First step / 941 bp nested PCR Internal control : 500 bp 35

คมู่ ือการตรวจโรคสัตว์นา้ ดว้ ยเทคนิค PCR-version 1 ศูนยว์ จิ ัยสขุ ภาพสตั วน์ า้ สงขลา กองวิจัยและพัฒนาสขุ ภาพสตั วน์ ้า กรมประมง ปี 2561 LO C.F., LEU J.H., CHEN C.H., PENG S.E., CHEN Y.T., CHOU C.M., YEH P.Y., HUANG C.J., CHOU H.Y., WANG C.H. &KOU G.H. (1996a). Detection of baculovirus associated with white spot syndrome (WSBV) in penaeid shrimps using polymerase chain reaction. Dis. Aquat .Org., 25, 133–141. LO C.F., HO C.H., PENG S.E., CHEN C.H., HSU H.C., CHIU Y.L., CHANG C.F., LIU K.F., SU M.S.,WANG C.H. & KOU G.H. (1996b). White spot syndrome baculovirus (WSBV) detected in cultured and captured shrimp, crab and other arthropods. Dis. Aquat. Org., 27, 215–225. 36

คมู่ อื การตรวจโรคสัตว์น้าดว้ ยเทคนคิ PCR-version 1 ศูนยว์ จิ ยั สขุ ภาพสตั ว์นา้ สงขลา กองวจิ ัยและพัฒนาสขุ ภาพสัตวน์ า้ กรมประมง ปี 2561 การตรวจเชอื ไวรัสกอ่ โรคแคระแกรน็ (IHHNV) ดว้ ยเทคนิค PCR หลักการ: เชือ Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus (IHHNV) เป็นสำเหตุของโรค แคระแกร็น (IHHN) ในกงุ้ ซึ่งมีสำรพันธุกรรมเป็นดเี อ็นเอ (ssDNA) กำรตรวจวินิจฉยั ตอ้ งสกัดสำรพันธุกรรมคือ DNA ออกจำกตัวอย่ำง หลังจำกนันนำไปผ่ำนขันตอนกำรเพิ่มปริมำณโดยปฏิกิริยำ Polymerase Chain Reaction (PCR) วิธีกำรท่ีใช้เป็นเทคนิค PCR โดยใช้ชุด primer ที่อยู่ในวิธีกำรตรวจขององค์กำรโรคระบำด สัตวร์ ะหว่ำงประเทศ (OIE, 2017; Tang et al., 2007) การสกัดสารพนั ธุกรรม:  อวัยวะท่ใี ช้ตรวจ: เหงอื ก (Gill), ขำวำ่ ยนำ (Pleopod) o ลกู กุง้ : สกดั DNA จำกลูกกุ้งทังตัว ดว้ ย DNAZol® Reagent หรือ สำรสกดั ดเี อน็ เออน่ื ๆ o กุง้ ใหญ่:สกดั DNA จำกGill, Pleopodดว้ ย DNAZol® Reagent หรอื สำรสกัดดเี อน็ เออน่ื ๆ การทา้ PCR: Primers: Primer name Sequences (53) PCR step Product band IHHNV309F 5-TCCAACACTTAGTCAAAACCAA-3 309 bp IHHNV309R 5-TGTCTGCTACGATGATTATCCA-3 Infectious 831 bp MG831F 5-TTGGGGATGCAGCAATATCT-3 100 copies 500 bp MG831R 5-GTCCATCCACTGATCGGACT-3 EF1aS-F 5-ATGGTTGTCAACTTTGCCCC-3 Insert EF1aS-R 5-TTGACCTCCTTGATCACACC-3 sequence Internal control PCR master mix: PCR components: Volume (µl)/reaction (1x) Final concentration DNA free water 7.50 - 2x PCR Master mix 12.50 1x 10 µM Primer IHHNV309F 0.50 0.2 µM 10 µM Primer IHHNV309R 0.50 0.2 µM 10 µM Primer MG831F 0.50 0.2 µM 10 µM Primer MG831R 0.50 0.2 µM 5 µM Primer EF1aS-F 0.50 0.1 µM 5 µM Primer EF1aS-R 0.50 0.1 µM DNA Template 2.00 100-500 ng Total 25.00 - Ref: 100 µl reaction mixture, 200 mM dNTP, 1.5 mM MgCl2, 100 pmol (100 mM) primers and 2.5 unit Taq polymerase, 1 µl 100-500 ng 37

คู่มอื การตรวจโรคสัตว์น้าด้วยเทคนคิ PCR-version 1 ศนู ยว์ ิจัยสุขภาพสัตว์นา้ สงขลา กองวจิ ัยและพัฒนาสขุ ภาพสัตวน์ า้ กรมประมง ปี 2561 การเตรียม Primer:  เตรยี ม 10 µM Primer: จำก Stock primer 100 µM 10 µL + 90 µL DEPC-treated water = 10 µM ดงึ ไปใช้ 0.2 µl/10 µl reaction และ 0.5 µl/25 µl reaction = 0.2 µM final conc.  เตรยี ม 5 µM Primer EF1aS-F/EF1aS-R: จำก Stock primer 100 µM 5 µL + 95 µL DEPC-treated water = 5 µM ดึงไปใช้ 0.2 µl/10 µl reaction (0.1 µM final conc.) PCR profile: IHHNV309 Cycle No. Temperature Time (45 min.) 3 min. Initial denaturation 1 94oC 30 s 30 s Denature 94oC 30 s Annealing 39 60oC 3 min. Extension Final Extension 72oC  1 72oC Holding 15oC Ref. 1 cycle of 94°C for 5 min, 35-40 cycles of 94°C 30 s, 55°C 30 s, 72°C 30 s, 72°C for 7 min. การแปลผล: รนั 1.5% agarose gel : 309 bp/ 309 และ 831 bp IHHNV +ve : 500 bp Internal control TANG K.F.J., NAVARRO S.A. & LIGHTNER D.V. (2007). A PCR assay for discriminating between infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) and the virus-related sequences in the genome of Penaeus monodon. Dis. Aquat. Org., 74, 165–170. 38

คู่มือการตรวจโรคสัตว์นา้ ด้วยเทคนิค PCR-version 1 ศนู ยว์ ิจัยสขุ ภาพสตั ว์นา้ สงขลา กองวิจัยและพัฒนาสุขภาพสตั วน์ ้า กรมประมง ปี 2561 การตรวจเชือ Penaeus monodon-type baculovirus (MBV) และ Baculovirus penaei (BP) ด้วยเทคนคิ Multiplex PCR หลกั การ: MBV และ BP เปน็ เชอื กอ่ โรคไวรัสทีม่ ีอวยั วะเปำ้ หมำยของเชือทีต่ บั และตบั อ่อน โดย MBV พบรำยงำน ในกงุ้ กุลำดำ ส่วน BP พบรำยงำนในกุง้ ขำวแวนนำไม เชอื ทังสองชนิดสำมำรถตรวจสอบได้ด้วยกล้องจุลทรรศน์ แต่ควำมไวของวิธีกำรตรวจไม่เท่ำวิธีกำรตรวจโดยใช้เทคนิค PCR วิธีกำรตรวจที่นำมำใช้เป็น multiplex PCR ซึ่งสำมำรถตรวจสอบทังเชือ MBV และ BP ได้จำกปฏิกิริยำ PCR เดียวกัน โดยปรับมำจำกวิธีกำรของ Surachetpong et al. (2005) และ Bonami et al. (1995) การสกัดสารพันธุกรรม  อวัยวะท่ีใชต้ รวจ: ตบั และตบั ออ่ น (Hepatopancrease), ขีกุ้ง (Feces) o ลูกกุ้ง: สกดั DNA จำกลกู กงุ้ ทังตวั ดว้ ยสำรสกดั DNA เช่น DNAZol® Reagent หรือสำรอน่ื ๆ o กุ้งใหญ:่ สกดั DNA จำกตับหรอื ขีกุง้ ดว้ ยสำรสกัด DNA เช่น DNAZol® Reagent หรือสำรอื่นๆ การท้า PCR: Sequence (53) Products 5- AATCCTAGGCGATCTTACCA-3 MBV 261 bp Primers: 5-CGTTCGTTGATGAACATCTC-3 Primer name 5- TGTAGCAGCAGAGAAGAGA-3 BP 644 bp 5-CACTAAGCCTATCTCCAG-3 401 bp MBV261F 5-CCTCGCTGGAGAAGTCCTAC-3 Internal MBV261R 5-TGGTCCAGACTCGTCGTACTC-3 control BP6581F BP6582R Actin_F Actin_R PCR master mix: PCR components: Volume (µl)/reaction (1x) Final concentration DNA free water 7.50 - 2x Multiplex Master mix 12.50 1x 10 µM Primer MBV261F 0.50 0.2 µM 10 µM Primer MBV261R 0.50 0.2 µM 10 µM Primer BP6581F 0.50 0.2 µM 10 µM Primer BP6582R 0.50 0.2 µM 5 µM Primer Actin_F 0.50 0.1 µM 5 µM Primer Actin_R 0.50 0.1 µM DNA Template 2.00 50-450 ng Total 25.00 - Ref: 25 µl reaction mixture, 200 mM dNTP, 1.5 mM MgCl2, 0.3 µM primers and 2.5 unit Taq polymerase, 0.5 µl 50-450 ng 39

คู่มือการตรวจโรคสตั ว์น้าด้วยเทคนิค PCR-version 1 ศูนยว์ ิจัยสขุ ภาพสตั ว์น้าสงขลา กองวิจัยและพัฒนาสุขภาพสตั วน์ า้ กรมประมง ปี 2561 การเตรียม Primer: - เตรยี ม 10 µM Primer: จำก Stock primer 100 µM 10 µL + 90 µL DEPC-treated water = 10 µM ดงึ ไปใช้ 0.5 µl/25 µl reaction = 0.2 µM final conc. - เตรยี ม 5 µM Primer: จำก Stock primer 100 µM  5 µL + 95 µL DEPC-treated water = 5 µM ดงึ ไปใช้ 0.5 µl/25 µl reaction (0.1 µM final conc.) PCR profile: MBV&BP Cycle No. Temperature Time ( 75 min.) Initial denaturation 1 94oC 3 min. 30 s Denature 94oC 30 s 45 s Annealing 39 60oC 3 min. Extension 72oC Final Extension  1 72oC Holding 15oC Ref. 1 cycle of 95°C for 5 min., 35 cycles of 94°C 30 s, 60°C 30 s, 72°C 30 s, 72°C for 7 min. การแปลผล: รันเจล 1.5% : 261 bp MBV +ve : 644 bp BP +ve : 401 bp Internal control MBV: SURACHETPONG W., POULOS B.T., TANG K.F.J. & LIGHTNER D.V. (2005). Improvement of PCR method for the detection of monodon baculovirus (MBV) in penaeid shrimp. Aquaculture, 249, 69–75. BP: BONAMI J.R., BRUCE L.D., POULOS B.T., MARI J. & LIGHTNER D.V. (1995). Partial characterisation and cloning of the genome of PvSNPV (= BP-type virus) pathogenic for Penaeus vannamei. Dis. Aquat. Org., 23, 59–66. Actin: Jaroenlak P, Sanguanrut P, Williams BAP, Stentiford GD, Flegel TW, Sritunyalucksana K, et al. (2016) A Nested PCR Assay to Avoid False Positive Detection of the Microsporidian Enterocytozoon hepatop0enaei (EHP) in Environmental Samples in Shrimp Farms. PLoS ONE 11(11): e0166320. doi:10.1371/journal.pone.016632. 40

คมู่ อื การตรวจโรคสตั ว์นา้ ด้วยเทคนคิ PCR-version 1 ศูนยว์ จิ ยั สุขภาพสตั วน์ ้าสงขลา กองวจิ ยั และพัฒนาสุขภาพสัตว์นา้ กรมประมง ปี 2561 การตรวจเชอื Shrimp hemocyte iridescent virus (SHIV) ด้วย nested PCR หลกั การ: เชือ Shrimp hemocyte iridescent virus (SHIV) เป็นเชือกลุ่มอิริโดไวรัสพบรำยงำนใน L. vannamei, Fenneropenaeus chinensis และ Macrobrachium rosenbergii มีสำรพันธุกรรมเป็น DNA สำยคู่ (dsDNA) กำรตรวจวินิจฉัยต้องสกัดสำรพันธุกรรมคือ DNA ออกจำกตัวอย่ำง หลังจำกนันนำไปผ่ำนขันตอนกำรเพิ่ม ปริมำณโดยปฏิกิริยำ Polymerase Chain Reaction (PCR) วิธีกำรตรวจวินิจฉัยท่ีใช้คือ nested PCR (Qiu et al., 2017) Clinical symptoms of L. vannamei challenged with the potential iridescent virus compared with thoseof the control group. (a) External appearance of the shrimp. (b) Section of hepatopancreas. การสกดั สารพนั ธุกรรม: o อวยั วะทใ่ี ชต้ รวจ: เลอื ด (Hemolymph), cephalothoraxes o ลูกก้งุ : สกดั DNA จำกลูกกุ้งทงั ตวั ด้วย DNAZol Reagent หรอื สำรสกดั ดเี อน็ เอ o กงุ้ ใหญ:่ สกัด DNA จำก Hemolymp ด้วย DNAZol Reagent หรอื สำรสกัดดีเอ็นเออ่นื ๆ 41

คู่มือการตรวจโรคสัตว์นา้ ด้วยเทคนคิ PCR-version 1 ศูนยว์ จิ ยั สขุ ภาพสตั วน์ า้ สงขลา กองวจิ ัยและพัฒนาสุขภาพสัตว์น้า กรมประมง ปี 2561 การท้า PCR: Sequences (53) First step Product band 5-GGGCGGGAGATGGTGTTAGAT-3 Nested 457 bp Primers: 5-TCGTTTCGGTACGAAGATGTA-3 129 bp Primer name 5- CGGGAAACGATTCGTATTGGG-3 Internal SHIV-F1 5-TTGCTTGATCGGCATCCTTGA-3 control 401 bp SHIV-R1 5- CCTCGCTGGAGAAGTCCTAC-3 SHIV-F2 5- TGGTCCAGACTCGTCGTACTC-3 SHIV-R2 Actin_F Actin_R PCR master mix: First step Volume (µl)/reaction (1x) Final concentration PCR components: WSSV 1ststep 8.50 - 12.50 1x DNA free water 2x PCR Master mix 10 µM Primer SHIV-F1 - 2 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs 1.00 0.4 µM 10 µM Primer SHIV-R1 1.00 0.4 µM 5 µM Primer Actin_F 0.50 0.1 µM 5 µM Primer Actin_R 0.50 0.1 µM DNA Template 1.00 - Total 25.00 - Ref: 25 µl reaction mixture, 200 mM dNTP, 2 mM MgCl2, 0.4 µM primers and 0.625 unit Taq polymerase, 0.5 µl 50-450 ng PCR mastermix: nested PCR components: WSSV nested Volume (µl)/reaction (1x) Final concentration DNA free water 9.50 - 2x PCR Master mix 12.50 1x 10 µM Primer SHIV-F2 1.00 0.4 µM 10 µM Primer SHIV-R2 1.00 0.4 µM 1ststepPCR Product 1.00 - Total 25.00 - Ref: 25 µl reaction mixture, 200 mM dNTP, 2 mM MgCl2, 0.4 µM primers and 0.625 unit Taq polymerase, การเตรยี ม Primer:  เตรยี ม 10 µM ดึงไปใช้ 1.0 µl/25 µl reaction = 0.4 µM final conc.  เตรยี ม 5 µM Primer: จำก Stock primer 100 µM 5 µL + 95 µL DEPC-treated water = 5 µM  ดงึ ไปใช้ 0.5 µl/25 µl reaction (0.1 µM final conc.) 42

คู่มือการตรวจโรคสตั ว์น้าดว้ ยเทคนคิ PCR-version 1 ศนู ยว์ ิจยั สขุ ภาพสตั วน์ า้ สงขลา กองวจิ ัยและพัฒนาสขุ ภาพสัตวน์ า้ กรมประมง ปี 2561 PCR profile: First step SHIV457 Cycle No. Temperature Time (41 min.) Initial denaturation 1 95oC 3 min. Denature 95oC 30 s Annealing 35 59oC 30 s Extension 72oC 30 s Final Extension 1 72oC 2 min. Holding 15oC  Ref. 1 cycle of 95°C 3 min., 35 cycles of 95°C 30 s, 59°C 30 s, 72°C 30 s, 72°C for 2 min. PCR profile: nested SHIV129 Cycle No. Temperature Time (43 min.) Initial denaturation 1 94oC 3 min. Denature 94oC 30 s Annealing 35 59oC 30 s 20 s Extension 72oC 3 min. Final Extension 1 72oC  Holding 15oC Ref. 1 cycle of 95°C 3 min., 35 cycles of 95°C 30 s., 59°C 30 s, 72°C 20 s, 72°C for 2 min. การแปลผล: รนั 1.5 % agarose ge SHIV +ve : 457 bp First step / 129 bp nested PCR Internal control : 500 bp Liang Qiu, Meng-Meng Chen, Xiao-Yuan Wan, Chen Li, Qing-Li Zhang, Ruo-Yu Wang, Dong-Yuan Cheng, Xuan Dong, Bing Yang, Xiu-Hua Wang, Jian-Hai Xiang & Jie Huang. 2017. Characterization of a new member of Iridoviridae, Shrimp hemocyteb iridescent virus (SHIV), found in white leg shrimp (Litopenaeus vannamei). www.nature.com/scientificreports 43

คู่มอื การตรวจโรคสตั ว์นา้ ด้วยเทคนิค PCR-version 1 ศูนยว์ ิจยั สขุ ภาพสตั วน์ ้าสงขลา กองวิจยั และพัฒนาสขุ ภาพสตั วน์ ้า กรมประมง ปี 2561 การตรวจเชือ NHPB ด้วยเทคนคิ PCR หลกั การ: NHPB เป็นเชือก่อโรคในกงุ้ ทะเลทีเ่ กดิ จำกแบคทีเรยี แกรมลบ มีอวัยวะเป้ำหมำยคือตับและตับอ่อน กำร ตรวจต้องสกัดดีเอ็นเอจำกตับหรือขีกุ้งนำมำตรวจเชือ NHPB ด้วยเทคนิค PCR วิธีกำรของ OIE (2017; Aranguren et al., 2010) การสกัดสารพันธกุ รรม  อวยั วะท่ใี ชต้ รวจ: ตบั และตบั อ่อน (Hepatopancrease), ขีกุ้ง (Feces) o ลกู กุ้ง: สกดั DNA จำกลูกกงุ้ ทงั ตวั ด้วยสำรสกดั DNA เช่น DNAZol® Reagentหรอื สำรอ่ืนๆ o กุง้ ใหญ:่ สกัด DNA จำกตบั หรอื ขกี งุ้ ดว้ ยสำรสกดั DNA เชน่ DNAZol® Reagentหรอื สำรอนื่ ๆ การทา้ PCR: Sequence (53) NHPB Products 5-CGTTGGAGGTTCGTCCTTCAGT-3 379 bp Primers: 5-GCCATGAGGACCTGACATCATC-3 Internal Primer name 5-TGCCTTATCAGCTNTCGATTGTAG-3 control 848 bp 5-TTCAGNTTTGCAACCATACTTCCC-3 NHPF2: NHPR2: DP143F DP145R PCR master mix: PCR components: Volume (µl)/reaction (1x) Final concentration Sterile dH2O 8.50 - 2x Master mix 12.50 1x 10 µM NHPF2: 0.50 0.2 µM 10 µM NHPR2: 0.50 0.2 µM 5 µM DP143F 0.50 0.1 µM 5 µM DP145R 0.50 0.1 µM DNA Template 2.00 5-50 ng Total 25.00 - Ref: 25 µl reaction mixture, 200 mM dNTP, 1.5 mM MgCl2, 0.4 µM primers and 0.2 unit Taq polymerase, 0.5 µl 5-50 ng การเตรยี ม Primer: - เตรยี ม 10 µM Primer: จำก Stock primer 100 µM 10 µL + 90 µL DEPC-treated water = 10 µM ดงึ ไปใช้ 0.5 µl/25 µl reaction = 0.2 µM final conc. - เตรยี ม 5 µM Primer: จำก Stock primer 100 µM 5 µL + 95 µL DEPC-treated water = 5 µM  ดงึ ไปใช้ 0.5 µl/25 µl reaction (0.1 µM final conc.) 44

คมู่ อื การตรวจโรคสัตว์น้าดว้ ยเทคนคิ PCR-version 1 ศูนยว์ จิ ยั สขุ ภาพสตั ว์นา้ สงขลา กองวจิ ัยและพัฒนาสุขภาพสัตว์นา้ กรมประมง ปี 2561 PCR profile: NHPB Cycle No. Temperature Time (46 min.) Initial denaturation 1 94oC 3 min. Denature 94oC 30 s Annealing 39 60oC 30 s Extension 72oC 30 s Final Extension 1 60oC 30 s 72oC 3 min. Holding 15oC  Ref. 1 cycle of 95°C 5 min., 35 cycles of 95°C 30 s, 60°C 30 s, 72°C 30 s, 1 cycle of 60°C 30 s, 72°C for 2 min. การแปลผล: รนั 1.5% agarose gel NHPB +ve : 379 bp Internal control : 848 bp Nunan M.L., Pantoja C. & Lightner D.V. (2008). Improvement of a PCR method for the detection of necrotizing hepatopancreatitis in shrimp. Dis. Aquat. Org., 80, 69–73. ARANGUREN L.F., TANG K.F. & LIGHTNER D.V. (2010). Quantification of the bacterial agent of necrotizing hepatopancreatitis (NHP-B) by real-time PCR and comparison of survival and NHP load of two shrimp populations. Aquaculture, 307, 187–192 45

คู่มือการตรวจโรคสัตว์นา้ ด้วยเทคนิค PCR-version 1 ศนู ยว์ จิ ัยสขุ ภาพสตั วน์ า้ สงขลา กองวิจัยและพัฒนาสุขภาพสัตวน์ ้า กรมประมง ปี 2561 การตรวจเชอื อริ ิโดไวรัส (Red Seabream Iridovirus; RSIV) ด้วยเทคนคิ PCR หลักการ: อิริโดไวรัส (Iridovirus) เป็นเชือท่ีมีสำรพันธุกรรมเป็น ssDNA ชนิดท่ีก่อโรคในปลำท่ีอยู่ในบัญชีรำยช่ือ ของคือ Red seabream iridovirus (RSIV) จัดอยู่ในกลุ่ม Megalocytivirus นอกจำก RSIV แล้วยังมีเชืออิริโด ไวรัสอีกชนิดหนึ่งท่ีก่อโรคเช่นเดียวกับ RSIV น่ันคือ Infectious spleen and kidney necrosis virus (ISKNV) วิธีกำรตรวจเป็นวิธี PCR ของ Kurata et al. (1998) ที่แนะนำโดย OIE (2017) และใช้ internal control 2 คขู่ ึนอยู่กับชนดิ ปลำ การสกัดสารพันธกุ รรม  อวัยวะท่ีใชต้ รวจ: มำ้ ม (Spleen) , เหงือก (Gill) o สกดั DNA จำกตัวอย่ำงด้วย DNAZol® Reagent หรอื สำรสกัดดีเอน็ เออื่นๆ การท้า PCR Sequence (53) Single step Products 570 bp Primers: 5-CTCAAACACTCTGGCTCATC-3 Internal 146 bp* Primer name 5-GCACCAACACATCTCCTATC-3 control 157 bp* 5-CCCATCTACGAGGGCTAT-3 Internal Irido570 1-F 5-ATGTCACGCACGATTTCC-3 control Irido570 1-R 5-CTTCACCACCACAGCCGAGA-3 ß-actin 1F 5-TGCCGATGGTGATGACCTGT-3 ß-actin 1R Lcal-qActinF Lcal-qActinR PCR reaction: PCR components Volume (µl)/reaction Final concentration DNA free water 8.50 - 2x PCR Master mix 12.50 1x 10 µM Primer Irido570 1-F 0.50 0.2 µM 10 µM Primer Irido570 1-R 0.50 0.2 µM 5 µM Primer ß-actin 1F 0.50 0.1 µM 5 µM Primer ß-actin 1R 0.50 0.1 µM DNA Template 2.00 Total 25.00 Ref: 25 µl reaction mixture, 200 mM dNTP, 2 mM MgCl2, 1 µM primers and 1.25 unit Taq polymerase, *Internal control ที่ใชข้ ึ้นกบั ชนดิ ปลา 46

คมู่ ือการตรวจโรคสัตว์นา้ ดว้ ยเทคนิค PCR-version 1 ศูนยว์ จิ ัยสุขภาพสัตวน์ ้าสงขลา กองวิจัยและพัฒนาสุขภาพสตั วน์ า้ กรมประมง ปี 2561 การเตรยี ม Primer: - เตรยี ม 10 µM Primer: จำก Stock primer 100 µM 10 µL + 90 µL DEPC-treated water = 10 µM ดึงไปใช้ 0.5 µl/25 µl reaction = 0.2 µM final conc. - เตรียม 5µM Primer: จำก Stock primer 100 µM 5 µL + 95 µL DEPC-treated water = 5 µM ดึงไปใช้ 0.5 µl/25 µl reaction (0.1 µM final conc.) PCR profile: Irido570 Cycle No. Temperature Time (75 min.) Initial denaturation 1 94oC 3 min. Denature 94oC 30 s 30 s Annealing 39 58oC 45 s Extension 72oC 3 min. Final Extension 1 72oC  Holding 15oC Ref. 1 cycle of 94°C 5 min., 30 cycles of 94°C 30 s, 58°C 60 s, 72°C 60 s, 1 cycle 72°C for 5 min. การแปลผล: รนั 1.5% agarose gel RSIV +ve : 570 bp Internal control : 146 bp ปลำกะรงั : 157 bp ปลำกระพงขำว KURITA J., NAKAJIMA K., HIRONO I. & AOKI T. (1998). Polymerase chain reaction (PCR) amplification of DNA of red sea bream iridovirus (RSIV) Fish Pathol., 33, 17–23. 47