E-book คู่มือปฏิบัติการชีวเคมี นรพ ทบ

E-book: คู่มือปฏิบตั กิ ารชีวเคมี สาหรับนักเรยี นพยาบาล ภาควิชาชีวเคมี กองการศึกษาวิทยาลัยแพทยศาสตร์พระมงกุฎเกลา้

คานา หนังสอื คมู่ อื ปฏิบัติการชีวเคมีเลม่ น้ี คณาจารย์ภาควชิ าชีวเคมีฯ ไดร้ ว่ มกันปรบั ปรงุ ใหม่และจัดทาขึ้นเพ่ือช่วยเสริมความเข้าใจในการเรียนเน้ือหาภาคปฏิบัติ และหวังว่านักเรียนพยาบาลจะสามารถนาประสบการณ์การเรยี นร้นู ี้ไปประยกุ ตใ์ ชใ้ นวชิ าชีพต่อไปได้ คณะผู้จดั ทาพ.อ.หญิง ผศ. อลสิ า เสนามนตรีพ.อ.หญงิ ผศ. อัญชลี วศิ วโภคาพ.อ.หญิง ณัฐประภา สุริยมณฑลพ.ท. ผศ. ประกานต์ ฤดีกุลธารงพ.ต.ธนกฤต วิชาศิลป์ร.ท.หญงิ มลฑลี ธีรอภิศักดิ์กุลร.ต.ชรินทร์ จงึ ศริ กลุ วิทย์ปรับปรงุ ล่าสดุ 20 ธ.ค. 2560

สารบญัหัวเรือ่ ง หน้าบทนา ระเบยี บท่ัวไปและคาแนะนาเก่ียวกับปฏิบตั กิ ารชวี เคมี 1ปฏบิ ตั ิการครงั้ ท่ี 1 I. เครอื่ งมอื และวธิ กี ารใช้ในห้องปฏิบัตกิ ารชวี เคมี 5 II. เครือ่ งแก้วสาหรับปฏบิ ัติการชวี เคมี 9 III. เทคนิคบางอยา่ งทใ่ี ชใ้ นการวเิ คราะห์ทางชวี เคมี 17ปฏบิ ัตกิ ารครั้งที่ 2 โปรตีนและเอ็นไซม์ 20ปฏิบัติการครั้งที่ 3 วธิ ีปริมาณวิเคราะห์ 25ปฏบิ ัตกิ ารครั้งท่ี 4 คาร์โบไฮเดรตและไขมนั 34ปฏิบัตกิ ารครั้งท่ี 5 การวิเคราะหห์ าปริมาณโปรตนี ในซีรมั่ 43ปฏบิ ัตกิ ารครง้ั ท่ี 6 การวเิ คราะหห์ าปริมาณโคเลสเตอรอล และ ครีอาตนิ นี ในเลือด 46ปฏิบตั ิการครั้งท่ี 7 การตรวจน้าตาลในเลอื ดโดยใช้แถบทดสอบและเครอ่ื งอตั โนมตั ิ 49ปฏบิ ตั กิ ารครง้ั ท่ี 8 การตรวจวิเคราะหป์ ัสสาวะ 56หนงั สอื อ่านประกอบ 59

Page | 1 บทนา I. งานปฏบิ ตั ิทางชีวเคมี การปฎิบตั ิงานทางชวี เคมีนอกจากจะใหค้ วามรู้เรื่องวิธีการ และเทคนิคของชวี เคมีคลนิ ิกแลว้ ยังช่วยให้นักเรียนได้ฝึกความปราณีต ความละเอียดถี่ถ้วน ความมีระเบียบ และการทางานตามลาดับข้ัน รวมทั้งการตัดสินใจที่ถูกต้อง สิ่งเหล่านี้เป็นความจาเป็น และเป็นบันไดไปสู่ความเป็นพยาบาลท่ีดี และมีระเบียบในการปฏิบตั งิ าน การทางานปฏิบตั ใิ หล้ ุลว่ งไปด้วยดี และโดยรวดเร็วต้องอาศยั สิง่ ต่อไปนี้ 1. ความเขา้ ใจในการทดลองทจ่ี ะทา ทุกคนตอ้ งศึกษาโดยละเอยี ดเสียก่อนท่จี ะเข้าห้องปฏบิ ัติ-การโดยอา่ นข้อปฏิบัติมาก่อน ต้องวางแผนงานท่จี ะทาและคาดคะเนผลที่จะเกิดข้ึนไวล้ ่วงหนา้ พยายามทาความเข้าใจในกระบวนการที่เกี่ยวขอ้ ง 2. ความปราณีต และความสะอาด เป็นหัวใจของงานปฏิบัติทางเคมีอยู่แล้ว งานปฏิบัติทางชีวเคมียิ่งต้องการมากกว่านั้น เพราะสารบางอย่างที่ได้จากสิ่งมีชีวิตนั้นเสื่อมฤทธิ์ หรือเสียได้ง่าย เช่น เอ็นไซม์ ดังน้ันการปฏิบัติจะตอ้ งดาเนินไปอย่างเข้มงวดตามวธิ กี ารที่วางไว้เพ่ือจะใหไ้ ด้ผลที่ถูกต้อง 3. ถ้าผลท่ีได้ไม่ตรงตามทฤษฎี จะตอ้ งรายงานให้อาจารย์ทราบทันทีพร้อมทั้งแสดงหลักฐานด้วย เพื่อจะได้ร่วมกันวิจารณผ์ ลท่ีเกดิ ขึน้ และหาข้อผดิ พลาดเพอ่ื แก้ไข 4. เมื่อมอี บุ ตั ิเหตเุ กดิ ขนึ้ ตอ้ งรายงานให้อาจารย์ทราบทนั ที II. ระเบียบทว่ั ไป และ คาแนะนาเกี่ยวกบั ปฏิบตั กิ ารชีวเคมีก. การใช้ของกลาง 1. เกยี่ วกับน้ายา1.1 น้ายาที่ใช้ทดลองต้องใช้อย่างประหยัดเสมอ การแบ่งน้ายาของกลางไปเก็บไว้ใช้เฉพาะตัวเป็นเรื่องท่ีห้ามเด็ดขาด การทดลองโดยใช้ของเรี่ยราดสุรุ่ยสุร่ายเป็นความผิดท่ีไม่มีการอภัย การใช้น้ายามากเกินไปนอกจากจะเป็นการหมดเปลืองโดยใช่เหตุแล้ว ยังอาจทาให้ผลการทดลองผิด หรือสังเกตการเปลี่ยนแปลงที่เกิดข้ึนได้ยาก ขวดน้ายาที่วางไว้เป็นของกลางภายหลังใช้แล้วต้องวางไว้ที่เดิม อย่าสลับจุกกัน ทางท่ีดีคือใช้น้ิวคีบจุกไว้ขณะรนิ น้ายา การวางจกุ ไว้บนโต๊ะอาจเกดิ การเปรอะเป้ือน หรอื ลมื ปดิ จุกได้1.2 เมอื่ น้ายาในขวดหมด ใหน้ าขวดไปรบั น้ายาใหมจ่ ากเจ้าหนา้ ที่ อยา่ หยิบขวดนา้ ยาจากโตะ๊ อืน่ มาใช้1.3 อย่าใช้ปเิ ป็ตดูดน้ายาจากขวดโดยตรง (นอกจากจะมีปเิ ป็ตรว่ มไวใ้ หใ้ ช้โดยเฉพาะ) ควรรนิ น้ายาแต่พอควรลงในกระบอกตวงหรือบีคเกอร์ทแ่ี ห้งและสะอาด แลว้ จงึ ดดู ด้วยปเิ ป็ต สว่ นทเี่ หลอื เลก็ นอ้ ยใหเ้ ททิ้งไป1.4 การรินน้ายาจากขวด ต้องรินทางด้านทีไ่ มไ่ ดต้ ดิ ฉลาก1.5 ในการเจอื จางทุกอย่างทสี่ ั่งใหเ้ จือดว้ ยนา้ ต้องใชน้ ้ากลัน่ เสมอนอกจากจะมคี าสั่งเปน็ อยา่ งอืน่ 2. เก่ยี วกบั ความรบั ผิดชอบเครอื่ งมอื และ อุปกรณต์ ่าง ๆ2.1 เม่ือมีความเสียหายเกิดข้ึนแก่เคร่ืองมือที่จ่ายให้ใช้ร่วมกันท้ังชั้น ต้องรีบรายงานให้อาจารย์ทราบ ถ้าปรากฎวา่ เคร่อื งมือเหล่านี้เสียหายโดยไมม่ ผี ้ใู ดรับวา่ กระทานักเรียนทง้ั หมดจะต้องเฉล่ยี กันใช้ค่าเสยี หายนั้น ๆ

Page | 22.2 กอ๊ กแก๊ส และ ก๊อกน้าต้องปิดให้สนิทเมอื่ เลิกใช้ ถ้ามีการร่ัวให้รีบแจ้งเจ้าหน้าทท่ี ราบทันที ขณะพักใช้แก๊สช่วั คราวตอ้ งหรไี่ ฟใหเ้ หลอื นอ้ ย หรอื ดับเสียเลย2.3 อ่างน้ามีไว้สาหรับล้าง และเทสิ่งท่ีเป็นน้าเท่านั้น สิ่งที่เป็นของแข็งต้องทิ้งในถังขยะ กรดและด่างเข้มข้นต้องเจือน้าให้จางเสียก่อนที่จะเทลงในอ่าง ไม้ขีดไฟต้องดับเสียก่อนจึงท้ิงลงในถัง และห้ามใช้กระดาษต่อไฟโดยเดด็ ขาด 3. เกีย่ วกบั คาสั่งนักเรียนต้องปฏิบัติตามคาส่ัง หรือ คาแนะนาของอาจารยโ์ ดยเคร่งครัด ผ้ทู ี่ฝ่าฝืนนอกจากจะตอ้ งรบั โทษแลว้ ยังอาจตอ้ งรับใช้คา่ เสียหายทีเ่ กิดข้ึนอีกดว้ ยข. ของใชเ้ ฉพาะแต่ละโตะ๊ 1. เครอ่ื งมือทจี่ ่ายให้ใช้ นกั เรยี นท่ีทางานด้วยกนั ย่อมมีความรับผิดชอบรว่ มกัน เว้นแต่มีหลักฐานว่าผู้ใดทาเสียหาย ผู้อื่นจึงไม่ต้องรับผิดชอบด้วย เม่ือมีการแตกหักหรือหายต้องรีบจัดการเบิกไปทดแทนเพื่อให้มีจานวนครบถ้วนอยูเ่ สมอ 2. การเอาใจใส่รักษาเคร่ืองมือเคร่ืองใช้เป็นคะแนนส่วนหน่ึงในการปฏิบัติ เครื่องใช้ที่ให้ประจาต้องล้างให้สะอาดก่อนที่จะเก็บเข้าตู้ ซึ่งต้องจัดให้เป็นระเบียบ เมื่อเลิกงานแล้วบริเวณที่ทางานต้องสะอาดเหมือนเดิมค. ความสะอาด 1. การรักษาความสะอาดเครือ่ งแกว้ ความสะอาดเป็นปัจจัยสาคัญย่ิงสาหรับความสาเร็จ การที่นักเรียนส่วนมากทางานไม่ได้ผลตามที่คาดคะเนนั้น สาเหตุที่สาคัญท่ีสุดคือ เครื่องใช้สกปรก โดยเฉพาะอย่างย่ิงหลอดทดลอง ฉะนั้นของใช้ทุกช้ินจึงจาเป็นตอ้ งทาความสะอาดอยา่ งหมดจดเสมอ เครื่องแก้วท่ีใช้เสร็จแล้วควรเทของทิ้ง แล้วรีบล้างทันทีโดยใช้น้ากับสบู่ หรือผงซักฟอก พร้อมกับใช้แปรงขัด ควรระวังอย่าให้โลหะด้ามแปรงขูดเคร่ืองแก้วจนเป็นรอย หรือแตกร้าว และคร้ังสุดท้ายจึงใช้น้ากล่ันเล็กน้อยล้างอีกครั้งหน่ึง และล้างเฉพาะภายในเท่าน้ัน ห้ามใช้ผ้าเช็ดภายในเพื่อให้แห้งเพียงแต่วางคว่าไว้ใหน้ า้ ไหลออกไปเอง หลังจากใช้ปิเป็ตดูดเลือด ซีรั่ม หรือพลาสม่าแล้ว ควรแช่ในน้าแล้วล้างทันที ถ้ามีการอุดตันของเลอื ดใหแ้ ชใ่ น 0.9% นา้ เกลอื แล้วใช้ลกู ยางดูดเอานา้ เกลอื เขา้ ออกจนเลอื ดท่ีอุดตันออกไปหมด การล้างปิเป็ตควรใช้ลกู ยางดูดเอาน้าเขา้ ออก อยา่ ใช้วิธเี อาปเิ ป็ตไปรองที่ก๊อกนา้ ให้น้าไหลผ่าน จะไมส่ ะอาดและสน้ิ เปลืองน้าด้วย สารโปรตีนท่ีแห้งติดอยู่มักจะล้างออกด้วยสารละลายด่าง (โซเดียมฮัยดรอกไซด์เข้มข้น) ท่ีอุ่น ๆ(ไมใ่ ช้กรดเขม้ ขน้ ลา้ ง) 2. ระวังอย่าให้สารเคมีหกบนโต๊ะ พื้น เครื่องช่ัง กล้องจุลทัศน์ หรือเคร่ืองมืออ่ืน ๆ หากเกิดข้ึนต้องรบี เชด็ ใหส้ ะอาดทันที

Page | 3ง. อบุ ตั ิเหตุ และ การป้องกัน 1. การระวงั ไฟ1.1 อีเธอร์ อะซีโตน แอลกอฮอล์ ฯลฯ เป็นสารไวไฟ จึงต้องพึงระวังอย่าให้สารเหล่าน้ีอยู่ใกล้เปลวไฟ ถ้าตอ้ งการระเหยควรต้งั ไว้ในท่ี ๆ มีลมโกรก หรอื ไม่ก็ตม้ น้าใหร้ อ้ นเสยี กอ่ น เมือ่ ดับไฟแลว้ จงึ คอ่ ยเอาน้ายาลงแช่1.2 หากเกิดไฟลุกข้ึน อย่าตกใจจนเสียขวัญ ต้องรีบจัดการป้องกันมิให้ไฟลามไปท่ีอ่ืน หากไฟลุกในหลอดทดลอง อย่าตกใจโยนหลอดท้งิ จะทาให้ไฟลามไปติดสิ่งอนื่ ๆ เพียงแต่ถือไว้เฉย ๆ ไม่ช้าไฟก็จะดับ ถ้าไฟลุกในชามหรือบีคเกอร์ ให้เอาแผ่นกระดาษ หรือโลหะปิดเสีย ไฟก็จะดับเพราะไม่มีอากาศ ข้อสาคัญคือระวงั อย่าให้ไฟแลบตดิ เสือ้ ผา้ ได้1.3 ควรสงั เกตตาแหน่งทไี่ ว้เครอ่ื งดับเพลงิ เพือ่ จะได้นามาใช้ไดท้ นั ที 2. สารเคมี2.1 อย่าใช้ปิเป็ตดูดกรดหรือด่างเข้มข้นหรือส่ิงท่ีเป็นพิษแรง ควรใช้กระบอกตวงหรือบิวเร็ตหรือไม่ก็ต้องดูดด้วยลกู ยาง2.2 เม่ือต้มของเหลวในหลอดทดลอง ให้เขย่าตลอดเวลาเพ่ือกันน้ายากระฉอกเนื่องจากได้รับความร้อนมากเกินไปในตาแหนง่ เดยี ว อย่าหนั หลอดเขา้ ตัวหรือหนั ไปทางผอู้ นื่2.3 เมื่อต้องการดมกล่ินแก๊สท่ีเกิดข้นึ จากน้ายาร้อนในหลอดทดลอง อยา่ เอาหลอดทดลองไปรอที่จมกู โดยตรงเพราะในบางคร้ังน้ายาร้อนจัดอาจกระเด็นเข้าตา และ ทาให้ตาบอดได้ ให้ถือหลอดในระดับคางห่างจากหน้าพอสมควร หนั ปลายหลอดออกจากหน้าแล้วใช้มือโบกควนั เข้าหาจมกู 3. การปฐมพยาบาล3.1 หากกรดเข้มข้นถูกผิวหนัง ควรล้างน้าก่อนแล้วใช้สารแก้ฤทธ์กิ รดเพราะถ้าใช้สารแกฤ้ ทธท์ิ ันที จะเกิดความร้อน เนื่องจากการ neutralize ระหว่างกรดกับสารแก้ฤทธ์ิ ซ่ึงทาให้เป็นอันตรายต่อผิวหนังขึ้นอีก สารแก้ฤทธ์ิทีใ่ ช้ได้แก่ 5% โซเดียมไบคารบ์ อเนต หรือ 5% แอมโมเนยี มฮัยดรอกไซด์3.2 หากดา่ งเขม้ ขน้ ถูกผวิ หนงั ควรลา้ งน้ากอ่ น แลว้ ใช้สารแกฤ้ ทธ์ดิ า่ งคอื 5% กรดบอรคิ หรอื 5% กรดอะซติ ิค3.3 เมอื่ ผิวหนงั ถูกความรอ้ นจัดลวก ให้ทาด้วยกลเี ซอรอล หรือ วาสลนิ3.4 เมื่อกรด หรือด่างเข้าตา ให้ล้างตาด้วยน้ามาก ๆ ก่อน แล้วใช้ 5% โซเดียมไบคาร์บอเนต ล้างตาเม่ือถูกกรด หรอื ใช้ 5% กรดบอรคิ ล้างตาเมอ่ื ถกู ดา่ ง3.5 เมื่อกรดแก่เข้าปาก ให้ล้างปากด้วยน้ามาก ๆ และใชด้ ่างโซเดียมฮัยดรอกไซด์ท่ีเจือจางมาก ๆ ล้าง หรือใช้milk of magnesia3.6 เมอื่ ดา่ งแก่เข้าปาก ใหล้ ้างปากดว้ ยนา้ มาก ๆ และใชก้ รดออ่ น เชน่ 5% กรดอะซิตคิจ. การบันทกึ ผลการทดลอง ใช้ข้อความส้ัน ๆ เข้าใจง่าย บันทึกการเปลี่ยนแปลงที่มองเห็นได้ด้วยตาเปล่าก่อน (เช่น การเกิดสีความขุ่น) แลว้ จึงแปลผลวา่ สง่ิ ทเ่ี กดิ ขนึ้ นน้ั มคี วามหมายอยา่ งไร การบันทกึ โดยแสดงเป็นตารางทาให้ประหยดั เวลาได้มาก ให้บันทึกผลลงในสมุดบันทึกผลเลยทีเดียว ไม่ใช่จาไว้ หรือ บันทึกในหัวข้อปฏิบัติก่อนแล้วไปลอกลงสมุดอีกครั้งหน่ึง วิธีท่ีดีท่ีสุดคือเตรียมเขียนการทดลองหัวข้อสั้น ๆ ไว้ในสมุดบันทึกล่วงหน้า และเว้นที่ไว้สาหรับบันทึกการเปลย่ี นแปลงทเ่ี กิดข้นึ

Page | 4ฉ. ความสาคัญของตัวเลข1. ในการวัดอย่างแม่นยา ตัวเลขที่ได้มาโดยการประมาณเป็นตัวเลขท่ีมีความสาคัญ เช่น ในการอ่านบิวเร็ตท่ีมีขีดแบ่ง 0.1 มล. เราอาจกะจานวนระหว่างช่องได้ สมมุติว่าถ้าระดับน้ายาอยู่ที่ขีดแบ่งพอดีท่ีเลข 0.8นกั เรียนต้องรายงานเป็น 0.80 มล. เลข 0 หลงั เลข 8 นี้มคี วามสาคัญ แต่ถา้ อ่านไดเ้ ลย 0.8 ซ่ึงประมาณได้เป็น0.83 มล. ในท่ีน้ีเลขทมี่ คี วามสาคญั คือเลข 3 ซึ่งเป็นการประมาณเพือ่ ให้ไดค้ า่ ใกลเ้ คียงความเป็นจรงิ ท่ีสุด2. การปัดตัวเลขหลังทศนยิ มน้นั นยิ มรายงานตัวเลขสาคญั ท้ายหลังทศนยิ มให้ใกล้เคยี งกับจานวนเดิมเช่น 2.255 หรือ 2.264 อาจรายงานเป็น 2.26 ได้ท้ังสองจานวน ในกรณีท่ีเลขท้ายเป็น 5 เม่ือต้องการปัดเศษใหด้ ูตัวทนี่ าหน้าเลข 5 นั้น ถ้าเปน็ เลขคใู่ ห้ปัดเศษ 5 ทง้ิ แตถ่ า้ เปน็ เลขคี่ใหป้ ัดขึ้นเปน็ จานวนเต็ม แต่ถ้าเลขท้ายเกิน 5 ข้นึ ไปก็ต้องปดั เศษใหก้ บั ตัวเลขที่นาหนา้ เสมอยกตัวอย่าง เชน่ 36.25 เป็น 36.2 36.35 เป็น 36.4 36.26 เป็น 36.3 36.36 เป็น 36.43. การท่ีจะรายงานเลขก่ีหลักหลังทศนิยมน้ัน แล้วแต่ความเหมาะสม เช่น ค่าเฉลี่ยปกติของยูเรีย ในปสั สาวะ 24 ชั่วโมงเทา่ กบั 15 ถึง 25 กรัม เม่ือคานวณได้ 20.4343 กรัม จะรายงานเพียง 20.4 กรมั ก็ได้ ส่วนกรดยรู ิค คา่ เฉลี่ยปกตใิ นเลอื ดเท่ากบั 0.0020 ถึง 0.0035 กรมั % เลขตาแหนง่ ท่ี 4 หลงั ทศนิยมก็มคี วามสาคัญเพ่ือความสะดวกในการเขียนหรือป้องกันความสับสนเขานิยมเปล่ียนให้เป็นหน่วยย่อยลงไปเป็นมิลลิกรัม หรือไมโครกรมั

Page | 5 ปฏิบัติการครงั้ ที่ 1 เรอื่ ง I. เครื่องมอื และวิธกี ารใช้ในหอ้ งปฏบิ ัติการชีวเคมี II. เครอื่ งแกว้ สาหรบั ปฏบิ ัตกิ ารชวี เคมี III. เทคนคิ บางอยา่ งที่ใชใ้ นการวเิ คราะห์ทางชวี เคมีI. เครอ่ื งมือ และ วิธกี ารใชใ้ นห้องปฏบิ ัติการชีวเคมี1. เครอื่ งชั่ง (Balance) มีลักษณะและความละเอียดแตกต่างกัน แล้วแต่วัตถุประสงค์ของการใช้ การใช้ต้องศึกษาให้เข้าใจวิธใี ช้ และใช้ดว้ ยความระมัดระวงั ชนิดของเครือ่ งชงั่ ทใี่ ช้ในห้องปฏบิ ัติการ มี 3 ชนิด คือ 1. เคร่ืองช่ังชนิดหยาบ (Trip balance) ปกติจะเป็นเคร่ืองช่ังสองจาน (Two-pan balance) ซ่ึงต้องใช้ตุ้มน้าหนักจากภายนอกช่วยในการช่ัง โดยทั่วไปแล้วจะมีขีดแบ่งละเอียดถึง 0.1 กรัม เครื่องชั่งชนิดหยาบนี้อาจจะเป็นเครอื่ งชัง่ ไฟฟา้ จานเดียว ซึง่ มคี วามแม่นยา และขีดจากัดในการวดั แตกตา่ งกันไป 2. เคร่ืองช่ังชนิดละเอียด (Analytical balance) อาจเป็นแบบจานเดียวหรือสองจาน และเป็นเครื่องช่ังธรรมดา หรอื เคร่อื งชั่งไฟฟ้า ซ่งึ สามารถใช้อ่านน้าหนกั ได้ละเอียดถงึ ทศนิยมตาแหน่งท่ี 4 หรอื ท่ี 5 ขนึ้ อยู่กับชนิดของเครอ่ื งมอื ซึ่งมที ั้งความละเอียดแม่นยา และไว ชัง่ น้าหนักได้ตัง้ แต่ 100 -200 กรัม หรอื ประมาณ 160กรัม เคร่ืองชั่งแบบนี้จาเป็นท่ีสุดที่จะต้องมีไว้ใช้ในห้องปฏิบัติการ การใช้เครื่องช่ังชนิดละเอียดน้ีจะมีความถูกตอ้ ง และแม่นยาเท่าใด ข้นึ อย่กู บั ปรมิ าณสารสทุ ธิที่ชัง่ ในแต่ละคร้ังด้วย 3. เคร่ืองช่ังชนิดพิเศษ (Prescription balance) ใช้ช่ังสารท่ีมีปริมาณน้อยมากมีน้าหนักสุทธิไม่เกินระดับของมลิ ลิกรมั เช่น Torsion balance เคร่ืองชั่งแบบน้ีช่งั ได้ประมาณ 100-200 มลิ ลิกรมั โดยมากใช้ทางเภสัชกรรม การเลอื กใช้เคร่ืองชั่ง และวธิ ีการใช้ ต้องเลือกใช้เคร่ืองช่ังให้เหมาะสมกับวัตถุประสงค์ ปัจจัยท่ีสาคัญในการเลือกใช้เครื่องชั่ง คือ น้าหนักของสารท่ีจะชั่ง (ต้องไม่เกินน้าหนักชั่งสูงสุดของเคร่ืองน้ัน ๆ) และความละเอียดที่ต้องการในการใช้เครื่องช่ังตอ้ งปฏบิ ัติ ดังน้ี 1. ต้องต้ังเครื่องชั่งบนพ้ืนราบที่ม่ันคง เครื่องช่ังชนิดละเอียดมีเคร่ืองบ่งบอกว่าเครื่องช่ังตั้งอยู่บนพื้นราบจรงิ ซงึ่ มลี กั ษณะเปน็ ฟองอากาศในนา้ มนั ทบ่ี รรจใุ นหลอดแกว้ 2. ขณะท่ีใช้เครื่องชั่ง ต้องรักษาความสะอาดของเครื่องช่ังตลอดเวลา ถ้ามีของหกจะต้องรีบเช็ดทันทีและควรใช้ลูกยางหรือแปรงเป่าฝุ่นบนจานและในตู้กระจกเสมอ สารท่ีอาจทาอันตรายต่อเคร่ืองช่ังต้องปิดให้มิดชิดกอ่ นนาไปช่ัง 3. ในขณะไม่ใช้ หรือใช้เสร็จแล้ว อย่าปลอ่ ยให้จานเคร่ืองช่ังแกว่งโดยเสรีต้องวางบนที่รองรับ และยกน้าหนกั ออกจากเคร่ืองใหห้ มดทกุ ครง้ั พร้อมท้ังทาความสะอาดทันที2. เคร่ืองป่ัน (Centrifuge) เป็นเครือ่ งที่ใช้ตกตะกอนสารโดยอาศัยแรงหนีศูนย์ (เช่นเดียวกับแรงดึงดูดของโลกต่อวัตถุต่าง ๆ บนพื้นผวิ โลก) ซึ่งเกิดจากการหมุนรอบแกนของหัวเหวี่ยง (rotor) ท่ีหมนุ ดว้ ยความเรว็ สูง (1,000-60,000 รอบต่อ

Page | 6นาที) สารจะถูกตกตะกอน (sediment) ลงมาตามความหนาแน่นของอนุภาคสาร กล่าวคือ สารท่ีมีความหนาแน่นสูง (ขนาดโมเลกุลใหญ่และอัดแน่น) จะตกตะกอนก่อน สารท่ีมีอนุภาคใหญ่ ๆ อาจจะตกตะกอนได้ด้วยแรงเหว่ียงต่า เช่น นิวเคลียสของเซลล์ หรือ ตะกอน (precipitate) เป็นต้น ดังนั้นอัตราเร็วของการตกตะกอนข้ึนอยู่กับขนาดของสาร (คือน้าหนักโมเลกุล) และความอัดแนน่ ของโมเลกลุ และยังข้ึนอยู่กบั แรงหนีศูนย์ท่ีใช้ในการเหว่ียงนั้นด้วย แรงหนีศูนย์มักวัดเทียบเป็นเท่าของแรงดึงดูดของโลก (g) และมีค่าขึ้นอยู่กับอัตราเร็วของการหมุนรอบตัวของหัวเหวี่ยง และขนาดของหัวเหว่ียง นอกจากแรงหนีศูนย์ท่ีกระทาต่ออนุภาคสารแล้ว ในขณะเดียวกันจะมีแรงหลายชนิดที่ต้านทานแรงนี้ แรงเหล่าน้ีได้แก่แรงลอยตัว (buoyant force)แรงเสยี ดทาน (friction) และมกี ารแพร่ (diffusion) ซง่ึ เกดิ ขึ้นตลอดเวลา และมีผลให้อนุภาคตกตะกอนชา้ ลง หน่วยท่ีใช้ในการ centrifuge อาจใช้เป็นความเร็วของการเหวี่ยง ซ่ึงใช้หน่วยเป็นจานวนรอบต่อนาที(revolution per minute = rpm) หรือใช้หน่วยเป็นจานวนเท่าของแรงดึงดูดของโลก (g = 980 ซม./วินาที) เครือ่ งปนั่ แบ่งออกไดเ้ ป็นหลายชนิด คอื 1. เคร่ืองป่ันแบบต้ังโต๊ะ (Bench-top centrifuge) เป็นเคร่ืองป่ันง่าย ๆ มีแรงเหว่ียงต่า คือ หมุนได้เร็วประมาณ 5,000 รอบ ต่อนาที ใช้สาหรับแยกโมเลกุลหนัก ๆ เช่น แยกตะกอนออกจากสารละลาย หรือแยกช้ันของสารละลายที่แยกได้ไม่ดีในการสกัดด้วยกรวยแยก การป่ันสารน้ันปกติจะเกิดแรงเสียดทานท่ีทาให้สารที่ถูกป่ัน และเครื่องป่ันมีอุณหภูมิสูงข้ึน เครื่องป่ันแบบนี้จึงเหมาะสาหรับใช้ป่ันสารท่ีไม่จาเป็นต้องอาศัยความเร็วสูงมากนกั และสารนั้นไม่สลายตวั เมื่อมอี ุณหภมู ิเปลยี่ นแปลง 2. เครื่องป่ันแบบความเร็วสูง (Superspeed centrifuge) หมุนได้เร็วประมาณ 20,000 รอบต่อนาทีเคร่ืองป่ันแบบน้ีมักมีเครื่องทาความเย็น เพ่ือให้สามารถใช้งานที่อุณหภูมิต่าได้ ใช้สาหรับแยกสารที่มีความไวต่อการเปล่ียนอุณหภูมิ เช่น ในการเตรียมเอ็นไซม์ และใช้ตกตะกอนสาร หรือ แยกองค์ประกอบของเซลล์ต่างๆ เช่น นวิ เคลยี ส ไมโตคอนเดรยี และไลโซโซม เป็นต้น 3. เครื่องป่ันแบบความเร็วสูงจัด (Ultracentrifuge) เป็นเครื่องปั่นที่มีความเร็วของการปั่นสูงมากหมุนได้เร็วประมาณ 60,000 รอบต่อนาที อาจมีเครือ่ งทาสูญญากาศเพื่อให้หัวเหว่ียงหมนุ ได้เร็วข้ึน เพราะไม่มีการเสียดสีกับอากาศและมีเคร่ืองควบคุมอุณหภูมิ ใช้สาหรับแยกสารโมเลกุลใหญ่ (macromolecules) ออกจากสารละลายของโมเลกลุ เหลา่ นีไ้ ด้ เชน่ พวก DNA และโปรตีน วิธีการใชเ้ ครื่องปน่ั แบบตง้ั โต๊ะ ซ่ึงในห้องปฏบิ ตั กิ ารเปน็ แบบ IEC clinical centrifuge 1. ตรวจดูวา่ ปุม่ ปรบั ความเรว็ ของเครือ่ งอยู่ทตี่ าแหนง่ off 2. เสียบปล๊กั เคร่อื ง และเปดิ ฝาครอบ 3. กอ่ นใช้เครื่องตอ้ งสารวจให้แน่นอนว่าในกระบอกโลหะสาหรับบรรจุหลอดปนั่ มียางรองกน้ หลอดอยู่มฉิ ะน้นั หลอดปนั่ ท่เี ปน็ แกว้ อาจแตกได้ 4. นาหลอดปั่นท่ีบรรจุสารละลายในระดับท่ีต่าจากขอบบนไม่เกิน 2 ซม. มาปรับน้าหนักบนเคร่ืองช่ัง2 จาน (วิธีการปรับน้าหนักหลอดป่ัน คือ วางบีคเกอร์ขนาด 100 มล. ลงบนจานเครื่องชั่งข้างละใบ แล้วปรับน้าหนักบนเคร่ืองชั่ง 2 จานให้เท่ากัน นาหลอดป่ันท่ีบรรจุสารละลายซึ่งต้องการป่ันวางลงในบีคเกอร์ข้างหน่ึงและหลอดปั่นสาหรับปรับน้าหนักวางลงในบีคเกอร์อีกข้างหน่ึง แล้วเติมน้าในหลอดป่ันสาหรับปรับน้าหนักจนกระทง่ั นา้ หนกั ทัง้ 2 ดา้ นเทา่ กนั ) 5. นาหลอดปั่นท่ีปรับน้าหนักแล้ว บรรจุลงในช่องรอบหัวเหว่ียง โดยท่ีหลอดปั่นคู่นี้ต้องใส่อยู่ในตาแหน่งตรงกนั ขา้ มเสมอ

Page | 7 6. ตรวจใหเ้ แนใ่ จวา่ ทกุ หลอดใสเ่ ข้าทีเ่ รยี บร้อย แลว้ จึงปดิ ฝาครอบ 7. หมนุ ปุม่ ควบคมุ ความเร็วไปในทิศทางตามเข็มนาฬกิ าชา้ ๆ จนไดค้ วามเร็วท่ีต้องการแลว้ เร่มิ จบั เวลา 8. เม่ือครบเวลาให้หมุนปุ่มปรับความเร็ว ทวนเข็มนาฬิกามาอยู่ที่ตาแหน่ง off และรอจนหัวปั่นหยุดหมนุ หา้ มเปดิ ฝาเครื่องเพือ่ ใชม้ ือช่วยให้เครื่องหยุด 9. เมือ่ เครอื่ งหยุดสนทิ แลว้ จึงเปิดฝานาหลอดปัน่ ออกจากเคร่ือง 10. ในระหว่างใช้เคร่ืองปั่น ถ้ามีเสียงผิดปกติดังมาจากภายในเคร่ือง ให้ปิดเคร่ืองทันทีรอจนเครื่องหยดุ จึงเปิดดู และทาความสะอาด นาเศษแก้วท่ีแตกออกจากเครื่องเสยี ก่อนท่จี ะใชต้ ่อไป3. เคร่อื งวดั พเี อช็ (pH meter) เป็นเครื่องวัดความเข้มข้นของไฮโดรเจนไออ็อน [H+] หรือความเป็นกรดด่างของน้ายาต่าง ๆ โดยอาศยั ศักย์ทางเคมขี อง [H+] ซึ่งวดั ได้โดยใชห้ ลอดอเี ล็คโตรด (electrodes) เครอ่ื งนมี้ ีอยหู่ ลายแบบ แต่แบบทใี่ ช้ในหอ้ งปฏบิ ตั กิ ารนเ้ี ป็นชนิด Eutech pH 510หน้าจอแสดงผล 34 56 27 1 12 11 8 10 91. HOLD ค่าการแสดงผลค้างบนหน้าจอ2. READY คา่ ทอ่ี ่านไดบ้ นหน้าจอคงท่ี (พร้อมสาหรับการอา่ นคา่ )3. SET UP เครือ่ งอยู่ใน mode การ set up4. MEAS เครื่องอยใู่ น mode การวัดคา่5. CAL เคร่ืองอยู่ใน mode การคาลิเบรท6. MEM ขอ้ มลู ท่อี า่ นไดถ้ ูกเก็บในหนว่ ยความจา7. R.mV, pH, ppm, 0C F mode การวดั ท่ใี ช้ (mV, pH, Ion, อุณหภมู ิ)8. pH หน่วยวดั ความเป็นกรด-ดา่ ง9. ATC รูปแบบการชดเชยอุณหภูมิแบบอัตโนมัติ10. BUFFER - พรอ้ มสาหรับการเลอื กใช้ buffer ในการคาลิเบรท (เม่อื ขน้ึ เพยี งเครอ่ื งหมายเดยี ว) - เกดิ ความผดิ พลาดของ buffer เม่ือข้ึนคู่กับเคร่ืองหมาย ERR11. ELECTRODE เกิดความผิดพลาดของหลอดอีเล็คโตรด เมือ่ ขน้ึ คกู่ บั เครอ่ื งหมาย ERR12. ERR เกดิ ความผิดพลาดข้นึ ในระบบการวดั คา่

Page | 8แป้นกด ป่มุ หนา้ ทใี่ นหน้าจอการวดั หน้าทใ่ี นหน้าจอการคาลิเบรท ON/OFF -CAL/MEAS สาหรับเปิด/ปดิ เครือ่ ง เมือ่ เปดิ เคร่อื งหน้าจอจะแสดง MODE หน้าจอสดุ ทา้ ยก่อนปิดเคร่อื ง - HOLD MI/۸ สาหรับเลือก mode ระห ว่างการวัดและการ คาลเิ บรท MR/٧ สาหรบั เลือก mode การวัดระหวา่ ง pH/ สาหรับเปลี่ยนระหว่าง mode pH กับ ENTER อณุ หภมู /ิ mV/ Ion/ (เฉพาะรุ่น pH/Ion 510) อณุ หภูมิ สาหรบั คา้ งคา่ การแสดงผลบนหน้าจอ - เมอ่ื ตอ้ งการยกเลกิ การค้างค่าให้กดปุ่มนี้อีกครั้ง สาหรับบันทึกค่าท่ีวัดได้ไปยังหน่วยความจาของ สาหรับเลื่อนค่าในหน้าจอการคาลิเบรท เครอื่ ง และสาหรับเล่ือนดตู าแหน่งในหน่วยความจา mVและอุณหภูมิและเลือกตัวเลือกต่าง ๆ ในหน้าจอการคาลิเบรท Ion สาหรับเลือ่ นดเู มนใู นหน้าจอ Setup สาหรับเรียกดูข้อมูลในหน่วยความจา และสาหรับ สาหรับเลื่อนค่าในหน้าจอการคาลิเบรท เล่อื นดูตาแหนง่ ในหน่วยความจา mV และอุณหภูมิและเลือกตัวเลือกต่างๆ ในหน้าจอการคาลเิ บรท Ion สาหรบั เลอ่ื นดูเมนูในหน้าจอ Setup สาหรับเข้าสู่ฟงั กช์ นั ในหน่วยความจา สาหรบั ยืนยนั ค่า วิธกี ารใช้เครอื่ งวัดพเี อช็ 1. กดป่มุ ON เม่ือเปิดเครื่องท่ีด้านบนของหน้าจอจะข้ึนคาว่า MEAS และถ้าหากเลือกรูปแบบการชดเชยอุณหภูมิแบบอตั โนมตั ิ ท่หี น้าจอจะข้นึ คาว่า ATC ดว้ ย 2. การเตรยี มหลอดอีเลค็ โตรด ก่อนใชต้ อ้ งนาหลอดอีเลค็ โตรดออกจากภาชนะท่เี ก็บกอ่ น 3. การ Calibrate เคร่อื งวดั พเี อช็ จุ่มหลอดอีเล็คโตรดลงในน้ายาพีเอ็ชมาตรฐานโดยจุ่มให้ท่วมเซนเซอร์ และกดปุ่ม CAL/MEAS ท่ีหน้าจอจะแสดงค่า pH ถ้าไม่ตรงกับค่า pH ของน้ายาพีเอ็ชมาตรฐานให้หมุนวนบีคเกอร์ที่บรรจุน้ายาพีเอ็ชมาตรฐานรอบๆ หลอดอีเล็คโตรด รอจนค่าที่อ่านได้คงท่ีจะปรากฎเคร่ืองหมาย READY กดปุ่ม ENTER เพื่อยืนยันค่าการ calibrate ที่บรรทัดบนจะปรากฎค่าการ calibrate ชั่วครู่ก่อนที่จะบันทึกค่าการ calibrate ในหน่วยความจา จากนั้นยกหลอดอีเล็คโตรดออกมาล้างด้วยน้ากล่ัน และซับให้แห้ง วิธีการนี้นักเรียนไม่ต้องปฏิบัติเอง เจา้ หน้าทีห่ อ้ งปฏิบตั ิการจะทาไว้ให้เรยี บร้อยแล้ว ส่วนการเลือกใช้นา้ ยาพเี อช็ มาตรฐานก็ข้ึนอยู่กับค่า pH ของน้ายาที่ต้องการวัดค่า แต่ส่วนใหญ่จะใช้ที่ pH 7 สาหรับเคร่ืองวัดพีเอ็ชชนิดนี้สามารถ calibrateค่า pH ของน้ายามาตรฐานได้อยา่ งน้อย 2-5 ค่า

Page | 9 4. การวดั คา่ พเี อ็ชของสารละลายตวั อย่าง จมุ่ หลอดอเี ล็คโตรดลงไปในสารละลายตวั อย่างโดยจุ่มให้ท่วมเซนเซอร์ พร้อมกับคนเบา ๆ เพ่ือให้สารละลายเป็นเน้ือเดียวกัน รอเพื่อให้ค่าที่วัดได้นิ่ง เม่ือค่าท่ีวัดได้น่ิงดีแล้ว หน้าจอจะข้ึนคาว่า READY (ค่าจะน่ิงตอ่ เมอ่ื คา่ pH ทีว่ ดั มีความแตกต่างไมเ่ กิน + 0.01)II. เครือ่ งแกว้ สาหรับปฏิบัติการชีวเคมเี บื้องตน้ เครื่องมือและอุปกรณ์ต่างๆที่ใช้อยู่ในห้องปฏิบัติการทางวิทยาศาตร์และทางการแพทย์มีมากมายหลายชนิด ส่วนใหญ่ที่นิยมใช้กันมักทามาจากแก้วจึงเรียกชื่อเครื่องมือและอุปกรณ์เหล่านี้ว่า เคร่ืองแก้ว (glassware)เครื่องแก้วมีหน้าที่หลัก 3 ประการคือ (1) เป็นที่สาหรับเก็บสาร (2) ใช้วัดปริมาตร และ (3) เป็นท่ีเกิดปฏิกิริยาต่างๆ เครื่องแก้วเหล่าน้ีทามาจากแก้วที่มีความทนทานทั้งต่อความร้อน แสง และการกัดกร่อนของสารเคมีต่างๆจึงเป็นที่นิยมใช้กันอย่างกว้างขวาง ตัวอย่างเช่น เคร่ืองแก้วที่ทามาจากแก้วชนิด borosilicate และaluminosilicate จะทนความร้อนสูงมาก เคร่ืองแก้วที่ทามาจากแก้วชนิด low actinic จะช่วยลดแสง จึงเหมาะสาหรับใส่สารที่ไวตอ่ แสงเช่น วติ ามนิ เอ เบต้าแคโรทนี หรือเคร่อื งแกว้ ท่ที ามาจากแกว้ ชนิด high silica เชน่ หลอดคิวเวตท่ีใช้กับเครื่อง spectrophotometer และเทอร์โมมิเตอร์ ในปัจจุบันเครื่องพลาสตกิ ได้เข้ามามีบทบาทแทนเคร่ืองแก้วมากขึ้น เน่ืองจากมีการพัฒนาคุณสมบัติของพลาสตกิ ให้ทนทานต่อการกัดกร่อนจากกรดและด่าง อกี ท้ังพลาสติกยังมีคุณสมบัติไม่แตก และราคาถูกกว่า พลาสติกที่นิยมใช้ เช่น polyethylene, polypropylene,Teflon และ polyvinylchloride เป็นต้น ไม่ว่าจะเป็นแก้ว หรือพลาสติกชนิดใดก็ตาม ต่างก็มีคุณสมบัติ และข้อจากัดในการใช้ที่แตกต่างกัน ดังนั้นการศึกษาข้อมูลละเอียดจะช่วยในการตัดสินใจเลือกซื้อและเลือกใช้เครื่องแก้วได้อยา่ งเหมาะสมกบั งาน และแหลง่ ขอ้ มูลทด่ี ีทสี่ ุดก็คอื บรษิ ัทผู้ผลติ นนั่ เอง แมว้ ่าเคร่ืองแกว้ จะมีมากมายและหลากหลาย แต่ก็มเี ครอื่ งแก้วสว่ นหน่ึงทีเ่ ป็นเครอ่ื งมือพ้ืนฐานจาเป็นสาหรับห้องปฏิบัติการท้ังหลาย ไม่ว่าจะเป็นห้องปฏิบัติการเคมี ห้องปฏิบัติการชีวเคมีหรือห้องปฏิบัติการเคมีคลินิกก็ตาม โดยทั่วไปสามารถจดั กล่มุ เครื่องแกว้ ทจี่ าเป็นเหลา่ น้ตี ามลกั ษณะการใช้งานได้ 2 กลุ่มใหญ่ๆ คอื - กลุ่มเคร่ืองแก้ววดั ปริมาตร (Volumetric glassware) - กลมุ่ เครื่องแก้วใสน่ า้ ยา (Non-volumetric glassware) เคร่ืองแก้วเหล่าน้ีแต่ละชนิดจะมีลักษณะ ประโยชน์ และวิธีการใช้แตกต่างกันไป ผู้ใช้จึงต้องทาความรู้จักกับเคร่ืองแก้วเหล่าน้ีก่อน จึงจะสามารถเลือกใช้ได้เหมาะสมกับงานและความต้องการ และสามารถใช้ได้อย่างถูกตอ้ ง อนั จะชว่ ยลดความผิดพลาดท่ีเกิดขึน้ ได้ นอกจากนี้ยังมีเคร่ืองแก้วอื่นๆ และอุปกรณ์ท่ีใช้ร่วมที่จาเป็นต้องทาความรู้จักควบคู่ไปด้วย ต่อไปน้ีเป็นรายละเอียดของเครื่องแกว้ ทม่ี ีใช้อยู่ท่วั ไปในการทดลองหรอื วิเคราะห์ทางชีวเคมีเบ้ืองต้นกลมุ่ เครือ่ งแก้ววัดปริมาตร (Volumetric glassware) เป็นกลุ่มเคร่ืองแก้วที่ใช้สาหรับวัดปริมาตรของเหลว ทั้งการวัดปริมาตรแบบธรรมดา และการวัดปรมิ าตรแบบที่มคี วามถกู ต้องแม่นยาสูง การออกแบบการใชง้ านเครือ่ งแกว้ วัดปริมาตรนีแ้ บง่ เป็น 2 วิธีดังนี้ 1. TC (to contain) หรือแบบท่ีใช้รับเป็นเคร่ืองมือแบบท่ีใช้วัดปริมาตรของเหลวท่ีบรรจุอยู่ภายในภาชนะน้ันๆ เมือ่ ถา่ ยเทของเหลวไปสู่ภาชนะอ่ืนจะได้ปริมาตรน้อยกว่าปริมาตรที่ระบไุ ว้ 2. TD (to deliver) หรอื แบบทใี่ ช้ส่ง เป็นเครื่องมือแบบที่ใชว้ ดั ปรมิ าตรของเหลวท่ีต้องการถ่ายเทไปสู่ภาชนะอนื่ เมอื่ ถ่ายเทของเหลวหมดจะไดป้ ริมาตรเท่าทกี่ าหนดไว้

P a g e | 10 เคร่ืองแก้ววัดปรมิ าตรที่ใช้จะออกแบบไว้เป็นแบบใด ผู้ใช้สามารถดูได้จากเคร่ืองหมายหรือตัวอักษรที่ทางบรษิ ัทผูผ้ ลิตทากากบั ไว้ เช่น “TC” หรือ “TD”วธิ กี ารอ่านปริมาตร ในการวัดปริมาตรของเหลวท่ีถูกต้อง นอกจากการเลือกใช้เคร่ืองแก้วที่เหมาะสมแล้ว ยังต้องรู้จักวิธีการอ่านปริมาตรอย่างถูกต้องด้วย วิธีการอ่านปริมาตรเริ่มจากการหาตาแหน่ง meniscus ของของเหลวก่อน (meniscus คือผิวหน้าของของเหลว มีลักษณะเป็นเส้นโค้ง) แล้วจึงอ่านปริมาตร ตามปกติสาหรับของเหลวใส ตาแหน่งที่ต้องอ่านคือที่ก้นท่ีลึกท่ีสุดของเส้นโค้งของของเหลว หากเป็นของเหลวมีสีทึบแสง เช่นเลือด หรือปรอท ต้องอ่านท่ียอดของเส้นโค้ง ในขณะอ่านปริมาตรระดับสายตา จุด meniscus และขีดบอกปริมาตรบนเคร่ืองแก้วจะต้องอยู่ในระดับเดียวกัน ข้อควรระวังในการอ่านปริมาตร คือ ไม่ควรอ่านปริมาตรของเหลวในขณะท่ีมีฟองอากาศปะปนอยู่ ควรรอให้ฟองอากาศหมดเสียก่อน เคร่ืองแกว้ ทใี่ ช้สาหรับวัดปรมิ าตรของเหลว ได้แก่ 1) กระบอกตวง (Graduated cylinders) 2) ขวดวัดปรมิ าตร (Volumetric flasks) 3) ปิเป็ต (Pipets) 4) บวิ เร็ต (Burets) 1. กระบอกตวง (Graduated cylinders) เป็นภาชนะทาด้วยแก้วหรือพลาสติก ทรงกระบอกยาวตั้งข้ึนและมีฐานเป็นวงกลมหรือเป็นรูปแปดเหลี่ยมด้านข้างของ ทรงกระบอกมีขีดบอกปริมาตรท่ีแบ่งเป็นขีดย่อยบอกปริมาตรไว้อย่างสม่าเสมอ ตลอดท้ังแท่ง กระบอกตวงเป็นเครื่องมือวัดปริมาตรทั้งแบบ TC และ TD ถ้าเป็น แบบ TC ใช้วัดปริมาตรของเหลวที่บรรจุอยู่ภายในกระบอกตวง และถ้าเป็นแบบ TD ใช้วัดปริมาตรของเหลวท่ีจะถ่ายเทไปสู่ภาชนะอื่น กล่าวคือ เมื่อเติมของเหลวจนเต็ม กระบอกตวงถงึ ขีดบอกปริมาตรบนสุดแล้วเทสารละลายจากกระบอกตวงไปสูภ่ าชนะ อ่ืน ปริมาตรของเหลวท่ีถ่ายเทออกไปสามารถวัดได้จากกระบอกตวงแบบ TD กระบอกตวงมีหลายขนาดตั้งแต่ 5 ถึง 2,000 มิลลิลิตร สามารถเลือกขนาดของ กระบอกตวงได้ตามปริมาตรทใี่ ช้การใชป้ ระโยชน์ กระบอกตวงเป็นเครื่องมือสาหรับใช้วัดปริมาตรของเหลวแบบธรรมดา ที่ไม่ต้องการความถูกต้องสูงจึงไม่เหมาะสาหรับการวิเคราะห์เชิงปริมาณ (quantitative analysis) สามารถวัดปริมาตรและถ่ายเทของเหลว ปริมาตรเทา่ ไรกไ็ ดจ้ นถึงปรมิ าตรสูงสดุ ท่ีระบุไว้ทีก่ ระบอกตวงแตล่ ะอันข้อควรระวงั กระบอกตวงห้ามถูกความร้อน เช่นนาไปต้ม หรือเผา เพราะจะแตกเมื่อถูกความร้อน เน่ืองจากทามาจากแกว้ หนา

P a g e | 11 2. ขวดวดั ปริมาตร (Volumetric flasks) เป็นขวดทรงกลม โดยเปน็ กระเปาะกลมท่ี ส่วนล่างและก้นเรียบ มีคอยาว มีจุกปิด และที่คอขวดมีขีดบอกปริมาตรที่จุตามท่ีระบุ ไว้ ณ อุณหภูมิท่ีกาหนด เป็นเครื่องมือวัดปริมาตรแบบ TC กล่าวคือ เมื่อเติม สารละลายถึงขีดที่กาหนด จะได้ปริมาตรตามที่ระบุไว้ หากถ่ายเทสารละลายภายใน ไปสู่ภาชนะอื่นจะได้ปริมาตรไม่เท่ากับท่ีระบุไว้ ขวดวัดปริมาตรที่ใช้อยู่ในปัจจุบันมี หลายขนาดตัง้ แต่ 1 จนถึง 4,000 มิลลลิ ติ ร การใช้ประโยชน์ ใช้ในการเตรียมน้ายาที่ต้องการความเข้มข้นท่ีแน่นอน มีความถูกต้องแม่นยาสูงมาก เชน่ สารละลายมาตรฐาน หรือการเจอื จางสารละลาย วธิ กี ารใช้ 1. ใสส่ ารทตี่ ้องการละลายหรอื เจอื จางลงในขวดวัดปรมิ าตร 2. เติมน้าหรอื ตัวทาละลายลงไปประมาณ 2/3 ของขวดวัดปรมิ าตร อยา่ ใหถ้ งึ ขีดบอกปรมิ าตร 3. หากเป็นของแข็งต้องให้ละลายให้หมดก่อน แล้วจึงเติมน้าหรือตัวทาละลายจนถึงขีดบอก ปริมาตรโดยเมื่อใกล้ถึงขีดบอกปริมาตรให้เติมด้วยพาสเจอร์ปิเป็ต (pasteur pipet) หรือ dropper ทีละหยดจนกระท่ังก้นของจุด meniscus ของสารละลายอยู่ในระดับพอดีกับขีดบอกปริมาตร ระวังอย่าให้มีน้าหรือสารละลายค้างอยู่ที่คอขวดบริเวณเหนือขีดบอกปริมาตร เพราะจะทาให้ปริมาตรสารละลายที่ได้ผิดไปจากที่ระบไุ ว้ 4. ปิดจกุ ขวดวดั ปรมิ าตร 5. ผสมสารละลายใหเ้ ป็นเนื้อเดียวกัน โดยควา่ ขวดวัดปริมาตรกลับไปมาหลายๆ ครัง้ พรอ้ มๆ กับเขย่าเมื่อสารละลายเข้ากันดีแล้ว จึงถ่ายเทสารละลายใส่ในขวดอื่นเช่น ขวดเก็บน้ายา เพื่อนาไปใช้ต่อไป อย่าเก็บสารละลายไว้ในขวดวดั ปรมิ าตร ขอ้ ห้าม 1. อยา่ ควา่ ขวดวัดปรมิ าตรจนกวา่ จะเตมิ นา้ หรอื สารละลายจนถึงขดี บอกปริมาตรที่กาหนด 2. อย่าตม้ นา้ ยาในขวดวัดปริมาตร 3. ไม่ควรใช้ขวดวัดปริมาตรเก็บสารละลาย3. ปิเป็ต (Pipets) เป็นท่อแก้วกลวงยาว ปลายเปิดทั้งสองด้าน มีขีดบอกปริมาตร เป็นเครื่องมือวัดปริมาตรทั้งแบบ TC และ TD ซึ่งสามารถสังเกตได้จากตัวอักษรที่กากับไว้ท่ีส่วนปลายด้านบนของปิเป็ตแต่ละอัน เราสามารถแบ่งปเิ ป็ตตามลกั ษณะการใชง้ านได้เป็น 3 แบบดังนี้ - ปเิ ป็ตแบบ TC จะบรรจุของเหลวไดต้ ามปรมิ าตรที่กาหนด เมื่อจะถา่ ยเทของเหลวใหไ้ ดต้ ามปรมิ าตรที่กาหนด จะต้องดูดน้าเข้าไปล้างส่วนที่เหลือค้างติดอยู่ในปิเป็ตออกมาจึงจะได้ปริมาตรครบ เช่นmicropipets - ปิเป็ตแบบ TD จะถา่ ยเทของเหลวได้ตามปริมาตรที่กาหนดด้วยวิธีแตะปล่อย โดยอาศัยแรงโน้มถ่วงกล่าวคือเมื่อของเหลวไหลออกจากปิเป็ตจนเกือบหมดแล้วต้องแตะปลายปิเป็ตไว้ข้างภาชนะรองรับท้ิงไว้เป็นเวลา 15 วินาที เพื่อให้ของเหลวที่เหลือค้างอยู่ในปิเป็ตไหลลงสู่ภาชนะรองรับได้หมด เช่น volumetricpipets

P a g e | 12 - ปิเป็ตแบบ TD/blow out จะถ่ายเทของเหลวได้ตามปริมาตรที่กาหนดด้วยวิธีแตะเป่า โดยเม่ือของเหลวไหลออกจากปิเป็ตจนเกือบหมดแล้ว ต้องแตะปลายปิเป็ตไว้ข้างภาชนะรองรับนานประมาณ 15 วินาทีเม่ือครบกาหนดแล้วต้องเป่าลมเข้าไปไล่ของเหลวท่ีค้างอยู่ภายในปิเป็ตออกมาอีกด้วย โดยเป่าลมสั้น ๆ ครั้งเดยี ว ปิเปต็ แบบนจ้ี ะมีแถบฝา้ ทึบเปน็ วงซอ้ นกัน 2 วงตรงปลายดา้ นบนของปิเปต็ เช่น Ostwald-Folin pipetsการใชป้ ระโยชน์ ใช้วัดปริมาตรของเหลวที่มีความถูกตอ้ งแม่นยาสูงมากวิธีการใช้ ปิเป็ตทุกชนิด (ยกเว้น automatic pipets) เรียกว่าเป็น manual pipets หมายถึงกลไกการดูดและถ่ายเทของเหลวเขา้ ออกจากปิเป็ตจะใช้แรงดันจากอากาศภายนอกปิเป็ต ดังน้ันในการใชป้ ิเป็ตพวกนี้จะต้องใช้ควบค่กู บั ลกู ยาง (rubber bulb) ซ่งึ มีหลายแบบให้เลอื ก ขน้ั ตอนการใชป้ ิเป็ตมดี งั นี้1. ลา้ งปิเปต็ ด้วยของเหลวท่จี ะใชเ้ ลก็ น้อย ขั้นนส้ี าคัญมากหากปเิ ปต็ ทน่ี ามาใช้ไมแ่ ห้งสนิท2. บบี ลมออกจากลูกยางค้างไว้ แลว้ สวมลูกยางเข้าทางปลายบนของปิเป็ต ห้ามใช้ปากดูดปเิ ป็ตเดด็ ขาด3. จุม่ ปลายปิเป็ตลงในของเหลวท่ตี ้องการดดู ขนึ้ มา โดยปเิ ปต็ ตอ้ งต้งั ตรงในแนวด่งิ4. ค่อยๆ ผ่อนลกู ยาง อากาศจะดันของเหลวเข้าไปในปิเปต็ ทาเชน่ นี้จนกระทงั่ ของเหลวข้ึนมาสูงเหนอื ขีดบอกปรมิ าตร5. ปลดลูกยางออกจากปิเปต็ พรอ้ มๆ กับใช้นิ้วชีป้ ิดที่ปลายบนของปิเปต็6. เผยอนิ้วชี้เล็กน้อย เพื่อปล่อยให้ของเหลวไหลออก จนกระทั่งจุด meniscus ของของเหลวพอดีกับขีดบอกปริมาตรของปิเป็ตเมื่ออยู่ในระดับสายตา วิธกี ารนี้เปน็ การควบคุมการไหลของของเหลวให้ลดลงจนได้ปริมาตรทต่ี อ้ งการ7. อ่านปริมาตรทต่ี ้องการ โดยต้ังปเิ ปต็ ให้ตรงในแนวด่งิ8. ใช้กระดาษนมุ่ ๆ ซับรอบๆ ดา้ นนอกของปเิ ปต็ ให้แห้ง9. ปล่อยของเหลวให้ไหลเอง โดยใช้ปลายปิเป็ตแตะท่ผี นังด้านข้างของภาชนะรองรับ และปเิ ป็ตยังคงตั้งตรงในแนวดิง่ อยู่10. เมื่อของเหลวไหลลงภาชนะอื่นหมดแล้ว ยังคงมีของเหลวหยดสุดท้ายเหลือติดอยู่ภายในปิเป็ต ก็ใช้วิธแี ตะปลอ่ ย หรอื วิธแี ตะเป่าขนึ้ กับชนิดของปเิ ปต็ ปเิ ป็ตที่นิยมใช้โดยทั่วไปมีหลายชนดิ เราสามารถแบ่งชนิดของปเิ ปต็ ได้ดงั นี้ 1. Serological pipet เป็นปิเป็ตแบบ TD หรอื แบบ TD/blow out ต้องสังเกตจากแถบฝ้าทึบเป็นวงซ้อนกัน 2 วงตรงปลายด้านบนของปิเป็ต ปิเป็ตชนิดน้ีใช้ถ่ายเทของเหลวปริมาตรเท่าใดก็ได้จนถึงปริมาตรสูงสุดตามท่ีกาหนดสาหรับปิเป็ตน้ัน ๆ มีลักษณะเป็นท่อกลมยาว และมีขีดบอกปริมาตรท่ีแบ่งเป็นขีดย่อยจากศูนย์ข้างบนจนถึงปลายล่างสุดของปิเป็ต จะละเอียดแค่ไหนก็ขึ้นอยู่กับขนาดของปิเป็ต ตัวอย่างเช่น ปิเป็ตขนาด 5 มิลลิลิตร จะแบ่งขีดเป็นส่วนย่อยได้ละเอียดถึง 0.1 มิลลิลิตร จึงวัดปริมาตรได้ตั้งแต่ 0.1 ถึง 5มลิ ลิลิตร ถ้าเป็นปิเป็ตขนาด 1 มิลลลิ ติ ร จะแบง่ ขดี เปน็ ส่วนย่อยได้ละเอียดถงึ 0.01 มลิ ลิลิตร จึงวดั ปริมาตรได้ตั้งแต่ 0.01 ถึง 1 มิลลิลิตร ดังน้ันจะเลือกใช้ปิเป็ตขนาดใดก็ขึ้นอยู่กับปริมาตรของของเหลวท่ีต้องการวัดด้วยเพ่อื ให้วดั ปริมาตรไดถ้ กู ตอ้ งมากข้ึนและผดิ พลาดนอ้ ยลง ปิเปต็ ชนิดน้นี ยิ มใช้ในการเจือจางในสดั สว่ นต่าง ๆ กันใช้มากใน serology

P a g e | 13 2. Mohr pipet เป็นปิเป็ตแบบ TD มีลักษณะเหมือน serological pipet ทุกอย่าง ยกเว้นแต่ขีดแบ่งปริมาตรสุดทา้ ยจะลงไปไม่ถึงปลายลา่ งสุดของปิเปต็ เวลาปลอ่ ยของเหลวก็ปล่อยจนถงึ ขีดบอกปริมาตรขีดสดุ ทา้ ยทางด้านล่างของปิเป็ตเท่าน้ัน อย่าปล่อยของเหลวจนถึงปลายล่างสุดที่ไม่มีขีดแบ่งปริมาตร และไม่ต้องเป่าของเหลวออก เพราะจะทาใหป้ รมิ าตรท่ีวัดได้มากเกินเป็นจริง และปลายปิเปต็ จะต้องไม่ถกู หรือแตะทผ่ี นงั ด้านในของภาชนะท่ีรองรับในระหว่างปล่อยของเหลวไหลออกจากปิเปต็ 3. Micropipet หรือ Lambda pipet เป็นปิเป็ตแบบ TC ท่ีทาด้วยแก้ว ใช้วัดสารที่มีปริมาตรน้อยกวา่ 1 มิลลิลติ ร เช่น ตง้ั แต่ 1-500 ไมโครลติ ร จะให้ความถูกตอ้ งแม่นยาดมี าก วิธีการใชม้ ดี ังนี้1) ใชร้ ว่ มกบั สายยางโดยเอาปลายสายยางดา้ นหนง่ึ ตอ่ เขา้ กับดา้ นกระเปาะใหญข่ องปเิ ป็ต2) ใช้ปากดูดน้ายาข้ึนมาโดยผ่านทางสายยางที่อยู่ในปากแล้วใช้ล้ินอุดท่ีปลายสายยางท่ีอยู่ในปาก เพ่ือปรับให้ได้ปริมาตรท่ีตอ้ งการ3) ใชก้ ระดาษ tissue ซบั ปลายปิเป็ตใหแ้ หง้4) ปล่อยสารละลายท่ีไดล้ งในภาชนะที่ตอ้ งการใช้ ซ่งึ มนี ้ายาหรอื น้าอย่กู อ่ นแล้ว5) เม่ือปล่อยสารละลายลงไปหมดแล้วต้องดูดน้าหรือน้ายาท่ีอยู่ในภาชนะรองรับข้ึนมาล้างในปิเป็ต 2-3 คร้ังจงึ จะไดป้ รมิ าตรตามท่ตี ้องการ 4. Volumetric pipet หรือ Transfer pipet เป็นปิเป็ตแบบ TD ใช้สาหรับถ่ายเทของเหลวปริมาตรเดียวตามท่ีระบุไว้ลักษณะของปิเป็ตเปน็ ท่อแก้วกลวงยาว มีกระเปาะทรงกระบอกอยู่ตรงกลางของท่อกลวงน้ัน มีขีดบอกปริมาตรเพียงขีดเดียวอยู่เหนือกระเปาะ ไม่มีการแบ่งขีดย่อย จึงใช้วัดปริมาตรจากัดเพียงปรมิ าตรเดยี วได้อย่างถกู ต้องแม่นยาดีมาก 5. Ostwald-Folin pipet เป็นปิเป็ตแบบ TD/blow out รูปร่างคล้าย volumetric pipet แต่กระเปาะเป็นรูปกระสวย และอย่คู ่อนมาทางปลายแหลมด้านล่างของปิเป็ต มีขีดบอกปริมาตรเพียงขีดเดียวอยู่เหนือกระเปาะ ไม่มีการแบ่งขีดย่อยเช่นเดียวกับ volumetric pipet นิยมใช้ในทางเคมีคลินิกในการวัดปรมิ าตรของเหลวทีม่ คี วามหนืดสูง เช่น เลือด เปน็ ต้น 6. Pasteur pipet มีลักษณะเป็นหลอดแก้วยาวโดยมีปลายข้างหน่ึงเรียวยาวเล็ก ไม่มีขีดบอกปริมาตร จึงใช้วัดปริมาตรท่ีแน่นอนไม่ได้ แต่จะใช้ในการถ่ายเทของเหลวจากภาชนะหน่ึงไปยังอีกภาชนะหนึ่งโดยไม่คานึงถงึ ปริมาตร จึงไม่ใช้ในการวิเคราะห์เชิงปริมาณ ตัวอย่างเช่น ใช้ในการดูดแยกซีรั่มออกจากเลือดที่ป่นั แลว้ หรือดูดแยกสารละลายออกจากตะกอน เป็นต้น ปิเป็ตนี้จะใช้ร่วมกับลูกยางขนาดเล็ก 7. Automatic pipet เป็นปิเป็ตแบบ TD ที่มีกลไกของการดูดและถ่ายเทของเหลวเกิดขึ้นโดยใช้ระบบลูกสูบภายในปิเป็ตเอง (automatic) โดยไม่ตอ้ งใช้ลูกยางเหมือนปิเป็ตอ่ืน ๆ ข้างต้น มีหลายขนาดตัง้ แต่ไมโครลิตร จนถึงมิลลิลิตร โดยปิเป็ตแต่ละอันจะมีขนาดเป็นช่วงเช่น ขนาด 2 – 20 ไมโครลิตร 10 – 100ไมโครลติ ร หรอื 100–1,000 ไมโครลิตร และสามารถปรบั ปริมาตรได้ตามต้องการ การใช้ปเิ ป็ตประเภทน้ีจะใช้รว่ มกับ tip ซึ่งเป็นส่วนที่บรรจุและถ่ายเทของเหลว tip ทาด้วยพลาสติก ส่วนใหญ่เป็นพวก polypropyleneเวลาจะใช้ก็เอา tip ใส่เข้าที่ลากล้องของปิเปต็ และเม่ือใช้เสร็จก็ท้ิงไดเ้ ลย เพราะมักเป็นแบบใช้คร้ังเดียวแล้วทิ้งมีขนาดต่าง ๆ กัน แล้วแต่ปริมาตรของของเหลวที่ต้องการวัด ปิเป็ตชนิดน้ีเป็นท่ีนิยมใช้กันมากในปัจจุบันในห้องปฏบิ ัติการชีวเคมีหรือเคมีคลินิก เมือ่ ต้องการใช้วัดปรมิ าตรน้อยๆ เป็นไมโครลิตร และใช้วัดปริมาตรใดปริมาตรหนึ่งซ้ากันหลาย ๆ คร้ัง จะมีความแม่นยาสูงมากข้ึน ข้อดีของปิเป็ตชนิดน้ี คือ ใช้ง่ายประหยัดเวลา ปลอดภัยคงที่และมีความแม่นยาเพ่ิมข้ึน ไม่ต้องทาความสะอาด เพราะส่วนที่จะเป้ือนมากท่ีสุดคือ tip ซึ่งมักจะเป็นแบบใชแ้ ล้วทง้ิ ได้เลย

P a g e | 141. Serological pipet 4. Volumetric pipet or Transfer pipet2. Mohr pipet 5. Ostwald-Folin pipet3. Micropipet or Lambda pipet 6. Automatic pipet 4. บิวเร็ต (Buret) เป็นเครื่องแก้ววัดปริมาตรแบบ TD และมีลักษณะเป็น หลอดแก้วกลวงทรงกระบอกยาวเส้นผ่าศูนย์กลางเท่ากันตลอด มีขีดแบ่งปริมาตร เป็นส่วนย่อยปลายด้านล่างมีจุกก๊อก (stopcock) สาหรับหมุนปิดเปิดควบคุมการ ไหลของน้ายา จุกนี้อาจทาด้วยแก้ว หรือ Teflon ก็ได้ บิวเร็ตท่ีใช้ในห้องปฏิบัติการ ชีวเคมมี อี ยู่ 2 ชนิด คือ 1. บิวเร็ตขนาดความจุ 25 มล.และมีขีดแบ่งออกเป็นส่วนย่อยถึง 0.1 มล. สามารถ อา่ นปรมิ าตรของสารละลายได้ละเอียดถึง 0.05 มล. 2. ไมโครบิวเร็ต (Microburet) มีขนาดความจุ 5 มล. และมีขีดแบ่งออก เป็น ส่วนย่อย ถงึ 0.01 มล. อ่านปริมาตรของสารละลายได้ละเอียดถงึ 0.005 มล การใชป้ ระโยชน์ ใช้ถ่ายเทของเหลวปริมาตรเท่าใดก็ได้จนถึงปริมาตรสูงสุดของบิวเร็ตนั้น นิยมใช้ใน การไตเตรท (titrate) และวดั ปรมิ าตรของเหลวที่ตอ้ งการความถกู ตอ้ งแมน่ ยาสูง วธิ กี ารใช้ 1. ก่อนใช้บิวเร็ต ต้องตรวจสอบว่าจุกก๊อกปิดสนิทหรือไม่ ถ้าเป็นจุกก๊อกประเภทแก้วควรทาด้วยgrease เพือ่ ใหเ้ ปดิ ปิดสะดวกและปอ้ งกนั การรั่วไหลของนา้ ยา

P a g e | 15 2. ล้างบวิ เร็ตดว้ ยนา้ ยาทีจ่ ะใช้ 3. ตั้งบิวเร็ตให้ตรงในแนวด่ิง แล้วจึงเติมน้ายาท่ีจะใช้ให้เหนือขีดศูนย์ โดยหากเป็นบิวเร็ตธรรมดา ให้เตมิ น้ายาโดยใช้กรวย และต้องเอากรวยออกก่อนจึงจะปรับปรมิ าตรไวท้ ศ่ี ูนย์ถา้ เป็นไมโครบิวเรต็ เตมิ น้ายาโดยใชล้ กู ยางดดู นา้ ยาขน้ึ มา 4. เปิดจกุ ก๊อกใหน้ ้ายาไหลผา่ นปลายบิวเร็ต เพ่ือไล่อากาศออก เพราะหากมีอากาศอยู่จะทาให้การวัดปริมาตรของน้ายาท่ีไหลออกมาจากบิวเรต็ ผดิ พลาดได้ แล้วคอ่ ยๆ ปรับปริมาตรของน้ายาโดยให้จุด meniscusของนา้ ยาอยใู่ นระดบั เดยี วกบั ขดี บอกปริมาตรท่ศี นู ย์ จึงเร่มิ ใชง้ านได้ 5. เปิดจุกก๊อกให้น้ายาค่อยๆ ไหลตามปริมาตรท่ีต้องการ ถ้ายังมีหยดน้ายาติดอยู่ที่ปลายบิวเร็ต ควรรอให้ไหลลงไปด้วย โดยการแตะปลายบิวเร็ตเข้าที่ผนังด้านในของภาชนะที่รองรับ แล้วจึงอ่านปริมาตรของน้ายาจากสเกลบนบวิ เร็ตขอ้ ควรระวังบวิ เรต็ ตอ้ งต้งั ตรงในแนวดิ่งตลอดเวลา และเวลาอา่ นปรมิ าตรต้องอ่านในระดับสายตา วิธีการจับบเู รต็ กบั ฟลาส ใช้มือขวาจับฟลาสเพื่อเขย่าได้ถนัด และป้องกันมิให้ปากฟลาสกระแทก ปลายบิวเร็ต โดยจะจับฟลาสด้วยนิ้วหัวแม่มือและน้ิวกลาง (ใช้ปลายนิ้วช้ี ช่วยยันไว้กับปลอกของลูกบิดจุกก๊อกเพื่อช่วยเป็นหลักในการควบคุมการ เขย่า) ใช้มือซ้ายสาหรับเปิดปิดจุกก๊อก ใช้ปลายนิ้ว 3 นิ้วโดยน้ิวหัวแม่มือ อยู่ด้านหนา้ และนิว้ ชก้ี ับนิว้ กลางอยู่ด้านหลงักลมุ่ เครอื่ งแก้วใส่น้ายา (Non-volumetric glassware) เป็นกลุ่มเคร่ืองแก้วท่ีส่วนใหญ่มักจะใช้สาหรับใส่น้ายาหรือสารละลายสาหรับทาการทดลอง แม้ว่าเครื่องแก้วในกลุ่มน้ีจะมีขีดบอกปริมาตรไว้ก็ตาม แต่ปริมาตรสารละลายที่วัดได้จะหยาบมากเม่ือเทียบกับเครอื่ งแกว้ ในกลมุ่ แรก จงึ นยิ มใช้ใสน่ า้ ยาหรือถ่ายเทสารละลายมากกว่า เครอื่ งแก้วเหลา่ นีไ้ ดแ้ ก่ 1. บีคเกอร์ (Beakers) 2. ขวดรปู ชมพู่ (Erlenmeyer flasks) 3. หลอด (Tubes)1. บีคเกอร์ (Beakers) เป็นแก้วมีปากกว้าง เส้นผ่าศูนย์กลางจากปากถึง กน้ เทา่ กันตลอด มรี อยบาก (notch) ทปี่ าก ด้านข้างมีขีดบอกปริมาตร อยา่ งหยาบ มีหลายขนาด ตัง้ แต่ 5 มิลลิลติ รข้นึ ไปจนถงึ หลายลิตรการใชป้ ระโยชน์ ใช้สาหรับผสมสาร ใส่น้ายาทาปฏิกิริยา ถ่ายสารละลายจากที่หน่ึงไปยังอีกท่ีหนึ่ง แต่จะไม่มีความถูกตอ้ งหากใชว้ ัดปรมิ าตรนา้ ยา

P a g e | 162. ขวดรูปชมพู่ (Erlenmeyer flasks) เป็นแก้วท่ีมีคอแคบและส้ัน ก้นกว้าง มีหลายขนาดตั้งแต่ 25มลิ ลลิ ติ รขน้ึ ไปจนถึงหลายลิตรการใช้ประโยชน์ ใช้สาหรับผสมสาร ใส่น้ายาทาปฏิกิริยา ถ่ายสารละลายจากท่ีหนึ่งไปยังอีกที่หนึ่ง เช่นเดียวกับบีคเกอร์ และเนื่องจากขวดรูปชมพู่มีปากแคบกวา่ บีคเกอร์ ดงั นั้นจึงเหมาะสาหรับเกบ็ สารละลายมากกวา่3. หลอด (Tubes) หลอดแกว้ สาหรับใส่สารหรือทาปฏกิ ริ ิยาทีน่ ิยมใชใ้ นหอ้ งปฏิบัตกิ ารชีวเคมีมหี ลายชนดิ เช่น3.1. หลอดทดลอง (Test tubes) เปน็ หลอดแก้วใชใ้ ส่นา้ ยาในการทดสอบปฏิกริ ยิ าต่าง ๆ มีหลายขนาด3.2. หลอดจกุ เกลยี ว (Screw cap tubes) เป็นหลอดแก้วท่ีมีจุกเกลียวปิดแน่นหนา ใช้ใส่น้ายาท่ีต้องการเขย่าแรงๆ เพื่อสกัดและแยกสารหรือตอ้ งการเก็บไวใ้ ช้นาน ๆ3.3. หลอดปั่น (Centrifuge tubes) เป็นหลอดที่กน้ แหลม จุได้ประมาณ 10-15 มลิ ลิลิตร อาจมีขีดบอกปรมิ าตรหรือไม่มกี ็ได้ ใช้กับเครื่องปั่นเพือ่ ป่นั แยกชนั้ ของสารละลาย หรือปั่นใหส้ ารตกตะกอน3.4. หลอดควิ เวต็ (Cuvets) เป็นหลอดแกว้ ชนิดพิเศษ เนอื้ แก้วท่ีใช้ในการผลิตหลอดชนิดน้ีมีการปรับการหกั เหแสงแล้ว ใช้สาหรับวดั คา่ O.D. ด้วยเครอ่ื ง spectrophotometer มี 2 ชนดิ ไดแ้ ก่ 1) Test tube cuvet ลักษณะคล้ายหลอดทดลอง แต่ที่ปากหลอดจะมีวงกลมสีขาว มีขนาดจุ 5มลิ ลิลติ ร และระดับสารละลายที่ใส่ในหลอด cuvet จะต้องมปี ริมาตรมากกวา่ 2 มลิ ลลิ ติ ร จึงจะวัดคา่ O.D.ได้ 2) Microcuvet สาหรบั ใส่สารละลายทต่ี อ้ งการวัดค่า O.D. แตม่ ปี ริมาตรเพียง 1 มลิ ลลิ ิตร ข้อห้าม หลอดชนิดน้ีห้ามล้างโดยใช้แปรงล้างหลอดทดลอง เพราะจะทาให้เกิดรอยขูดขีด ซึ่งมีผลต่อการอา่ นค่า O.D.ได้ นอกเหนือจากเครื่องแก้วใน 2 กลุ่มแรกแล้ว ยังมีเคร่ืองแก้วและอุปกรณ์อ่ืนอีกที่นิยมใช้ในปฏิบัติการชีวเคมีเบ้ืองตน้ แต่ไม่ได้นับรวมอยูใ่ น 2 กลมุ่ แรก ดงั เชน่ กรวย (funnel) ที่ใช้สาหรับช่วยในการรินหรือถ่ายเทของเหลวจากภาชนะหนึ่งไปยังอีกภาชนะหนึ่ง และยังช่วยในการกรองแยกสารด้วย มีท้ังทาด้วยแก้วและพลาสติก และมีขนาดเส้นผ่าศูนย์กลางหลายขนาด การใช้กรวยมักจะใช้ร่วมกับ กระดาษกรอง (filter paper)ซึ่งเป็นตัวกลางสาคัญสาหรับการกรอง โดยอาศัยรู (pore) ของกระดาษ กระดาษกรองเป็นกระดาษที่ดูดความชื้นได้งา่ ย และสามารถกักตะกอนดว้ ยรู (pore) ของกระดาษ ซึ่งมีอยหู่ ลายขนาด กอ่ นทจ่ี ะกรองสารใด ๆจะต้องเตรียมกระดาษกรองก่อน โดยการเลือกกระดาษที่มีขนาดพอเหมาะกับกรวย พับกระดาษกรองให้เป็นรูปกรวย (cone) ใส่ลงไปในกรวย

P a g e | 17การทาความสะอาดเครอื่ งแกว้ ผลที่ได้จากการทาปฏิบัติการชีวเคมีอาจคลาดเคลื่อนได้หากเครื่องแก้ว หรือภาชนะท่ีใช้ไม่สะอาดพอดังน้ันเราจาเป็นท่ีจะต้องรู้จักวิธีทาความสะอาดเคร่ืองแก้วอย่างถูกต้องเพื่อป้องกัน ความผิดพลาดท่ีจะเกิดข้ึนเทคนคิ หรอื ข้ันตอนที่ถูกตอ้ งในการลา้ งทาความสะอาดเครื่องแกว้ มดี งั น้ีการลา้ งเคร่อื งแก้วตามปกติ ล้างเคร่ืองแก้วทันทีที่ใช้เสร็จ โดยการล้างเขย่าเคร่ืองแก้วแต่ละช้ินด้วยน้า หลังจากนั้นจึงแช่ในน้าสบู่หรือน้ายาล้างเครื่องแก้ว หรืออาจเป็น acid dichromate หรือ 20% nitric acid ใช้แปรงล้างเคร่ืองแก้วถูท้ังด้านในและด้านนอก ระวังอย่าให้ขูดเป็นรอย หรือแตกร้าว แล้วจึงล้างด้วยน้าก๊อกอย่างน้อย 3 ครั้ง สุดท้ายล้างและเขยา่ ด้วยน้ากล่นั (distilled water) อกี คร้ัง แล้วนาไปอบให้แห้งในเตาอบการลา้ งเคร่อื งแกว้ มคี ราบเลือดหรอื เลือดอดุ ตัน ให้แช่เครื่องแก้วใน 10% sodium hydroxide เป็นเวลา 12-24 ช่ัวโมง หลังจากนั้นจึงล้างตามวิธีปกตดิ ังกล่าวข้างตน้การล้างปิเป็ต กรณีปิเป็ตใหม่ ให้ล้างและเขย่าด้วย 5% hydrochloric acid หรือ 5% nitric acid แล้วล้างตามวิธีปกติดังกล่าวขา้ งตน้III. เทคนคิ บางอยา่ งทีใ่ ชใ้ นการวิเคราะหท์ างชวี เคมี1. การกรอง (Filtration) ควรใช้กระดาษกรองที่มีขนาดพอเหมาะกับกรวย การกรองในวิธีปริมาณวิเคราะห์ต้องใช้กรวยและกระดาษกรองที่แห้ง ถ้าต้องการกรองเร็วควรใช้กระดาษกรองชนิดจีบ เว้นเสียแต่ต้องการเก็บตะกอนสาหรับวิเคราะหป์ ริมาณ2. การเจอื จางสารละลาย (Dilution) ในการทดลองทางชีวเคมีบ่อยครั้งทเ่ี รามีความจาเป็นจะตอ้ งใช้สารละลายซึ่งเจอื จางกว่าสารละลายท่ีมีอยู่ ดังน้ันจึงควรมีวิธีการทาสารละลายให้เจือจางอย่างถูกวิธี โดยใช้เครื่องแก้วที่เหมาะสม กล่าวคือไม่ใช้กระบอกตวงมาตวงน้าเพื่อนาไปเจือจางต่อ เพราะจะได้ความเข้มข้นท่ีไม่ถูกต้องนัก ต้องใช้ปิเป็ตขนาดพอดีท่ีจะดูดน้ายาในปริมาตรที่ใกล้เคียงกันกับขนาดของปิเป็ตนั้นการเจือจางสารต้องทาในขวดวัดปริ มาตรที่มีขนาดตรงกับที่ต้องการ ถ้าปริมาตรสุดท้ายไม่ตรงกับขนาดของขวดวัดปริมาตรให้ใช้ปิเป็ตดูดตัวทาละลายน้ันอย่างถกู ตอ้ งแทน วธิ กี ารทาสารละลายให้เจอื จางมีอยู่หลายวิธี ดังน้ี ก. การเจือจางขั้นเดียว (single dilution) ยกตัวอย่างเช่น ต้องการสารละลายที่เจือจางกว่าท่ีมีอยู่500 เท่า การเจือจางขั้นเดียวทาได้โดยนาเอาสารละลายที่มีอยู่ปริมาณ 0.2 มล.มาเติมตัวทาละลายให้มีปรมิ าตรเป็น 100 มล. จะไดส้ ารละลายท่ีเจือจางกวา่ เดมิ 100 x 1/0.2 = 500 เทา่ ข. การเจือจางหลายข้ัน (multiple dilution) เป็นการทาสารละลายให้เจือจางโดยการทาหลายขั้นเช่น เม่ือต้องการได้สารละลายที่เจือจางกว่าเดิม 500 เท่า ทาได้โดยนาสารละลายที่มีอยู่ 0.2 มล.มาเติมตัวทาละลายให้มีปริมาตรเป็น 10 มล. จะได้สารละลายท่ีเจือจางกว่าเดิม 50 เท่า แล้วนาเอาสารละลายท่ีเจือจางแล้วขนั้ หนึ่งน้ี 1 มล. มาเตมิ ตวั ทาละลายเปน็ 10 มล. ก็จะไดส้ ารละลายทเ่ี จอื จางกวา่ เดมิ = 50x10=500 เทา่

P a g e | 18 ค. การเจือจางแบบอนุกรม (serial dilutions) เป็นการทาสารละลายให้เจือจางติดต่อกันหลายข้ันยกตัวอย่างเช่น การทาเจือจางแบบอนุกรม 5 คร้ังติดต่อกัน โดยการเจือจางที่ทาให้สารละลายใหม่เข้มข้นเป็นคร่ึงหนึ่งของสารละลายเดิม จะได้สารเจือจางกว่าเดิม 2, 4, 8, 16 และ 32 เท่า ตามลาดับ การเจือจางแบบอนกุ รมนน้ี ิยมใช้มากในการเตรียมสารละลายเพอื่ สรา้ งกราฟมาตรฐาน (standard curve)3. การไตเตรต (Titrimetry) เป็นวิธีหนึ่งในการหาปรมิ าณวิเคราะห์ท่ีใช้กนั มากในการวิเคราะห์ทางชีวเคมี เครื่องแก้วที่ใช้ในการไตเตรตน้ันมีบิวเรต็ ใส่น้ายาท่ีทราบความเขม้ ข้นแนน่ อนแล้วกับภาชนะ เชน่ ขวดรูปชมพูใส่น้ายาที่ต้องการทราบความเขม้ ขน้ (วดั ปรมิ าตรโดยใชป้ เิ ปต็ ) และอนิ ดิเคเตอร์ ก่อนไตเตรตต้องบันทึกระดบั ต้ังต้นไวใ้ นสมุด มิใช่จาไวใ้ นใจเพราะอาจลืมได้โดยง่าย เมื่อเสร็จจากการไตเตรตแลว้ ตอ้ งอ่านระดับน้ายาอีกคร้งั หน่ึง และจดบนั ทกึ หลกั สาคญั ในการไตเตรต ได้แก่ 1. ปล่อยน้ายาให้ไหลลงในภาชนะในปริมาณพอสมควร ตอนต้นใส่ครั้งหนึ่งค่อนข้างมาก เมื่อเข้าใกล้จุดจบ (end point) กเ็ ติมทีละหยด 2. เขยา่ น้ายาในภาชนะใหผ้ สมกนั ท่ัวก่อนจะเติมนา้ ยาครง้ั ตอ่ ไป 3. ตอ้ งรู้ว่าจุดจบนน้ั ควรเปน็ อยา่ งไร เช่นมีสอี ะไร หรอื มคี วามขนุ่ เกิดขน้ึ เพ่ือยุติการไตเตรตได้ถูกตอ้ ง 4. เม่ือสงสัยว่าถึงจุดจบแล้ว หรือใกล้มากแล้ว อ่านระดับน้ายาเสียก่อนแล้วลองเติมน้ายาอีก 1 หยดและเขย่า ถ้าเห็นว่าเกินจุดจบแล้ว (เช่น สีเข้มเกินไป) ให้ถือว่าระดับท่ีอ่านไว้ตอนแรกเป็นระดับท่ีต้องการ แต่ถา้ เห็นว่ายังไมเ่ กนิ ก็อ่านระดบั ในตอนใหม่น้นั ไว้ แลว้ เติมอีก 1 หยด เช่นนี้เรอ่ื ยไป ความแม่นในการไตเตรต ต้องทาซ้าอย่างน้อยสามครั้ง คร้ังแรกทาอย่างคร่าวๆ คือปล่อยน้ายาค่อนข้างเร็ว และปล่อยเรื่อย ๆ ขณะที่เขย่าไปด้วย จนกระทั่งถึงจุดจบ จดผลเอาไว้แล้วทาซ้าใหม่ คราวนี้ปล่อยน้ายาไหลอย่างเร็วจนกระทั่งออกไปได้ประมาณ 90% ของจานวนท่ีทาไว้ ต่อจากน้ันปล่อยน้ายาอย่างระมัดระวังและระวังยิ่งขึ้นเม่ือใกล้จุดจบ เพื่อให้ได้ผลที่ถูกต้อง สาหรับคร้งั ที่สามทาเช่นเดียวกับครั้งที่สอง ถ้าได้ผลใกลเ้ คยี งกนั กไ็ มต่ ้องทาอีก และใช้ค่าเฉลี่ยของผลจากสองคร้ังหลัง4. การเทียบสี และ การดดู แสง (Colorimetry & Spectrophotometry) การวิเคราะห์หลายอยา่ งต้องอาศัยการเทียบความเข้มของสที ี่เกิดขึ้นจากการเติมสาร (reagent) ลงไปในนา้ ยาท่ีตอ้ งการหาคา่ ซง่ึ เรียกวา่ น้ายาปัญหา (unknown) กบั สีทเ่ี กิดขึ้นจากการเติมสารอย่างเดยี วกันลงไปในนา้ ยาที่รู้ค่า ซงึ่ เรียกว่า น้ายามาตรฐาน (standard) สว่ นใหญจ่ ะมีขั้นตอนในการทาเป็น 3 ระยะดว้ ยกัน คือ 1. การเตรียมนา้ ยาปัญหาที่มสี เี หมาะสม 2. การเตรียมนา้ ยามาตรฐาน 3. การเทียบสหี รือวัดการดดู แสง เคร่ืองมือท่ใี ช้นม้ี ี 2 ชนิดคือ 1. เครอื่ งเทยี บสีดว้ ยตาไฟฟ้า (photoelectric colorimeter) หรือ (photocolorimeter) ซึ่งปัจจบุ ันใชน้ ้อยมาก 2. เคร่ืองวัดการดดู แสง (spectrophotometer) มปี ระโยชนแ์ ละใชก้ นั มากในปจั จบุ ัน ข้อจากดั บางประการเก่ยี วกับความแม่นของการวเิ คราะหแ์ บบน้ี คือ1. ความเข้มของสีมไิ ด้เปล่ยี นแปลงเป็นสดั ส่วนโดยตรงกบั ความเข้มขน้ ของสารท่ีตอ้ งการทราบเสมอไป2. ถ้าความเข้มข้นของน้ายาปัญหากับน้ายามาตรฐานแตกตา่ งกนั มาก ๆ แลว้ ความแม่นยาจะน้อยลง

P a g e | 193. ความแตกต่างกันในความแรงของกรดต่างๆ หรือส่ิงปนเป้ือน (contaminant) ในน้ายาปัญหากับน้ายามาตรฐานทาให้ความแมน่ ยาเสยี ได้4. สีท่ีเกิดข้ึนส่วนมากเปล่ียนความเข้มเม่ือตั้งทิ้งไว้ ฉะนั้นปฏิกริยาทางเคมีท่ีใช้กับ unknown และ standardจะตอ้ งทาไปพร้อม ๆ กันซึ่งทาใหก้ ารวเิ คราะหแ์ บบนไ้ี ม่สะดวกในบางกรณี ความแม่นยาของวิธีเทียบสี และการวัดการดูดแสงน้ีกล่าวโดยทั่ว ๆ ไปสู้วิธีช่ังน้าหนักหรือวิธีไตเตรตไม่ได้ แต่อย่างไรก็ดีวิธีการเทียบสีใช้เวลาน้อยกว่า ง่าย และ สะดวกต่อการวัด รวมท้ังมีความจาเพาะ(specificity) และความไว (sensitivity) ดีกว่า วิธีปริมาณวิเคราะห์ทาได้ 3 วิธีคือ การช่ัง (gravimetry) การไตเตรต (titrimetry) กับการเทียบสีและการดูดแสง (colorimetry & spectrophotometry) ซ่ึงในการวิเคราะห์ทางชีวเคมีส่วนใหญ่ใช้วิธีการไตเตรต และเทยี บสี

P a g e | 20 ปฏิบตั ิการครัง้ ท่ี 2 เรือ่ ง โปรตีนและเอน็ ไซม์ โปรตีนเป็นสารชีวโมเลกุล ที่ประกอบด้วยกรดอะมิโนเรียงต่อกันด้วยพันธะเพ็พไทด์ ดังน้ันรูปร่างและโครงสร้างของโปรตีนจึงขึ้นอยู่กับชนิดของกรดอะมิโนท่ีประกอบกันเป็นโมเลกุลของโปรตีนนั้นๆ การทดสอบชนิดของโปรตีนอยา่ งง่าย สามารถทาได้ โดยการใช้คุณสมบตั ทิ างกายภาพ เชน่ การละลายและการตกตะกอนการทดลองที่ 2.1 คุณสมบัติทางกายภาพของโปรตีนสารละลายโปรตนี ทใี่ ชใ้ นการทดลอง : สารละลายไขข่ าวท่เี จอื จาง 1:5 และสารละลาย casein จากนา้ นมก. การตกตะกอนโปรตนี ด้วยโลหะหนักหลกั การ โปรตีนจะตกตะกอนกับเกลือของโลหะหนักบางชนิด โดยการเข้าจับกับโปรตีนท่ีมีประจุตรงข้ามเกิด เปน็ metal proteinate โดยปฏิกิริยาน้ีโปรตีนจะมีประจเุ ปน็ ลบ และโลหะมปี ระจบุ วก จากคณุ สมบัติน้ี สามารถนาไปแก้ไขคนท่ีดืม่ ยาพิษ ซ่ึงมกั มสี ่วนประกอบของโลหะหนกั เช่น mercuricchloride ได้ โดยให้น้านมหรือไข่ขาวแก่คนน้ัน โปรตีนในน้านมหรือไข่ขาวจะจับกับ mercuric ion แล้วตกตะกอน เมอื่ ดดู เอาตะกอนออกมา (โดยการลา้ งกระเพาะ) ก็จะเป็นการลดอนั ตรายท่ีเกดิ จากโลหะปรอทได้วธิ กี าร เตรียมแผ่น slide 3 แผ่น หยดสารละลายโปรตีน แผ่นละ 2 หยด และนาไปเติม 2 หยดของ สารละลายโลหะหนักดังต่อไปนี้ แผน่ ท่ี 1 เตมิ 0.2 M เมอร์ควิ รคิ คลอไรด์ (HgCl2) แผ่นท่ี 2 เตมิ 0.1 M ซลิ เวอร์ไนเตรท (AgNO3) แผน่ ท่ี 3 เติม 0.01M คอปเปอรซ์ ลั เฟต (CuSO4) สังเกตตะกอนท่ีเกิดข้ึน ถ้าไม่มีตะกอนให้หยด 1 N โซเดียมฮัยดรอกไซด์ลงไปเล็กน้อย จน pH เป็นดา่ ง จะเห็นตะกอนเกดิ ขน้ึ ได้

P a g e | 21ข. การตกตะกอนโปรตนี ด้วยกรดหลกั การ โปรตนี ทมี่ ปี ระจเุ ปน็ บวก สามารถตกตะกอนกับกรดอณใู หญ่วธิ ีการ เตรียมแผ่น slide 3 แผ่น หยดสารละลายโปรตีน แผ่นละ 2 หยด และนาไปเติม 2 หยดของ สารละลายกรดดงั ต่อไปนี้ แผ่นท่ี 1 เตมิ 10% กรดไทรฆลอโรอะซติ ิค (TCA) แผน่ ท่ี 2 เติม 2% กรดแทนนคิ (tannic acid) แผ่นที่ 3 เตมิ กรดปคิ รคิ อ่ิมตัว (picric acid)สังเกตตะกอนทเ่ี กิดขน้ึ ถา้ ไมเ่ ห็นตะกอนให้ใส่กรดอะซิติคเจอื จางเล็กนอ้ ย เพอ่ื ทาให้สารละลายโปรตีนเป็นกรดจะสามารถเห็นตะกอนได้ค. การตกตะกอนโปรตนี โดยใชเ้ กลอื (salting out)หลกั การ โปรตีนสามารถแยกออกจากสารละลายได้ โดยการผสมกับเกลือท่ีมีความเข้มข้นเหมาะสม เกลือจะ ไปแยง่ โมเลกลุ ของน้าท่เี รียงตวั เปน็ ชนั้ ๆ รอบโมเลกุลของโปรตนี ทาให้โปรตีนตกตะกอน โปรตีนท่ีมี ขนาดใหญจ่ ะตกลงมากอ่ น เติมเกลือวิธกี าร ผสมสารละลายไขข่ าว 5 มล. กบั สารละลายแอมโมเนยี มซัลเฟตอิม่ ตวั 5 มล.ในหลอดทดลอง โดยไม่ ต้องเขย่า สังเกตลักษณะตะกอนที่เกิดขึ้น ตั้งทิ้งไว้สักครู่ ให้ตะกอนรวมตัวกันแล้วจึงกรอง นาน้า กรองท่ีได้มาเติมผลึกแอมโมเนียมซัลเฟตลงไปทีละน้อย จนกระทั่งผลึกไม่ละลายอีก สังเกตว่ามี ตะกอนของโปรตนี อกี ชนิดหน่ึงตกลงมาหรือไม่ พรอ้ มสังเกตลักษณะของตะกอน แลว้ บนั ทึกผล

P a g e | 22ง. การแข็งเปน็ ล่ิมเพราะความร้อน (coagulation)หลกั การ โปรตีนเม่ือได้รับความร้อน จะเกิดการแข็งเป็นล่ิม เนื่องจากโครงสร้างเดิม (native form) ถูกทาลาย การเติมกรดลงไปเล็กน้อยจะช่วยให้โปรตีนตกตะกอนได้ง่ายขึ้น และช่วยขจัดผลบวกเท็จจากการ ตกตะกอนของเกลอื บางชนิด เช่น เกลือของฟอสเฟต คาร์บอเนต และไบคาร์บอเนต ซ่ึงเกลือเหล่านี้จะ ตกตะกอนได้ด้วยความรอ้ น แตจ่ ะละลายในสารละลายกรดวิธีการ ผสมสารละลายโปรตีน 2 มล. กับกรดอะซิติคเจือจาง 2-3 หยด ในหลอดทดลองแล้วทาให้ร้อนช้า ๆ ดว้ ยตะเกียงแอลกอฮอล์ สังเกตผลทเ่ี กิดขน้ึการทดลองเร่ืองเอ็นไซม์ เอ็นไซม์ เป็นโปรตีนที่ทาหน้าท่ีเร่งปฏิกิริยาในร่างกายของสิ่งมีชีวิตแทบทุกปฏิกิริยา ปัจจัยสาคัญที่มีผลต่อการทางานของเอนไซม์ ได้แก่ ความเป็นกรด-เบสของสารละลาย อุณหภูมิท่ีเหมาะสมของการเกดิ ปฏกิ ิริยา รวมถึงการมสี ารเรง่ หรือยับย้ังการทางานของเอ็นไซม์การทดลองที่ 2.2 เอ็นไซมย์ รู ีเอส (urease)หลักการ เอ็นไซม์ยูรีเอสสามารถย่อยยเู รียให้เป็นแอมโมเนีย ซ่ึงแอมโมเนียที่เกิดข้ึนจะเปล่ียนสีของฟนี อล์ฟธาลีน ใหเ้ ปน็ สแี ดง โดยมปี รอทเปน็ อินฮิบเิ ตอร์ของเอ็นไซม์ยูรเี อสวธิ กี าร เตรยี มหลอดทดลอง 3 หลอด แล้วผสมสารตามลาดับรายการ รายการสารละลาย หลอดท่ี 1 หลอดที่ 2 หลอดที่ 3สารละลายยเู รยี (3 มล.) + + +เมอรค์ รู คิ คลอไรด์ (1 หยด) - + -ฟนี อลฟ์ธาลีน (2 หยด) + + +น้ากรองถ่ัวเหลือง (5 หยด) + + -นา้ กรองถั่วเหลืองตม้ (5 หยด) - - +ต้ังทิ้งไวส้ กั ครู่ แลว้ สงั เกตสขี องสารละลาย บนั ทกึ ผลหมายเหตุ น้ากรองถวั่ เหลอื ง เปน็ สารละลายทมี่ เี อน็ ไซมย์ รู ีเอส

P a g e | 23การทดลองที่ 2.3 การทดสอบเอ็นไซมอ์ ะมยี เ์ ลส (amylase) ในนา้ ลายหลักการ เอ็นไซมอ์ ะมยี เ์ ลสจะย่อยแป้งเปน็ ขัน้ ๆ ไดผ้ ลิตผลเปน็ นา้ ตาล แป้ง (amylum) อะมยี โ์ ลเด็กซ์ตริน (amylodextrin) อีริโธรเด็กซต์ ริน (erythrodextrin) (มีกลโู คส 8-12 หน่วย) อะโฆรเด็กซต์ ริน (achrodextrin) (มกี ลูโคสไม่เกนิ 6 หน่วย) มอลโตสวิธกี าร การเตรยี มน้าลาย เตรยี มน้าลายโดยบ้วนปากด้วยน้าเปล่าให้สะอาด บ้วนน้าลายลงในบีเคอร์ แล้วเท ลงบนกรวยที่กรองด้วยสาลีรองรับด้วยหลอดทดลอง เก็บน้าลายท่ีกรองให้ได้ประมาณ 5-10 มล. แลว้ ทาการทดลองต่อไปน้ี ก. การทดสอบหาพเี อ็ชทเ่ี หมาะสม (Optimum pH)1. ใส่ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ หลอดละ 3 มล. ลงในหลอดทดลอง 4 หลอดตามลาดับ คือ pH = 5.0, 6.8, 8.4 และ10.02. ใสน่ ้าแป้งหลอดละ 5 มล. ผสมใหเ้ ขา้ กัน3. เตมิ น้าลาย 10 หยด เขย่าแลว้ ตั้งไว้ 5 นาที4. ใส่โปแตสเซียมคาร์บอเนตอิ่มตัว (sat.potassium carbonate) หลอดละ 2 หยด ผสมให้เข้ากันเพื่อยตุ ิการย่อย5. แบง่ นา้ ยาในแต่ละหลอดมาหลอดละ 1 มล. ทาการทดสอบเบเนดิคต์ เพ่ือดปู ริมาณน้าตาล6. ตรวจดูสีของสารละลายและปริมาณของตะกอนในหลอดทั้งส่ีเปรียบเทียบกันเพื่อตัดสินว่าหลอดที่ pHเท่าใด ทาใหก้ ารย่อยดาเนินไปได้ดที ีส่ ุด ข. การทดสอบหาอณุ หภูมทิ ี่เหมาะสม (Optimum temperature)1. ใสน่ า้ แปง้ ในหลอดทดลอง 3 หลอด ๆ ละ 5 มล.2. เอาหลอดหนึ่งแช่ในน้าแข็งละเอียด (2-50ซ.) หลอดท่ีสองแช่น้าอุ่น (400ซ.) หลอดที่สามแช่น้าร้อน (800ซ.)ท้ิงไว้ 5 นาที3. เติมน้าลายหลอดละ 10 หยดโดยเร็ว เขย่าให้เข้ากัน จับเวลาหลังจากท่ีผสมน้าลายทันทีแล้วรีบแช่ไว้ ณ ที่อุณหภูมิเดิมต่ออีก 5 นาที (ให้นาน้าลายไปเติม ณ ที่ ๆ แช่หลอดไว้ ไม่เอาหลอดขึ้นจากที่แช่แล้วเอาไปเติมน้าลายทโี่ ตะ๊ )

P a g e | 244. ยุติการย่อยด้วยการเติมโปแตสเซียมคาร์บอเนตอ่ิมตัว หลอดละ 2 หยด เขย่าให้เข้ากัน และดูปริมาณการย่อยเชน่ เดยี วกบั ข้อ ก.5. ตรวจดูว่าท่อี ณุ หภมู ิใด การย่อยดาเนนิ ไปได้ดีทสี่ ดุการทดสอบเบเนดิกต์ ใส่น้ายาเบเนดิกต์ 3 มล ในหลอดแก้ว เติมน้ายาที่ต้องการทดสอบ 1 มล. ผสมให้เข้ากันดี แล้วนาไปต้มในบีคเกอร์น้าเดือดนาน ½ - 1 นาที เม่ือสารละลายเปล่ียนสีให้นาหลอดแก้วไปแช่ในบีคเกอร์น้าอุณหภมู ิหอ้ ง เพื่อหยุดปฏกิ ริยา ผลบวกเกิดข้ึนตามปรมิ าณนา้ ตาลในนา้ ยาที่ต้องการทดสอบ“พอตรวจพบ” ไม่เหน็ ตะกอนในตอนแรก แต่เหน็ เลก็ นอ้ ยภายหลัง เป็นสเี หลืองที่กน้ หลอดน้ายาสนี ้าเงนิ“1 บวก” มตี ะกอนเปน็ สเี หลอื งเลก็ นอ้ ยที่ก้นหลอด นา้ ยาสนี า้ เงนิ ออ่ น“2 บวก” มตี ะกอนสสี ม้ น้ายาสเี ขยี ว“3 บวก” ตะกอนสสี ม้ แกมน้าตาล นา้ ยาสเี ขยี วออ่ น“4 บวก” ตะกอนสีแดงจัด น้ายาไม่มีสีข้อควรระวังในการทดลองเกย่ี วกับเอน็ ไซม์ 1. เอ็นไซม์ และ โคเอ็นไซม์ (Coenzyme) มักจะเสื่อมฤทธ์ิได้ง่าย ถ้ายังไม่สามารถทาการทดลองได้ทันที ควรเก็บไว้ในทเ่ี ยน็ หากตอ้ งเกบ็ ไวเ้ ปน็ เวลานานอาจใช้วธิ แี ช่เย็นจนแข็ง หรอื ทาใหแ้ หง้ (Lyophilize) 2. น้ากล่ันที่ใช้ต้องเป็นน้ากลั่นแก้วเสมอในงานเก่ียวกับเอ็นไซม์ ท้ังนี้เพ่ือหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนด้วยโลหะ หนัก เน่ืองจากเอ็นไซม์ชนิดน้ัน ๆ เสื่อมฤทธ์ิง่ายมากเม่ือถูกโลหะหนัก อาจใช้เคร่ืองกล่ันที่ทาด้วย ควอทซ์ แลว้ กลนั่ ซ้า 2-3 คร้งั หรือใช้เคร่อื งเกบ็ ไอออ็ นจากน้า (demineralizer) ก็ได้ 3. เคร่ืองแก้วทุกชิ้นท่ีใช้ต้องระวังความสะอาดเป็นพิเศษกว่าการทดลองปฏิบัติเร่ืองอ่ืน ๆ ภายหลังท่ีทา ความสะอาดแลว้ ควรใช้นา้ กล่ันกรอกล้างภายในหลอดอีกอยา่ งนอ้ ยสามคร้ัง

P a g e | 25 ปฏิบตั กิ ารครั้งท่ี 3 เร่อื ง วิธีปริมาณวเิ คราะห์การวัดการดูดแสงโดยหลกั การของ spectrophotometryการวัดคุณสมบัติการดูดแสง (absorbance) ของสารในสารละลาย เป็นวิธีท่ีใช้มากทางชีวเคมี มีประโยชน์ในการศึกษาหาปริมาณความเข้มข้น (quantitative analysis) และคุณลักษณะ (qualitativeanalysis) ของสาร (solute) ในสารละลายน้ัน โดยอาศัยหลักทางฟิสิกส์ของแสง คือ สารที่มีมวลทุกชนิดสามารถดูดแสงได้ในช่วงความยาวคลื่นแสง (wavelength) ต่าง ๆ กัน ตามคุณลักษณะจาเพาะของสารน้ัน ๆการหาปริมาณสารประกอบในเลือดและปัสสาวะ เช่น หาปริมาณกลูโคสในเลือด เราอาจนากลูโคสมาทาปฏิกิรยิ าให้เกิดสี เพ่อื วัดความสามารถในการดูดแสงของสที ่เี กิดข้ึนในทางฟิสิกส์ แสงถูกแบ่งออกเป็นช่วง ๆ ตามความยาวคล่ืนของแสงซึ่งมีหน่วยนาโนเมตร(nanometre, nm) เช่น แสงในช่วงวสิ ิเบิล (visible) ซ่ึงสามารถมองเหน็ ไดด้ ้วยตาเปล่าจะมคี วามยาวคล่ืนของแสงอยู่ในช่วงต้ังแต่ 400 - 700 nm ปกติเป็นแสงสีขาว เกิดจากการรวมของแสง spectrum 7 สี สาหรับแสงในชว่ งอลุ ตร้าไวโอเลต (ultraviolet, UV) จะมีความยาวคลน่ื ช่วง < 380 nmถา้ เราทาสารอย่างหนึ่งให้มีสี เช่น โปรตีนทาปฏิกริ ิยากับน้ายาอย่างหน่ึง ได้สีขึ้นมา สารละลายท่ีมีสีน้ีจะดูดแสงในชว่ ง visible ความเขม้ ของสีบอกถึงความเข้มข้นของสารท่ีมีอยู่ในสารละลายนั้นได้ การหาปริมาณสีน้ี เรยี กวา่ \"colorimetric analysis\"การที่เราเห็นสารละลายที่มีสีน้าเงิน ก็เพราะสารน้ันดูดสีในช่วงความยาวคลื่นอ่ืน ๆ ไว้ นอกจากสีน้าเงนิ ของตนเอง ดังน้ันช่วงคลื่นของสีน้าเงินกผ็ ่านสารละลายมาสู่ตาเราได้ ปรมิ าณของแสงในช่วงความยาวคลื่นท่ีถูกดูดไว้มีความสัมพันธ์โดยตรงกับความเข้มข้นของสารที่ดูดสีนั้น สารท่ีมีความเข้มข้นมากจะเกิดสีเข้มมาก และดูดแสงเอาไว้มาก สีของสารละลายท่เี กิดข้ึนแต่ละสีจะดูดแสงที่ wavelength ต่างกันเราสามารถหาปริมาณของสารท่ีไม่มีสีได้ ถ้าสารนั้นดูดแสงได้ที่ช่วง UV ซ่ึงข้ึนอยู่กับคุณลักษณะเฉพาะของสารชนิดนนั้ ๆวิธีการวิเคราะห์หาปริมาณสารที่อาศัยหลักวัดการดูดแสง (absorption photometry) ของสารที่wavelength ใด wavelength หนง่ึ ของ spectrum เรียกวา่ \"photo-metric procedures\" เคร่ืองมอื ท่ีใชว้ ัดการดูดแสงคือ spectrophotometer เป็นเคร่ืองชนิดที่วัดได้ในช่วงคลื่นแสง UV และ visible เราเรียกว่า\"UV-visible spectrophotometer\"หลอดแก้วมาตรฐานสาหรับใส่สารละลายท่ีจะใช้วัดหาความเข้มข้นนั้นเรียกว่า cuvet ซึ่งมี 2 ลักษณะคือ เป็นหลอดหน้าตัดส่ีเหล่ียมจัตุรัส หรือเป็นหลอดกลมคล้ายหลอดทดลองธรรมดา แต่ทาด้วยแก้วท่ีมีคุณสมบัติพเิ ศษ มขี นาดเสน้ ผา่ ศูนย์กลางตา่ งกัน ซึง่ จะเป็นระยะทางทีแ่ สงจะตอ้ งผา่ นสารละลายในนั้น เราเรียกระยะทางน้ีวา่ \"ทางเดินของแสง\"(length of light path,l)ถา้ ใช้แสงที่มีความเข้ม I0 ผ่าน cuvet ท่ีใส่สารที่ดูดสี ความเขม้ ของแสงท่ีออกมาจะลดลง เป็นสัดสว่ นกบั ระยะทางทีแ่ สงผ่าน cuvet นนั่ คอื ปรมิ าณแสงที่ถกู ดูดโดยสารนน้ั จะแปรตามค่า lกฎของ LambertLog I0/I = kl k = ค่าคงท่ี I0 = ความเขม้ ของแสงกอ่ นผา่ น I = ความเข้มของแสงภายหลังผ่าน

P a g e | 26 ถา้ แสง wavelength เดียวกันน้ี ผ่านสารละลายท่ีมคี วามเข้มขน้ C ปริมาณแสงที่ถูกดูดก็จะแปรตามความเข้มข้นของสารน่นั เองกฎของ Beer k' = คา่ คงท่ี Log I0/I = k'C Log I0/I หมายถึง absorbance ( A ) คือ การดูดแสงหรือ optical density (O.D.) จากการรวมกฎของ Lambert & Beer ได้ว่า O.D. = KlC (K เป็นค่าคงท่ีซึ่งขึ้นอยู่กับชนิ ดของสารที่ดูดแสง และwavelength ของแสงนั้น กล่าวคือ ถ้าเป็นสารชนิดเดียวกัน และใหด้ ูดแสงท่ี wavelength เดียวกัน ค่า K จะเทา่ กัน) ถ้าดูในอีกมุมหนึ่ง ปริมาณแสงที่ผ่านออกมาจากสารละลายหลังจากท่ีบางส่วนถูกดูดไว้ เราเรียก\"transmittance\" (T) T = I/I0 หรอื 1/T = I0/Iฉะนน้ั ค่า T ปกติ < 1 เสมอ แตน่ ยิ มคิดเปน็ % เรียกว่า % T เพราะฉะน้นั % T = I/I0 x 100 ถา้ เปน็ น้ากลัน่ หรอื น้ายา blank (ไม่มีสารดูดสี) อย่ใู น cuvet เราสามารถตัง้ ค่า I = I0 นน่ั คอื ต้ังค่าใหแ้ สงผ่านออกมาไดห้ มด 100 % T เพอ่ื ความสะดวกในการวดั สารอ่ืน ๆ จาก log I0/I = O.D. นน่ั คอื log 1/T = O.D. - log T = O.D. จาก log I0/I = O.D. เราได้วา่ 100/% T = I0/I และ log 100/% T = log I0/I นั่นคือ log 100/% T = O.D. หรือ log 100 - log % T = O.D. บน scale ของ spectrophotometer จะอา่ นค่าไดท้ งั้ O.D. และ % T จากสมการ O.D. = KlC นี้ ถ้าเราใช้ cuvet ขนาดเดียวกันวัดสารละลายชนิดเดียวกันแล้ว เราจะได้คา่ l และ K คงที่ ดงั นั้น O.D. ข้นึ กบั C ค่าเดยี วscale ของ O.D. มีค่าต้งั แต่ 0 ถึง 2scale ของ % T มคี ่าตั้งแต่ 0 ถงึ 100 จากการท่ีเราอ่าน O.D. ของ standard solution ที่รู้ความเข้มข้นของสาร (C) แล้ว เราสามารถหาความเข้มข้นของ unknown ที่เป็นสารชนิดเดียวกันกับ standard ได้โดยการอ่าน O.D. ของ unknownsolution นนั้ และคานวณจากสมการO.D.unk /O.D.std = Cunk /CstdC unk = O.D.unk x C std /O.D.std

P a g e | 27 ท้ังน้ี standard และ unknown ต้องเป็นสารประเภทเดียวกัน ใช้ cuvet อย่างเดียวกัน ทาไปพร้อมๆกนั ดว้ ยวิธกี ารภายในสภาวะ (condition) เดยี วกนั และอา่ นจากเครื่องอันเดยี วกันดว้ ยการคานวณ ในทางปฏิบัติเมื่อเราต้องการหาความเข้มข้น (initial concentration) ของสารใดสารหน่ึงสารน้ันอาจจะต้องผ่านกรรมวิธีหลายขั้นตอน เช่น การสกัด การทาปฏิกริยาทางเคมีให้เกิดสี หรือเปล่ียนเป็นสารอื่นก่อนท่ีจะนามาวัดโดยหลักการของ spectrophotometry ซึ่งขั้นตอนเหล่าน้ี จะทาให้ความเข้มข้นของสารเปล่ียนแปลงไปจากเดิม ดังน้ันหลังจากที่เราคานวณความเข้มข้นข้ันสุดท้าย (final concentration) ของสารน้ีจากสมการท่ีดัดแปลงจาก Beer's law แล้ว การคานวณกลบั ไปส่คู วามเข้มขน้ เดมิ (initial concentration) ของสารกอ่ นผา่ นกรรมวิธหี ลาย ๆ ขนั้ ตอนน้จี ึงมีความสาคญั อย่างย่ิงในวิธีปรมิ าณวิเคราะห์การคานวณสามารถแบง่ ออกไดเ้ ปน็ 2 วิธี คือ 1. วิธบี ัญญัติไตรยางค์ 2. วิธี dilution factor Dilution factor (DF) หมายถึง ตวั คูณในการเจอื จาง มีสตู รดงั น้ี Dilution factor = final volume/initial volume หรอื = initial concentration/final concentration ตัวอย่างเช่น ถ้าเรานาสารละลายที่มีความเข้มข้นของเกลือ NaCl 10 มก./มล. มา 1 มล. แล้วเติมน้า9 มล. หมายความวา่ เราเจือจางนา้ เกลือ 10 เท่า นั่นคือค่า dilution factor เท่ากับ10 นั่นเอง และเม่ือเราเจือจางนา้ เกลอื 10 เท่า ความเขม้ ขน้ ของ NaCl กจ็ ะนอ้ ยลง 10 เทา่ ดว้ ย คือ มีค่าเท่ากับ 1 มก./มล. ทั้งสองวิธีน้ีอาศัยหลักการเดียวกัน คือ Beer's law เพ่ือคานวณหาความเข้มข้นสุดท้าย (finalconcentration) ของสารจากสมการของ Beer แล้วคานวณย้อนกลับไปเป็นความเข้มข้นเดิม (initialconcentration) ก่อนเจอื จางตัวอย่างการคานวณ ในการทดลองเพื่อหาความเข้มข้นของโปรตีนรวมในซีรมั่ ของผปู้ ว่ ยรายหนึง่ มีข้ันตอนดงั นี้1. นาซรี ่มั ของผ้ปู ่วย 0.2 มล. มาผสมกับ 0.9 % NaCl 10.0 มล.2. แบ่งซีรัม่ เจือจางแลว้ นี้ 5.0 มล. ผสมกับ 0.9 % NaCl 5.0 มล. และนา้ ยา biuret 10.0 มล.3. วัด O.D.555 nm ได้ 0.344. นาน้ายามาตรฐาน ที่มีโปรตีน 2.8 มก./มล. มา 0.5 มล. ผสมกับ 0.9 % NaCl 4.5 มล. และน้ายา biuret5.0 มล.5. วดั O.D.555 nm ได้ 0.156. จงคานวณหาโปรตีนรวมในซรี ่มั ผู้ปว่ ยรายนี้เป็น กรมั /ดล.

P a g e | 28ข้ันตอนในการเจอื จาง สามารถเขยี นเปน็ แผนผังได้ ดงั น้ีUnknown 10.2 มล. 0.2 มล.ซีร่ัม + 10.0 มล.NaCl 5.0 มล. + 5.0 มล. NaCl + 10.0 มล. Biuret 20.0 มล. (O.D.555 = 0.34)Standard 10.0 มล. 0.5 มล. Standard + 4.5 มล. NaCl + 5.0 มล. Biuret (O.D.555 = 0.15) (2.8 มก./มล.)การคานวณวิธีบญั ญตั ไิ ตรยางค์นา้ ยาโปรตีนมาตรฐานมีความเข้มข้น = 2.8 มก./มล.0.5 มล. ทีใ่ ชม้ ีปรมิ าณโปรตนี = 2.8 x 0.5 / 1 = 1.4 มก.ความเขม้ ขน้ เมอื่ วดั O.D.555 nm(final Cstd ) = 1.4 / 10 มก./มล. = 0.14 มก./มล.จาก Beer's law O.D.unk / O.D.std = C unk / Cstdแทนค่า 0.34 X 0.14 / 0.15 = 0.317 มก./มล.ใน 20.0 มล. หลงั ทาปฎกิ ริ ิยา biuret มีปริมาณโปรตนี = 0.317 x 20 = 6.347 มก.ซงึ่ มาจาก ซีรม่ั เจือจางแล้ว 5.0 มล.ใน 10.2 มล. ซรี ่ัมเจือจางแลว้ มีโปรตีน = 6.347 x 10.2 / 5 = 12.947 มก.ซ่งึ มาจาก ซีรมั่ 0.2 มล.100 มล. ซีรมั่ มีโปรตีน = 100 x 12.95 / 0.2 = 6473.5 มก.ผ้ปู ว่ ยมีโปรตนี 6473.5 / 1000 = 6.474 กรัม/ดล.ซีร่มัการคานวณวธิ ี Dilution factor จากโจทย์ตวั อยา่ ง ซรี ัม่ ผู้ปว่ ยตอ้ งผา่ นการเจือจาง 2 ขัน้ ตอนก่อนวัด O.D.555 nm 0.2 มล. 10.2 มล. (DF = 10.2/0.2 = 51x) 5.0 มล. 20 มล. (DF = 20/5 = 4x) ส่วนนา้ ยาโปรตีนมาตรฐานผ่านการเจอื จางคร้ังเดียวกอ่ นวัด O.D.555 nm 0.5 มล. 10 มล. (DF = 10/0.5 = 20x)

P a g e | 29นา้ ยาโปรตีนมาตรฐานมี initial concentration = 2.8 มก./มล. Final concentration = 2.8/20 = 0.14 มก./มล.จาก Beer's law O.D.unk / O.D.std = Cunk / Cstdแทนค่า  Final Cunk = 0.34 x 0.14/0.15 = 0.317 มก./มล. = 64.735 มก./มล.Initial Cunk = 0.317 x 4 x 51 = 6473.5 มก. 100 มล. ซรี ัม่ มโี ปรตีน = 64.735 x 100 = 6.474 กรมั /ดล.ซรี ัม่เครื่องวดั การดดู แสง Spectrophotometer เป็นเครื่องที่ใช้วัดการดูดแสงท่ีช่วงคล่ืนต่าง ๆ ของสารละลาย เคร่ืองมือชนิดนี้มีหลายแบบข้ึนอยู่กับความ ละเอียด และช่วงค ลื่น ของแสงที่ ใช้ เคร่ืองที่ ใช้ใน ห้ องป ฏิ บั ติการนี้ คื อ Spectronic 21spectrophotometer ซ่ึงวัดแสงได้ในช่วงคลื่นแสงทเี่ ห็นด้วยตาเปล่า เท่านั้น (visible region) คือตั้งแต่ 400ถงึ 700 นาโนเมตร (nm) เครื่องนี้จะประกอบด้วย 2 ส่วน คือ สเปคโตรมิเตอร์ (spectrometer) และโฟโตมิเตอร์(Photometer) สเปคโตรมิเตอร์ เป็นส่วนท่ีให้แสงออกมา และสามารถจะเลือกแสงท่ีมีความยาวคล่ืนแสงเฉพาะตามต้องการ สเปคโตรมิเตอร์นี้ประกอบดว้ ย - Light source สามารถให้แสงท่ีมีความยาวคล่ืนแสงต่าง ๆ หลายช่วงอยู่รวมกันซึ่งเป็นแสงสีขาวส่วนมากเลือกใช้ tungsten lamp เป็น light source เพราะว่าสามารถจะให้แสงต้ังแต่ความยาวคล่ืนแสง300 nm จนถงึ ชว่ ง infrared (มากกวา่ 700 nm) - Lens อยู่ถดั จาก light source จะรวมแสงใหเ้ ปน็ light beam ตรงเขา้ สู่ grating - Grating เป็นตัวทาให้ลาแสงหักเห และกระจายออกเป็น spectrum ซึ่งมีความยาวคล่ืนแสงต่าง ๆกนั (เกดิ เปน็ แสงสีแดง สม้ เหลือง เขยี ว นา้ เงิน ม่วง) - Slit แสง spectrum จาก grating จะผ่านมายัง slit ซ่ึงเป็นช่องแคบ ๆ ท่ีปรับได้จากปุ่มwavelength control เพื่อใช้สาหรับคัดเอาเฉพาะความยาวคลื่นแสงท่ีต้องการซ่ึงมีเพียง wavelength เดียวเรยี กว่า \"monochromatic beam\" ผา่ นไปยงั sample โฟโตมิเตอร์ เป็นส่วนที่ใช้วัดความเข้มของแสงท่ีถูกดูดเอาไว้ หรือ ที่เหลือผ่านออกมาจาก sampleโฟโตมเิ ตอรน์ จ้ี ะประกอบดว้ ย - Detector เปน็ ตัวทีเ่ ปลย่ี นพลงั งานแสงสวา่ งใหเ้ ปน็ พลังงานไฟฟา้ - Readout device เป็นตัวที่เราจะอ่านพลังงานไฟฟ้า ออกมาเป็น transmittance (T) หรือabsorbance unit (A)

P a g e | 30 ผังแสดงการทางานของเครื่อง SPECTROPHOTOMETERLIGHT LENS LENS SLIT CUVET PHOTOCELL METERSOURCE GRATING SPECTROPHOTOMETER (Spectronic model 21)

P a g e | 31วิธใี ช้เครื่อง (Operating Procedure) แบ่งออกเป็น 2 ขน้ั ตอน คือ 1. การาเตรียมเครอื่ งก่อนใช้งาน 2. การวดั ผล1. การเตรียมเครอ่ื งก่อนใช้งาน ก่อนจะใช้งานเครื่อง ต้องตรวจสอบการปรับมาตรฐานชุดอิเลคโทรนิค (Electronic calibration) ซ่ึงปกติจะปรับเปรียบเทยี บมาแล้วจากบริษทั ผูผ้ ลิต สามารถตรวจสอบได้งา่ ยโดย1.1 เสยี บปลกั๊ ของเครื่องเข้ากับเบา้ รบั ไฟฟา้ ทีม่ ีสายดินเรียบรอ้ ย (ground outlet)1.2 เปิดสวิทซไ์ ฟ (1) ทางด้านลา่ งขวามือของเครอ่ื งจะสงั เกตเห็นมีไฟแสดงบนหน้าปัทม์ทางด้านบนขวามือ (2)และอุน่ เครอ่ื งทิง้ ไว้ประมาณ 15-30 นาที1.3 ใช้ปุม่ หมนุ (3) หมุนเลือกความยาวคลน่ื แสงที่ 450 นาโนเมตร1.4 หมุนปุม่ (4) 100% T Zero A จนเขม็ บนมเิ ตอรช์ ้ีที่ 100% T1.5 ใสแ่ ท่งพลาสติกสาหรบั ก้นั ลาแสง (occluder Block)ลงในชอ่ งใสห่ ลอดวดั (5) พรอ้ มกบั ปิดฝาครอบให้สนทิ1.6 อา่ นคา่ จากมเิ ตอร์ว่าได้ผลอยา่ งไร- หากอ่านได้ 0% T แสดงว่าเครื่องได้ปรับเปรียบเทยี บค่ามาตรฐานไว้แลว้ สามารถใช้งานตอ่ ไปได้ทันที- หากอ่านไม่ได้ 0% T ให้ใช้ไขควงปรับค่า 0% T จากปุ่มปรับทางด้านหลังของเครื่องจนมิเตอร์อ่านได้ 0% Tเครอื่ งก็สามารถจะใชง้ านต่อไปได้ทันที2. การวดั ผล2.1 ใช้ปุ่มหมุน (3) หมนุ เลอื กความยาวคลน่ื แสงทีต่ ้องการใชง้ าน2.2 เลือกหลอดใส่สารตัวอย่างสาหรับวัดท่ีมีคุณสมบัติเหมือนกัน (matched cuvet) และเหมาะสมกับกรรมวิธีในการวิเคราะห์ให้ใช้หลอดใส่สารตัวอย่างสาหรับวัดชนิดเดียวกัน สาหรับสารละลายเปรียบเทียบ(blank) สารละลายมาตรฐาน (standard) และสารละลายตัวอย่าง (sample) หลอดวัดโดยท่ัวไปจะมีเคร่ืองหมายในแนวต้ัง (vertical mark) สาหรับการใสห่ ลอดต้องใหต้ รงตาแหน่งเดียวกันกบั หลอดอ่ืน ๆ ในการวัด และบางย่ีห้อจะมีเคร่ืองหมายในแนวระดับ (horizontal mark) สาหรับเป็นเคร่ืองหมายในการเติมสารละลายสาหรบั วดั ขอ้ สงั เกต- ระดบั สารละลายจะต้องสงู อยา่ งนอ้ ย 20 มิลลเิ มตร สาหรับหลอดใสส่ ารมาตรฐานใชก้ ับ cuvet adapter- ระดับสารละลายจะต้องสูงอย่างน้อย 32 มิลลิเมตร สาหรับหลอดใส่สารทั่วไป (test tube cuvet) ใช้กับuniversal test tube holder2.3 เปดิ ฝาของช่องใสห่ ลอดวัด (5) นาเอาแทง่ พลาสติกก้ันลาแสงออก2.4 เตมิ หลอดใสส่ ารสาหรับวัดด้วยสารละลายเปรียบเทยี บ (blank) และบรรจุในชอ่ งใส่หลอดวัด ปดิ ฝา2.5 หมุนปุ่ม (4) 100% T Zero A ทางด้านล่างซ้ายมือของเคร่ือง จะอ่านผลบนมิเตอร์ได้เป็น 0.0 A หรือ100% T2.6 เปดิ ฝาช่องใส่หลอดได้ และนาเอาหลอดบรรจุสารละลายเปรียบเทยี บออก2.7 เติมหลอดใส่สารสาหรับวัดด้วยสารละลายมาตรฐาน (Standard) หรอื สารละลายตัวอยา่ ง (Sample) และบรรจุในชอ่ งใส่หลอดวดั ปิดฝา2.8 อ่านคา่ เปน็ คา่ การดูดกลืนคล่นื แสง (Absorbance) หรอื ปรมิ าณร้อยละทแี่ สงผา่ น (transmittance)

P a g e | 32การทดลองท่ี 3.1 การศกึ ษาเก่ียวกบั เครือ่ ง spectrophotometer ก. ทาความรจู้ กั เกี่ยวกบั สว่ นตา่ ง ๆ และทาความเข้าใจถึงหลักการของเครื่องมือน้ี ข. ศึกษาวธิ ีใชเ้ ครื่อง Spectronic 21การทดลองท่ี 3.2 การหา wavelength ทีเ่ หมาะสมกับการวัดความเขม้ ขน้ ของสารละลายหลักการ สารละลาย (solution) แต่ละประเภทมีสีต่างกัน เช่น แดง น้าเงิน เขียว ฯลฯ ฉะนั้นเม่ือจะใช้ spectrophotometer วัดความเข้มของสีใดสีหนึ่ง ต้องใช้แสงท่ีมี wavelength เหมาะสม และจาเพาะ กับสีน้ัน ๆ ผ่านสารละลายท่ีต้องการ แสงท่ีผ่านจะถูก absorbed เป็นสัดส่วนกับความเข้มข้นของสาร และ wavelength ท่ีเลือกใช้ด้วย กล่าวคือ สีนั้นจะดูดแสงได้ดีที่ช่วง wavelength หนึ่ง และจะไม่ดูด แสงเลยใน wavelength อีกช่วงหน่ึง เราจะหา wavelength ทีเ่ หมาะสมนี้ได้ โดยการนาสารละลายนั้น มาอ่านค่า O.D. หรือ % T ท่ี wavelength ต่าง ๆ กัน แล้วเขียนกราฟค่า O.D. หรือ % T กับ wavelength ต่ างๆ ก ราฟ ท่ี ได้ นั้ น เรีย ก ว่า \"absorption spectrum\" ข อ งส ารล ะล ายนั้ น ๆ wavelength ทีเ่ หมาะสมสาหรับหาความเข้มข้นของสารละลายหนึ่งนั้น เราใช้ wavelength ตรงท่ีอา่ น ค่า O.D. ไดส้ ูงสดุ ( max)วธิ กี าร 1. ดดู สารละลาย oxyhemoglobin (HbO2) ประมาณ 3 มล. ใส่ใน cuvet 2. Cuvet อีกอันใส่น้ากล่ันเท่า ๆ กัน เพื่อเป็น blank ใช้สาหรับตั้ง 100 % T ต้องตั้ง % T ให้ เทา่ กบั 100 ทุกครงั้ ท่เี ปลย่ี นค่า wavelength 3. วัดค่า O.D. และ % T ของสารละลาย oxyhemoglobin ท่ี wavelength ตั้งแต่ 500 ถึง 600 nm โดยให้อา่ นและจดค่า % T และ O.D.ทุก ๆ 10 nm และทุก 5.0 nm ของแตล่ ะขา้ งท่ียอดสูงสุด ของ curve 4. เขียนกราฟ absorption spectrum โดยให้ค่า wavelength อยู่บนแกน X และ O.D. กับ % T อยู่บนแกน Y (ในกราฟเดียวกัน)การทดลองท่ี 3.3 การทา standard curve (calibration curve)หลักการ Standard curve เป็นกราฟแสดงความสัมพันธ์ระหว่าง O.D. กับความเข้มข้นของสาร (C) เรา สามารถทาได้โดยนาสารละลายชนิดเดียวกันกับ unknown ที่รู้ปริมาณความเข้มข้นแน่นอนมาเจือ จางใหม้ ีความเข้มขน้ ของสารตา่ ง ๆ กัน นาสารละลายปริมาณความเข้มขน้ ตา่ ง ๆ กนั นี้มาวัด O.D. ที่  max ของสารละลายน้ัน O.D. มีความสัมพันธ์แปรตามกับความเข้มข้นของสารตาม Beer's Law โดย Standard curve ท่ีได้ต้องเป็นเส้นตรงผ่านจุด origin (0,0) ซ่ึงมีประโยชน์ในการหาปริมาณ ความเข้มของสาร unknown

P a g e | 33วิธีการ1. ใช้ standard oxyhemoglobin ที่รู้ความเข้มข้น (2.8 มก./มล.) แล้วมาเจือจางตามตารางข้างล่างนี้ และนามาอ่านคา่ O.D. ท่ี  max หลอดท่ี 12 34 5Dilution blank 1:4 1:2 3:4 -Oxy-Hb solution (มล.) 4นา้ กลน่ั (มล.) 01 23 0ความเข้มข้น Oxy-Hb (มก./มล.) 43 21O.D. ............... nm2. เขียนกราฟ ค่า O.D. และความเข้มข้น (มก./มล.) ลงบนกระดาษกราฟธรรมดา โดยให้ค่า O.D. อยู่บนแกนY และความเข้มข้นอยบู่ นแกน Xการแปลผล เสน้ ตรงทเี่ ขียนไดน้ ีเ้ ปน็ ไปตาม Beer's law หรอื ไม่ ?การทดลองท่ี 3.4 การหาความเขม้ ข้นของสารละลาย unknown จาก standard curve เน่ืองจากบางคร้ัง unknown มีปริมาณสารเข้มข้นมาก จนไม่สามารถใช้ standard curve อ่านค่าความเขม้ ข้นได้ ดังน้นั เรานิยมเจอื จาง unknown น้กี ่อนหลาย ๆ dilution แล้วนามาอ่านค่า O.D. เปรยี บเทียบกันแต่ละ dilutionวธิ ีการ 1. นา unknown oxyhemoglobin มาเจือจางเป็น 1:2 และ 1:4 2. อ่านคา่ O.D. ของ unknown ท่ียังไม่ได้เจอื จาง และท่ีเจอื จางแล้วท้ัง 2 dilution ท่ี max 3. หาค่าเป็น มก./มล. จาก standard curve และคานวณหาความเข้มข้นสารเดิมก่อนเจือจางเป็นมก./ดล. (mg% )การทดลองที่ 3.5 จงแสดงวิธีการคานวณหาความเข้มข้นของสารในซีร่มั ผ้ปู ่วยจากโจทยท์ ใ่ี ห้

P a g e | 34 ปฏบิ ตั ิการครัง้ ที่ 4 เรื่อง คารโ์ บไฮเดรตและไขมนั คาร์โบไฮเดรต (carbohydrate) เป็นสารประกอบ หรืออนพุ ันธ์ที่มีหมู่คีโตน (ketone) หรอื หมู่อัลดีไฮด์ (aldehyde) และมีหมู่ไฮดรอกซิล (hydroxyl) มากกว่า 1 หมู่ คาร์โบไฮเดรตพบได้ท้งั ในพืชและสัตว์ และมีความสาคัญต่อร่างกายสัตว์ โดยทาหนา้ ที่เป็นแหลง่ พลังงาน ได้แก่ กลูโคสในเลือด และไกลโคเจนท่ีเก็บไว้ในตบั และกลา้ มเนอื้ คาร์โบไฮเดรตที่สาคัญในพืชได้แก่ แปง้ และ เซลลูโลส สาหรบั คาร์โบไฮเดรตท่ีมีความสาคัญทางชีวเคมี ไดแ้ ก่ โมโนแซคคาไรด์ (monosaccharides) เช่น  เพน็ โตส (pentose) เชน่ ไรโบส (ribose) ซยั โลส (xylose) และอะราบโี นส (arabinose)  เฮก็ โซส (hexose) เชน่ กลโู คส (glucose) ฟรุคโตส (fructose) และกาแลคโตส (galactose) ไดแซคคาไรด์ (disaccharides) เชน่  มอลโตส (maltose) แลคโตส (lactose) และซโู ครส (sucrose) โพลีแซคคาไรด์ (polysaccharides) เชน่  แป้ง (starch) เด็กซตรนิ (dextrin) และไกลโคเจน (glycogen) ไลปิด (lipid) เป็นสารประกอบอินทรีย์ที่ละลายในตัวทาละลายอินทรีย์ (non-polar solvent) เช่นอีเธอร์ อะซโี ตน แตไ่ ม่ละลายในนา้ ไลปดิ อาจแบง่ ตามสว่ นประกอบในโมเลกุล ได้เปน็ 3 กลมุ่ คอื 1. ไลปิดสามัญ (simple lipids) เป็นเอสเตอร์ของกรดไขมัน (fatty acids) กับแอลกอฮอล์ได้แก่ไตรกลีเซอไรด์ (triglycerides) เป็นเอสเตอร์ของกรดไขมันและกลีเซอรอล และขี้ผ้ึงต่างๆ (waxes) เป็นเอสเตอรข์ องกรดไขมนั กบั แอลกอฮอล์ทม่ี ีน้าหนักโมเลกลุ สงู ๆ 2. ไลปิดผสม (compound lipids) เป็นเอสเตอร์ของกรดไขมันกับแอลกอฮอล์และมีสารประกอบอืน่ อยดู่ ้วย ได้แก่ ฟอสโฟไลปิด (phospholipids) (ซึง่ ประกอบด้วยกรดไขมนั กลเี ซอรอล กรดฟอสฟอรคิ และไนโตรเจนเบส) ไกลโคไลปิด (glycolipids) (ซึ่งประกอบด้วย กรดไขมัน sphingosine และคาร์โบไฮเดรต)และไลโปโปรตีน เปน็ ต้น 3. ไลปิดอนุพันธ์ (derived lipids) เป็นสารประกอบท่ีได้จากการไฮโดรไลส์ไลปิด แต่ยังคงมีลกั ษณะจาเพาะของไลปิดอยู่ ได้แก่ กรดไขมัน (fatty acid) โมโนกลีเซอไรด์ (monoglyceride) ไดกลีเซอไรด์(diglyceride) และวิตามินที่ละลายในไขมัน เป็นต้น สารไลปดิ พบไดใ้ นส่วนตา่ งๆ ของร่างกาย เชน่ ท่ไี ขกระดูก สมอง (สว่ นใหญเ่ ปน็ ไลปดิ ผสม) ตบั และเลือด (มีไลปิดทกุ ชนิด) และเนื้อเย่ือไขมัน (เกือบทง้ั หมดเป็นไตรกลีเซอไรด์)

P a g e | 35การทดลองที่ 4.1 การทดสอบโมโนแซคคาไรด์ และไดแซคคาไรด์ ใช้สารละลายนา้ ตาลมาตรฐาน ไดแ้ ก่ 0.05M xylose, glucose, fructose, lactose และsucrose กับสารละลายนา้ ตาล unknown สาหรับการทดสอบตา่ งๆ ต่อไปนี้ ก. การทดสอบโมลชิ (Molisch’s test): ใชท้ ดสอบคารโ์ บไฮเดรตทว่ั ไปหลักการ กรดเข้มข้นจะดึงน้าออกจากโมเลกุลของน้าตาล โดยเกิดปฏิกริยา dehydration ถ้าเป็นน้าตาลเพ็น โตสจะได้เป็น furfural และถ้าเป็นน้าตาลเฮ็กโซสจะได้เป็น hydroxymethyl-furfural ซ่ึงสาร 2 ตัว นจี้ ะรวมกบั -naphthol เกิดเป็นสารที่มสี ีม่วงจนถึงมว่ งแดงวิธีการ ใส่สารละลายน้าตาล 1mL ในหลอดทดลองขนาดเล็ก เติมน้ายาโมลิช 3 หยด เขย่าให้เข้ากัน เอียง หลอดแกว้ แลว้ ค่อยๆ เติมกรดกามะถันเข้มข้นประมาณ 1mL ให้ไหลลงไปตามขา้ งหลอดจนเกิดเป็น ช้นั แยกกนั อย่างชดั เจนผลบวก คอื หลังจากตง้ั ทิ้งไว้ จะเกิดวงแหวนสีม่วงระหว่างช้นั ของน้ายาทัง้ สองชนิด ข. การทดสอบเบเนดิคต์ (Benedict’s test): ใชท้ ดสอบน้าตาลทีม่ ีคุณสมบตั ริ ดิ ิวซ์หลักการ สารละลายคิวปริกในด่าง สามารถอ็อกซิไดส์น้าตาลที่มีหมู่อัลดีไฮด์อิสระ หรือหมู่คีโตอิสระ หรือ หมู่ไฮดรอคซีของ anomeric carbon เกิดเป็นตะกอนสีแดงของคูปรัสอ็อกไซด์ (cuprous oxide, Cu2O)วิธกี าร ผสมน้ายาเบเนดิคต์ 3mL กับสารละลายน้าตาล 5 หยดในหลอดทดลอง แล้วแช่หลอดในน้าเดือด ประมาณ 5 นาทีผลบวก คือ การเกิดตะกอนสีเหลือง น้าตาล หรือแดงอิฐของ Cu2O (แล้วแต่ความเข้มข้นของน้าตาล) ถ้ามี น้าตาลซึง่ มีฤทธร์ิ ีดวิ ซ์อยู่เพยี งเล็กน้อย จะเห็นนา้ ยาเปน็ สีเขยี วปนเหลือง แล้วเห็นตะกอนทก่ี ้นหลอด ภายหลังทีต่ ัง้ ทิง้ ไว้ใหเ้ ย็น ค. การทดสอบบารเ์ ฟดิ (Barfoed’s test): ใชท้ ดสอบเฉพาะพวกโมโนแซคคาไรด์หลักการ สารละลายควิ ปรคิ ในกรด สามารถอ็อกซิไดสน์ ้าตาลโมโนแซคคาไรด์เท่าน้ัน ไดเ้ ป็นตะกอนสแี ดงอฐิ ของคูปรสั อ็อกไซด์ (Cu2O)วิธกี าร ผสมน้ายาบาร์เฟดิ 3mL กบั สารละลายน้าตาล 5 หยดในหลอดทดลอง แล้วแชห่ ลอดในน้าเดือด ประมาณ 5 นาที

P a g e | 36ผลบวก คือ การเกิดตะกอนสีแดงอิฐของ Cu2O และเห็นได้ชัดเจนเมื่อท้ิงไว้ให้ตะกอนนอนก้น (ตะกอนไม่มาก เม่ือเทียบกับการทดสอบข้อ ข.) การทดสอบนี้ไม่เหมาะสาหรับทดสอบน้าตาลในปัสสาวะเพราะมี คลอไรด์ ซึง่ จะจบั กบั คูปรสั ไอออน เกิดเป็นตะกอนของคปู รัสคลอไรด์ (CuCl) ง. การทดสอบเซลิวานอฟฟ์ (Seliwanoff’s test): ใชท้ ดสอบเฉพาะ fructoseหลักการ น้าตาลคีโตส ทาปฏิกิริยากับกรดเข้มข้น ได้เป็น 4-hydroxymethyl furfural และสารน้ีจะทา ปฏกิ ิริยากบั resorcinol เกิดเป็นสารละลายสีแดงวธิ ีการ ผสมน้ายาเซลิวานอฟฟ์ 3mL กับสารละลายน้าตาล 10 หยดในหลอดทดลอง แล้วแช่หลอดในน้า เดือด และเมือ่ เห็นสารละลายเรม่ิ มีสีชมพเู กิดขึ้น ให้รบี ยกหลอดออกทันทีผลบวก คือ น้ายาจะค่อยๆ เปลี่ยนเป็นสีแดง แต่หากต้มนานเกินไป sucrose และ glucose จะสามารถให้ ผลบวกได้เชน่ กัน (ผลบวกเทจ็ ) จ. การทดสอบอะนีลีน (Aniline test): ใช้ทดสอบเฉพาะน้าตาล pentoseหลักการ น้าตาล pentose ทาปฏิกิรยิ ากับกรดเข้มข้นได้เป็น furfural ซึ่งจะทาปฏิกิริยาต่อกับอะนิลีนได้เป็น สารละลายสีแดงสดวธิ กี าร ผสมสารละลายน้าตาล 1mL กับ glacial acetic acid 1mL และน้ายาอะนีลีน 3 หยด ในหลอด ทดลอง แล้วแช่หลอดในน้าเดือดประมาณ 3 นาที จากนัน้ ยกหลอดออกและปล่อยไว้ใหเ้ ย็นผลบวก คือ น้ายาจะเปล่ียนเปน็ สีแดงสด หรือแดงเชอรี่ ฉ. การเกิดผลกึ โอซาโซน (Osazone formation test): ใชท้ ดสอบนา้ ตาลท่มี คี ุณสมบัติริดิวซ์หลกั การ ใน ต อ น แ รก โม โน แ ซ ค ค าไรด์ แ ล ะ reducing disaccharide จ ะ ท าป ฏิ กิ ริย ากั บphenylhydrazine ได้ phenylhydrazone ซึ่งจะทาปฏิกิริยาต่อไปกับ phenylhydrazine ที่มากเกินพอ ได้เป็นผลึก osazone สีเหลืองท่ีไม่ละลายน้า มีรูปร่างผลึกและจุดหลอมเหลวแตกต่างกัน (ปฏิกิรยิ านี้สามารถใช้ทดสอบเพือ่ แยกชนิดของน้าตาลตา่ งๆ ได้ด้วย) ผลกึ osazone ของ fructose, glucose และ mannose จะมีรูปรา่ งคล้ายกัน เพราะมสี ตู รโครงสร้างตัง้ แต่ C ตาแหนง่ ท่ี 3 ถึง 6 เหมอื นกัน

P a g e | 37 รปู แสดงปฏิกริ ยิ าการเกดิ ผลึก osazoneวธิ กี าร ผสมสารละลายน้าตาล unknown 5mL กับ glacial acetic acid 10 หยด และสารละลาย phenylhydrazine 3 หยด ในหลอดทดลอง จากนั้นเติมผง sodium acetate ลงไปเล็กน้อย (ประมาณเท่าหัวไม้ขีดไฟ) นาหลอดไปแช่ในน้าเดือดประมาณ 15 นาที ค่อยๆ เขย่าบ้างเป็นบางคร้ัง โดยช่วง 5 นาทีแรก หากมีตะกอนเกิดข้ึน ต้องกรองตะกอนนั้นทิ้งก่อน จึงค่อยนามาแช่ในน้าเดือด ต่อจนครบเวลา หรือหากสารละลายเร่ิมมีความขุ่นก่อนครบเวลา ให้ยกหลอดออกมาต้ังท้ิงไว้ โดย ไม่ใหห้ ลอดถูกกระทบกระเทือน ผลกึ osazone จะคอ่ ยๆ ตกตะกอนลงมาท่กี น้ หลอด จากน้ันใช้ Pasteur pipette ดูดผลึก osazone ที่ก้นหลอดมาเล็กน้อย นามาหยดลงบนแผ่นสไลด์ ปิดด้วย cover slip และนาไปส่องดูลักษณะของรูปร่างผลึก osazone ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ บันทึกผลโดยการวาดผลึก osazone ท่ีดูผ่านกล้องจุลทรรศน์ จากนั้นนารปู ที่วาดไปเปรยี บเทียบกับ ผลึก osazone ของน้าตาลชนิดต่างๆ ท่ีห้องปฏิบัติการต้ังแสดงไว้ และบอกว่าผลึก osazone ของ นา้ ตาล unknown ทีไ่ ดค้ ือ นา้ ตาลชนิดใดการทดลองที่ 4.2 การทดสอบโปลีย์แซคคาไรด์ (polysaccharide) ก. การทดสอบไอโอดนี (Iodine test)หลกั การ การทดสอบไอโอดนี มปี ระโยชน์สาหรบั เปรียบเทียบความแตกต่างกันของโปลีย์แซคคาไรด์ชนิดต่างๆ โดย จะให้สารประกอบท่ีมีสีกับไอโอดีน สาหรับแป้งเม่ือทาปฏิกิริยากับไอโอดีนจะให้สารประกอบสีน้าเงิน สว่ นไกลโคเจน หรอื แป้งท่ีถูกสลายใหโ้ มเลกลุ เลก็ ลง เชน่ เดก็ ซ์ตรนิ จะใหส้ ีน้าตาลแดงวิธีการ ใช้สารละลายแป้ง, สารละลาย dextrin และสารละลาย glycogen อย่างละ 2mL ผสมกับ 0.2% น้ายาไอโอดีน 2 หยด และทาหลอดคอนโทรลสาหรับเปรียบเทียบสี โดยใช้น้ากล่ัน 2mL ผสมกับ นา้ ยาไอโอดีน 2 หยด บันทึกผลที่เกดิ ขนึ้

P a g e | 38 ข. การย่อยสารละลายแปง้ ด้วยกรด (Acid hydrolysis of starch)หลักการ ในการทดลองนีจ้ ะศกึ ษาการเปล่ยี นแปลงความสามารถในการรีดิวซข์ องโพลีแซคคาไรด์ เม่ือนาไปต้ม กับกรด เน่ืองจากโพลแี ซคคาไรด์ เมื่อนาไปสลายด้วยกรดจะไดส้ ารประกอบเป็นโมโนแซคคาไรดแ์ ละ ไดแซคคาไรด์ ซง่ึ มคี ณุ สมบัติรีดิวซ์ hydrophilic acidวิธีการ ผสมสารละลายแป้ง 5mL กับน้ากล่ัน 5mL และกรดกามะถันเข้มข้น (conc.H2SO4) 10 หยดใน flask ขนาด 50mL ปิดปาก flask ด้วย beaker ขนาดเล็กเพื่อกันน้าระเหย แล้วนาไปต้มโดยใช้ ตะเกียงแอลกอฮอล์ให้เดือดน้อยๆ นาน 10-15 นาที (ระวังไหม้ ถ้าน้างวดมากให้เติมน้ากลั่นลงไป ทดแทน) เมือ่ ครบเวลายกลงจากไฟ และปลอ่ ยท้ิงไว้ให้เย็น จากนั้นทาการปรับ pH ของสารละลายให้เป็นกลางด้วยผง sodium carbonate (ทดสอบ pH ด้วย กระดาษลิตมัส) แบ่งสารละลายที่ได้มาทดสอบคุณสมบัติรีดิวซ์ด้วย Benedict’s test (การทดสอบ ในข้อ 1 ข.) และทดสอบโพลีแซคคาไรด์ด้วย Iodine test (การทดสอบในข้อ 2 ก.) บันทึกผลท่ี เกิดขึ้นการทดลองท่ี 4.3 การวเิ คราะหอ์ งค์ประกอบทางเคมขี องไลปิดดว้ ยวิธี spot tests ใช้กระดาษกรอง No.4 ขนาด 3 x 5cm จานวน 4 แผ่น ในแต่ละแผ่นใช้ดินสอวงกลมขนาดเส้นผ่าศนู ย์กลาง 1cm จานวน 2 วง แตล่ ะวงหา่ งกนั ประมาณ 1.5cm ดังรปู Standard Unknown ในแต่ละแผ่นให้หยดสารละลาย standard ซ่ึงเป็นไลปิดผสมที่มีไลปิดครบทุกชนิดที่มีการทดสอบ 1ตาแหน่ง (ควรหยดซา้ อย่างนอ้ ย 4 - 5 ครัง้ ) และสารละลาย unknown อกี 1 ตาแหน่ง ปลอ่ ยใหแ้ หง้ แลว้ นามาทดสอบ ดังตอ่ ไปน้ีแผ่นท่ี 1 ทดสอบโคลีน (choline test): เป็นการทดสอบไลปิดท่ีมีกลุ่มโคลีนอยู่ในโมเลกุล ได้แก่phosphatidylcholine (lecithin) และ sphingomyelinหลกั การ โคลีน จะจับ กับ phosphomolybdic acid ซึ่งจะถูกรีดิวซ์ ต่อด้วย stannous chloride ได้ phosphomolybdenum blue

P a g e | 39วธิ ีการ หยด 1% phosphomolybdic acid ประมาณ 2-3 หยด ลงบนวงไลปดิ ทงั้ standard และ unknown และท้ิงไวป้ ระมาณ 10 นาที จากน้ันหยดต่อด้วย 10% stannous chloride ประมาณ 2-3 หยด ถา้ มีกลุ่มโคลีนจะได้วงสีน้าเงินแผ่นที่ 2 ทดสอบกลุ่มอะมิโน (amino test): เป็นการทดสอบฟอสโฟไลปิดท่ีมีกลุ่มอะมิโนเสรี (freeamino group) ไดแ้ ก่ phosphatidylethanolamine และ phosphatidylserineวิธกี าร หยดน้ายา ninhydrin ประมาณ 2-3 หยด ลงบนวงไลปิดทั้ง standard และ unknown แล้วอบ กระดาษในตู้อบจนแหง้ ถ้ามกี ลมุ่ อะมโิ นจะได้วงสีม่วงแผน่ ที่ 3 ทดสอบความไม่อมิ่ ตวั (unsaturation test)หลกั การ ด่างทับทิม (potassium permanganate, KMnO4) จะเข้าทาปฏิกิริยาทุกตาแหน่งท่ีมี double bond ของไลปิดได้เปน็ peroxide และ manganese dioxide (MnO2)วิธีการ หยด 1% KMnO4 ประมาณ 2-3 หยด ลงบนวงไลปดิ ท้งั standard และ unknown ถา้ มีกรดอะมิโน ไม่อ่ิมตัวเป็นองคป์ ระกอบในไลปิดทที่ าการทดสอบจะไดว้ งสีนา้ ตาลของ MnO2แผ่นที่ 4 ทดสอบความเปน็ กรด (acid test): ใช้ทดสอบกรดไขมัน หรือสารท่ีมกี รดไขมนั เป็นส่วนประกอบหลักการ Bromothymol blue เป็น pH indicator ทีเ่ ปลย่ี นสใี นช่วง pH 6.0 (สีเหลือง) -7.6 (น้าเงนิ )วธิ กี าร หยด bromothymol blue ประมาณ 2-3 หยด ลงบนวงไลปิดท้ัง standard และ unknown ถ้ามี สารประกอบกรดจะได้วงสีเหลอื งบันทึกผลที่ได้จากการทดสอบ ถ้าพบให้ใส่เคร่ืองหมาย + ถ้าไม่พบให้ใส่เคร่ืองหมาย -และสรุปว่า unknownมไี ลปดิ ชนดิ ใดบ้างจากผลการทดสอบข้างตน้

P a g e | 40 รายงานผลการทดลอง ปฏบิ ตั กิ ารครง้ั ท่ี 4 เรือ่ ง คาร์โบไฮเดรตและไขมันชื่อ…………………………………………………………..……เลขที่……………วนั ท.่ี ................................................ชอ่ื ……………………………………………………………..…เลขที่……………ชื่อ……………………………………………………………..…เลขท่ี……………ชอ่ื ……………………………………………………………..…เลขที่……………ผลการทดลองที่ 4.1 การทดสอบ monosaccharide และ disaccharideรายงานผลการทดลองดว้ ย + หรอื – และบนั ทกึ การเปลี่ยนแปลงทเี่ กิดข้นึ ด้วยนา้ ตาล/วิธี Xylose Glucose Fructose Lactose Unknown ทดสอบ Sucrose No...........Molisch ผลบวกของปฏกิ ิริยานี้ คือ TestBenedict ผลบวกของปฏิกิริยาน้ี คอืTestBarfoed ผลบวกของปฏกิ ิริยานี้ คือTestSeliwanoff ผลบวกของปฏิกิรยิ าน้ี คือTestAniline ผลบวกของปฏิกริ ยิ านี้ คอืTestสารละลาย unknown No. …..... ประกอบดว้ ยนา้ ตาล……………………………………………………………

P a g e | 41จงวาดรปู ผลกึ osazone ของนา้ ตาลแต่ละชนดิ ที่หอ้ งปฏิบัติการตงั้ แสดง และของน้าตาล unknown วธิ ีทดสอบ Xylose Glucose Fructose Lactose Unknown Osazone Test (รูปผลกึ สเี หลอื ง)สรปุ ผลและวจิ ารณผ์ ลการทดลองท่ี 4.1……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………ผลการทดลองที่ 4.2 การทดสอบ polysaccharide Glycogen น้ากล่นัก. การทดสอบไอโอดนี สารละลายแปง้ Dextrin สที ่ไี ด้หลงั เติมไอโอดีนข. การย่อยสารละลายแป้งด้วยกรด หลังจากการย่อยสารละลายแปง้ ด้วยกรด ผลท่ไี ด้จาก Benedict test คือ ………………………………………..……………………………………………………… และผลที่ไดจ้ าก Iodine test คอื ………………………………………………………………………………………………สรปุ ผลและวิจารณผ์ ลการทดลองที่ 4.2………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….……………………………………………………………………………………………………………………….

P a g e | 42ผลการทดลองที่ 4.3 การวเิ คราะหอ์ งคป์ ระกอบทางเคมีของไขมันดว้ ยวิธี spot tests Choline test Amino test Unsaturation Acid test testStandardUnknownno……………. บันทึกผลท่ีได้จากการทดสอบ ถา้ พบใหใ้ สเ่ คร่อื งหมาย + ถา้ ไมพ่ บใหใ้ ส่เครอ่ื งหมาย - และ สรปุ ว่า unknown มไี ขมนั ชนิดใดบา้ งจากผลการทดสอบข้างตน้Unknown no…………… ประกอบด้วยไขมันชนดิ ใดบา้ ง พร้อมยกตัวอย่าง………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

P a g e | 43 ปฏิบัตกิ ารครั้งท่ี 5 เรื่อง การวิเคราะหห์ าปริมาณโปรตีนในซรี ่ัมการทดลองที่ 5 การวิเคราะหห์ าปริมาณโปรตนี รวม แอลบูมิน และโกลบูลิน ในซีร่ัม (โดยวิธี Kingsley Biuret method ดัดแปลโดย Weicheelbeum)หลกั การ การวิเคราะห์หาปริมาณโปรตีนรวม และ แอลบูมินในซีร่ัมใช้วิธีไบยูเร็ต โปรตีนรวมในซีร่ัม ประกอบด้วยแอลบูมนิ และโกลบูลิน เม่ือจะวิเคราะห์หาปริมาณแอลบูมินจึงต้องตกตะกอน โกลบูลิ นออกก่อนด้วยโซเดียมซัลเฟต (Na2SO4) โปรตีนจะทาปฏิกริยากับน้ายาไบยูเร็ตให้สีน้าเงินม่วง ซึ่ง จะเกดิ สีเข้มทส่ี ุดภายใน 15 นาที และจะคงอยูน่ านหลายชัว่ โมงวิธีการ ก. การหาปริมาณแอลบมู นิ 1. นาซีรั่ม 0.5 มล.ใสห่ ลอดทดลองชนิดท่ีมีฝาเกลียวปิด เติม 24.5% โซเดียมซัลเฟต 7.5 มล. ปิดจุก ใหแ้ นน่ แล้วเขยา่ อย่างแรง 2. ต้ังหลอดท้ิงไว้ 15 นาที เติมอเี ธ่อร์ประมาณ 3-4 มล. ลงในหลอด (ห้ามใช้ปากดูด หรือทาใกล้ไฟ) ใช้นิ้วหัวแม่มือปิดปากหลอดให้แน่น เขย่าอย่างแรงนานประมาณคร่ึงนาทีขณะท่ีเขย่าค่อย ๆ เผยอ น้ิวเพ่ือไล่ความดันแก๊สทเ่ี กิดข้ึนในหลอด และช่วยป้องกันการหกกระเด็นของอีเธ่อร์ และสารละลาย ในหลอด 3. นาไปป่ันท่ี 2,500 รอบต่อนาที นาน 4 นาที จะเกิดตะกอนของโกลบูลินเป็นแถบก้ันอยู่ระหว่าง อเี ธอ่ ร์ซง่ึ อยสู่ ว่ นบนกบั นา้ ใสของแอลบมู นิ ซง่ึ อยู่ส่วนล่าง 4. เอียงหลอด เอาปลายนิ้วปิดปาก transfer pipet ขนาด 5 มล. ค่อย ๆ สอดปลายปิเปตลงไปโดย เม่ือปลายปิเปตอยู่ใต้ช้ันตะกอนโกลบูลิน หรือที่ก้นหลอดแก้วจึงปล่อยน้ิวจากปากปิเปตดูดเอา ส่วนน้าใสท่ีอยู่ใตช้ ั้นตะกอน มา 2.5 มล. ใส่ลงในหลอดทดลองขนาดใหญ่ (18 x 150 มล.) 5. เติม 0.9% โซเดียมฆลอไรด์ 2.5 มล. ผสมให้เข้ากนั 6. นาหลอดทดลองขนาดใหญ่อีกหลอดหนึ่งมาเตรียม blank โดยใส่สารละลาย 24.5% โซเดียม ซลั เฟต 2.5 มล. และ 0.9% โซเดยี มฆลอไรด์ 2.5 มล. ผสมให้เขา้ กนั

P a g e | 447. เติมน้ายาไบยูเร็ต 5 มล. ลงในหลอดที่เตรียมไว้ในข้อ 5 และ 6 โดยให้ใส่ในเวลาเดียวกันห้ามใส่ น้ายาไบยูเร็ตในหลอด blank ก่อนแล้วต้ังทิ้งไว้ผสมให้เข้ากัน โดยใช้ parafilm พันปิดปาก หลอดใหแ้ น่น และคว่าหลอดกลบั ไปมา8. นาหลอดทง้ั สองแช่ในนา้ อนุ่ 300-320ซ. เป็นเวลา 30 นาที9. อ่านคา่ O.D. ท่คี ลืน่ แสง 555 nm10. อ่านค่าความเขม้ ขน้ ของแอลบูบินในซีรั่มจาก calibration curve ทไี่ ด้จากขอ้ ค.ข. การหาปรมิ าณโปรตีนรวมทาการเจือจางซีรั่ม โดยนาซีร่ัม 0.2 มล. ใส่ในหลอดทดลอง เติม 0.9% โซเดียมคลอไรด์ลงไป8 มล. ผสมให้เข้ากัน ให้ทาพร้อมการทา calibration curve ของโปรตีน โดยแบ่งมา 5 มล.ใส่ในหลอดท่ี 6 ในข้อ ค.ค. การเตรยี ม calibration curve ของโปรตนี รวม และแอลบูมนิ1. เตรยี มหลอดทดลองขนาดใหญ่ 6 หลอด ใส่สารละลายเรียงตามลาดบั ดงั ตารางน้ีหลอดท่ี 12345 6 -โปรตีนมาตรฐาน (2.8 มก./มล.)(มล.) - 1 2 3 4 5 -ซรี ัม่ เจอื จาง (จากข้อ ข.) (มล.) ----- 50.9% โซเดยี มคลอไรด์ (มล.) 54321น้ายาไบยเู รต็ (มล.) 555552. ผสมสารละลายใหเ้ ข้ากนั โดยใช้ parafilm พันปดิ ปากหลอดใหแ้ น่นและควา่ หลอดกลับไปมา3. นาหลอดทง้ั หมดไปแชใ่ นน้าอุ่น 300-320C เปน็ เวลา 30 นาที4. นาไปอา่ นค่า O.D. ท่คี ลื่นแสง 555 nm5. เขียนกราฟค่า O.D.555 กับความเข้มข้นของโปรตีนมาตรฐานเปน็ มก./ดล. บนกระดาษกราฟและอ่านค่าความเข้มข้นของโปรตนี ในซีรม่ั จาก calibration curve

P a g e | 45การคานวณ 1. จาก calibration curve เปลีย่ นคา่ O.D. ของโปรตนี รวม และแอลบูมนิ เปน็ กรมั ในซีรัม่ 100 มล. 2. ปรมิ าณโกลบูลิน = ปริมาณโปรตนี รวม – ปรมิ าณแอลบมู นิรายงาน ปรมิ าณของโปรตนี รวม แอลบูมิน และโกลบูลินในซรี ่ัมเป็น กรัม/ดล.การแปลผล ซีร่ัมของคนปกติมีโปรตีนรวม 6.0-8.0 กรัม/ดล. โดยเป็นแอลบูมิน 3.5–5.0 กรัม/ดล. และ ไฟบริโนเจ็น 0.2-0.4 กรัม/ดล. เม่ือคานวณอัตราเทียบแอลบูมิน ต่อโกลบูลินจะได้ประมาณ 1.5–3:1 หากโปรตีนรวมของเลือดน้อยกว่า 5.5 กรัม/ดล. จะเกิดการบวมได้ เรียกระดับโปรตีน รวมนว้ี า่ “ระดบั บวม” ภาวะที่โปรตีนในเลือดต่า (hypoproteinemia) พบในผู้ป่วยโรคตับ โรคเบาหวาน ผู้ป่วยต่อม ไธรอยด์ทางานมากผิดปกติ (hyperthyroidism) ท่ีสาคัญคือ ผู้ป่วยโรคไต (nephrosis) และอาจ พบได้ในหญิงตั้งครรภ์ เนอื่ งจากความต้องการโปรตีนของทารกในครรภใ์ ช้ในการสรา้ งกลา้ มเนื้อ สาหรับภาวะโปรตีนในเลือดสูง (hyperproteinemia) เกิดได้จากการเพ่ิมปริมาณโกลบูลิน เช่น มะเร็งเม็ดเลือดขาว บางกรณีพบว่าแอลบูมินมีปรมิ าณน้อยลง และโกลบูลินเพิ่มมากข้ึน เช่น โรค ตับแข็ง นอกจากน้ันผู้ป่วยท่ีร่างกายขาดน้า จะพบภาวะโปรตีนในเลือดสูงด้วย การเกิดภาวะโรค ตา่ ง ๆ อาจมผี ลให้อตั ราเทยี บแอลบมู ิน ต่อ โกลบลู นิ มีคา่ เปล่ียนแปลงไปเป็น 1:2 ได้

P a g e | 46 ปฏบิ ัตกิ ารครง้ั ท่ี 6 เรอ่ื ง การวเิ คราะห์หาปริมาณโคเลสเตอรอล และ ครีอาตนิ นี ในเลอื ดการทดลองท่ี 6.1 การวเิ คราะหห์ าปริมาณโคเลสเตอรอลในซีรั่ม (Babson)หลักการ ตกตะกอนโปรตีนด้วยแอลกอฮอล์ และ สกัดโคเลสเตอรอล ด้วยเอทธิลอะซิเตท (Ethyl acetate) นาไปทาปฏิกิรยิ ากับ Ferric Chloride (FeCl3) ในสายละลายที่เป็นกรดแก่จะได้สีน้าตาลเกิดขึ้นซึ่ง เป็นอตั ราส่วนกับปริมาณของโคเลสเตอรอลในซีร่มัข้ันตอนที่ 1 ตกตะกอนโปรตีนและสกดั โคเลสเตอรอลวธิ ีการ 1.1 นา unknown serum 0.2 มล. ใส่ในหลอดแกว้ หมุนเหว่ียง (centrifuge tube) 1.2 เติมเอทธิลอะซิเตทในแอลกอฮอล์ (1:1 โดยปรมิ าตร) 3 มล. จากนั้นเขย่าอย่างแรงดว้ ยเครอ่ื ง เขย่า (vortex mixer) ตงั้ ทงิ้ ไว้ 5 นาที 1.3 นาหลอดแก้วหมุนเหว่ียงอกี หลอดหนง่ึ มาปรับน้าหนักดว้ ยน้าใหเ้ ท่ากบั หลอดหมุนเหวยี่ งในข้อ 1.2 เพ่ือใชเ้ ปน็ หลอดปรับสมดลุ ในเครอื่ งป่ัน 1.4 นาไปปน่ั เหว่ยี ง ท่ี 2,500 รอบตอ่ นาที นาน 3 นาที 1.5 ใช้ pasture pipette ดูดน้าใสส่วนบน (ไมเ่ อาตะกอน) มาใส่ในหลอดทดลองหลอดใหม่ 1.6 ใช้ pipette ดดู น้าใสสว่ นบนมา 0.5 มล. แยกใสใ่ นหลอดทดลองขนาดใหญ่ กาหนดใหเ้ ปน็ หลอด สารละลาย unknown (หลอดที่ 1)ขน้ั ตอนท่ี 2 เจือจางสารละลายโคเลสเตอรอลวธิ กี าร 2.1 เตรยี มหลอดทดลองหลอดทีส่ อง ใสส่ ารละลายโคเลสเตอรอลมาตรฐาน 0.2 มล. และเอทธิลอะซิ เตทในแอลกอฮอล์ 3 มล. เขยา่ ให้เข้ากันดว้ ยเครอื่ งเขย่า 2.2 แบง่ สารละลายท่ีเตรียมไวใ้ นข้อ 2.1 มา 0.5 มล. ใส่ในหลอดทดลองใหญ่อีกหลอดหน่ึง กาหนดให้ เป็นหลอดสารละลายโคเลสเตอรอลมาตรฐาน (หลอดที่ 2)ข้นั ตอนท่ี 3 เตรยี มหลอดอกี หน่งึ หลอดเปน็ หลอด blankวิธกี าร เตรียมหลอดทดลองขนาดใหญ่หลอดหน่ึงใส่เอทธิลอะซิเตทในแอลกอฮอล์ 0.5 มล. กาหนดใหเ้ ปน็ หลอด blank (หลอดท่ี 3)ขน้ั ตอนที่ 4.วธิ กี าร 4.1 นาหลอดที่ 1, 2 และ 3 มาเติม 0.1 % FeCl3 ใน เอทธลิ อะซเิ ตท 2.5 มล. เขย่าให้เขา้ กันด้วย เครอื่ งเขยา่ 4.2 เติมกรดกามะถันเข้มขน้ (ในต้คู วนั ) 2 มล. ท้งั 3 หลอด รบี เขยา่ อย่างแรงทนั ทีโดยใชเ้ ครอ่ื ง เขยา่ จากนั้นตัง้ ทิ้งไว้ 10 นาที 4.3 แบง่ สารละลายทั้ง 3 หลอดใส่ cuvette แล้วนาไปอา่ นคา่ O.D. ท่คี วามยาวคลน่ื แสง 550 nm

P a g e | 47การคานวณ สารละลายโคเลสเตอรอลมาตรฐานมคี วามเข้มขน้ 200 มก./ดล.O.D.unknown x 200 = X mg/dLO.D.standardรายงาน ปรมิ าณโคเลสเตอรอลเปน็ มก.ในซีรั่ม 100 มล. (mg/dL)การแปลผล โคเลสเตอรอลในเลือดจะมีปริมาณเท่ากันในระหว่างเม็ดเลือด และ พลาสม่าปกติ และมักไม่ เปลี่ยนแปลงแต่อาจแตกต่างกันได้ในระหว่างบุคคล นอกจากนี้ปริมาณของโคเลสเตอรอลใน เลือดอาจมากหรือน้อยในภาวะที่ไม่ได้เป็นโรคก็ได้ โดยเกี่ยวกับชนิดของไขมันท่ีกิน อายุ และ เพศดว้ ยระดบั โคเลสเตอรอลตามคาแนะนาของ European Atherosclerosis Society: Lipid disorderCholesterol < 200 mg/dL NoCholesterol 200-300 mg/dL Yes ถา้ HDL < 35 mg/dlCholesterol > 300 mg/dL Yesโคเลสเตอรอล ในเลอื ดมากข้ึนในโรคหรือในภาวะต่าง ๆ ไดแ้ ก่ - โรคเบาหวาน (DM) มีระดับโคเลสเตอรอลสูงข้ึนในขณะเดียวกันมีระดับไตรกลีเซอไรด์สูงขึ้นด้วย แตม่ อี ตั ราสว่ นที่น้อยกว่า - โรคไต (Nephrotic syndrome) ระดับโคเลสเตอรอลสูงขึ้นมากบางครั้งอาจพบซีรั่มมีลกั ษณะขุ่น ขาวเหมอื นนา้ นม (milky serum) - โรคหลอดเลือดแดงแข็งและตีบ (Atherosclerosis) เพราะมีโคเลสเตอรอลสะสมอยู่มากท่ีผนัง หลอดเลอื ดทาให้เสน้ เลือดตบี มกั เกิดกับเส้นเลอื ดหัวใจทาให้หัวใจขาดเลอื ดได้ - ภาวะ Hypothyroidism (ขาด LDL receptor ที่จะนา LDL เขา้ สู่เซลลไ์ ปสลายเป็นพลังงาน)โคเลสเตอรอล ในเลอื ดน้อยพบไดใ้ นภาวะ - Hyperthyroidism (metabolism สูง) - ระยะสดุ ทา้ ยของโรคต่าง ๆการทดลองที่ 6.2 การวเิ คราะหห์ าปรมิ าณเครอาตนิ ีน (Taussky)หลกั การ เติมแอลคาไลน์ปิเครต ลงในน้ากรองไรโ้ ปรตีนและเทียบสกี ับนา้ ยามาตรฐานขั้นตอนท่ี 1 เตรียมน้ากรองไร้โปรตีนโดยวิธีโฟลินวู (Folin wu) ดัดแปลงโดยเฮเด็น (Haden) (น้ากรองไร้โปรตนี ทไ่ี ด้จะเจอื จางลงกว่าเดิม 10 เท่า)