การขยายพันธพุ์ ชื ดว้ ยเทคนคิ การเพาะเลย้ี งเนอ้ื เยอ่ื พชื
คำ� นำ� การเพาะเลี้ยงเนื้อเย่ือเป็นเทคโนโลยีการขยายพันธุ์พืช เพื่อให้ได้จ�ำนวนมากในระยะเวลาอันสั้น โดยเป็นการเพาะเลี้ยงสิ่งมีชีวิตเฉพาะส่วนเท่าน้ันไม่ใช้พืชทั้งต้น การเพาะเลี้ยงเนื้อเย่ือพืช ท�ำโดยน�ำเอา เน้อื เยือ่ ของพชื ในส่วนท่ีก�ำลังเจริญเตบิ โตอย่างรวดเรว็ เชน่ ทีป่ ลายยอดอ่อน ตาขา้ ง ดอก ใบ เน้อื เย่อื หรือ สว่ นประกอบของพชื ทเี่ ปน็ เนอื้ เยอ่ื เจรญิ มาเพาะเลยี้ งในอาหารสงั เคราะหท์ อี่ ยใู่ นสภาวะปลอดเชอ้ื ซง่ึ เปน็ อาหาร ที่เนื้อเย่ือนั้นต้องการ พร้อมทั้งสารที่กระตุ้นโดยจัดและควบคุมสภาพแวดล้อมให้อยู่ในสภาพที่ปลอดเชื้อ มีอณุ หภูมิความช้ืนและแสงสวา่ งทีต่ ้องเอ้อื ต่อช้นิ สว่ นของพืชจะเจรญิ เตบิ โตได้ การเจริญเตบิ โตของเน้อื เยอ่ื น้ัน ๆ ทำ� ใหเ้ ซลลข์ องพืชแบ่งตวั เพม่ิ จำ� นวนมากมายเปน็ กลมุ่ เซลลท์ เ่ี รยี กว่า แคลลสั (calus) เราจึงสามารถ บังคับให้เนื้อเยื่อนี้เจริญเติบโตข้ึนเป็นต้นอ่อนได้เมื่อมีสภาวะที่เหมาะสมและแบ่งเน้ือเย่ือเหล่านี้ไปเล้ียงใน อาหารใหมจ่ นเจรญิ เตบิ โตเปน็ ตน้ ใหมจ่ ำ� นวนมากมายตามตอ้ งการ วธิ นี ใ้ี ชก้ นั มากในการกระจายพนั ธพ์ุ ชื บาง ชนิดท่มี คี วามส�ำคญั ทางเศรษฐกิจ เชน่ กลว้ ยไม้ หนา้ ววั ต้นสกั หวาย กล้วย ข้าว เป็นตน้ ที่จ�ำเป็นอยา่ งย่งิ ท่จี ะต้องมีการด�ำเนินการอยา่ งตอ่ เนือ่ งเพ่ือตอบสนองความต้องการของผบู้ ริโภค
ประเทศไทยนนั้ ความรทู้ างดา้ นการเพาะเลยี้ งเนอ้ื เยอื่ พชื นนั้ ไดเ้ ขา้ มามบี ทบาทอยา่ งมากทางดา้ นการเกษตร เชน่ การขยายพนั ธพ์ุ ชื ชนดิ ตา่ งๆ เชน่ กลว้ ยไม้ กลว้ ยไมด้ อกชนดิ ตา่ ง ๆ เปน็ ตน้ โดยมกี ารผลติ เปน็ เชงิ การคา้ และได้มีการใช้ในการปรบั ปรงุ พันธุพ์ ชื พันธใ์ุ หม่ๆ ให้มลี ักษณะต่างๆ ตามความต้องการของเกษตรกร เชน่ มะเขอื เทศ และสตรอเบอร่ี เป็นต้น ตลอดจนการผลิตพืชปราศจากโรคแก่เกษตรกร เชน่ มันฝรัง่ เป็นตน้ มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีราชมงคลล้านนา มีนักวิจัยด้านการเพาะเล้ียงเนื้อเยื่อพืชท่ีมีประสบการณ์ มอี าคารปฏบิ ตั กิ ารเพาะเลย้ี งเนอ้ื เยอื่ พชื สำ� หรบั การทำ� งานวจิ ยั และการเรยี นการสอนของนกั ศกึ ษามหาวทิ ยาลยั เทคโนโลยีราชมงคลล้านนา นอกจากนี้ ยังได้จัดการฝึกอบรมหลักสูตรด้านการเพาะเล้ียงเน้ือเยื่อให้กับ ผู้ประกอบการขยายพันธุ์พืช เกษตรกร ครู อาจารย์จากโรงเรียนมัธยมศึกษาตอนปลาย และผู้สนใจท่ัวไป เพื่อน�ำความรู้ท่ีได้ไปพัฒนาธุรกิจการขยายพันธุ์พืชของเกษตรกร ผู้ประกอบการ และเผยแพร่แก่ผู้สนใจอื่น เพ่อื ใชป้ ระโยชน์ตอ่ ไป
06 ความหมาย ของการเพาะเล้ยี ง เนื้อเยอื่ พืช 09 หอ้ งปฏบิ ัตกิ าร เพาะเลีย้ งเนื้อเยอ่ื พืช
18 อาหารวิทยาศาสตร์ ส�ำหรบั เพาะเล้ียง เน้อื เย่ือพชื 24 การคดั เลือกชิ้นสว่ น ของพืชที่จะนำ� มา เพาะเลี้ยงเนือ้ เยอื่ 30 ตวั อย่างการขยายพันธพุ์ ืช เศรษฐกจิ บางชนิด ดว้ ยการเพาะเลยี้ งเนือ้ เย่ือพืช 36 บทสรปุ
ความหมาย ของการเพาะเลี้ยง เนือ้ เยื่อพืช การเพาะเลยี้ งเนอ้ื เยอื่ พชื หมายถงึ การนำ� เอาอวยั วะสว่ นใดสว่ นหนง่ึ ของพชื เชน่ ใบ ดอก ราก ตา ขอ้ หรอื เมลด็ เน้อื เยื่อ เซลล์ หรือเซลลท์ ่ีไมม่ ีผนังเซลล์ท่ี เรยี กวา่ โพรโทพลาสต์ (protoplast) มาเลย้ี งบนอาหารวทิ ยาศาสตร์ ซงึ่ ประกอบ 6 ดว้ ยธาตอุ าหารตา่ งๆ วติ ามนิ นำ�้ ตาล และสารควบคมุ การเจรญิ เตบิ โตของพชื (plant growth regulators) ภายใตส้ ภาพท่ีปลอดจากเชอ้ื จลุ นิ ทรีย์และควบคุม อณุ หภมู แิ ละแสง ชน้ิ สว่ นของพชื เหลา่ นจี้ ะสามารถพฒั นาไปเปน็ ตน้ พชื โดยตรง หรือแคลลัส หรือโครงสร้างคล้ายคัพภะ (embryo) ซ่ึงเรียกว่าเอ็มบริออยด์ (embryoid) หลังจากนั้นจึงพัฒนาไปเป็นต้นพืชท่ีสมบูรณ์ต่อไป เนื่องจาก เซลล์พืชมีคุณสมบัตทิ ่เี รยี กว่าโททโิ พเทนซี (totipotency) คือมคี วามสามารถ ทีจ่ ะเจริญเปน็ ต้นพืชที่สมบรู ณ์ได้ หลกั การเพาะเล้ยี งเนื้อเยอ่ื พชื หลกั การทสี่ ำ� คญั ของการเพาะเลยี้ งเนอ้ื เยอ่ื พชื คอื ตอ้ งใชเ้ ทคนคิ ปลอดเชอ้ื ตดั เอาชนิ้ สว่ นของพชื ทสี่ ะอาด นำ� มาเลยี้ งในขวดแกว้ ทบี่ รรจอุ าหารวทิ ยาศาสตร์ ซึ่งได้ผ่านการน่ึงฆ่าเช้ือมาเรียบร้อยแล้ว เมื่อเซลล์จากชิ้นส่วนต่างๆ ของพืช ทนี่ ำ� มาเลยี้ งไดร้ บั แรธ่ าตุ ไวตามนิ สารควบคมุ การเจรญิ เตบิ โต และนำ้� ตาล จาก อาหารวิทยาศาสตร์ ท่ใี ช้เลยี้ งในสภาพปลอดเชอื้ จะมีการเจริญเตบิ โตเป็นต้น โดยตรง หรอื เกดิ เปน็ กลุ่มของเซลลท์ เ่ี รียกวา่ “แคลลสั ” หรอื เกดิ ทีเ่ ปน็ คัพภะที่ เรยี กวา่ “โซมาตกิ เอมบรโิ อ” หรอื “เอมบรอิ อยด”์ และเมอื่ ตดั แบง่ เปน็ ชน้ิ ๆ แลว้ เปลีย่ นอาหารใหม่บ่อยๆ ก็สามารถเพม่ิ ปริมาณไดไ้ ม่มีท่ีสน้ิ สดุ ผลสุดท้ายกจ็ ะ ไดต้ น้ ทมี่ ลี กั ษณะเหมอื นกนั ทกุ ประการเปน็ จำ� นวนมากเหมาะทจี่ ะนำ� ไปใชข้ ยาย พันธ์ไุ ม้ดอก ไม้ประดับ ผัก ไม้ผล ไม้ปลูกป่า พืชไร่ รวมทั้งพืชสมุนไพรตา่ งๆ การขยายพนั ธพ์ุ ชื ดว้ ยเทคนคิ การเพาะเลยี้ งเนอ้ื เยอ่ื พชื
ประเภทของการเพาะเล้ยี งเน้ือเย่อื พืช การเพาะเล้ยี งเนือ้ เยื่อพชื แยกออกเป็นประเภทต่างๆ ไดด้ งั นี้ 1. การเพาะเลี้ยงพืช ทั้งต้น (Plant culture) โดยการเพาะเล้ียงเมล็ดในหลอด แก้วจนได้เป็นต้น เช่น การ เพาะเมล็ดกล้วยไม้ในหลอดแก้ว จนกระท่ังพัฒนาเปน็ ตน้ พืช 2. การเพาะเลย้ี งคพั ภะ (Embryo culture) โดยแยกคพั ภะ 7 มาเลี้ยงในสภาพหลอดแก้วหลังจากแกะเอาเปลือกหุ้มเมล็ดออกแล้ว อาจเป็นคัพภะที่เจริญเต็มท่ีแล้ว (mature embryo) หรือยังอ่อนอยู่ (immature embryo) 3. การเพาะเล้ยี งอวัยวะ (Organ culture) เปน็ การแยก เอาอวยั วะไปเลยี้ งในสภาพหลอดแก้ว เช่น การเพาะเลี้ยงเนื้อเย่ือเจริญ (meristem) ปลายยอด ใบออ่ น ราก ดอกออ่ น ผลออ่ น อับละอองเกสร เปน็ ตน้ อวยั วะหรอื ช้นิ ส่วนเร่มิ ตน้ ที่นำ� มาเลีย้ งเรยี กวา่ Explant 4. การเพาะเล้ียงแคลลัส (Callus culture) โดยการ เพาะเล้ียงคัพภะหรืออวัยวะให้เจริญเติบโตเป็นแคลลัสซึ่งเป็นก้อน เน้ือเยื่อที่ประกอบด้วยเซลล์มีลักษณะเหมือนกัน ไม่สามารถบอกได้ว่า มาจากส่วนไหนของพืช (dedifferentiated tissue) แล้วจึงน�ำแคลลัส ไปเลย้ี งต่อไป 5. การเพาะเลยี้ งเซลลแ์ ขวนลอย (Suspension culture) เป็นการเพาะเล้ียงเซลล์เดี่ยวหรือกลุ่มเซลล์ ขนาดเลก็ มากซง่ึ กระจายตวั และเจรญิ เตบิ โตอยใู่ นอาหารเหลว 6. การเพาะเล้ียงโพรโทพลาสต์ (Protoplast culture) เป็นการเพาะเล้ียง เซลลท์ ี่ผนังเซลลถ์ ูกย่อยดว้ ยเอนไซม์ การขยายพนั ธพ์ุ ชื ดว้ ยเทคนคิ การเพาะเลยี้ งเนอ้ื เยอ่ื พชื
8 การขยายพนั ธพ์ุ ชื ดว้ ยเทคนคิ การเพาะเลย้ี งเนอื้ เยอ่ื พชื
9 หอ้ งปฏบิ ัติการ เพาะเลีย้ งเน้ือเย่ือพชื ต้องเป็นห้องที่สะอาดปราศจากเชื้อ สามารถควบคุมสภาพแวดล้อมได้ โดยเฉพาะอุณหภูมิ โดยการตดิ ตง้ั เครอื่ งปรบั อากาศ ควบคมุ อณุ หภมู ใิ หอ้ ยรู่ ะหวา่ ง25-28 องศาเซลเซยี ส ไดร้ บั แสง16 ชว่ั โมงตอ่ วนั มืด 8 ช่ัวโมงต่อวัน ความเขม้ แสงประมาณ 2000 ลกั ซ์ การขยายพนั ธพ์ุ ชื ดว้ ยเทคนคิ การเพาะเลยี้ งเนอื้ เยอื่ พชื
เครื่องมอื และอปุ กรณ์ ในการเพาะเลี้ยงเนอื้ เยื่อพชื 1. พันธพ์ุ ชื ที่จะน�ำมาเพาะเลีย้ งเนอ้ื เย่อื ควรจะ สะอาดปราศจากโรคและใชส้ ่วนท่ียังอ่อนอยู่ 2. เครอ่ื งทำ� นำ้� กลน่ั หรอื เครอื่ งกรองนำ�้ เพอื่ ผลติ น้�ำไว้ใชเ้ ตรยี มอาหาร และน้ำ� ยาฟอกฆ่าเชือ้ 3. เครื่องช่ัง 2 ตัว ตัวแรกเป็นเคร่ืองช่ังอย่าง ละเอยี ด สามารถชง่ั สารเคมแี ละสารควบคมุ การเจรญิ เติบโตได้ในปรมิ าณนอ้ ยมาก (ทศนยิ ม 4 ตำ� แหนง่ ) เคร่ืองชั่งอีกตัวหนึ่งเป็นเคร่ืองช่ังอย่างหยาบ มีไว้ สำ� หรบั ชั่งวุ้น และนำ�้ ตาล 10 4. เคร่ืองวดั ความเปน็ กรดเปน็ ดา่ ง (pH meter) 5. เตาแกส๊ เตาไฟฟ้า หรอื ตู้ไมโครเวฟ ส�ำหรบั ต้มวุน้ ใหล้ ะลาย 6. หม้อนึ่งความดัน (Autoclave) มีไว้ส�ำหรับ ฆ่าเชื้อในอาหาร ที่เตรียมไว้เพาะเลี้ยงเนื้อเย่ือ และ ฆ่าเชื้อท่ีติดมากับเครื่องมือผ่าตัด ในการน่ึงฆ่าเชื้อ ใชอ้ ณุ หภูมิ 121 องศาเซลเซยี ส ความดัน 15 ปอนด์ ต่อตารางน้วิ นงึ่ เปน็ เวลา 15-20 นาที การขยายพนั ธพ์ุ ชื ดว้ ยเทคนคิ การเพาะเลย้ี งเนอ้ื เยอ่ื พชื
7. ตู้อบแหง้ (Oven) มไี วส้ ำ� หรับฆา่ เชอ้ื ท่ตี ดิ มา กบั เครื่องแก้ว และเครอื่ งมอื ผา่ ตัด ใชอ้ ณุ หภูมิ 180 องศาเซลเซียส เปน็ เวลา 3 ชว่ั โมง 8. ตู้เย็น มีไว้ส�ำหรับเก็บสารเคมี ที่เตรียมไว้ เป็น Stock Solution สารควบคุมการเจริญเติบโต และไวตามนิ 9. ตู้หรอื ชัน้ วางสารเคมี 10. ตเู้ ก็บเครื่องแกว้ 11. ตยู้ ้ายเนื้อเยอ่ื (Transfer Cabinet, Bioclean หรอื Laminar flow) ภายในตปู้ ระกอบด้วยแผ่นกรอง ฝุ่นละออง และเช้ือจลุ นิ ทรียจ์ ากอากาศ 2 แผ่น คือ Pre - filter และ Absolute Filter นอกจากนยี้ งั ใช้ ระบบอนื่ ๆ รว่ มดว้ ยชว่ ยในการฆา่ เชอ้ื เชน่ ใชแ้ สงUV (Ultraviolet) การฉีดพ่นด้วยเอทธิลแอลกอฮอล์ 70% หรือการอบดว้ ยฟอรม์ าลนิ และดา่ งทบั ทิม 11 12. ช้นั วางขวดเพาะเล้ยี งเนอ้ื เย่ือ (Culture shelf) ทำ� ด้วยไม้ หรือเหลก็ ฉาก มปี ระมาณ 4 ชนั้ ขนาดชน้ั กวา้ ง 60 เซนติเมตร ยาว 125 เซนตเิ มตร แตล่ ะชั้นสงู 50 เซนตเิ มตร ติดหลอดไฟ White Light หรือ Gro lux ที่มคี วามเข้มของแสง ประมาณ 100 ฟุตแคนเดลิ เปดิ เป็นเวลา 16 ช่ัวโมง และปดิ เปน็ เวลา 8 ชวั่ โมงตอ่ วัน การขยายพนั ธพ์ุ ชื ดว้ ยเทคนคิ การเพาะเลย้ี งเนอื้ เยอ่ื พชื
13. เคร่ืองเขย่า (Shaker) เมอื่ เลย้ี งเนอื้ เยอ่ื ในอาหารเหลว ต้อง วางขวดบนเคร่ืองเขย่า 12 ที่เคลื่อนท่ีในอัตรา 120 รอบต่อนาที เป็นการเพม่ิ ออกซิเจนลงไปในอาหาร 14. เคร่ืองปรับอากาศ จ�ำเป็นต้องมีไว้ในห้องเพาะ เลี้ยงเนื้อเยือ่ และหอ้ งยา้ ยเนอื้ เย่ือ ควบคุมอณุ หภมู ิให้อยู่ ประมาณ 25 ถึง 28 องศาเซลเซยี ส 15. เครอ่ื งแก้วต่างๆ ทใี่ ช้เตรยี มอาหาร ได้แก่ กรวย กระบอกตวง ฟลาสก์ ปิเปตต์ บีกเกอร์ เคร่ืองแก้วท่ีใช้ ในการเพาะเล้ียงเน้ือเยื่อได้แก่ ฟลาสก์ หลอดแก้ว หลอดทดลอง มดี ผา่ ตดั ปากคบี กรรไกร 16. เครอื่ งมือผ่าตัด ประกอบด้วย มดี ผ่าตัด ปากคบี กรรไกร 17. อปุ กรณอ์ ่นื ๆ ไดแ้ ก่ อลมู ินมั ฟอยด์ สำ� ลี ตะเกียง แอลกอฮอล์ กระดาษทิชชู และกระดาษกรอง การขยายพนั ธพ์ุ ชื ดว้ ยเทคนคิ การเพาะเลย้ี งเนอ้ื เยอ่ื พชื
13 ห้องปฏบิ ัตกิ ารเพาะเลย้ี งเนื้อเยอ่ื พืช การเลี้ยงเน้ือเย่ือเป็นการเลี้ยงชิ้นส่วน เซลล์ โพรโทพลาสต์ บนอาหารสังเคราะห์ ในอาหารสังเคราะหม์ ีส่วนประกอบทเี่ หมาะสมกบั การเจริญของเชื้อจุลิทรีย์ด้วย ในการเล้ียงเนื้อเยื่อจ�ำเป็นที่ต้องท�ำการ ฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ที่ติดมากับวัสดุพันธุ์พืช อาหาร เคร่ืองมือที่ใช้ทั้งหมด โดยเฉพาะอย่างยิ่งเครื่องมือท่ีใช้ในการตัดและเล้ียงเนื้อเย่ือ ซึ่งต้อง ท�ำในสภาพปลอดเชื้อ ความสะอาดเป็นหัวใจส�ำคัญโดยการเพาะเลี้ยง เน้ือเยื่อ ถ้าไม่สะอาดเนื้อเยื่อที่เลี้ยงจะตายเพราะเกิดการปนเปื้อนของ เช้ือจุลินทรีย์ เพื่อให้ได้สภาพท่ีปลอดเชื้อในระดับที่สูง ต้องค�ำนึงถึง ห้องปฏบิ ตั ิการเพาะเลี้ยงเนอื้ เยอ่ื โดยตงั้ แตเ่ รม่ิ สร้างห้องปฏิบตั กิ าร การขยายพนั ธพ์ุ ชื ดว้ ยเทคนคิ การเพาะเลย้ี งเนอ้ื เยอ่ื พชื
14 การเลอื กท�ำเลทจ่ี ะสรา้ งหอ้ งปฏบิ ตั กิ าร ดงั น้ี - มีฝุน่ นอ้ ย - มีไฟฟ้า ส�ำหรับในสถานท่ีท่ีมีไฟฟ้าเสียบ่อย ๆ ควรท่ีจะต้อง มีเครือ่ งกำ� เนดิ ไฟฟ้าส�ำรอง (Standby Generator) และมตี ัวตัดไฟฟา้ อัตโนมัตใิ นกรณผี ดิ ปกติ เพือ่ ปอ้ งกันเครอ่ื งใช้ไฟฟ้าต่างๆท่เี สยี หายอาจ จะเสยี หายเนอ่ื งจากกระแสไฟฟา้ กระชาก - มแี หล่งน�ำ้ สะอาดอย่างสมำ�่ เสมอ - ควรเล่ียงพื้นที่ ที่มีความชื้นเกินไป เพราะความช้ืนจะท�ำให้ เกิดการปนเปื้อนได้ค่อนสูงในการเล้ียง และห่างไกลจากพ้ืนที่ที่มีการ เลยี้ งสตั ว์ หรือโรงเหด็ การขยายพนั ธพ์ุ ชื ดว้ ยเทคนคิ การเพาะเลยี้ งเนอ้ื เยอ่ื พชื
องค์ประกอบของของห้องปฏิบัติการเพาะ 4. ห้องเล้ียงเน้ือเย่อื เลี้ยงเนื้อเยือ่ (Culture room) สว่ นประกอบของพนื้ ทท่ี จ่ี ำ� เปน็ ตอ่ การปฏบิ ตั กิ าร ถ้าเป็นห้องปฏิบัติการขนาดเล็กอาจจัดรวมอยู่ เพาะเลี้ยงเน้ือเย่ือพืช ประกอบด้วยห้องปฏิบัติการ ในห้องเดียวกับห้องย้ายเน้ือเย่ือ และต้องการความ แยกเปน็ ส่วน ๆ โดยควรค�ำนงึ ถึงความสะดวกในการ สะอาดและปลอดโรคเชน่ เดยี วกนั หากเปน็ ไปได้ควร ปฏบิ ตั งิ าน การใชเ้ นอื้ ทใ่ี หเ้ กดิ ประโยชนม์ ากทส่ี ดุ และ ติดหลอดอัลตราไวโอเลตเพ่ือใช้ฆ่าเช้ือจุลินทีรย์เป็น คา่ ก่อสรา้ งนอ้ ยที่สดุ ดงั น้ี บางคร้ัง อุปกรณ์ที่ส�ำคัญ ได้แก่ ช้ันเล้ียงเนื้อเย่ือ 1. หอ้ งเก็บสารเคมี ที่มีขนาดพอเหมาะและจัดวางในต�ำแหน่งที่มี (Chemical stored room) ชอ่ งทางเดนิ สะดวกท่ัวถึง มีระบบระบายอากาศและ ควรเป็นห้องแยกเฉพาะใช้เก็บสารเคมีเป็น ติดต้ังเครื่องปรับอากาศเพ่ือการควบคุมการเล้ียงใน หม ว ด ห มู ่ ไ ว ้ ใ น ตู ้ ท่ี ว า ง กั บ พ้ื น ตู ้ ติ ด ผ นั ง สภาพท่ีเหมาะสมท่ีสุด เครื่องเขย่า (shaker หรือ หรอื ตแู้ ขวนลอยกไ็ ด้ เพ่อื สะดวกในการหยบิ ใช้ rotator) สำ� หรบั เนอ้ื เย่ือที่เล้ยี งในอาหารเหลว 2. หอ้ งเตรียมอาหาร 5. ห้องพักนกั วิจยั (Preparation room) (Researcher room) ควรมีเนอ้ื ท่ีกว้างขวางพอท่ีจะจดั อปุ กรณ์ต่าง ๆ ถ้ามีเนื้อท่ีเพียงพออาจจัดเป็นมุมเล็กๆ ได้แก่ โต๊ะท�ำงาน โต๊ะวางเคร่ืองมือ ตู้เก็บอาหาร ในส่วนของห้องย้ายเนือ้ เยอ่ื หรือแยกเป็นห้องเฉพาะ ขวดและภาชนะส�ำหรับเลย้ี ง และเครอื่ งแกว้ ตา่ ง ๆ ในบริเวณใกล้เคียง เพื่อใช้เป็นส่วนนั่งท�ำงาน อ่างน�้ำ ตู้เย็นส�ำหรับเก็บอาหารเหลวและสารเคมี เก็บเอกสาร ต�ำรา และอุปกรณ์ท่ีส�ำคัญบางอย่าง บางชนิดที่ต้องเก็บในที่เย็น เคร่ืองมือวิทยาศาสตร์ที่ ของนักวิจัย การวางผังห้องปฏิบัติการส�ำหรับ 15 ควรมอี ยใู่ นหอ้ งนี้ ได้แก่ เครอื่ งวัดความเป็นกรดและ การเพาะเล้ียงเนื้อเย่ือมักจะไม่ตายตัวท่ีแน่นอน ดา่ ง(pHmeter) เครอ่ื งกรองนำ�้ เครอ่ื งทำ� นำ�้ กลน่ั เตา แตใ่ หส้ ามารถปรบั ไดเ้ ขา้ กบั สภาพพน้ื ทแ่ี ตล่ ะแหง่ แต่ แกส๊ หมอ้ นงึ่ ความดนั (autoclave) เตาอบไมโครเวฟ จะต้องค�ำนงึ ดังน้ี และเครือ่ งช่ัง เปน็ ต้น - มคี วามเปน็ ระเบยี บ ซง่ึ จะชว่ ยลดการปนเปอ้ื น 3. ห้องยา้ ยเนอื้ เยือ่ ของเชอื้ จลุ ินทรยี ไ์ ด้ (Transferring or incubation room) - การท�ำงานสามารถทำ� ไดส้ ะดวกจะต้องมพี ืน้ ที่ ต้องมีความสะอาดและปลอดเช้ือ จึงควรปิด เพียงพอ แตไ่ ม่ควรใหญ่เกินไปเพราะจะเสียพลงั งาน ให้สนิทและมีการผ่านเข้าออกน้อยที่สุดเท่าท่ีจ�ำเป็น มาก พ้ืนที่จะต้องค�ำนวณจากจ�ำนวนคนท่ีจะท�ำงาน อุปกรณ์ที่ส�ำคัญ ได้แก่ ตู้ย้ายเนื้อเยื่อ (Laminar ในห้องนั้น Air-Flow Cabinet) กลอ้ งจุลทรรศน์ เครือ่ งวัดความ - วางผังให้ใช้ง่ายได้อย่างมีประสิทธิภาพและ นำ� ไฟฟา้ สารเคมแี ละอปุ กรณเ์ กย่ี วกบั การฟอกฆา่ เชอื้ ประหยัดเวลา - การท�ำงานในแต่ละห้องให้สามารถท�ำงานได้ แบบไหลเลอื น (flow) ของงาน จะตอ้ งเปน็ ไปอย่าง ธรรมชาติ เราจะวางแผนได้เราต้องทราบขั้นตอนใน การท�ำงานก่อน และท�ำอะไรก่อนหลัง จะได้วางผัง หอ้ งปฏบิ ัติการเพาะเลย้ี งเนือ้ เย่อื ไดถ้ กู ต้อง การขยายพนั ธพ์ุ ชื ดว้ ยเทคนคิ การเพาะเลย้ี งเนอ้ื เยอื่ พชื
ลกั ษณะการใช้งานห้องปฏิบัตกิ ารตา่ งๆ โดยทั่วไปห้องปฏิบัติการเพาะเลี้ยงเนื้อเย่ือ - กลอ่ งโลหะใสจ่ านอาหารเพาะเลี้ยง ควรมีการแยกสัดส่วนที่แน่นอนตามลักษณะของการ - ภาชนะพาลสติก ใช้งานและอยู่ในอาคารบริเวณเดียวกัน แต่ละส่วน - จุกส�ำลี กระดาษตะถ่ัว (Aluminum foil) ที่แยกน้ีควรมีเคร่ืองมือวัสดุอุปกรณ์ต่าง ๆ ที่ต้อง พาราฟลิ ม์ ใชอ้ ยู่ด้วย เชน่ มโี ตะ๊ และชั้นวางของเพอ่ื ใหเ้ ครอื่ ง - ถงั เก็บนำ�้ กล่ัน มือแต่ละชนิดพร้อมจะใช้งานได้ทันที ข้อส�ำคัญ - เครื่องหมนุ เหวย่ี ง (Centrifuge) คือ ความสะอาด ถ้าเป็นห้องปิดไม่มีลมพัดได้ยิ่ง - ตู้เยน็ เกบ็ สาร ดี ผนังห้องควรเรียบ เพื่อไม่ให้เป็นที่หลบซ่อนของ ห้องยา้ ยเล้ียงหรอื หอ้ งปลอดเช้อื จลุ ินทรีย์ตา่ ง ๆ ควรเป็นห้องปิดภายในปรับอากาศ อาจติดตั้ง หอ้ งปฏบิ ัตกิ ารทว่ั ไป หลอดไฟอัลตราไวโอเลต (Ultraviolet, UV) เพอ่ื ฆา่ เป็นห้องท่ีใช้ส�ำหรับการเตรียมชิ้นส่วน และ เชื้อในอากาศ และมีวัสดอุ ปุ กรณ์ดังต่อไปน้ี เตรียมอาหารเพาะเล้ียง โดยมีโต๊ะส�ำหรับเตรียม - เคร่อื งปรับอากาศ พรอ้ มพดั ลมดดู อากาศออก อาหาร ตู้เกบ็ เครือ่ งแก้วและเคร่ืองมอื ตา่ ง ๆ วัสดุ - ตู้ปลอดเชอื้ (Lamimar air flow cabinet) อปุ กรณท์ ค่ี วรมใี นหอ้ งน้ี ได้แก่ - ตะเกียงแกส๊ ตะเกยี งแอลกอฮอล์ - กล้องสเตอรโิ อ 16 - เคร่ืองแก้วชนดิ ตา่ ง ๆ - กระดาษกรอง - สารเคมี - จานอาหารเพาะเล้ียง - หม้อนึง่ ความดนั (Autoclave) - เครอื่ งชงั่ อยา่ งละเอยี ด (ความแมน่ ยำ� ถงึ 0.01) - แอลกอฮอล์ความเขม้ ข้นตา่ ง ๆ - เคร่อื งกวนสารละลายแบบมแี ผน่ ให้ความรอ้ น - ปากคบี มดี ผ่าตัด (Hotplate stirrer) - สารเคมีพวกสเตอริแลนด์ (Sterilants) เช่น - เครื่องกวนหรือผสม ส�ำหรบั การเตรียมอาหาร โซเดยี มไฮโพคลอไรด์ (NaOCl) คลอรอกซ์ (Clorox) จ�ำนวนมาก ๆ สำ� หรบฟอกฆ่าเช้อื - เตาอบไมโครเวฟ ส�ำหรับท�ำให้ร้อนเร็ว ห้องลา้ งเครอื่ งมอื และละลายวนุ้ อาหาร - เคร่ืองจ่ายอาหารอัตโนมัติ (Automatic ควรมบี ริเวณส�ำหรบั วางชนั้ เคาน์เตอรแ์ ละอ่าง Dispensor) ลา้ งเคร่ืองแกว้ วัสดอุ ุปกรณ์ทค่ี วรมใี นห้องน้ี คือ - ตูอ้ บแหง้ (Oven) ส�ำหรับอบเคร่ืองแกว้ ใหแ้ หง้ - เครอ่ื งปรับความเป็นกรดด่าง - สารซกั ฟอก สำ� หรบั ลา้ งเครอื่ งแกว้ และภาชนะ - เครื่องกรองน�้ำระบบรีเวอร์ออสโมซิส หรือ เครอ่ื งกลนั่ น้ำ� ทเ่ี ปน็ พลาสตกิ - ชอ้ นตักสาร - ชั้นหรือเคาน์เตอร์ส�ำหรับวางเคร่ืองแก้วท่ีจะ - ชุดกรองมลิ ลพิ อร์ (Milipore filter system) ล้างและเก็บเครอื่ งแก้วทลี่ า้ งแลว้ - ตะแกรงโลหะส�ำหรับใส่หลอดทดลองใน หมอ้ นึง่ ความดัน การขยายพนั ธพ์ุ ชื ดว้ ยเทคนคิ การเพาะเลยี้ งเนอื้ เยอื่ พชื
17 ห้องเพาะเลีย้ ง - ชน้ั ไฟเพาะเลยี้ งเนือ้ เยื่อ เปน็ หอ้ งสำ� หรบั เพาะเลยี้ งชน้ิ สว่ นพชื ภายใตก้ าร - หลอดไฟโกรลกั ซ์ (Gro-lux) ใหแ้ สงสวา่ ง หรอื ควบคมุ สภาพแวดลอ้ มอนั ไดแ้ ก่ อณุ หภมู ิ ความชน้ื หลอดฟลอู อเรสเซนต์ทัว่ ๆ ไป และแสงสวา่ ง วัสดอุ ปุ กรณท์ ีค่ วรมีในห้องนี้ คอื - เครื่องเขย่าทั้งแบบธรรมดาและแบบควบคุม - เครื่องปรับอากาศ เพื่อควบคุมอุณหภูมิและ อุณหภูมิ ความชน้ื ใหอ้ ยใู่ นชว่ งประมาณ17-27 องศาเซลเซยี ส - นาฬิกาต้งั เวลาสว่างและมืด ควรมีสองเคร่ืองไว้เปิดสลับกันไป ในกรณีที่เคร่ือง - เทอรโ์ มมิเตอร์สำ� หรบั วดั อณุ หภมู ิ หนงึ่ ชำ� รดุ นำ� ไปซอ่ มแซม อกี เครอ่ื งหนงึ่ สามารใชง้ าน - ต้เู พาะเลย้ี งแบบควบคมุ อุณหภมู ิ ได้ ท�ำให้ไม่เกิดความเปล่ียนแปลงในด้านอุณหภูมิ - จานหมุน (Roler drums) และแสงสว่างมากนกั การขยายพนั ธพ์ุ ชื ดว้ ยเทคนคิ การเพาะเลยี้ งเนอื้ เยอ่ื พชื
18 1. ธาตุอาหารอนินทรีย์ (Inorganic element) ประกอบด้วย ธาตอุ าหารหลกั (Macroelement) เปน็ สารอนนิ ทรีย์ทพี่ ชื ตอ้ งการ ใชใ้ นปรมิ าณมาก ได้แก่ คารบ์ อน (C) ไฮโดรเจน (H) ออกซิเจน (O) ไนโตรเจน (N) ฟอสฟอรสั (P) โปแตสเซยี ม (K) ซัลเฟอร์ (S) แคลเซยี ม (Ca) และแมกนเี ซยี ม (Mg) ซง่ึ อาจจะใชใ้ นรปู ของแอมโมเนยี มไนเตรต (คNลHอ4ไธNราดOต์ 3ุอ()CาโหaปCาแรlต2ร)สอเเงปซน็ยี (Mตมน้ไiดcrไoฮeโดleรmเจeนnฟtอ) สเเปฟ็นตส(าKรHอ2PินOท4ร)ียแ์ทล่ีพะืชแตค้อลงเซกยี ามร เพยี งเล็กน้อย แต่จำ� เปน็ ต่อการเจริญเตบิ โต ไดแ้ ก่ เหล็ก (Fe) คลอรนี (Cl) แมงกานีส (Mn) ทองแดง (Cu) สังกะสี (Zn) โบรอน (B) และ โมลบิ ดินัม (Mo) การขยายพนั ธพ์ุ ชื ดว้ ยเทคนคิ การเพาะเลย้ี งเนอ้ื เยอ่ื พชื
อาหารวทิ ยาศาสตร์ ส�ำหรับเพาะเลยี้ ง เนื้อเยื่อพชื 2. สารประกอบพวกคาร์บอนที่ให้ 19 พลังงาน ได้แก่ น�้ำตาลซโู ครสในปริมาณ 2-4% 3. ไวตามิน และสารอ่ืนๆ ไดแ้ ก่ thiamine, nicotinic acid, pyridoxine, inositol, pantothenic acid และ biotin 4. สารควบคมุ การเจริญเติบโต (Growth regulator) ได้แก่ Auxin ที่ใชม้ ากคอื IAA (3-indoleacetic acid) IBA (3-indolebutyric acid) NAA (naphthalene acetic acid) 2,4-D (2,4-dichlorophenoxy acetic acid) Cytokinin ที่ใช้มากคอื Kinetin (6-furfurylamino purine) BA (6-benzylamino purine) 2-ip (r-r dimethylalylamino purine) Zeatine 5. สารอนนิ ทรยี ท์ ี่ไดจ้ ากธรรมชาติ ไดแ้ ก่ น�้ำมะพร้าว น้�ำมะเขือเทศ น้�ำสกัดจากหัวมันฝรั่ง กล้วยบด yeast extract และ casein hydrolysate เป็นต้น การขยายพนั ธพ์ุ ชื ดว้ ยเทคนคิ การเพาะเลยี้ งเนอ้ื เยอ่ื พชื
สว่ นประกอบ Murashige Vacin Gamborg McCowan Nitsch Heler White และ Skoog และ , Miler และ Lloyd และ (1953) (1963) สสาารรอนินนททรรียยี์ ์ (1962) Went และ (WPM; Nitsch (1949) Ojima 1980)* (1969) (1968) KCl - -- - --- NH4NO3 1,650 - - 400 720 - - KNO3 1,900 525 2,500 - 950 - 80 CaCl2.2H2O 440 - 150 96 166 75 - CaCl2 - -- - --- Ca(NO3)2.4H2O - - - 556 - - - Ca3(PO4)2 - 200 - - --- MgSO4.7H2O 370 250 250 370 185 250 750 K2SO4 - - - 990 - - - 20 KH2PO4 170 250 - 170 68 - - (NH4)2SO4 - 500 134 - --- Ca(NO3)2.4H2O - -- - - - 300 NaNO3 - -- - - 600 - Na2SO4 - -- - - - 200 NaH2PO2.H2O - - 150 - - 125 19 KCl - -- - - 750 65 KI 0.83 - 0.75 - - 0.01 0.75 H3BO3 6.2 - 3 6.2 10 1 1.5 MnSO4.4H2O 22.3 5.7 10 22.3 19 0.1 5 ZnSO4.7H2O 8.6 - 2 8.6 10 1 3 MoO3 - -- - - - 0.001 Na2MoO4.2H2O 0.25 - 0.25 0.25 0.25 - - CuSO4.5H2O 0.025 - 0.025 0.25 0.025 0.03 0.01 การขยายพนั ธพ์ุ ชื ดว้ ยเทคนคิ การเพาะเลย้ี งเนอื้ เยอ่ื พชื
ตารางท่ี 1 (ต่อ) ส่วนประกอบ Murashige Vacin Gamborg McCowan Nitsch Heler White CoCl2.6H2O และ Skoog และ , Miler และ Lloyd และ (1953) (1963) AlCl3 NiCl2.6H2O (1962) Went และ (WPM; Nitsch FeCl3.6H2O Fe(C4H2O6)3.2H2O (1949) Ojima 1980)* (1969) Fe2(SO4)3 FeSO4.7H2O (1968) Na2.EDTA EDTA sodium ferric 0.025 - 0.025 - 0.025 - - salt สารสอานิ รทอรียิน์ ทรยี ์ - -- - - 0.03 - Myo-inositol Nicotinic acid - -- - - 0.03 - Pyridoxine HCl Thiamine HCl - -- - -1- Glycine Cystein - 28 - - --- Folic acid Biotin - -- - - - 2.5 Sucrose Coconut milk 27.85 - - 27.8 27.8 - - 37.25 - - 33.6 37.3 - - - 40 - - - - 100 - 100 100 100 100 - 21 0.5 - 1 0.5 5 5 0.05 0.5 - 1 0.5 0.5 0.5 0.01 0.1 - 10 1 0.5 0.5 0.01 2 -- 2 523 - -- - --1 - -- - - 0.5 - - -- - - 0.05 - 30,000 20,000 20,000 20,000 20,000 20,000 20,000 - 150 - - --- มลิ ลิลิตร การขยายพนั ธพ์ุ ชื ดว้ ยเทคนคิ การเพาะเลยี้ งเนอ้ื เยอ่ื พชื
ตารางท่ี 2 การเตรยี มสารละลายเขม้ ข้นและการเตรยี มอาหารตามสูตรของ Murashige และ Skoog (1962) สตู รสารเคมี ปริมาณสารเคมีในอาหาร ปริมาณสารเคมใี น ปริมาณสารละลายเข้มขน้ (มิลลิกรัมตอ่ ลิตร) สารละลายเขม้ ข้น ทีใ่ ช้เตรียมอาหาร NH4NO3 1 ลติ ร (มลิ ลิลิตร) KNO3 1650 (กรัมตอ่ ลิตร) 100 CaCI2.2H2O 1900 stock # 1; 10 เท่า MgSO4.7H2O 440 KH2PO4 370 16.50 170 19.00 4.40 3.70 1.70 stock # 2; 100 เท่า 10 6.2 0.62 H3BO3 0.83 0.083 KI 0.25 0.025 Na2MoO4.2H2O 0.025 0.0025 CoCI2.6H2O 22.3 2.23 8.6 0.86 22 MnSO4. 4H2O 0.025 0.0025 ZnSO4.7H2O CuSO4.5H2O stock # 3; 100 เทา่ 10 37.25 3.725 Na2 EDTA 27.85 2.785 FeSO4. 7H2O Thiamine.HCI 0.1 stock # 4; 100 เทา่ 10 Nicotinic acid(Niacine) 0.5 0.01 Pyridoxine.HCI 0.5 0.05 * Glycine 2.0 0.05 * Myo-inositol 100.0 0.20 Sucrose 3 เปอรเ์ ซน็ ต์ 10.0 Agar 1 เปอรเ์ ซ็นต์ - - การขยายพนั ธพ์ุ ชื ดว้ ยเทคนคิ การเพาะเลยี้ งเนอื้ เยอื่ พชื
“ อาหารวทิ ยาศาสตร์ “ ส�ำหรบั เพาะเลี้ยงเนอ้ื เยอ่ื พืช เป็นปจั จยั ทม่ี ีผลต่อความส�ำเรจ็ ในการเล้ยี งเน้อื เย่อื พชื ทีส่ �ำคัญยิ่งประการหนง่ึ
การคัดเลือกชิ้นส่วน ของพชื ทจ่ี ะนำ� มาเพาะ เลย้ี งเนอ้ื เยอ่ื
พันธุ์พืชท่ีจะน�ำมาเพาะเลี้ยงเน้ือเย่ือ ควรจะ สะอาดปราศจากโรค และใช้ส่วนที่ยังอ่อนอยู่ ต้อง 25มีการคัดเลือกให้เหมาะสม แล้วแต่ชนิดของพืช กล้วยไม้ส่วนใหญ่จะใช้ตา หน้าวัวใช้ใบอ่อน ลิลลี่ น ใชส้ ่วนของดอก ไผใ่ ช้เมล็ด เปน็ ตน้ ชน้ิ ส่วนของพืช เหล่านี้ต้องสะอาด ถ้าต้องการต้นท่ีปราศจากไวรัส ก็ต้องใช้เนื้อเย่ือเจริญที่อยู่ปลายสุดท่ีมีขนาดเล็ก ความยาวไมเ่ กนิ 0.5 มิลลิเมตรไปเลยี้ ง ะ การท�ำความสะอาดชิ้นส่วนพชื เน่ืองจากอาหารท่ีใช้เล้ียงเนื้อเยื่อพืช ประกอบด้วยธาตุอาหาร น�้ำตาล ไวตามิน และ สารควบคุมการเจริญเติบโตอยู่ด้วย จึงเหมาะสมต่อการเจริญเติบโตของเช้ือจุลินทรีย์ เป็นอย่างดี และบางคร้ังเจริญได้เร็วกว่าเน้ือเยื่อพืช ดังนั้นนอกจากการฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ ได้ และล้างออกได้ง่าย สารเคมีบางชนิดแม้ว่าจะฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ได้ แต่ล้างออกยาก จะมผี ลท�ำใหเ้ นอื้ เยอื่ ตาย หรอื เจริญเติบโตได้ไมด่ ีเท่าท่คี วร สารเคมีทีน่ ิยมใช้ไดแ้ ก่ แคลเซียมไฮโปคลอไรท์ 9-10% โซเดียมไฮโปคลอไรท์ 2-5% หรอื ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 10-12% การขยายพนั ธพ์ุ ชื ดว้ ยเทคนคิ การเพาะเลยี้ งเนอ้ื เยอื่ พชื
การเตรียมน้�ำยาฆา่ เชอื้ 1. เอทธิลแอลกอออล์ 70% เตรียมได้จากการ ใช้เอทธิลแอลกอฮอล์ 95% จ�ำนวน 70 มิลลิลิตร แลว้ เตมิ นำ�้ 25 มลิ ลิลิตร 2.คลอร็อกซ์ 10% ได้จากการใช้น�้ำ 90 มิลลิลิตร ท่นี ึ่งฆา่ เชื้อโรคไวก้ อ่ น เม่ือจะใชก้ ็เติม คลอร็อกซ์ 10 มลิ ลิลติ ร และสารเปยี กใบ เช่น Tween 20 1-2 หยด 3. คลอรอ็ กซ์ 5% ได้จากการใชน้ ำ้� 95 มลิ ลิลติ ร ท่ีนึ่งฆ่าเชื้อโรคไว้ก่อน เมื่อจะใช้ก็เติมคลอร็อกซ์ 5 มลิ ลลิ ติ ร และสารเปยี กใบ เชน่ Tween 20 1-2 หยด 4. น้�ำ 100 มิลลิลิตร ที่น่ึงฆ่าเชื้อโรคแล้วมีไว้ ส�ำหรบั ล้างคลอร็อกซ์ ออกจากชนิ้ สว่ นของพชื กอ่ น ทจี่ ะนำ� ไปเล้ียงบนอาหาร หมายเหตุ คลอรอ็ กซ์เปน็ สารฆา่ เชอ้ื ประกอบ 26 ด้วยโซเดียมไฮโปคลอไรท์ 5.25% การขยายพนั ธพ์ุ ชื ดว้ ยเทคนคิ การเพาะเลย้ี งเนอ้ื เยอ่ื พชื
วธิ ีการฟอกฆา่ เชือ้ 27 1. น�ำชิน้ ส่วนของพืชมาล้างให้สะอาด 2. ชุบด้วยเอทธิลแอลกอฮอล์ 70% 3. แช่ในนำ�้ ยาคลอรอ็ กซ์ 10% เปน็ เวลา 15 นาที 4. ลา้ งดว้ ยนำ�้ ทน่ี ง่ึ ฆา่ เชอื้ แลว้ เอานำ�้ ยาคลอรอ็ กซ์ ออกใหห้ มด 5. ใช้เทคนิคปลอดเช้ือ ตัดชิ้นส่วนท่ีต้องการ ไปเลย้ี งบนอาหาร โดยหลักการแล้วไม่ว่าจะเป็นชิ้นส่วนพืชชนิด ใดก็ตาม จะมีวิธีการในการฟอกฆ่าเชื้อที่คล้ายกัน ตามวธิ ีดงั กล่าว แต่ในทางปฏิบตั ิแล้ว ลกั ษณะความ แตกตา่ งของชนิ้ สว่ นพชื เชน่ ตายอด ตาขา้ ง ใบ ดอก ปลายราก ฝักอ่อน นนั้ มีความแตกต่างกันมาก ทัง้ ใน เรื่องของรูปร่างลักษณะ ความทนทานต่อการฟอก ฆ่าเช้ือ และความยากง่ายในการก�ำจัดเช้ือจุลินทรีย์ ที่ตดิ มากบั ผิวพืช ส่งิ ตา่ งๆ เหลา่ นี้เปน็ ข้อกำ� หนดให้ เกิดเทคนคิ ท่ีแตกต่างกันออกไป ดงั จะได้ยกตัวอยา่ ง พอสังเขป แต่อย่างไรก็ตาม หากผู้ปฏิบัติมีความ ชำ� นาญ เทคนิคเหล่าน้อี าจเปลี่ยนแปลงได้ตามความ เหมาะสม การขยายพนั ธพ์ุ ชื ดว้ ยเทคนคิ การเพาะเลย้ี งเนอื้ เยอ่ื พชื
วิธีการเพาะเลี้ยงเนื้อเย่ือพชื การเพาะเล้ียงเน้ือเย่ือพืชต้องใช้เทคนิค ปลอดเชอื้ โดยมีวธิ กี าร 3 ข้นั ตอนที่สำ� คญั คือ 1. น�ำช้ินส่วนของพืชมาท�ำการฟอกฆ่า เชือ้ จลุ นิ ทรยี ์ท่ตี ิดอย่ทู ผี่ ิวพชื (surface sterilization) วธิ เี พ่ิมปริมาณแคลลัสหรือต้น แล้วเล้ียงบนอาหารวิทยาศาสตร์ที่บรรจุอยู่ในขวด เมอื่ ทำ� การเพาะเลยี้ งเนอื้ เยอื่ ทตี่ อ้ งการจนไดเ้ ปน็ จนเจริญเติบโตและพัฒนาได้ต้น หรือแคลลัส หรือ แคลลัสหรือตน้ แล้ว ขน้ั ตอนส�ำคญั ข้นั ตอนต่อไปกค็ ือ เอมบริออยด์ท่ีปลอดเชอ้ื การท�ำใหแ้ คลลสั หรือตน้ เหลา่ นน้ั เพิ่มปริมาณขน้ึ ซึง่ 2. การเพิม่ ปรมิ าณ โดยการตดั แบง่ แยก วธิ กี ารโดยท่ัวไปมดี งั นคี้ อื ต้น หรือขอ้ หรอื แคลลสั ออกเป็นชน้ิ ๆ โดยใช้เทคนคิ 1. ท�ำการตัดแบ่งแคลลสั ออกเป็นชน้ิ เลก็ ๆ หรือ ปลอดเชอ้ื แลว้ ยา้ ยเปลย่ี นอาหารขวดใหมท่ กุ ๆ เดอื น ถ้าเป็นต้นก็ท�ำการตัดแบ่งออกเป็นล�ำต้น ใบ หรือ น�ำขวดไปวางบนช้ันเพาะเลี้ยงเน้ือเยื่อ หรือวางบน ราก ย้ายไปเล้ียงในอาหารใหม่ทุกเดอื นเร่ือยๆ ไป ก็ แท่นเขยา่ กจ็ ะเพม่ิ ปริมาณ 5-10 เทา่ เรอื่ ยๆ ไป สามารถเพิม่ ปริมาณได้มากมายไมม่ ที ่สี ิน้ สดุ 3. เมอ่ื ไดต้ น้ ทม่ี ากพอแลว้ กช็ กั นำ� ใหอ้ อก 2. ส�ำหรับแคลลัสน้ันจ�ำเป็นท่ีจะต้องบังคับให้ ราก และเมื่อเจรญิ เตบิ โตเป็นตน้ ท่ีสมบรู ณแ์ ข็งแรงดี เกิดเป็นต้น โดยใช้สารควบคุมการเจริญเติบโตพวก 28 แลว้ จึงนำ� ออกปลูกในดนิ ออกซินร่วมกับไซโตไคนิน การขยายพนั ธพ์ุ ชื ดว้ ยเทคนคิ การเพาะเลย้ี งเนอื้ เยอ่ื พชื
วิธีการน�ำต้นที่ ได้จากการเพาะเล้ียง 29 เนอื้ เย่อื ออกปลกู หลังจากเพ่ิมปริมาณต้นได้มากจนเป็นที่พอใจ แล้ว ข้ันตอนสุดท้ายที่จะเป็นตัวชี้ความส�ำเร็จคือ การนำ� ต้นออกปลกู ซึ่งมีวธิ ีการคอื 1. ใช้ปากคีบดงึ เอาตน้ ออกจา กอาหารว้นุ 2. ล้างน้ำ� ให้สะอาด 3. แชใ่ นน้ำ� ยากันราและแบคทเี รีย 4. น�ำออกปลูกลงดิน หรือวัสดุปลูกชนิดอ่ืนท่ี เหมาะสม เกบ็ ไว้ในที่รม่ และมีความชน้ื สูงช่ัวระยะ เวลาหน่ึง การขยายพนั ธพ์ุ ชื ดว้ ยเทคนคิ การเพาะเลยี้ งเนอื้ เยอ่ื พชื
30 การขยายพนั ธพ์ุ ชื ดว้ ยเทคนคิ การเพาะเลย้ี งเนอื้ เยอ่ื พชื
ตวั อยา่ ง การขยาย พนั ธพ์ุ ชื เศรษฐกจิ 31 บางชนดิ ดว้ ยการ เพาะเลย้ี ง เนอื้ เยอ่ื พชื การขยายพนั ธพ์ุ ชื ดว้ ยเทคนคิ การเพาะเลยี้ งเนอ้ื เยอ่ื พชื
32 การเพาะเลย้ี งเนื้อเยอ่ื กล้วย ในปจั จบุ นั กลว้ ยหลายชนดิ มคี วามตอ้ งการของตลาด และเรม่ิ มกี าร ส่งออกเปน็ สนิ คา้ และมรี าคาแพง การปลกู กล้วยเชงิ การคา้ จึงต้องการ ต้นพันธุ์กล้วยท่ีมีขนาดอายุใกล้เคียงกัน หรือสามารถก�ำหนดอายุของ ต้นพันธุ์ เพื่อง่ายในการบริหารจัดการ วิธีการเพาะเลี้ยงเนื้อเย่ือกล้วย การขยายพันธุ์กล้วย เป็นวิธีการขยายพันธุ์พืชวิธีหนึ่ง แต่มีการปฏิบัติ ภายใต้สภาพทค่ี วบคุม เรือ่ ง ความสะอาดแบบปลอดเชอ้ื อุณหภูมิ และ แสง ด้วยการนำ� ชน้ิ สว่ นของพชื ที่ยงั มชี วี ิต เชน่ ลำ� ตน้ ยอด ตาข้าง กา้ น ชอ่ ดอก ใบ ก้านใบ อบั ละอองเกสร เปน็ ตน้ มาเพาะเลย้ี งบนอาหาร สงั เคราะห์ และชนิ้ สว่ นนน้ั สามารถ เจรญิ และพฒั นาเปน็ ตน้ พชื ทสี่ มบรู ณ์ มีท้ังส่วนใบ ล�ำต้น และรากทส่ี ามารถน�ำออกปลูกในสภาพธรรมชาติได้ การขยายพนั ธพ์ุ ชื ดว้ ยเทคนคิ การเพาะเลย้ี งเนอ้ื เยอ่ื พชื
ขั้นตอนที่ 1 การเร่ิมต้นในการเพาะเล้ียง 33 เนอ้ื เยอ่ื อยา่ งแรกคอื การคดั เลอื กแมพ่ นั ธข์ุ องตน้ กลว้ ย ทใ่ี หผ้ ลผลติ สงู มจี ำ� นวนหวตี อ่ เครอื ทดี่ ก ผลของกลว้ ย มขี นาดใหญ่ ปราศจากโรคและแมลง โดยทเี่ ราจะนำ� แม่พันธ์โุ ดยการไปคดั หน่อจากแปลงปลูก ท่ีเปน็ หน่อ ใบดาบหรอื หนอ่ ใบแคบ ตอ้ งเลอื กแมพ่ ันธ์ุท่ดี ี 1 หน่อ ของต้นแม่ ข้ันตอนท่ี 2 น�ำหน่อกล้วยท่ีได้มาท�ำการลอก กาบออกใหไ้ ดข้ นาด ของหนอ่ ประมาณ2 ซม. จากนนั้ จึงนำ� ไปฟอกในสารละลายคลอร็อกซ์ 20% เปน็ เวลา 10 นาที เทคลอรอ็ กซอ์ อก ฟอกซำ�้ ดว้ ยคลอรอ็ กซ์10% อีกครงั้ เป็นเวลา 10 นาที ขั้นตอนท่ี 3 หลังจากนั้นจึงน�ำไปท�ำการล้าง ออกดว้ ยน้ำ� กล่ันทน่ี งึ่ ฆา่ เช้ือแลว้ จ�ำนวน 3 ครงั้ ในตู้ ยา้ ยเนอ้ื เยอื่ ท�ำการตดั แตง่ เนอ้ื เยื่อ ลอกเนอื้ เยื่อดา้ น นอกออกให้เหลือปลายยอด น�ำไปเลย้ี งบนอาหาร MS ทเ่ี สริมด้วย BA 5 มก./ลติ ร ในหอ้ งเพาะเลี้ยงเนื้อเยือ่ เพื่อเป็นการควบคุมอุณหภูมิและแสง ให้อุณหภูมิ ประมาณ 25-27 องศา และใหแ้ สง 16 ชวั่ โมง ข้ันตอนที่ 4 เม่ือเนื้อเย่ือที่ท�ำการเพาะเล้ียง มีการแตกหน่อในอาหารเพาะเลี้ยงแล้ว จึงท�ำการ ขยายเน้ือเย่ือกล้วยต่อ โดยการย้ายหน่อใหม่ ลงใน อาหารชนดิ เดิม ทำ� การเลยี้ งขยายไปเรือ่ ยๆจนเปน็ ที่ ได้จำ� นวนตามตอ้ งการ ข้ันตอนท่ี 5 น�ำหน่อกล้วยท่ีต้องการให้เกิด ราก โดยการยา้ ยลงอาหารMS เพอื่ ชกั นำ� ใหก้ ลว้ ยเกดิ ราก เม่อื ได้รากแลว้ จึงย้ายลงในวสั ดุปลกู นำ� ออกมา อนุบาลภายในโรงเรือนประมาณ 60 วัน กส็ ามารถที่ จะนำ� ไปปลกู ไดแ้ ล้ว การขยายพนั ธพ์ุ ชื ดว้ ยเทคนคิ การเพาะเลย้ี งเนอื้ เยอ่ื พชื
การเพาะเลย้ี งเน้อื สับปะรด ในปัจจุบันสับปะรดท่ีใช้ในการบริโภคผลสด ส่วนใหญ่เป็นพันธุ์ที่ได้จากสับปะรดที่ใช้ในการบรรจุ กระป๋อง มีสายพันธุ์สับปะรดใหม่ๆหลายสายพันธุ์ที่ เหมาะสมสำ� หรบั การบรโิ ภคและการสง่ ออกสับปะรด โดยมีหลายสายพันธุ์ท่ีมีผลผลิตเป็นที่ต้องการของ ตลาดต่างประเทศแต่ยังมีการเพาะปลูกไม่มาก ในประเทศไทย ดังน้ันการผลิตสายพันธุ์สับปะรด สายพันธุ์ดังกล่าวให้มีคุณภาพจึงมีความจ�ำเป็น โดยเฉพาะอย่างย่ิงต้นพันธุ์ที่ใช้ในการปลูก เพื่อง่าย ในการบริหารจัดการ วิธีการเพาะเลี้ยงเน้ือเย่ือ สบั ปะรดดว้ ยการเพาะเล้ยี งเนือ้ เยือ่ เป็นวิธีการขยาย พนั ธพ์ุ ชื วธิ หี นงึ่ แตม่ กี ารปฏบิ ตั ภิ ายใตส้ ภาพทคี่ วบคมุ เรื่อง ความสะอาดแบบปลอดเช้อื อุณหภูมิ และแสง ด้วยการน�ำชิ้นส่วนของพืชที่ยังมีชีวิต เช่น ล�ำต้น ยอด ตาข้าง ก้านชอ่ ดอก ใบ กา้ นใบ อบั ละอองเกสร 34 เป็นต้น มาเพาะเล้ียงบนอาหารสังเคราะห์ และชิ้น สว่ นนน้ั สามารถ เจรญิ และพฒั นาเปน็ ตน้ พชื ทส่ี มบรู ณ์ มีท้ังส่วนใบ ล�ำต้น และรากท่ีสามารถน�ำออกปลูก ในสภาพธรรมชาตไิ ด้ วิธีการเพาะเล้ียงเน้อื เย่ือสับปะรด ขั้นตอนท่ี 1 การเร่ิมต้นในการเพาะเลี้ยง เนื้อเย่ือ อย่างแรกคือการคัดเลือกแม่พันธุ์ของต้น สบั ปะรด ปราศจากโรคและแมลง นำ� หนอ่ สบั ปะรดที่ ไดม้ าทำ� การลอกใบออกให้ได้ขนาด ใหไ้ ด้ขนาดยอด ประมาณ 1 ซม. จากนน้ั จึงน�ำไปฟอกในสารละลาย คลอรอ็ กซ์ 10% เปน็ เวลา 10 นาที ข้ันตอนท่ี 2 หลังจากน้ันจึงน�ำไปท�ำการล้าง ออกดว้ ยน�ำ้ กลน่ั ท่นี ง่ึ ฆา่ เชอ้ื แลว้ จ�ำนวน 3 คร้ัง ในตู้ ยา้ ยเนือ้ เยือ่ ท�ำการตัดแต่งเนื้อเยื่อ ลอกเน้อื เยอื่ ดา้ น นอกออกให้เหลือปลายยอด น�ำไปเลย้ี งบนอาหาร MS ที่เสรมิ ด้วย BA 2 มก./ลติ ร ในห้องเพาะเลี้ยงเนอ้ื เยอื่ เพ่ือเป็นการควบคุมอุณหภูมิและแสง ให้อุณหภูมิ ประมาณ 25-27 องศา และใหแ้ สง 16 ชว่ั โมง การขยายพนั ธพ์ุ ชื ดว้ ยเทคนคิ การเพาะเลย้ี งเนอ้ื เยอื่ พชื
35 ข้ันตอนท่ี 3 เม่ือเน้ือเย่ือท่ีท�ำการเพาะเล้ียง มีการแตกหน่อในอาหารเพาะเลี้ยงแล้ว จึงท�ำการ ขยายเนือ้ เย่อื สับปะรดตอ่ โดยการย้ายหนอ่ ใหม่ ลง ในอาหารชนดิ เดมิ ทำ� การเลย้ี งขยายไปเรอื่ ยๆจนเปน็ ท่ีไดจ้ �ำนวนตามตอ้ งการ ขน้ั ตอนที่ 4 น�ำตน้ ออ่ นสบั ปะรดท่ีตอ้ งการให้ เกิดราก โดยการย้ายลงอาหาร MS ที่เสรมิ ด้วย IBA 4 มก./ลิตร เพื่อชักน�ำให้กล้วยเกิดราก เมื่อได้ราก แล้วจึงย้ายลงในวัสดุปลูก น�ำออกมาอนุบาลภายใน โรงเรือนประมาณ 60 วัน ก็สามารถท่ีจะนำ� ไปปลกู ไดแ้ ล้ว การขยายพนั ธพ์ุ ชื ดว้ ยเทคนคิ การเพาะเลยี้ งเนอ้ื เยอ่ื พชื
36 การขยายพนั ธพ์ุ ชื ดว้ ยเทคนคิ การเพาะเลย้ี งเนอื้ เยอ่ื พชื
บทสรปุ การเพาะเล้ียงเนื้อเย่ือพืช หรือการเล้ียงเน้ือเย่ือในสภาพหลอดแก้ว 37 เปน็ เทคโนโลยชี วี ภาพสมยั ใหมโ่ ดยนำ� เซลล์(cel) หรอื ชนิ้ สว่ นของพชื ทมี่ ขี นาด เลก็ เชน่ อวยั วะตา่ ง ๆ เนอ้ื เยอื่ เซลล์ หรอื โพรโทพลาสต์ (protoplast) มาเลยี้ งใน อาหารวทิ ยาศาสตรซ์ งึ่ ประกอบดว้ ยธาตอุ าหาร นำ�้ ตาล วติ ามนิ และฮอรโ์ มนพชื ภายใต้สภาพท่ีปลอดจากเช้ือจุลินทรีย์ โดยเพาะเล้ียงในห้องท่ีควบคุม อณุ หภมู ิและแสง ส่งผลให้ชน้ิ สว่ นของพืชเหลา่ น้เี จริญเปน็ ตน้ ใหม่ แคลลสั (callus) หรือโครงสร้างคล้ายเอ็มบริโอ (embryo) เรียกว่า เอ็มบริออยด์ (embryoid หรอื somatic embryo) แลว้ จงึ พฒั นาเป็นต้นพืชท่สี มบูรณ์ ประกอบด้วยใบ ราก ปัจจุบันการเพาะเล้ียงเน้ือเยื่อพืชมีบทบาทอย่างมากท้ังในด้าน การเกษตรกรรม อุตสาหกรรม และด้านการแพทย์ ดงั นัน้ ประโยชนข์ องการ เพาะเลย้ี งเนอื้ เยือ่ พืชสามารถกล่าวได้ดังนี้ 1. เพอื่ การขยายพันธุ์ (Micropropagation) 2. เพอ่ื การผลิตพชื ทปี่ ราศเช้อื ไวรสั (Virus-Free Plant Propagation) 3. เพือ่ การปรบั ปรงุ พันธพ์ุ ชื (Plant Improvement) 4. เพ่อื การผลิตพืชพันธต์ุ า้ นทาน (Resistant Plant) 5. เพอื่ การผลิตพชื พนั ธท์ุ นทาน (Tolerance Plant) 6. เพือ่ การผลิตสารทตุ ิยภูมิ (Secondary Metabolite) 7. เพ่อื การศกึ ษาทางชีวเคมีและสรรี วิทยาของพชื (Biochemical and Physiology Study) 8. เพอื่ การเกบ็ รกั ษาพนั ธพ์ุ ชื (GermplasmConservation,GeneBank) การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชจึงเป็นเทคโนโลยีสมัยใหม่ ที่จะช่วยเข้ามา พฒั นาการปลกู พชื ในดา้ นตา่ งๆ ไดอ้ ยา่ งมปี ระสทิ ธภิ าพมากขนึ้ ทงั้ ในแงก่ าร สรา้ งสายพนั ธพ์ุ ชื ใหมๆ่ และการเพม่ิ จำ� นวนตน้ พชื ในปรมิ าณมากๆใหไ้ ดต้ าม ความตอ้ งการของเกษตรกรทีต่ ้องการจะปลกู พชื ชนิดตา่ งๆอีกดว้ ย การขยายพนั ธพ์ุ ชื ดว้ ยเทคนคิ การเพาะเลย้ี งเนอ้ื เยอื่ พชื
เอกสารอา้ งอิง ค�ำนูณ กาญจนภูมิ. 2542. การเพาะเลี้ยงเน้ือเย่ือพืช. ส�ำนักพิมพ์แห่งจุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย, กรุงเทพฯ. 162 หน้า. ประศาสตร์ เกอื้ มณ.ี 2538. เทคนคิ การเพาะเลย้ี งเนอ้ื เยอื่ พชื . โอ.เอส. พรนิ้ ตง้ิ เฮา้ ส,์ กรงุ เทพฯ. 158 หนา้ . ประสาทพร สมิตะมาน. 2541. โปรโตพลาสตเ์ ทคโนโลยี. สาขาเทคโนโลยชี วี ภาพ คณะเกษตรศาสตร์ มหาวทิ ยาลยั เชียงใหม่, เชียงใหม.่ 196 หนา้ . ไพบูลย์ กวินเลิศวัฒนา. 2524. หลักการและวิธีการเลี้ยงเน้ือเย่ือพืช. ภาควิชาพืชสวน คณะเกษตร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร,์ กรุงเทพฯ. 109 หน้า. 38 รังสฤษดิ์ กาวีตะ๊ . 2541. การเพาะเล้ยี งเน้อื เยอ่ื พืชและเทคนคิ . ส�ำนกั พมิ พ์มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์, กรุงเทพฯ. 219 หน้า. สมปอง เตชะโต. 2539. เทคโนโลยีชวี ภาพของพืชปลูก. ภาควชิ าพชื ศาสตร์ คณะทรพั ยากรธรรมชาติ มหาวิทยาลยั สงขลานครินทร,์ สงขลา. 285 หน้า. การขยายพนั ธพ์ุ ชื ดว้ ยเทคนคิ การเพาะเลยี้ งเนอื้ เยอื่ พชื
ผ้เู ขยี น ชอ่ื -นามสกลุ ผชู้ ว่ ยศาสตราจารยพ์ งศย์ ทุ ธ นวลบญุ เรอื ง ต�ำแหนง่ ปจั จุบนั อาจารยส์ าขาพชื ศาสตร ์ การศกึ ษา ปรญิ ญาโท สาขาเทคโนโลยีชวี ภาพ จุฬาลงกรณ์มหาวทิ ยาลัย หน่วยงาน สถาบันวจิ ยั เทคโนโลยีเกษตร มหาวทิ ยาลัยเทคโนโลยรี าชมงคลล้านนา Email: [email protected] ช่อื -นามสกุล ผู้ชว่ ยศาสตราจารย์อภชิ าติ ชิดบรุ ี 39 ตำ� แหนง่ ปัจจุบัน อาจารยส์ าขาพชื ศาสตร์ หน่วยงาน สถาบันวจิ ยั เทคโนโลยีเกษตร มหาวิทยาลยั เทคโนโลยีราชมงคลล้านนา การศึกษา ปรญิ ญาเอก สาขาพชื สวน มหาวทิ ยาลัยเชยี งใหม่ Email: [email protected] ชอ่ื -นามสกลุ นายพิทักษ์ พทุ ธวรชยั ต�ำแหน่งปจั จุบัน อาจารย์ สาขาพชื ศาสตร์ หนว่ ยงาน สถาบันวจิ ัยเทคโนโลยเี กษตร มหาวทิ ยาลยั เทคโนโลยรี าชมงคลลา้ นนา การศึกษา ปรญิ ญาโท สาขาพืชสวน มหาวทิ ยาลัยเชยี งใหม่ Email: [email protected] การขยายพนั ธพ์ุ ชื ดว้ ยเทคนคิ การเพาะเลยี้ งเนอ้ื เยอ่ื พชื
กองบรรณาธิการ การขยายพนั ธพ์ุ ชื ดว้ ยเทคนคิ การเพาะเลย้ี งเนอื้ เยอ่ื พชื ISBN : 978-974-625-832-6 (Print) ISBN : 978-974-685-831-9 (E-Book) ทีป่ รกึ ษา ผชู้ ่วยศาสตราจารยป์ ระพัฒน์ เชือ้ ไทย ดร.ภาสวรรธน ์ วชั รด�ำรงค์ศักด์ิ ผู้เขยี น ผชู้ ่วยศาสตราจารย์พงศย์ ทุ ธ นวลบญุ เรือง ผู้ช่วยศาสตราจารย์ ดร.อภชิ าติ ชิดบรุ ี อาจารย์พทิ กั ษ์ พุทธวรชัย กองบรรณาธิการ นายภฤศพงศ์ เพชรบลุ ผชู้ ว่ ยศาสตราจารยย์ ุทธนา เขาสุเมรุ ผชู้ ่วยศาสตราจารยเ์ กรียงไกร ธารพรศรี นายนริศ ก�ำแพงแก้ว ว่าท่ี ร.ต.รชั ต์พงษ์ หอชัยรัตน์ 40 วา่ ท่ี ร.ต.เกรียงไกร ศรปี ระเสรฐิ นายพิษณุ พรมพราย นายจกั รรินทร ์ ช่นื สมบตั ิ นางสาวรตั นาภรณ ์ สารภี นางสาวอารรี ตั น ์ พิมพน์ วน นายเจษฎา สภุ าพรเหมนิ ทร์ นางสาวสุธาสิน ี ผอู้ ยูส่ ขุ นางสาวฉตั วณฐั มโนพฤกษ์ นางสาวหนงึ่ ฤทัย แสงใส นางสาวเสาวลักษณ ์ จันทร์พรหม นางสาวทนิ อ่อนนวล นางสาววราภรณ์ ต้นใส นายวีรวิทย ์ ณ วรรณมา จดั ท�ำโดย สถาบนั ถา่ ยทอดเทคโนโลยสี ู่ชมุ ชน มหาวทิ ยาลัยเทคโนโลยีราชมงคลลา้ นนา 98 หมู่ 6 ต�ำบลปา่ ป้อง อำ� เภอดอยสะเก็ด จงั หวดั เชยี งใหม่ 50220 พิมพท์ ่ี เอ็ม ดี ดี กรปุ๊ 28/3 หมู่ 10 ตำ� บลป่าไผ่ อำ� เภอสนั ทราย จังหวัดเชียงใหม่ 50210 โทร. 09-9226-1953, 09-9239-1771 การขยายพนั ธพ์ุ ชื ดว้ ยเทคนคิ การเพาะเลย้ี งเนอื้ เยอื่ พชื
Search
Read the Text Version
- 1 - 44
Pages: