โครงงานแพทย์วิจัย-สมบูรณ์-

โครงงานวทิ ยาศาสตร์ เรือ่ ง สารสกดั สมุนไพรรกั ษาโรคกลาก The herbal medicine of Ringworm โดย นายอะซาน จนิ เดหวา นายวชิรวิทย์ ชานาญวงศ์ นางสาวชเนตตี แสงเรอื ง โรงเรียนมหาวชริ าวุธ จงั หวัดสงขลา สานกั งานเขตพ้นื ทกี่ ารศึกษามัธยมศกึ ษาสงขลาเขต 16

โครงงานวทิ ยาศาสตร์ เรอื่ ง สารสกดั สมุนไพรรกั ษาโรคกลาก The herbal medicine of Ringworm โดย นายอะซาน จินเดหวา นายวชิรวิทย์ ชานาญวงศ์ นางสาวชเนตตี แสงเรอื ง คุณครูท่ีปรกึ ษา 1.คณุ ครสู วุ รรณนติ ย์ นิสัยม่ัน 2.คุณครยู ศวดี ศศิธร 3.คณุ ครูสมศักด์ิ คงสกุล โรงเรียนมหาวชิราวธุ จงั หวัดสงขลา สานกั งานเขตพน้ื ท่ีการศึกษามธั ยมศกึ ษาสงขลาเขต 16



ก ชอ่ื โครงงาน สารสกัดจากพืชสมุนไพรรักษาโรคกลาก The herbal medicine of Ringworm สาขา วิทยาศาสตรช์ ีวภาพ ชื่อนักเรยี น 1.นายอะซาน จนิ เดหวา 2.นายวชิรวิทย์ ชานาญวงศ์ 3.นางสาวชเนตตี แสงเรือง อาจารยท์ ีป่ รกึ ษา 1.คุณครูสวุ รรณนิตย์ นสิ ัยมัน่ 2.คุณครูยศวดี ศศธิ ร 3.คณุ ครูสมศกั ดิ์ คงสกุล ชื่อโรงเรยี น โรงเรยี น มหาวชิราวธุ จังหวดั สงขลา สถานทีต่ ดิ ต่อ เลขที่ 19 ถนนราชดาเนนิ ตาบลบอ่ ยาง อาเภอเมือง จงั หวัดสงขลา รหัสไปรษณีย์ 90000 โทรศพั ท์ 0-7431-1006 โทรสาร 0-7432-6107 ระยะเวลาในการทาโครงงาน 1 กรกฏาคม – 28 ธันวาคม 2563 บทคดั ยอ่ โครงงานวิทยาศาสตร์เร่ืองสารสกัดสมุนไพรรักษาโรคกลาก จัดทาข้ึนโดยมีวัตถุประสงค์เพื่อ ศึกษาประสิทธิภาพของสารสกัดจากพืชสมุนไพรในตัวทาละลายต่างชนิดกันท่ีสามารถยับย้ังเช้ือรา กอ่ โรค เพ่ือศึกษาค่าความเข้มข้นต่าสุดของสารสกัดสมุนไพรท่ีสามารถยับย้ังและฆ่าเชื้อรา เพ่ือศึกษา ประสทิ ธภิ าพสารผสมสารสกดั จากสมุนไพรและเจลจากสารสกัดสมุนไพรท่ีมีความสามรถในการยับยั้ง เช้ือราด้วยวิธี agar well diffusion ผลการทดลองสรุปได้ว่า สารสกัดจากพืชสมุนไพรของผลมะคาดีควาย ใบชุมเห็ดเทศและ ใบทองพันช่ัง ในตัวทาละลายเอทานอลความเข้มข้น 95 %v/v สามารถยับยั้งการเจริญเติบโต ของเชื้อราได้ดีที่สุด โดยความเข้มข้นต่าสุดท่ีสามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเช้ือราได้ (MIC) คอื ความเข้มขน้ สารสกัดจากใบชุมเหด็ เทศ 0.25 ใบทองพันชั่ง 0.5 และผลมะคาดีควาย 0.125 g/ml ตามลาดับ แต่ค่าความเข้มข้นของสารสกัดสมุนไพรท่ีสามารถฆ่าเชื้อราได้ (MFC) คือความเข้มข้น สารสกัดจากใบชุมเห็ดเทศ 0.25 ใบทองพันชั่ง 1 และผลมะคาดีควาย 0.125 g/ml ตามลาดับ เมื่อนาสารสกัดสมุนไพรมาผสมกันและทาการวัดขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางโซนยับย้ัง พบว่าสารผสม สารสกัดจากพืชท้ัง 3 ชนิดสามารถยับย้ังการเจริญเติบโตของเช้ือราได้ดีที่สุด และการนาเจลจากสาร สกัดสมุนไพรมาเปรียบเทียบกับยา Clotrimazole Cream พบว่าเจลจากสารสกัดสมุนไพรมีขนาด เส้นผ่านศูนยก์ ลางโซนยบั ยัง้ ที่มากกวา่ ยา Clotrimazole Cream

ข กติ ติกรรมประกาศ โครงงานเรื่องนี้ประกอบด้วย การดาเนินงานหลายข้ันตอนประกอบไปด้วยการหาข้อมูล การวิเคราะห์ ผลการทดลอง การจัดทารูปเล่ม จนกระท่ังโครงงานนี้สาเร็จลุล่วงไปด้วยดีตลอด ระยะเวลาดังกล่าว ทางคณะผู้จัดทาได้รับคาแนะนาต่างๆ ตลอดจนกาลังใจจากบุคคลหลายๆท่าน ซง่ึ ผจู้ ดั ทาไดต้ ระหนกั และซาบซ้ึงในความกรุณาจากทุกๆ ท่านเป็นอย่างยิ่ง จึงถือโอกาสนี้ ขอขอบคุณ ด้วยใจจรงิ ตอ่ ทกุ ท่านดงั น้ี ขอขอบคุณ คุณครูสุวรรณนิตย์ นิสัยม่ัน คุณครูผู้ให้คาปรึกษาด้านการทาโครงงาน แนวทาง ในการตรวจสอบผลการทดลองของโครงงานตลอดจนคาเเนะนาด้านวิชาการเเละเทคนิคต่างๆ ทเ่ี กย่ี วข้องกบั การทาโครงงาน ขอขอบคุณ คณุ ครยู ศวดี ศศิธร คุณครทู ปี่ รึกษาโครงงานโรงเรียนมหาวชิราวุธ จังหวัดสงขลา ผ้ใู หค้ าแนะนาด้านวิชาการและเทคนคิ การจดั ทารปู เล่มโครงงาน ขอขอบคุณ คุณครูสมศักดิ์ คงสกุล คุณครูผู้ให้คาปรึกษาเกี่ยวกับพืชสมุนไพรในท้องถิ่น ตลอดจนเเนวทางในการศกึ ษาคน้ ควา้ ขอ้ มูลท่เี ก่ียวขอ้ งกบั การทาโครงงาน ขอขอบคุณ เจ้าหน้าที่ห้องปฏิบัติการโรงเรียนมหาวชิราวุธ จังหวัดสงขลา ผู้ให้คาแนะนา ตลอดจนความชว่ ยเหลือในการทดลองต่างๆ ท้ายทส่ี ุดน้ีขอขอบคณุ คุณพ่อและคุณแมผ่ ู้ใหก้ าลงั ใจและโอกาสในการศกึ ษา คณะผูจ้ ดั ทา

สารบญั ค บทคัดย่อ หนา้ กติ ติกรรมประกาศ ก สารบัญ ข สารบัญตาราง ค สารบญั รูปภาพ ง จ บทที่ 1 บทนา ที่มาและความสาคัญ 1 วตั ถุประสงค์ของโครงงาน 1 สมมติฐาน 1 ขอบเขตของโครงงาน 1 ตวั แปรที่ศึกษา 2 นยิ ามศัพท์เชิงปฏบิ ัตกิ าร 2 ประโยชน์ทไ่ี ด้รับ 4 4 บทท่ี 2 เอกสารและงานวิจัยท่ีเกี่ยวข้อง 5 บทที่ 3 วธิ ีดาเนนิ การทดลอง 12 บทท่ี 4 ผลการทดลอง 16 บทที่ 5 สรุปผล อภิปรายผล เเละข้อเสนอเเนะ 19 บรรณานุกรม 21 ภาคผนวก 22

ง สารบญั ตาราง หนา้ 15 ตารางที่ 1 ปฏทิ ินปฏบิ ัตงิ าน 16 ตารางที่ 2 แสดงพื้นท่โี ซนยับยั้งเชอ้ื ราของสารสกดั จากสมุนไพร 17 ในตวั ทาละลายต่างชนิดกันด้วยวิธี agar well diffusion 17 ตารางท่ี 3 แสดงคา่ ความเข้มข้นต่าสุดของสารสกดั จากสมุนไพร 17 ในตวั ทาละลายทีเ่ หมาะสม สามารถยับยงั้ การเจริญเติบโตของเช้ือรา 18 ( Minimal Inhibitory Concentration : MIC ) ตารางท่ี 4 แสดงค่าความเขม้ ข้นต่าสดุ ของสารสกัดจากสมุนไพร ในตวั ทาละลายท่เี หมาะสม สามารถฆา่ เชื้อราก่อโรค ( Minimal Fungicidal Concentration : MFC ) ตารางที่ 5 แสดงเสน้ ผ่านศนู ย์กลางโซนยับย้ังเช้ือราของสารผสมสารสกดั จากสมนุ ไพร ดว้ ยวธิ ี agar well diffusion ตารางท่ี 6 แสดงเสน้ ผา่ นศูนย์กลางโซนยบั ย้ังเชือ้ ราของเจลสารสกดั จากสมนุ ไพร กบั ยา Clotrimazole Cream

สารบญั รปู ภาพ จ ภาพท่ี 1 อาหารเลย้ี งเช้ือ หน้า ภาพท่ี 2 การเพาะเชือ้ 5 ภาพที่ 3 การทา agar well diffusion 6 ภาพท่ี 4 การหาค่า MIC และMFC 7 ภาพที่ 5 ใบชมุ เห็ดเทศ 7 ภาพที่ 6 สาร Rhein 8 ภาพที่ 7 ใบทองพนั ชง่ั 8 ภาพที่ 8 Rhinacanthin a,b,c 8 ภาพท่ี 9 ผลมะคาดีควาย 8 ภาพที่ 10 Saponin 9 ภาพท่ี 11 โรคกลาก 9 ภาพท่ี 12 สารสกดั จากสมุนไพร 9 ภาพที่ 13 การระเหยตัวทาละลาย 10 ภาพที่ 14 เจลแอลกอฮอล์ 10 11

1 บทที่ 1 บทนา 1.1 ที่มาและความสาคญั เน่ืองจากในปัจจุบันผู้คนเร่ิมหันมาให้ความสนใจยาที่สกัดจากพืชสมุนไพรแทนยา Clotrimazole cream มากขึ้นเพราะสารสกัดสมุนไพรเป็นสารที่สกัดจากธรรมชาติทาให้มี ความปลอดภัยสูง ไม่ส่งผลเสียหรือเป็นสารตกค้างต่อร่างกาย ซึ่งในประเทศไทยน้ันมีสมุนไพร จานวนมากท่มี สี รรพคุณในการรักษา ทางคณะผูจ้ ัดทาสนใจศึกษาเช้ือราชนิด Microsporum gypseum ซ่ึงเป็นเชื้อราท่ีพบได้ง่าย ในกลุ่มคนที่อาศัยอยู่ในแถบภูมิอากาศร้อนชื้น ซ่ึงเป็นท่ีตั้งของประเทศไทย ที่ก่อให้เกิดโรคกลากใน คน โดยทางคณะผู้จัดทาได้ทาการศึกษาตัวอย่างชนิดของสมุนไพรทั้ง 3 ชนิดได้แก่ ใบทองพันช่ัง ผลมะคาดีควาย และใบชุมเห็ดเทศ ซ่ึงท้ัง 3 ชนิด มีสรรพคุณช่วยรักษาโรคกลาก และสามารถพบ ไดง้ ่ายในท้องถนิ่ 1.2 วัตถุประสงค์ 1.2.1 เพอ่ื ศกึ ษาประสิทธิภาพของสารสกัดพืชสมุนไพรในตัวทาละลายต่างชนิดกันท่ีสามารถ ยบั ย้ังเชอื้ ราก่อโรคดว้ ยวิธี agar well diffusion 1.2.2 เพื่อศึกษาค่าความเขม้ ข้นตา่ สุดของสารสกดั พชื สมุนไพรทสี่ ามารถยบั ย้งั การเจรญิ ของ เช้ือรากอ่ โรค ( Minimum Inhibitory Concentration : MIC ) 1.2.3 เพ่ือศกึ ษาค่าความเข้มข้นตา่ สุดของสารสกัดพืชสมุนไพรท่มี ีความสามารถในการฆา่ เชอ้ื ราก่อโรค ( Minimum Fungicidal Concentration : MFC ) 1.2.4 เพอื่ ศกึ ษาสารผสมสารสกัดจากพืชสมุนไพรที่มีผลต่อการยับย้ังการเจริญของเช้ือราก่อ โรคด้วยวธิ ี agar well diffusion 1.2.5 เพื่อศึกษาประสิทธิภาพของสารสกัดสมนุ ไพรชนิดเจลทมี่ ีความสามรถในการยบั ยั้ง เช้ือรากอ่ โรคโดยวธิ ี agar diffusion 1.3 สมมตฐิ าน 1.3.1 ใบทองพันช่ัง ผลมะคาดีควาย และใบชุมเห็ดเทศ ในตัวทาละลายเอทานอล ความเข้มข้น 95 %v/v น่าจะสามารถยับยง้ั การเจรญิ เติบโตของเชอ้ื ราได้ดที ี่สุด 1.3.2 ค่าความเขม้ ขน้ ตา่ สดุ ทสี่ ามารถยบั ยง้ั การเจริญของเชอ้ื ราในสารสกัดใบทองพันชั่ง ผลมะคาดีควายและใบชมุ เหด็ เทศคอื 0.125 g/ml 1.3.3 คา่ ความเขม้ ขน้ ต่าสุด ทสี่ ามารถฆ่าเชอ้ื ราของสารสกัดใบทองพันชง่ั ผลมะคาดีควาย และใบชมุ เหด็ คอื 0.125 g/ml 1.3.4 สารผสมสมุนไพรท่ีมีส่วนผสมจากสารสกัดของทองพันชั่ง ผลมะคาดีควาย และ ใบชุมเห็ดเทศ ท้ังสามชนิดน่าจะมีประสิทธิภาพในการยับยั้งการเจริญเติบโตของเช้ือราก่อโรคกลาก ไดด้ ที ่ีสุด 1.3.5 เจลจากสารผสมพชื สมนุ ไพรนา่ จะมีประสทิ ธภิ าพในการยบั ยั้งเชอ้ื ราไดด้ ีกวา่ ยา Clotrimazole cream

2 1.4 ขอบเขตการศึกษา 1.4.1 ศึกษาประสิทธภิ าพของสารสกัดจากพชื สมนุ ไพรในตวั ทาละลายต่างชนิดกัน ท่ีสามารถ ยบั ยง้ั เชอ้ื ราก่อโรคด้วยวธิ ี agar well diffusion 1.4.2 ศึกษาคา่ ความเขม้ ข้นต่าสดุ ของสารสกัดสมุนไพร ทส่ี ามารถยับย้งั การเจริญของเชือ้ รา ก่อโรค ( Minimum Inhibitory Concentration : MIC ) 1.4.3 ศกึ ษาคา่ ความเขม้ ข้นตา่ สุดของสารสกัดสมุนไพร ทม่ี ีความสามารถในการฆา่ เช้ือรา ก่อโรค ( Minimum Fungicidal Concentration : MFC ) 1.4.4 ศึกษาสารผสมสารสกัดจากสมุนไพร ที่มีผลต่อการยับยั้งการเจริญของเชื้อราก่อโรค ด้วยวิธี agar well diffusion 1.4.5 ศกึ ษาประสิทธิภาพของสารสกัดสมนุ ไพรชนดิ เจล ทีม่ คี วามสามารถในการยับยั้งเชื้อรา กอ่ โรคโดยวธิ ี agar well diffusion 1.5 ตวั แปรที่ศกึ ษา 1.5.1 การทดลองที่ 1 การศึกษาประสิทธิภาพของสารสกัดจากพืชสมุนไพรในตัวทาละลาย ตา่ งชนดิ กนั ทสี่ ามารถยับยั้งเชื้อรากอ่ โรคดว้ ยวธิ ี agar well diffusion ตวั แปรต้น สารสกัดสมุนไพรแตล่ ะชนิด ( ใบทองพันชั่ง,ผลมะคาดีควาย, ใบชุมเห็ดเทศ) ในตัวทาละลายทใ่ี ช้ (นา้ กล่นั ,เอทานอล 75 ,85, 95 %v/v) ตัวแปรตาม ขนาดเส้นผ่านศูนยก์ ลางโซนยับยัง้ (inhibition zone) ตัวแปรควบคมุ ปรมิ าณตัวทาละลาย ความชืน้ จานวนเช้อื ราตั้งต้น ปรมิ าณ สมนุ ไพร ระยะเวลาในการเพาะเช้ือรา อุณหภูมทิ ่ีใชใ้ นการบม่ เชอื้ รา ความเข้มข้นของสารสกดั สมุนไพร ปริมาณสารทห่ี ยดลง ในหลุม ขนาดหลุม 1.5.2 การทดลองที่ 2 การศึกษาคา่ ความเขม้ ข้นตา่ สุดของสารสกัดสมนุ ไพรทีส่ ามารถยบั ย้ัง การเจริญของเช้ือราก่อโรค ( Minimum Inhibitory Concentration : MIC ) ตัวแปรตน้ ชนิดสารสกัดสมุนไพรในตวั ทาละลายทเี่ หมาะสม ( ความเขม้ ขน้ 1, 0.5, 0.25, 0.125, g/ml ) ตวั แปรตาม ความเข้มขน้ ตา่ สดุ ของสารสกดั สมุนไพรทย่ี บั ยงั้ การเจรญิ ของเชือ้ รา ตัวแปรควบคมุ ชนิดสารสกดั สมนุ ไพร ความชน้ื จานวนเชอื้ ราตัง้ ตน้ ระยะเวลาใน การเพาะเชอ้ื รา ปริมาตรสารสกดั สมนุ ไพร ปรมิ าตรทใี่ ชใ้ นการหยด ลงในหลมุ อณุ หภูมิทีใ่ ชใ้ นการบม่ เช้อื รา

3 1.5.3 การทดลองที่ 3 การศกึ ษาค่าความเขม้ ขน้ ต่าสดุ ของสารสกัดสมุนไพรท่ีมี ความสามารถในการฆา่ เช้ือราก่อโรค ( Minimum Fungicidal Concentration : MFC ) ตัวแปรตน้ ความเขม้ ข้นตา่ สุดของสารสกดั สมุนไพรอยา่ งน้อย 2 ความเข้มข้น ทย่ี ับยั้งการเจริญของเชื้อรา ตวั แปรตาม ความเข้มขน้ ตา่ สดุ ของสารสกัดสมนุ ไพรท่ยี ับยัง้ ไมใ่ ห้เกิดเชื้อรา ตวั แปรควบคมุ ความชนื้ จานวนเชอ้ื ราตัง้ ตน้ ระยะเวลาในการเพาะเช้อื รา ปริมาตรที่ใชใ้ นการหยดลงในหลมุ อณุ หภูมทิ ่ใี ชใ้ นการบม่ เช้ือรา 1.5.4 การทดลองท่ี 4 การศึกษาสารผสมสารสกัดจากพืชสมุนไพร ท่ีมีผลต่อการยับยั้งการ เจรญิ ของเชื้อรากอ่ โรคด้วยวธิ ี agar well diffusion ตัวแปรต้น สารผสมสารสกดั จากพชื สมนุ ไพร ( ใบทองพนั ชั่งผสมใบชุมเหด็ เทศ, ใบทองพันชั่งผสมผลมะคาดีควาย , ผลมะคาดคี วายผสม ใบชุมเหด็ เทศ,ใบทองพันชง่ั ผสมใบชมุ เหด็ เทศผสมผลมะคาดคี วาย) ตวั แปรตาม ขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางโซนยับยั้ง (inhibition zone) ตัวแปรควบคุม ความชน้ื จานวนเชอื้ ราตัง้ ตน้ ระยะเวลาในการเพาะเช้ือรา ปรมิ าตรสารผสมสารสกดั สมุนไพร ปริมาตรทใ่ี ช้ในการหยดลง ในหลุม อุณหภูมิทีใ่ ช้ในการบม่ เช้ือรา อตั ราสว่ นของสารผสม สมุนไพร 1.5.5 การทดลองท่ี 5 การศึกษาประสิทธิภาพของสารสกัดสมุนไพรชนิดเจล ที่มี ความสามารถในการยับยั้งเชื้อรากอ่ โรคด้วยวธิ ี agar well diffusion ตวั แปรตน้ สารผสมสารสกัดพืชสมนุ ไพรชนิดเจล ตวั แปรตาม ขนาดเสน้ ผา่ นศูนย์กลางโซนยบั ยัง้ (inhibition zone) ตวั แปรควบคมุ ความช้นื จานวนเชอื้ ราตัง้ ต้น ระยะเวลาในการเพาะเชอื้ รา ปริมาตรสารผสมสารสกดั สมุนไพร อุณหภูมทิ ใ่ี ช้ในการบม่ เชอ้ื รา อัตราส่วนของสารผสมสมุนไพร ปรมิ าตรทใ่ี ช้ในการหยดลงในหลมุ 1.6 นยิ ามเชิงปฏิบตั กิ าร 1.6.1 เช้ือรา จุลินทรีย์ในกลุ่มฟังไจ (fungi) ราเจริญได้ในภาวะที่มีอากาศเท่าน้ัน (obligate arobe) จึงพบการเจริญของราบริเวณผิวหน้าของอาหาร ราเป็นสาเหตุสาคัญ ท่ีทาให้ อาหารเส่ือมเสีย (microbial spoilage) แต่ในอุตสาหกรรมอาหารก็นารามาใช้ประโยชน์เพ่ือการหมัก (fermentation) เช่น ซอี ิว้ (fermented soy sauce) เตา้ เจ้ียว มโิ ซะ เนยแข็ง เปน็ ต้น 1.6.2 น้ากลั่น คอื น้าที่ได้จากการควบแนน่ ด้วยเครอื่ งกลนั่ น้า 1.6.3 เอทานอล เปน็ แอลกอฮอล์บริสุทธิ์ 95% ใช้สาหรับทาความสะอาดฆ่าเชื้อโดยไมเ่ ปน็ พษิ ต่อรา่ งกาย สามารถนามาเช็ด ถู หรือฉีด บนรา่ งกายไดอ้ ย่างปลอดภยั 1.6.4 water bath คือ อา่ งนา้ ท่ีใช้สาหรบั ควบคุมอณุ หภูมขิ องสารละลายในอ่างซงึ่ มีหนา้ ท่ี ทาให้อุณหภูมิสารคงที่ ณ อุณหภูมิใดอุณหภูมิหนึ่ง และจะมีตัวเลขแสดงอุณหภูมิตลอดเวลา ซึ่งของเหลวท่ีใส่ในอ่างมีหลากหลายชนิด เช่น น้า น้ามัน หรือของเหลวอื่นๆ ข้ึนอยู่กับอุณหภูมิ การใชง้ าน โดยท่ัวไปมกั พบมากในหอ้ งปฏิบัติการทางเคมแี ละทางชีวภาพ รวมถงึ อุตสาหกรรมต่างๆ

4 1.6.5 Autoclave เป็นเครื่องมือที่ใช้สาหรับนึ่งฆ่าเช้ือ โดยใช้ไอน้าร้อนและแรงดันสูง ทาให้ ของที่ผ่านการนึ่งแล้วอยู่ในสภาพปราศจากเชื้อ จึงมักใช้เคร่ืองนี้ในการน่ึงฆ่าเช้ือของเสียทางชีวภาพ เพอ่ื กาจดั และปอ้ งกนั การปนเป้อื น 1.7 ประโยชนท่ไี ดร้ ับ 1.7.1 สามารถสกดั สารทใี่ ช้ในการรกั ษาโรคกลากจากพืชสมนุ ไพรออกมาได้ 1.7.2 สารสกัดจากพืชสมุนไพรมีประสทิ ธภิ าพในการยับย้ังการเจรญิ เตบิ โตของเชื้อรา 1.7.3 สามารถผลิตเจลจากสารสกัดสมุนไพรรักษาโรคกลากได้ 1.7.4 สามารถใช้กระบวนการทางวิทยาศาสตรใ์ นการนาสมนุ ไพรไทยมาใชใ้ หเ้ กดิ ประโยชน์ 1.7.5 ประชาชนสามารถเข้าถึงการรักษาได้ง่าย ประหยัด และปลอดภัย โดยไร้สารเคมี ตกค้างในร่างกาย

5 บทที่ 2 เอกสารและงานวจิ ัยทเี่ ก่ียวขอ้ ง ในการศึกษาครัง้ น้ี คณะผู้จดั ทาได้ศกึ ษาเอกสารและงานวิจยั ทเี่ กี่ยวข้องดังนี้ 1. ความรเู้ กย่ี วกับอาหารเลยี้ งเชอื้ 2. ความรเู้ กีย่ วกับการเพาะเชื้อรา 3. ความรเู้ กี่ยวกบั วธิ ี agar well diffusion 4. ความรู้เกี่ยวกับคา่ MIC และ MFC 5. ความรู้เกย่ี วกบั สมุนไพร 6. ความรู้เกี่ยวกบั โรคกลาก 7. ความรู้เก่ยี วกบั การสกัดสารในพชื 8. ความรเู้ ก่ยี วกับการระเหยตัวทาละลาย 9. ความรู้เก่ียวกบั การทาเจล 2.1 ความรูเ้ กีย่ วกับอาหารเล้ียงเช้อื ปัจจุบันการเพาะเลี้ยงเชื้อรา ส่วนใหญ่จะเพาะเลี้ยงในอาหาร PDA (Potato Dextrose Agar) ซึ่งมสี ่วนประกอบท่ีสาคัญคือ มันฝรั่ง น้าตาล Dextrose และวุ้น เม่ือนาเช้ือรามาเลี้ยงใน PDA พบว่ามีการเจริญของเส้นใยได้ดี แต่เนื่องจากมันฝร่ัง มีราคาค่อนข้างสูง จึงได้มีการทดลองปรับปรุง สูตรอาหารเลี้ยงเชื้อ โดยนาเมล็ดธัญพืชมาใช้ในการทาอาหารเลี้ยงเช้ือ ในงานวิจัยจะเลือกใช้ ถวั่ เหลืองมาเป็นวตั ถดุ ิบแทนมนั ฝร่งั ในการทาอาหารเลี้ยงเชื้อรา เพราะในถ่ัวเหลืองมีสารอาหารคล้าย กบั ในมนั ฝรั่ง นอกจากน้ียงั พบวา่ ถว่ั เหลอื งเพาะปลูกได้ง่ายและราคาถูกกว่ามันฝร่ัง ภาพที่ 1 อาหารเล้ยี งเชื้อ ทมี่ า : shorturl.at/mwCSW

6 2.2 ความรู้เก่ยี วกับการเพาะเชื้อรา การขีดเช้ือในจานเพาะเชื้อ (Streak plate) และการทาให้เชื้อกระจายในจานเพาะเช้ือ (Spread plate) เป็นการแยกเชื้อให้บริสุทธ์ิ ซ่ึงเป็นเทคนิคพื้นฐานทางจุลชีววิทยา ที่มีความสาคัญ อย่างมาก เน่ืองจากส่ิงแวดล้อมต่างๆ เช่น น้า อากาศ พื้นห้องเรียนหรือแม้แต่ร่างกายของคนก็มี เชอ้ื จลุ ินทรียอ์ ยูห่ ลายชนิด ทอ่ี าจปนเป้อื นในหลอดเพาะเชอื้ ได้ หลกั การของการแยกเช้ือให้บริสุทธ์ิบน อาหารเลี้ยงเชื้อ (Culture medium) คือ จะต้องแยกเชื้อให้ได้โคโลนีเดี่ยวๆ (Single colony) จานวนมาก จากนั้นจึงนาเชื้อท่ีเป็นโคโลนีเด่ียวไปศึกษารูปร่างลักษณะและคุณสมบัติต่างๆ เพื่อให้ ทราบว่าเป็นเชื้อชนิดใด เทคนิคที่นิยมใช้ในการแยกเชื้อบริสุทธ์ิ คือ วิธี cross streak plate ซ่ึงทาได้โดยใช้ห่วง เขี่ยเชือ้ (Loop) แตะตัวอย่างหรอื สิง่ สง่ ตรวจแลว้ ลากหรอื ขดี (Streak) ลงบนจานเพาะเชื้อ ท่ีมีอาหาร แข็ง (Agar plate) อยู่ให้ได้แนวระนาบติดต่อกัน 4-5 เส้น หลังจากเสร็จในระนาบแรก ซึ่งมี เชื้อจุลินทรีย์อยู่หนาแน่นท่ีสุด ให้นาห่วงเขี่ยเช้ือมาเผาไฟให้ลวดท่ีปลายร้อนแดง เพื่อฆ่าเช้ือท่ีติด ใหห้ มด จากนั้นจงึ ขีดเชื้อจากส่วนของรอยลากในระนาบแรกออกมาเพียง 1 ครั้ง แล้วลากเป็นระนาบ ท่ีสอง 4-5 เส้นติดกันโดยรอยขีดของเช้ือจะไม่ทับกับระนาบแรกอีก หลังจากนั้นก็ทาเช่นเดียวกันกับ ระนาบที่สองจนครบท่ัวทง้ั จานเพาะเช้ือซึ่งมีประมาณ 4 ระนาบ เมื่อได้เชื้อบริสุทธิ์แล้วจะมีการศึกษา เช้ือต่อไปในด้านต่างๆ ซึ่งจะต้องมีการถ่ายเช้ือจากอาหารเดิมไปยังอาหารใหม่ หรือมีการเพาะเช้ือลง ในอาหารเพอ่ื การทดสอบและการวิเคราะห์ต่างๆ ดังน้ันการเรียนรู้เทคนิคที่ถูกต้องในการถ่ายเช้ือจึงมี ความสาคญั เป็นอยา่ งยง่ิ ซง่ึ ต้องอาศัยหลักการของ aseptic technique เพ่ือป้องกันการปนเปื้อนของ เชื้อชนิดอ่ืนซึ่งจะทาให้ผลการทดลองผิดพลาดได้ อุปกรณ์พื้นฐานที่ใช้ในการถ่ายเช้ือคือ ห่วงเข่ียเช้ือ (Loop) เข็มเข่ียเชื้อ (Needle) และตะเกียงแอลกอฮอล์สาหรับใช้ฆ่าเช้ือโดยการเผา (Incineration) การถา่ ยเชื้อจุลนิ ทรยี พ์ วกแบคทีเรียและยีสต์จะใช้ห่วงเขี่ยเช้ือเป็นส่วนใหญ่ มีบางคร้ังท่ีใช้เข็มเข่ียเช้ือ ปลายตรง สว่ นเช้ือราทเี่ ป็นเสน้ สาย (filamentous fungi) มักจะใชเ้ ขม็ เขี่ยปลายงอ ภาพที่ 2 การเพาะเชือ้ ทมี่ า : shorturl.at/bnGMZ

7 2.3 ความรู้เก่ียวกับวิธี agar well diffusion เป็นการทดสอบความสามารถในการยับย้ังแบคทีเรียหรือเชื้อราของสารสกัดในแต่ละชนิด ทาได้โดยการนาจานอาหารท่ีเล้ียงเชื้อไว้ให้แข็งมาเจาะหลุมวุ้นด้วย cock borer ขนาดเส้นผ่าน ศูนย์กลางประมาน 6-8 mm ห่างกันประมาณหลุมละ 3 cm เติมสารสกัดลงไปในหลุมละ 80-100 µl นาไปบ่มที่อุณหภูมิเหมาะสมกับเช้ืออินดิเคเตอร์ เป็นเวลา 18-24 ช่ัวโมง วัดเส้นผ่าน ศนู ยก์ ลางยับย้ังทเ่ี กิดขึ้น การอา่ นผล จะทาการวัดขอบวงใสท่ีเกิดขึ้นโดยใช้ Vernia caliper วัด 2 แนวต้ังฉากกันจาก ขอบโคโลนีของเชื้อที่สร้างสารยับยั้ง ไปยังริมขอบวงใสท่ีเช้ือเติบโตได้ แล้วนามาลบด้วยความกว้าง ของหลุม จากนั้นนาไปหาร 2 แลว้ หาคา่ เฉลยี่ ของทงั้ 2 แนว หน่วยเป็นมลิ ลเิ มตร ภาพท่ี 3 การทา agar well diffusion ทมี่ า : shorturl.at/moLT2 2.4 ความรู้เก่ยี วกับคา่ MIC และ MFC MIC คอื ปรมิ าณยาต่าสุดท่ปี ้องกนั ไม่ใหเ้ กดิ การเจรญิ ของแบคทีเรียในหลอดทดลอง คา่ ที่ใช้ เปน็ หลกั คือ MIC MFC คือ ปรมิ าณยาต่าสุดจากหลอดทดลองท่นี ามาเพาะเช้ือต่อใน agar plate ทีไ่ ม่มยี า ตา้ นจุลชพี แล้วสามารถป้องกันไม่ใหเ้ กิดการเจริญของเชือ้ ได้ ภาพท่ี 4 การหาค่า MIC และ MFC ท่ีมา : shorturl.at/hpqK9

8 2.5 ความรเู้ กย่ี วกับสมนุ ไพร 2.5.1 ใบชุมเห็ดเทศ สารสกัดจากใบชุมเห็ดเทศมีฤทธิ์ยับย้ัง T.rubrum และ M.Gypseum ได้ดี โดยสารสกัดจากใบชุมเห็ดเทศมีผลทาให้สายรามีความผิดปกติ หดตัวเห่ียวย่นทั้งน้ีอาจ เนื่องมาจากการร่ัวไหลของเหลวภายในเซลล์ ใบชุมเห็ดเทศมีองค์ประกอบทางเคมีท่ีสาคัญ ประกอบด้วยสารกลุ่ม Anthraquinone โดยในใบชุมเห็ดเทศ มีสารสาคัญ Hydroxy-anthracene derives ไม่น้อยกว่า 1.0% w/w (โดยคานวณเป็น rhein-8-glucoside) เช่น Aloe-emodin, Chrysophanol , Chrysophanic acid, lsochrysophanol, Physcion glycoside, Terpenoids, Sennoside, Sitosterols, Lectin, Rhein สารประกอบสาคญั ทีใ่ ชใ้ นการรกั ษาโรคกลาก คือ Rhein ภาพท่ี 5 ใบชมุ เห็ดเทศ ภาพท่ี 6 สาร Rhein ทม่ี า : shorturl.at/oxIY3 ที่มา : shorturl.at/fjxyB 2.5.2 ทองพันช่ัง มีสาร rhinacathin-C, rhinacathin -D และ rhinacathin -N ซึ่งแยกจาก ใบทองพันชั่ง เม่ือนามาทดสอบฤทธิ์ต้านเช้ือราด้วยวิธี agar well diffusion พบว่าสารดังกล่าวทั้ง 3 ชนิดสามารถตา้ นเช้อื ราท่ที าให้เกิดโรคผิวหนังคือ Trichiopiytona rubrium, T. Mentagroniytes และ Microsporum gypseum ได้โดยท่ีสาร rhinacathin-C มีฤทธ์ิต้านเชื้อราดังกล่าวแรงสุด ต้นทองพันช่ัง จึงมีสรรพคุณทางการรักษาโรคกลากเกล้ือนได้ ซ่ึงในงานวิจัยท่ีผ่านมามีผู้ทาการศึกษา ฤทธ์ิในการต้านเช้ือราของสาร โดยใบสดและราก ใช้รักษาโรคผิวหนัง โรคสะเก็ดเงิน พุพอง กลากเกลื้อน พิษจากแมลงกัดต่อย มีการวิจัยยืนยันสรรพคุณในการรักษาโรคผิวหนัง พบสาร rhinacanthin A, B และ oxymethylanthraquinone มีฤทธ์ิยับยั้งการเจริญเติบโตของเช้ือรา เช่น กลากเกล้อื น รวมท้ังเชื้อโรคและเชื้อไวรัส รวมถึงสามารถต้านการอักเสบอีกดว้ ย ภาพที่ 7 ใบทองพนั ช่ัง ภาพท่ี 8 Rhinacanthin A,B,C ทม่ี า : shorturl.at/uKUY6 ทมี่ า : shorturl.at/fjxyB

9 2.5.3 ผลมะคาดีควาย มีสารเคมีที่พบ คือ saponin, Emarginatonede, o-Methyl- Saponin, Quercetin, Quercetin-3-a-L-arabofuranoside และ beta– sitosterol โดยสารท่ี สาคัญ คือ saponin เป็นสารประเภท glycoside ท่ีเป็นสารพวก Steroid หรืออาจเป็น triterpene มีรสเฝ่ือน มีคุณสมบัติทาให้เม็ดเลือดแดงแตก เมื่อละลายน้าและเขย่า จะทาให้เกิดฟองรูปรวงผึ้ง ชาวบ้านมักใช้ผลมาแทนสบู่ สาหรับซักล้างทั่วไป สารนี้มีความคงตัวได้นาน และเป็นพิษต่อ สัตว์เลือดเย็น เช่น ปลา หอย และแมลงต่างๆ สารนี้เป็นสารสาคัญท่ีถูกนามาใช้ประโยชน์มากมาย มีสรรพคุณฆ่าเชื้อรา แก้โรคชันนะตุ รักษาโรคผิวหนัง บาดแผลได้ และใช้เป็นสารสกัดสาหรับกาจัด แมลงศตั รพู ชื ชนิดตา่ งๆ ภาพที่ 9 ผลมะคาดคี วาย ภาพท่ี 10 Saponin ทมี่ า : shorturl.at/ruNPT ทม่ี า : shorturl.at/oxIY3 2.6 ความรเู้ กีย่ วกบั โรคกลาก กลาก (Tinea circinato or Ringworm) เกิดจากเชื้อรากลุ่มเดอร์มาโตไฟต์(Dermatophytes) สามารถตดิ ต่อได้ง่าย หากไปสมั ผสั กับคนที่เป็นโรคน้ี หรือไปใช้ของใช้ร่วมกับคนที่เป็นโรคนี้ก็มีโอกาส ติดโรคมาได้ สัตว์เลี้ยงในบ้านอย่างสุนัข แมว ก็อาจนาโรคน้ีมาให้ได้เช่นกัน เกล้ือนเป็นโรคผิวหนังที่ พบได้บ่อย โดยเฉพาะในวัยหนุ่มสาว เกิดจากเช้ือรากลุ่มมาลาสซีเซีย เฟอร์เฟอร์ (Malassezia furfur) ซึ่งเป็นเชื้อราท่ีพบได้ที่ผิวหนังตามธรรมชาติ โดยปกติเช้ือรานี้จะไม่แผลงฤทธ์ิจนกว่าจะมีปัจจัย สง่ เสรมิ ให้เช้อื ราเจรญิ งอกงาม เชน่ การมีเหงอื่ อบั ช้นื เปน็ ต้น ภาพที่ 11 โรคกลาก ที่มา : shorturl.at/dfzNO

10 2.7 ความรเู้ กี่ยวกับการสกดั สารในพืช ปัจจบุ นั เทคนิคการกล่ันและการสกัดดว้ ยตัวทาละลายไดร้ บั ความนยิ มอยา่ งแพร่หลาย ในการ นามาใช้กับการสกัดสารสาคัญจากสมุนไพร โดยการสกัดแบบการกล่ันนั้น ใช้หลักการการควบแน่น และการระเหยของสารสาคญั และน้า ซึ่งไดน้ าเสนอไว้ 3 เทคนิค ได้แก่ การกล่ันด้วยน้าและไอน้า และ การกล่ันด้วยไอน้า ซึ่งการกลั่นด้วยไอน้าน้ีได้เพ่ิมเทคนิคการกลั่นแบบ Instant Controlled Pressure Drop (DIC) ซ่ึงเป็นท่ีนิยมใช้ในปัจจุบัน สาหรับการสกัดด้วยตัวทาละลายน้ัน จะใช้หลักการของการทาละลายกัน ระหว่างสารสาคัญและตัวทาละลาย โดยได้นาเสนอการสกัดด้วยตัวทาละลายไว้หลายเทคนิค เช่น การสกัดแบบชง การสกดั แบบต่อเนื่อง การสกัดแบบการหมัก การสกัดโดยใช้ไขมัน การสกัดสารด้วย ของไหลวกิ ฤตยิ งิ่ ยวด การสกัดด้วยคลน่ื ไมโครเวฟ และการสกัดโดยใชค้ ล่ืนเสยี งความถีส่ งู เป็นต้น ภาพท่ี 12 สารสกดั จากสมนุ ไพร ทม่ี า : shorturl.at/hoBR7 2.8 ความรเู้ กี่ยวกับการระเหยตัวทาละลาย การระเหยเป็นการลดปริมาณตัวทาละลาย โดยให้ความร้อนเพ่ือให้เกิดการระเหย ตัวทาละลายออกจากสารละลาย ซ่ึงสารละลายท่ีต้องการเพ่ิมความเข้มข้นในกระบวนการระเหย มักจะประกอบด้วยตัวทาละลายท่ีระเหยได้ง่าย และตัวถูกละลายท่ีไม่ระเหย โดยท่ัวไปกระบวนการ ระเหยมักถูกนาไปใช้เพื่อให้ได้สารละลายที่เข้มข้นข้ึน (thick liquor) และจะทิ้งไอของตัวทาละลายที่ ระเหยออกมา เชน่ การผลติ น้าผลไมเ้ ข้มขน้ การผลิตน้าตาล เป็นตน้ ในกระบวนการระเหยนั้นหากให้ ความรอ้ นแก่สารละลายอย่างต่อเน่ืองแล้ว ความเข้มข้นท่ีสภาวะสุดท้ายของสารละลายในการระเหย จะเป็นความเข้มข้นของระบบก่อนท่ีผลึกจะเริ่มตกออกมา และหากยังได้รับความร้อนต่อ ในท่ีสุดจะ เกิดการตกผลึก (crystallization) ออกจากสารละลาย เน่ืองจากสภาวะอิ่มตัวยิ่งยวดของสารละลาย ทาให้เกดิ ผลึก ภาพท่ี 13 การระเหยตวั ทาละลาย ท่ีมา : shorturl.at/sADU4

11 9.ความรเู้ กยี่ วกับการทาเจล สว่ นผสม 1.Ethanol 95% ปริมาณ 750 ml 2.Glycerin ปรมิ าณ 9 g 3.Triethanolamine 99% (TEA) ปรมิ าณ 0.75 g 4.Carbopol 940 ปริมาณ 3.6 g 5.นา้ สะอาด ปริมาณ 225 ml วธิ ีทา 1.นา Carbopol 940 ละลายในน้าสะอาดตามปริมาณที่กาหนดไว้และแช่ทิ้งไว้ 1-2 ชั่วโมง เพื่อให้ พองตวั 2.เมื่อท้ิง Carbopol 940 ท่ีผสมกับน้าสะอาดไว้ 1 คืน แล้วจะได้เป็นลักษณะเจลขุ่นๆ ให้เติม Ethanol 95% ผสมลงไป โดยใชเ้ คร่อื งป่ันเปน็ ตัวช่วยให้เน้ือเจลผสมเขา้ กนั ไดด้ ี 3.ระหวา่ งปน่ั เนอ้ื เจลใหเ้ ตมิ Glycerin ตามปรมิ าณทีก่ าหนดไว้ลงไป 4.เตมิ Triethanolamine ที่ทาใหเ้ นื้อเจลเซตตวั และใสขึน้ ปั่นจนเนือ้ เนียนละเอยี ดเขา้ กนั ได้ดี 5.บรรจุใส่ขวดท่ีสะอาด และนาไปใชง้ านไดท้ นั ที 6.สามารถเพิ่มนา้ หอมหรือสี เพ่ือให้เจลมลี กั ษณะตามทค่ี ุณชอบได้ ภาพท่ี 14 เจลแอลกอฮอล์ ทีม่ า : shorturl.at/sADU4

12 บทที่ 3 วัสดุอปุ กรณ์และวธิ ีการทดลอง 3.1 อุปกรณ์และเครอ่ื งมือพิเศษ 3.1.1 วัสดุอุปกรณ์ 1) เคร่อื งชั่ง 2) บกี เกอร์ 3) แท่งแกว้ คนสาร 4) ตะแกรง 5) แผน่ สไลด์ 6) ท่อทองเหลือง 7) ใบชุมเหด็ 8) ตอู้ บ 9) ใบทองพนั ช่ัง 10) หลอดหยด 11) ผลมะคาดีควาย 12) จานเพาะเชอ้ื 13) ขวดปรบั ปริมาตร 14) กระบอกตวง 15) เคร่ืองปนั่ 16) ตูบ้ ่มเช้ือ 17) Autoclave 18) กลอ้ งจุลทรรศน์ 19) มีด 20) หลอดทดลอง 21) อา่ งไอนา้ (waterbath) 22) อาหารเลี้ยงเชื้อ(PDA) 23)เวอร์เนียร์คาลปิ เปอร์ 24) เขียงพลาสตกิ 25) ไมโครปเิ ปตต์ 26) ปากคบี 27) Hotplate 28) ขวดฉีดนา้ กล่นั 29) ลูปเขี่ยเชื้อ 30) needle 31) ขวดพลาสติก 32) ขวดบรรจุสาร 3.2 สารเคมี 1) เอทานอล 2) ยา Clotrimazole cream (canestane) 3) น้ากล่นั 4) กลเี ซอรอล 5) คารโ์ บพอล 6) ไตรเอทาโนลามีน 3.3 ส่ิงมีชีวิต 1) Microsporum gypseum วิธีการดาเนนิ งาน 1. การเตรียมต้นเชือ้ ทดสอบ เตรยี มเชอื้ รา Microsporum gypseum และเพาะเลีย้ งเชื้อราโดยวธิ ี streak plate โดยใช้ ห่วงถ่ายเช้ือเข่ียโคโลนีของเชื้อลงบนอาหารเลี้ยงเชื้อ PDA (Potato Dextrose Agar) นาเช้ือท่ีได้ไป บ่มท่ีอุณหภูมิหอ้ งเป็นเวลา 72 ช่วั โมง จากน้ันทาการตรวจสอบภายใต้กล้องจุลทรรศน์ 400 เท่า

13 2. การสกัดสารจากพืชสมนุ ไพร การคัดเลือกตัวอย่างพืชสมุนไพร และการสกัดสารจากพืชสมุนไพร ทาการคัดเลือกตัวอย่าง พืชสมุนไพรจานวน 3 ชนิด คือ ผลมะคาดีควาย ใบทองพันช่ัง และใบชุมเห็ดเทศ ล้างด้วยน้าสะอาด 2 คร้ัง นาตัวอย่างพืชสมุนไพรท้ัง 3 ชนิด ไปผึ่งให้สะเด็ดน้าแล้วนามาหั่นเป็นชิ้นเล็กๆ จากน้ันนาไป ปั่นด้วยน้ากลั่น เอทานอลความเข้มข้น 75%v/v , 85%v/v และ 95%v/v ตามลาดับ โดยใช้ พืชสมุนไพรจานวน 200 g ในตัวทาละลาย 200 ml จากนั้นนาสารที่ได้ไปกรองเเยกกาก พร้อมท้ัง นาสารละลายส่วนของเหลวไประเหยตัวทาละลายออก โดยใช้อ่างไอน้า ( water bath ) จะได้ สารสกัดจากพชื สมนุ ไพร เพอื่ ใชใ้ นการทดสอบประสิทธิภาพการยบั ยั้งเชือ้ ราก่อโรคในลาดบั ต่อไป การทดลองที่ 1 การศกึ ษาประสทิ ธิภาพ ของสารสกดั จากพชื สมุนไพรในตัวทาละลายต่างชนดิ กนั ทสี่ ามารถยับยง้ั เชอ้ื รากอ่ โรคด้วยวธิ ี agar well diffusion 1.นาเชื้อราทดสอบมาเกลี่ย (Streak) ให้ทั่วบนอาหารเพาะเชื้อ Potato Dextrose Agar (PDA) จากนั้นท้ิงไว้ประมาณ 72 ชั่วโมง เจาะหลุมขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางประมาณ 6 mm ด้วยทอ่ ทองเหลอื งท่ผี ่านการฆ่าเชอื้ ด้วยเครือ่ ง autoclave 2.ใช้ไมโครปิเปตต์ ปิเปตสารสกัดจากพืชทั้ง 3 ชนิด ( ใบทองพันช่ัง, ผลมะคาดีควาย และ ใบชุมเห็ดเทศ ) จากตัวทาละลายท้ัง 4 ชนิด (น้ากลั่น,เอทานอล 75 , 85, 95 v/v) จานวน 1 g ใน น้ากล่ัน 1 ml เป็นความเข้มข้น 1 g/ml โดยหยดปริมาตรละ 1 µl ลงในหลุม ชนิดละ 4 หลุมและ ท้ิงไว้เปน็ เวลา 10-15 นาที 3.ใช้ไมโครปิเปตต์ ปิเปตน้ากล่ันปริมาตร 1 µl จานวน 4 หลุมเป็นชุดการทดลองควบคุม แสดงผลลบ และใช้ไมโครปิเปตต์ ปิเปตยา Clotrimazole cream ปริมาตร 1 µl จานวน 4 หลุม เป็นชุดการทดลองควบคมุ แสดงผลบวก และทงิ้ ไวเ้ ปน็ เวลา 10-15 นาที 4.จากน้ันนาไปบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 24 ชั่วโมง ตรวจสอบผลการทดลองโดยวัดขนาด เส้นผ่านศูนย์กลางโซนยับยั้ง (inhibition zone) ด้วยเวอร์เนียร์คาลิปเปอร์ โดยวัดจาก 2 แนว ตัง้ ฉากกนั และบันทึกผลการทดลอง การทดลองท่ี 2 การศึกษาความเข้มข้นต่าสุด ที่สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อ (Minimal Inhibitory Concentration : MIC ) 1.ค่า MIC เป็นค่าของสารสกัด ที่มีความเข้มข้นต่าท่ีสุดในการยับยั้งเชื้อรา ซึ่งจะทาให้ทราบ ปริมาณสารสกัดอย่างน้อยที่สุด ท่ีควรนามายับยั้งการเจริญเติบโตของเช้ือรา โดยนาสารสกัดที่ แสดงผลการยบั ยง้ั เชอ้ื รา ทดสอบด้วยวธิ ี agar well diffusion มาตรวจสอบหาค่า MIC 2.ทาการเจือจางสารสกัดจากพืชสมุนไพรในตัวทาละลายที่เหมาะสมความเข้มข้น 1 ,0.5 ,0.25 ,0.125 g/ml ด้วยน้ากล่ัน จากนั้นใช้ไมโครปิเปตต์ ปิเปตสารสกัดจากพืชสมุนไพรลงในหลุม ปรมิ าตรหลุมละ 1 µl จานวน 4 หลมุ 3.จากนั้นนาเช้ือไปบ่มท่ีอุณหภูมิห้องเป็นเวลา 24 ชั่วโมง ตรวจสอบผลการทดลองโดยวัด ขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางโซนยับยั้ง (inhibition zone) ด้วยเวอร์เนียร์คาลิปเปอร์โดยวัดจาก 2 แนวต้ังฉากกนั และบันทกึ ผลการทดลอง

14 การทดลองที่ 3 การศึกษาความเข้มข้นต่าสุด ที่สามารถฆ่าเช้ือราทดสอบ(Minimum Fungicidal Concentration : MFC ) 1.คา่ MFC เป็นค่าความเขม้ ข้นของสารสกัดต่าทส่ี ุดที่สามารถฆา่ เชอ้ื ทดสอบได้ 2.เข่ียเช้ือจากบริเวณยับย้ังของค่า MIC ที่ความเข้มข้นต่าสุดอย่างน้อย 2 ความเข้มข้นมา streak บนอาหารเลย้ี งเชือ้ Potato Dextrose Agar (PDA) ทป่ี ราศจากเช้อื รา 3.นาไปบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 24 ช่ัวโมง อ่านผลหาค่า MFC หากสารสกัดสมุนไพร สามารถฆ่าเช้ือได้จะแสดงผลลบ คือ ไม่มีโคโลนีของเช้ือปรากฏ ดังนั้นความเข้มข้นน้อยท่ีสุดของ สารสกัดจากสมุนไพรทีส่ ามารถฆ่าเช้อื ราไดค้ ือคา่ MFC การทดลองท่ี 4 การศึกษาประสิทธิภาพของสารผสมจากสารสกัดจากพืชสมุนไพรในการยับยั้ง เช้ือราก่อโรคด้วยวิธี agar well diffusion 1.เตรียมสารสกัดสมุนไพรท้ัง 3 ชนิด ในความเข้มข้น 1 g/ml แล้วนามาผสมกันในหลอด ทดลองอัตราสว่ นดงั นี้ ผลมะคาดีควาย : ใบทองพันชั่ง 1:1 ใบทองพันชงั่ : ใบชมุ เห็ดเทศ 1:1 ผลมะคาดคี วาย : ใบชมุ เหด็ เทศ 1:1 ผลมะคาดคี วาย : ใบชุมเห็ดเทศ : ใบทองพันชงั่ 1:1:1 ปริมาตรละ 1 ml 2.ใช้ไมโครปิเปตต์ ปิเปตสารผสมสารสกัดสมุนไพรที่เตรียมไว้ปริมาตร 1 µl ลงในหลุม จานวน 4 หลมุ และท้งิ ไวเ้ ป็นเวลา 10-15 นาที จากนน้ั นาไปบ่มในตู้บ่มเช้ือเป็นเวลา 24 ช่วั โมง 3.ตรวจสอบผลการทดลอง โดยวัดขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางโซนยับยั้ง (inhibition zone) ดว้ ยเวอรเ์ นียร์คาลปิ เปอรโ์ ดยวดั จาก 2 แนวต้ังฉากกนั และบนั ทกึ ผลการทดลอง

15 การทดลองท่ี 5 การศกึ ษาประสิทธภิ าพของสารผสมสารสกัดสมนุ ไพรชนิดเจล ท่ีมีความสามารถ ในการยบั ยง้ั เช้ือรากอ่ โรค โดยวิธี agar well diffusion 1.การเตรียมสารสกัดผสมจากพืชสมุนไพรชนิดเจล นาสารผสมจากสารสกัดสมุนไพรท้ัง 3 ชนิด ในความเข้มข้น 1 g/ml มาทายาชนิดเจลโดยทาการผสมน้าบริสุทธ์ิ 100 ml จากน้ันเติม คาร์โบพอล 940 หนกั 1 g และเติมไตรเอทาโนลามนี 1 ml ทาการกวนผสมให้กระจายตวั 2.ใชไ้ มโครปิเปตต์ ปเิ ปตสารสกดั สมุนไพรชนดิ เจลที่เตรยี มไว้ปริมาตร 1 µl ลงในหลุมจานวน 4 หลมุ และทิ้งไว้เปน็ เวลา 10-15 นาที 3.ใชไ้ มโครปเิ ปต ปเิ ปตยา Clotrimazole cream ความเข้มขน้ 1 g/ml ที่เตรียมไว้ ปริมาตร 1 µl ลงในหลุมจานวน 4 หลมุ และทิง้ ไวเ้ ป็นเวลา 10-15 นาที 4.จากนั้นนาไปบ่มที่อุณหภมู ิห้องในตู้บม่ เชือ้ เปน็ เวลา 24 ชัว่ โมง 5.ตรวจสอบผลการทดลอง โดยวัดขนาดเส้นผ่านศูนยก์ ลางโซนยับยั้ง (inhibition zone) ด้วยเวอร์เนียรค์ าลิปเปอรโ์ ดยวัดจาก 2 แนวตงั้ ฉากกัน 6.ทาการหยดสารสกัดและวัดซ้าเม่ือเวลาผ่านไป 48 ,72 ,96 และ 120 ช่ัวโมง บันทึกผล การทดลองเปรยี บเทยี บยาสารสกัดสมนุ ไพรกับยา Clotrimazole cream ตารางปฏิทิน .

16 บทที่ 4 ผลการทดลอง จากการทดลองสมุนไพรรักษาโรคกลาก โดยศึกษาการยับยั้งการเจริญเติบโตของเช้ือรา จะได้ ผลการทดลองดังน้ี ตารางที่ 1 แสดงขนาดเสน้ ผา่ นศนู ย์กลางโซนยับยงั้ เชือ้ ราของสารสกดั จากสมนุ ไพรในตวั ทาละลาย ต่างชนิดกนั ดว้ ยวิธี agar well diffusion ชนิดสมุนไพร ชนิดของ พน้ื ท่โี ซนยบั ย้ัง (mm) ตวั ทาละลาย หลมุ ท่ี 1 หลุมที่ 2 หลุมท่ี 3 หลมุ ท่ี 4 ค่าเฉล่ีย S.D. น้ากล่ัน 1.24 1.64 1.21 1.15 1.31 0.22 เอทานอล 75 %v/v 1.18 0.51 0.74 0.73 0.79 0.28 ใบชุมเห็ดเทศ เอทานอล 85 %v/v 2.19 1.63 2.14 1.58 1.89 0.32 เอทานอล 95 %v/v 2.51 2.60 2.59 3.01 2.68 0.23 น้ากล่ัน 2.24 1.59 1.70 1.68 1.80 0.30 เอทานอล 75 %v/v 1.59 1.65 2.05 1.73 1.74 0.21 ใบทองพันช่งั เอทานอล 85 %v/v 2.74 1.63 2.18 1.74 2.07 0.50 เอทานอล 95 %v/v 2.63 2.69 2.06 2.16 2.39 0.32 น้ากลนั่ 2.01 2.23 1.47 2.20 1.97 0.34 เอทานอล 75 %v/v 1.65 1.04 1.68 1.73 1.53 0.33 ผลมะคาดีควาย เอทานอล 85 %v/v 1.65 2.16 1.58 1.60 1.75 0.28 เอทานอล 95 %v/v 2.70 3.18 2.73 2.69 2.83 0.24

17 ตารางท่ี 2 แสดงคา่ ความเข้มขน้ ต่าสุดของสารสกัดจากสมุนไพรในตัวทาละลายทีเ่ หมาะสม สามารถยับยง้ั การเจริญเติบโตของเชื้อรา (Minimal Inhibitory Concentration : MIC ) ชนดิ ของสารสกดั ชนดิ ตวั ทาละลาย MIC (g/ml) ใบชุมเหด็ เทศ เอทานอล 0.250 ใบทองพนั ชั่ง เอทานอล 0.500 ผลมะคาดีควาย เอทานอล 0.125 ตารางที่ 3 แสดงคา่ ความเข้มข้นต่าสุดของสารสกดั จากสมุนไพรในตวั ทาละลายทเี่ หมาะสม สามารถฆา่ เช้ือราก่อโรค ( Minimal Fungicidal Concentration : MFC ) ชนิดของสารสกัด ชนดิ ตวั ทาละลาย MFC (g/ml) ใบชมุ เหด็ เทศ เอทานอล 0.250 ใบทองพนั ชั่ง เอทานอล 1.000 ผลมะคาดีควาย เอทานอล 0.125 ตารางท่ี 4 แสดงขนาดเส้นผ่านศนู ย์กลางโซนยบั ยงั้ เชอ้ื ราของสารผสมสารสกดั จากพชื สมนุ ไพรด้วย วิธี agar well diffusion ชนดิ ของสารผสม ขนาดเสน้ ผ่านศูนยก์ ลางโซนยับย้ัง (mm) หลุมท่ี 1 หลมุ ที่ 2 หลมุ ท่ี 3 หลมุ ที่ 4 คา่ เฉลยี่ S.D. ใบทองพนั ช่ัง + ใบชุมเห็ดเทศ 2.06 2.55 2.10 2.14 2.21 0.23 ผลมะคาดีควาย + ใบชมุ เหด็ เทศ 2.70 3.58 3.16 2.59 3.00 0.45 ใบทองพนั ชง่ั + ผลมะคาดคี วาย 3.10 3.73 3.18 3.56 3.39 0.30 ใบทองพันช่ัง + ผลมะคาดีควาย 4.21 4.63 4.23 4.58 4.32 0.20 + ใบชุมเห็ดเทศ

18 ตารางที่ 5 แสดงการเปรยี บขนาดเส้นผา่ นศนู ยก์ ลางโซนยบั ยัง้ เชอื้ ราของเจลสารสกัดจากสมุนไพรกบั ยา Clotrimazole Cream ขนาดเส้นผ่านศนู ยก์ ลางโซนยับย้ัง (mm) ชนดิ ของสารทดสอบ วนั ท่ี 2 วนั ท่ี 3 วันท่ี 4 วนั ท่ี 5 วนั ท่ี 1 เจลสารสกัดจาก 1.44±0.01 2.05±0.05 2.28±0.22 2.97±0.20 3.10±0.03 พชื สมุนไพร 1.55±0.27 2.10±0.03 2.60±0.04 2.68±0.03 3.07±0.05 Crotrimazole Cream

19 บทท่ี 5 สรุปผล อภปิ ราย และขอ้ เสนอแนะ 5.1 สรุปผลการทดลอง จากการทดลองสรุปผลได้ว่า สารสกัดจากสมุนไพรโดยผลมะคาดีควาย ใบชุมเห็ดเทศ และ ใบทองพันชั่ง ในตัวทาละลายเอทานอลความเข้มข้น 95 %v/v สามารถยับย้ังการเจริญเติบโตของ เช้ือราได้ดีที่สุด โดยความเข้มข้นต่าสุดที่สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเช้ือรา (MIC) ได้ คือ ความเข้มข้นสารสกัดจากใบชุมเห็ดเทศ 0.25 ใบทองพันชั่ง 0.5 และผลมะคาดีควาย 0.125 g/ml ตามลาดับ แต่ค่าความเข้มข้นของสารสกัดสมุนไพรที่สามารถฆ่าเช้ือราได้ (MFC) คือ ความเข้มข้น สารสกัดจากใบชุมเห็ดเทศ 0.25 ใบทองพันชั่ง 1 และผลมะคาดีควาย 0.125 g/ml ตามลาดับ สามารถฆ่าเชื้อราได้ เมื่อนาสารสกัดสมุนไพรมาผสมกัน และทาการวัดขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางโซน ยับยั้ง พบว่าสารผสมสารสกัดจากพืชสมุนไพรทั้ง 3 ชนิด สามารถยับย้ังการเจริญเติบโตของเช้ือรา ได้ดีที่สุด และการนาเจลจากสารสกัดสมุนไพรมาเปรียบเทียบกับยา Clotrimazole Cream โดย เปรียบเทียบขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางโซนยับย้ังพบว่าเจลจากสารสกัดสมุนไพรมีขนาดเส้นผ่าน ศูนย์กลางโซนยับย้ังท่ีมากกว่ายา Clotrimazole Cream แสดงว่า เจลจากสารสกัดพืชสมุนไพรมี ประสิทธิภาพในการยับย้งั ท่ดี ีกวา่ ยา Clotrimazole cream 5.2 อภปิ รายผลการทดลอง จากการศึกษาผลของสารสกัดจากพืชสมุนไพรในการยับย้ังเช้ือรา Mycrosporum gymseum โดยใช้วิธี Agar well diffusion พบว่าสารสกัดจากมะคาดีควายโดยมีเอทานอล 95% %v/v เป็น ตัวทาละลายสามารถยับย้ังการเจริญเติบโตของเช้ือราได้ดีท่ีสุด ซึ่งสอดคล้องกับสรรพคุณของ มะคาดีควาย โดยมะคาดีควายมีสารท่ีสาคัญ คือ saponin เป็นสารประเภท glycoside ที่เป็นสาร พวก Steroid ซ่งึ มีสรรพคณุ ฆ่าเชอ้ื รา แกโ้ รคชนั นะตุ และรักษาโรคผวิ หนังได้ จากการศึกษาความเข้มข้นต่าสุดที่สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเช้ือ (Minimal Inhibitory Concentration : MIC ) พบว่าในสารสกัดจากมะคาดีควายใช้ความเข้มข้น 0.125 g/ml สารสกัดจากใบทองพันช่ังใช้ความเข้มข้น 0.5 g/ml และสารสกัดจากใบชุมเห็ดเทศใช้ความเข้มข้น 0.25 g/ml จากการศึกษาความเข้มข้นต่าสุดที่สามารถฆ่าเช้ือราทดสอบ ( Minimum Fungicidal Concentration : MFC ) พบว่าสารสกัดจากมะคาดีควายใช้ความเข้มข้น 0.125 g/ml สารสกัดจาก ใบทองพนั ช่ังใชค้ วามเขม้ ข้น 1 g/ml และสารสกัดจากใบชมุ เห็ดเทศใชค้ วามเข้มข้น 0.25 g/ml จากการศึกษาประสิทธิภาพของสารผสมจากสารสกัดจากพืชสมุนไพรในการยับยั้งเชื้อรา ก่อโรคด้วยวิธี agar well diffusion พบว่าสารผสมระหว่างสารสกัดจากใบทองพันช่ัง ใบชุมเห็ดเทศ เเละผลมะคาดีควาย สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อราได้ดีท่ีสุด ซึ่งตรงกับสรรพคุณของสาร ท่ีพบในผลมะคาดีควาย ใบชุมเห็ดเทศ และใบทองพันชั่ง โดยในใบชุมเห็ดเทศ พบสาร Chrysophanic acid, lsochrysophanol, Physcion glycoside, Terpenoids, Sennoside, Sitosterols, Lectin และโดยเฉพาะสาร Rhein ซ่ึงเป็นสารที่สาคัญ ในการรักษาโรคกลากเกล้ือน และในใบทองพันชั่งพบสาร rhinacathin-A, rhinacathin -B, rhinacathin -C, rhinacathin -D

20 และ rhinacathin -N ซ่ึงเป็นสารที่มีความสามารถในการต้านเช้ือราท่ีทาให้เกิดโรคผิวหนังคือ Trichiopiytona rubrium,T. Mentagroniytes และ Microsporum gypseum เเละจากการการศึกษาประสิทธิภาพของสารสกัดสมุนไพรชนิดเจล ท่ีมีความสามารถในการ ยับยั้งเช้ือราก่อโรคด้วยวิธี agar well diffusion พบว่าเจลจากสารสกัดพืชสมุนไพรมีเส้นผ่าน ศูนย์กลางโซนยับยั้งที่มากกว่ายา Clotimazole cream แสดงว่าเจลจากสารสกัดพืชสมุนไพร มปี ระสทิ ธภิ าพในการยบั ย้ังท่ดี กี ว่ายา Clotrimazole cream 5.3 ข้อเสนอแนะ 1.ควรหาวิธกี ารเก็บรกั ษาเจลจากสารสกดั สมนุ ไพรให้มีระยะเวลาที่ยาวนานข้ึน 2.ควรทาการศึกษาเชื้อท่กี ่อให้เกดิ โรคกลากเพิม่ เตมิ โดยนาพชื สมุนไพรมายบั ย้ังการเจริญเติบโตของ เช้อื ดังกล่าว 3.ควรทาการศึกษาอตั ราสว่ นของสารผสมสกดั พืชสมนุ ไพรที่มีผลตอ่ การเจรญิ เติบโตของเชือ้ เพม่ิ เตมิ 4.ควรทาในหอ้ งท่ปี ลอดเช้ือเพราะป้องกันการปนเป้ือนของเชื้ออ่นื ๆ 5. ควรนาเจลจากสารสกัดพชื สมุนไพรไปเปรยี บเทียบประสิทธภิ าพกับยาชนิดอื่นนอกจาก Clotimazole cream

21 บรรณานกุ รม Disthai. (2561). ชมุ เห็ดเทศ. สืบค้นเมอ่ื 21 สงิ หาคม 2563, จาก https://medthai.com/ Medthai. (2561). ใบทองพนั ช่ัง. สืบคน้ เมอ่ื 20 สงิ หาคม 2563, จาก https://medthai.com/ Medthai. (2561). มะคาดีควาย. สืบคน้ เม่ือ 20 สิงหาคม 2563, จาก https://medthai.com/ POBPAD. (2560). โรคกลากเกลื้อน. สืบคน้ เม่ือ 5 สิงหาคม 2563, จาก https://www.pobpad.com/ SEMINARDD. (2560). การสกดั จากสมุนไพร. สบื ค้นเมื่อ 20 สิงหาคม 2563, จาก https://seminardd.com/ กรกนก พิบลู ย์ผล,อรอนงค์ สมทรพั ย์ และคณะ.(2562). งานวจิ ยั เร่ืองฤทธ์ิยบั ยง้ั เเบคทีเรียและฤทธ์ิ ต้านอนมุ ูลอสิ ระของสารสกัดผลมะเปรียง ชชู าติ ทองนาค. (2560). อาหารเลีย้ งเช้ือ. สบื คน้ เม่ือ 12 สิงหาคม 2563, จาก https://sites.google.com/ เดลนิ ิวส์. (2559). 5 สมุนไพรแก้กลากเกล้ือน. สืบคน้ เม่ือ 13 สงิ หาคม 2563, จาก https://www.dailynews.co.th/ ผศ.ชศู รี ไพศาลอุดมศิลป์ และ ผศ.นันทนิตย์ ยม้ิ วาสนา.(2553). งานวิจยั เร่อื ง การเตรียมเจลท่ีมี ฤทธิ์ในการยบั ยงั้ เช้ือรา Trichophyton rubum ของสารสกดั จากใบทองพันช่ัง ลลิตา ไพบรู ณ์ , วิสสุตา วงศษ์ า เเละคณะ.(2558). งานวิจยั เร่ือง ประสิทธภิ าพของเจลล้างมือผสม สารสกดั จากเปลอื กผลไมใ้ นการยับย้งั แบคทีเรยี กอ่ โรค รศ.วชั รนิ ทร์ รกุ ขไชยศิรกิ ลุ และรศ.เสาวลกั ษณ์ พงษ์ไพจิตร.(2542). งานวิจัยเรอ่ื งฤทธิ์ตา้ นจลุ ินทรยี ์ ของสารสกัดจากพชื สกุล canssia sp. Antimicrobial Activities of Extractacts from Cassia sp. ศาสตราจารยเ์ กยี รติคุณ ดร.นิธยิ า รตั นาปนนท์. (2559). วิธตี รวจนบั จุลนิ ทรยี ์มาตรฐาน. สบื คน้ เมื่อ 12 สงิ หาคม 2563,จาก https://science.srru.ac.th/

22 ภาคผนวก

ภาพที่ 1 ทาความสะอาดอุปกรณ์ดว้ ยดว้ ยแอลกอฮอล์ ภาพท่ี 2 ชง่ั สมุนไพร 100 กรัม ภาพท่ี 3 ป่ันสมุนไพร ภาพท่ี 4 ระเหยตวั ทาละลายดว้ ย water bath

ภาพที่ 5 สารสกดั สมุนไพร ภาพท่ี 6 นาอุปกรณ์เขา้ autoclave ภาพที่ 7 เทอาหารเล้ียงเช้ือ 35 ml ภาพที่ 8 ภาพการ streak plate

ภาพท่ี 9 เช้ือรา Microsporum gymseum ภาพท่ี 10 ชงั่ สารสกดั สมุนไพรแตล่ ะความเขม้ ขน้ ภาพท่ี 11 สารสกดั สมุนไพรแต่ละความเขม้ ขน้ ภาพท่ี 12 การทา Agar well diffusion

ภาพท่ี 13 การเจาะหลุมดว้ ยท่อทองเหลือง ภาพท่ี 14 หยดสารสกดั สมุนไพรลงในหลุม ภาพท่ี 15 ภาพสารสกดั จากใบชุมเห็ดความเขม้ ขน้ 0.5 ภาพท่ี 16 การเกิด inhibition zone ของ มะคาดีควาย

ภาพท่ี 17 การทาเจลจากสารสกดั สมุนไพร ภาพที่ 18 เจลจากสารสกดั สมุนไพร ภาพที่ 19 การทาลายเช้ือรา ภาพท่ี 20 ภาพรวมสารสกดั สมุนไพร

ภาพที่ 21 ภาพรวมอุปกรณ์