Insect Pathology

ควำมตำ้ นทำนของแมลงอำศยั 236 Phagocytosis Phagocytosis เป็นภำษำกรีก หำกแปลในควำมหมำยในภำษำอังกฤษ หมำยถึง กำรกลืนกิน ใน กระบวนกำร phagocytosis เม็ดเลือดท่ีเรียกว่ำ granulocytes จะเข้ำไปจับกับอนุภำคของสิ่ง แปลกปลอม แล้วโอบล้อมเซลล์ และทำกำรกำจัด ในกระบวนกำรดังกล่ำว เช้ือโรคจะถูกตรึง อยู่กับ phagosome และปล่อยสำรท่ีเป็นพิษกับเชื้อโรคที่เรียกว่ำ releases reactive oxygen intermediates (ROIs) และ reactive nitrogen intermediates (RNIs) (Lavine and Strand, 2002) ซ่ึง ROIs และ RNIs จะส่งสัญญำณไปยังระบบภูมิคุ้มกัน humoral ที่จะผลิต antimicrobial peptides ออกมำช่วยทำลำยเชื้อโรคอีกทำงหนึ่งด้วย (Lavine and Strand, 2002) Phagocytosis เป็นระบบ ภูมิคุ้มกันของ cellular immune มีทั้งสัตว์มีกระดูกสันหลังและไม่มีกระดูกสันหลัง ในกำรกำจัดสิ่ง แปลกปลอมที่มีขนำดเล็ก หลังจำกน้ันจะปล่อย hydrolytic enzymes มำทำลำยเซลล์ดังกล่ำว ซึ่ง ประกอบด้วย circulating and sessile haemocytes (Hillyer and Strand, 2014) สำหรับหน้ำที่นั้น haemocytes ที่เก่ียวข้องกับ phagocytose คือ granulocytes พบใน Hemiptera and mosquitoes, Lepidoptera, plasmatocytes of fruit flies (Hillyer and Strand, 2014) กระบวนกำร Phagocytosis เป็นกำรกระตุ้นท่ีรวดเร็วในยุง circulating and sessile haemocytes เร่ิมภำยในวินำทีที่เช้ือเดินทำงเข้ำมำ (Sigle and Hillyer, 2016) และ tobacco hornworm haemocytes phagocytose เริ่มกำจัดแบคทีเรียจำนวนมำก ซ่ึงแตกต่ำงกับกระบวนกำร melanization ซ่ึงใช้ระยะเวลำในกำรกำจัดเช้ือโรคยำวนำนกว่ำ ในปี 1884 Metsohnikoff ได้ศึกษำใน เซลล์พวก crustacean Daphnia ได้โอบล้อมเชื้อรำ Blastomyces bicuspidate เขำเรียกเซลล์ที่โอบ ล้อมว่ำ phagocytes และเรียกกระบวนกำรนี้ว่ำ phagocytosis ยังเกิดข้ึนในสัตว์ชั้นสูง ซ่ึงเกิดจำกเชื้อ โพรโทซัวเข้ำทำลำย โดยในเซลล์สัตว์ช้ันสูงจะทำลำยโพรโทซัวเซ ลล์เดียวด้วยกระบวนกำร phagocytosis จะเกิดในส่วนของ epidermis, endocrine glands, tracheal epithelium, salivary glands, malpighian tubules, fat bodies, light organs และ muscles ซ่ึงเน้ือเย่ือดังกล่ำวนี้ทำกำร ตรวจจับอนุภำคภำยนอกโดยวิธีกำร phagocytosis แล้วกำจัดออกจำก haemolymph กระบวนกำร phagocytosis เป็นกำรกำจัดเชื้อโรคที่เข้ำทำลำยแมลง เช่น เชื้อไวรัส เช้ือรำ แบคทีเรีย รวมท้ังสำรพิษ ต่ำง ๆ (Shapiro, 1979) ในส่วนของ endocytosis ได้ถูกนำมำเป็นส่วนหน่ึงของกระบวนกำร phagocytosis และ pinocytosis (Crossley, 1975) endocytosis เป็นกระบ วนกำรซึ่งพ ลำสมำเมม เบ รนโอบล้อม (infolded) เชอ้ื โรคไว้ และทำลำยในทส่ี ุด Phagocytosis มีส่วนช่วยในกระบวนกำรทำงสัณฐำนวิทยำที่จะต้ำนทำนกับเชื้อโรคโดยท่ี กระบวนกำร phagocytosis จะทำให้เกิดกำรแบ่งตัวของเซลล์ในช่วงที่แมลงเกิดกำรลอกครำบ กระบวนกำร phagocytosis หรือ phagocytic cells ในแมลงบำงครั้งจะเรียกว่ำ arthrocytes ซ่ึง mesodermal cells สำมำรถจับกับสิ่งแปลกปลอมท่ีเข้ำสู่ร่ำงกำยของแมลง (Jones, 1977) จะรวมถึง ระบบกำรไหลเวียนของเลือดหรือเนื้อเยื่อที่เกี่ยวกับกระบวนกำร phagocytic arthrocytes มีหลำยช่ือท่ี รู้จักกันดี ส่วนท่ีอยู่ในส่วนหัวของแมลงจะเรียกว่ำ cephalic nephrocytes ส่วนท่ีอยู่ในส่วนท้ำยของ

ควำมต้ำนทำนของแมลงอำศยั 237 ลำตัวแมลง บริเวณท่อขับถ่ำยจะเรียกว่ำ pericardial cells และในส่วนที่อยู่ในบริเวณท่ออำหำร (esophagus) จะเรียกว่ำ garland cells นอกจำกนี้ยังแบ่ง arthrocytes ออกเป็น 3 กลุ่มใหญ่ ๆ ข้ึนอยู่ กับตำแหน่งทีต่ ้งั ในแมลง 1. dorsal (pericardial cells, endocardial cells, cells within phagocytic organs) 2. ventral (subesopphageal body cells of the embryo, garland cells of postembryonic insects, cephalic nephrocytes) 3. circulating or temporary sessile arthrocytes (haemocytes) ซึง่ กระบวนกำรของ phagocytosis จะมีข้ันตอนกำรทำงำนดังนี้ 1. เลือกจำ (recognite) ส่ิงแปลกปลอมท่ีเข้ำมำในแมลง ถึงแม้ว่ำขบวนกำรต่ำง ๆ ในเลือดจะ ยังคงไม่รู้จักส่ิงแปลกปลอมก็ตำม แต่มีหลักฐำนว่ำ Lectins เป็นสำรที่มีบทบำทในกำรจดจำโมเลกุลของ ส่งิ แปลกปลอม 2. กระบวนกำรทำงเคมีหรือท่ีเรียกว่ำ chaemotactic attraction เม่ือเลือดได้จับกับสิ่ง แปลกปลอม 3. เม่ือสง่ิ แปลกปลอมได้จบั กบั cell surface 4. เกิดกำรย่อยเมอื่ pseudopodia ไดเ้ ขำ้ ไปลอ้ มรอบสิ่งแปลกปลอมนน้ั 5. degranulation จำก granules (lysosomes) จะปล่อยเอนไซม์ออกมำยอ่ ย 6. เกิดกระบวนกำรย่อยข้ึนและหำก particles ท่ีไม่สำมำรถย่อยได้จะถูกปลดปล่อยออกมำโดย กระบวนกำร exocytosis ซึ่งกระบวนกำรที่ 1 และ 2 ค่อยข้ำงจะไม่ค่อยเกิดขึ้น แต่กระบวนกำรท่ี 3 ถึง 6 จะพบได้ทั่ว ๆ ไปในกำรศึกษำ กำรเพำะเลีย้ งเซลลข์ องแมลง Melanization กระบวนกำร melanization เร่ิมจำก (ภำพท่ี10-6) เมื่อเช้ือโรคเข้ำสู่ช่องวำ่ งภำยในลำตัว จะถูก จ ด จ ำโด ย pattern recognition receptors (PRRs) เช่ น ß-1,3 glucan recognition receptors (ßGPPs), C-type lectins (CTL) แ ล ะ Gram-negative binding proteins (GNBP) (Matskevich, 2010; Wang, 2014b) แ ล้ วส่ งต่ อ ม ำยั ง serine protease cascade แ ล้ ว ถู ก ก ระตุ้ น ด้ ว ย pro- phenoloxidase activating enzymes (Pro-PPAE) ทำให้เปล่ียนรูปร่ำงเป็น phenoloxidase (PO) (An et al., 2011, 2009) ซ่ึง PO จะเปน็ ตัวกำรทำให้ Tyrosine อยู่ในรูปของ Dopa แล้ว Dopa จะแบ่ง ปฏิกิริยำเป็น 2 ส่วน คู่ขนำนกัน ส่วนแรก Dopa จะถูก oxidized โดยเอนไซม์ phenoloxidase (PO) ทำให้ Dopa เปล่ียนรูปเป็น dopaquinone แล้วเปล่ียนรูปแบบอีกคร้ังไปเป็น Dopachrome (Christensen et al., 2005) Dopachrome จะไปรวมกับน้ำย่อยท่ีมีช่ือว่ำ dopachrome conversion enzyme ทำให้ Dopachrome ไปอยู่ในรูปของ 5,6-dihydroxyindole ส่วนปฏิกิริยำท่ีสอง ต้ังต้นตั้งแต่ Dopa ถูกเอนไซม์ dopa decarboxylase (DDC) ย่อยด้วยกระบวนกำร hydroxylates เปลี่ยนรูปเป็น

ควำมตำ้ นทำนของแมลงอำศัย 238 dopamine แล้วรวมตัวกับเอนไซม์ PO เปลี่ยนรูปแบบอีก 2 คร้ัง คือ Dopaminequinone และ Dopaminechrome ตำมลำดับ แล้วผ่ำนเข้ำไปในปฏิกิริยำแรกเป็น 5, 6-dihydroxyindole ต่อจำกน้ัน ถูก oxidize โดย PO มำอยู่ในรปู แบบ indole-5,6-quinone จำกนัน้ โปรตีนในน้ำเลือดแมลงทำปฏิกิริยำ กับ indole-5,6-quinone จนเกิดเป็น melanization ที่สมบูรณ์แบบ ทำให้เช้ือโรคหรือส่ิงแปลกปลอม ถูกกำจัดเป็นจุดสีน้ำตำลดำ อัตรำกำรเกิดกระบวนกำร melanization ข้ึนอยู่กับ Tyrosine ซึ่งเป็นสำร ต้ังต้นของ Dopa Tyosine ได้จำกกำร phenylalanine ถูกกระบวนกำร hydroxylation กับเอนไซม์ phenylalanine hydroxylase เอนไซม์ต่ำง ๆ และ PRRs ที่มำประกอบตัวกันเพ่ือทำให้เกดิ กำร melanization ถูกสร้ำงมำจำก haemocytes และ oenocytoids หรือที่เรียกอีกชื่อหนึ่งว่ำ crystal cells เป็นเน้ือเยื่อหลักท่ีผลิต pro- phenoloxidase (Ashida et al., 1988; Hillyer et al., 2003a) เช้ือโรคท่ีมีขนำดเล็ก เช่น เซลล์ของ แบคทีเรียจะถูกกำจัดโดยกระบวนกำร melanization และ phagocytosis ส่วนสิ่งแปลกปลอมท่ีเข้ำสู่ ระบบไหลเวียนเลือดในแมลง ที่มีขนำดของอนุภำคขนำดใหญ่ จะถูกกำจัดโดยกระบวนกำร encapsulate (Hillyer et al., 2003a,b) โปรตีนหลำยชนิดที่ มีส่วนเก่ียวข้องกับกระบวนกำร melanization ได้แก่ โปรตีน phenoloxidases รูปแบบต่ำง ๆ ในแมลงหว่ี D. melanogaster PPO1 และ PPO2 มีส่วนสำคัญในกำรสร้ำงสำรออกมำต่อต้ำนเชื้อแบคทีเรีย และนอกจำกนี้ PPO2 และ PPO3 ทำให้เกิดขบวนกำร encapsulation (Dudzic et al., 2015) โปรตีน Po-PO I ในแมลง Armigeres subalbatus มีส่วนสำคัญในกำรทำให้เกิด melanization เพื่อ filarial worms เข้ำทำลำย ในขณะที่ Pro-PO III ทำให้เกิดกำรสร้ำงผนังลำตัวของแมลงชนิดน้ี อนุพันธ์ของโปรตีน Pro-PO V มีส่วนทำให้เกิด melanization และกำรทำให้ผนังของช้ันเปลือกไข่ของแตนเบียนมีสีน้ำตำล และตำยในที่สุด (Shiao et al., 2001; Tsao et al., 2015

ควำมตำ้ นทำนของแมลงอำศัย 239 ภำพท่ี10-6 กระบวนกำรทำงชีวเคมีในกำรกำจดั สิง่ แปลกปลอมของ Melanization (Hillyer, 2016)

ควำมต้ำนทำนของแมลงอำศยั 240 Melanization หมำยถึง กำรปลอ่ ยสำรเคมีท่มี ีสคี ล้ำออกมำลอ้ มรอบบำดแผลหรือเข้ำทำลำยเชื้อ โรค ทำให้เซลล์แปลกปลอมถูกทำลำย โดยกำรทำให้เซลล์ดังกล่ำวเส่ือมสภำพลง ข้ันตอนดังกล่ำวของ melanization แบ่งออกเปน็ 3 ขัน้ ตอน คือ ขั้นตอนแรกกระตุ้นให้หลั่งสำร phenoloxidase cascade ซ่ึงข้ันตอนนี้เกิดขึ้นอย่ำงรวดเร็ว ขณ ะท่ีมีกำรติดเชื้อ (Royet, 2004b) ปัจจุบัน พบว่ำ phenoloxidases มีอย่ำงน้อย 6 ชนิด (Christensen et al., 2005) ขั้นตอนที่สอง ของกระบวนกำรน้ีจะเรียกว่ำ proliferation and physical alterations of haemocytes โดยจะเข้ำไปจับกับ receptors ของสิ่งแปลกปลอม เพ่ิมจำนวนและสร้ำงผนัง multicellular sheath ห่อหมุ้ สิ่งแปลกปลอมดงั กล่ำว ข้ันตอนสุดท้ำย คือ กำรผลิตสำรพิษ ออกมำทำลำยส่ิงแปลกปลอมที่มีช่ือว่ำ ROIs (O2, H2O2), RNIs (NO), quinones, hydroquinones (Lavine and Strand, 2002; Christensen et al., 2005; Carton et al., 2002) Phenoloxidases เป็น zymogen พบในเลือดของแมลง และจะพบ phenoloxidase ได้เมื่อแมลงเกิดบำดแผลและเกิดกำรติดเช้ือ ซ่ึงเป็นส่วนของ innate immune เอนไซม์นจ้ี ะเหมือนกบั เอนไซม์ tyrosinases ในสัตว์เลีย้ งลกู ด้วยนม ซ่ึงเอนไซมน์ ้ีตอ้ งใช้ copper อะตอม โดยมีออกซิเจน เป็ นตัวตั้งต้น โดยเอนไซม์นี้จะท ำให้ hydroxylate ซ่ึง quinones อยู่ในรูป dihydroxyphenylalanine และทำให้ oxidize o – diphenols อยู่ในรูป quinones ซึ่ง quinones นี้ จะถูกสร้ำงมำจำก melanin ซ่ึง melanin จะพบได้ในผนังล้อมรอบของ encapsulated parasites, haemocytes nodules และในบำดแผล นอกจำกน้ียังช่วยยับยั้งไม่ให้เชื้อโรคแพร่กระจำยไปยัง ส่วนตำ่ ง ๆ Encapsulation กระบวนกำร encapsulation เป็น cellular immune โดยท่ัว ๆ ไปจะเกิดข้ึนเมื่อมีสิ่ง แปลกปลอมหรือเชื้อโรคหรือ parasite มีขนำดใหญ่ เช่น พวกแมลงเบียนต่ำง ๆ (parasitoids) และ ไส้เดือนฝอย (nematodes) เนื่องจำกอนุภำคท่ีใหญ่กว่ำที่กระบวนกำร phagocytosis จะทำกำรกำจัด ได้ ระบบเลือดท่ีจะเข้ำมำล้อมรอบสิ่งแปลกปลอมนั้นส่วนใหญ่จะเป็นชนิด plasmatocytes (Tembhare, 2016) หลังจำกน้ันก็จะปล่อยสำรสีดำออกมำท่ีเรียกว่ำ เมลำนิน แล้วทำให้เกิด เป็นถุงข้ึนมำที่เรียกว่ำ capsule กระบวนกำร encapsulation ในแมลง Lepidopteran เกิดได้ 2 กระบวนกำร คือ กระบวนกำรแรกเม็ดเลือด (granulocytes และ coagulocytes) จะเข้ำมำล้อมรอบสิ่ง แปลกปลอมนั้น กระบวนกำรท่ี 2 เลอื ดจะทำกำรย่อยและปลดปล่อยสำรต่ำง ๆ ออกมำจำกเลือดเพื่อจับ กับส่ิงแปลกปลอมนั้นที่เรียกว่ำ capsules capsules นั้นจะแบ่งออกเป็น 2 ส่วน คือ cellular capsule และ sheath capsule สำหรับ cellular capsule ประกอบไปด้วย เซลล์ของเม็ดเลือดประมำณ 50 เซลล์ หรือมำกกว่ำน้ัน ส่วน sheath capsules จะเกิดขึ้นเม่ือถูกห่อหุ้มด้วยช้ันของเลือดเพียงบำง ๆ นอกจำกน้ียังมเี มลำนินเกิดข้นึ ชนดิ ของเมลำนินน้ีจะแตกตำ่ งขึ้นอยู่กับชนดิ ของแมลง (Hillyer, 2016) ใน แมลงกระบวนกำร encapsulation จะพบมำกเมื่อเซลลแ์ มลง ทำลำยพวกไขข่ องตัวเบียน (parasitoid)

ควำมต้ำนทำนของแมลงอำศัย 241 Nodulation nodules จะเกิดข้ึนเมื่อเช้ือโรคท่ีเข้ำทำลำยแมลงมีควำมเข้มข้นสูง หรือมีเช้ือจำนวนมำก เข้ำสู่ระบบเลือดของแมลง ซ่ึงระบบน้ีจะเกิดข้ึนได้อย่ำงรวดเร็วภำยใน 24 ชั่วโมงของกำรเข้ำทำลำยเชื้อ แบคทีเรียจำนวนมำก มีกำรต้ังข้อสมมติฐำนสำหรับกำรเกิด nodules ประกำรแรก ได้แก่ เช้ือที่เข้ำทำลำยจะถูกจดจำโดยโมเลกุลจำเพำะที่อยู่ภำยในเลือดแมลง เช่น PGRPs, LPs แล้ว เข้ำล้อมรอบส่ิงแปลกปลอมนั้น และปล่อยสำรประเภท flocculent material ออกมำจับทำลำย เชื้อโรค หลังจำกนน้ั กระบวนกำร melanization จึงเกิดข้ึนต่อ (Satyavathi et al., 2014) บำงกรณีอำจ เกิด encapsulation ดังภำพที่ 10-7 ตัวอย่ำงของ nodulation ที่พบในแมลง ได้แก่ ไส้เดือนฝอย Abbreviata caucasica เจำะเข้ำไปในผนังลำไส้ของแมลงสำบ Dlattella germanica แล้วปลดปล่อย เช้ือแบคทีเรียที่อยู่ภำยในลำไส้ ออกมำทำลำยแมลง ซึ่งจะถูกปิดล้อมโดย giant cells ของแมลงสำบ ใน ตั๊กแตนและแมลงสำบ ส่วนใหญ่จะเกิดเป็นจุดเล็ก ๆ และเพิ่มขนำดข้ึนในผนังชั้นในสุดของกระเพำะของ แมลง nodules หรอื tumors นจ้ี ะเกิดข้นึ เมื่อมีไวรัสเขำ้ ทำลำย หรือพวกเชอื้ ไมโครพลำสมำ ภำพท1ี่ 0-7 กระบวนกำรตอ่ ต้ำนสิง่ แปลกปลอมของเซลลใ์ นแมลงของวิธี nodule และ encapsulation (Santoyo and Aguilar, 2011). Lysis Lysozymes เป็นโปรตีนอีก family หน่ึงที่มีสมบัติในกำรช่วยย่อยหรือกำจัดเช้ือโรค โดยเฉพำะ เชอื้ แบคทีเรีย (Elmogy et al., 2015; Kwon et al., 2014b) นอกจำกน้ี Lysozymes ยังกำจัดเช้ือชนิด อื่น ๆ ด้วย เช่น anti-Plasmodium ซึ่งเป็นเชื้อโพรโทซัว หรือต่อต้ำนเชื้อรำ (Kajla et al., 2011; Sowa-Jasilek et al., 2014) นอกจำกน้ี Lysozymes ยังมีส่วนเกี่ยวข้องกับ phenoloxidase ใน กระบวนกำร melanization (Li and Paskewitz, 2006; Rao et al., 2010) Lysozymes ในแมลงผลิต

ควำมตำ้ นทำนของแมลงอำศัย 242 มำจำกในส่วนทำงเดินอำหำร และ dual oxidase ซ่ึงก่อให้เกิด hydrogen peroxidase ซ่ึงมีสมบัติใน กำรต่อต้ำนเชื้อแบคทีเรียในทำงเดินอำหำรของแมลงวันผลไม้ (Ha et al., 2005) และในยุงนั้น กระบวนกำร oxidation ของ L-Arginine ไปเป็น L-Citrulline ทำให้เกิดกรด nitric oxide ซ่ึงสำมำรถ ยับย้ังกำรเจริญของเช้ือโพรโทซัว Plasmodium ในทำงเดินอำหำรของแมลงในกลุ่มยุงได้ (Hughes, 2008; Gupta et al., 2009 ) นอกจำกน้ีในช่องว่ำงภำยในลำตัวแมลง ยังมีกลุ่มเซลล์ที่ผลิตสำรต้ำนทำน เช้ือโรคต่ำง ๆ ท่ีเข้ำบุกรุกเซลล์ดังกล่ำว ได้แก่ haemocytes สำรต้ำนทำนเช้ือโรคท่ีพบ ได้แก่ nitric oxide ซ่ึงมีหน้ำท่ีเป็นท้ังโมเลกุลที่เคลื่อนที่ไปเพ่ือดักจับเช้ือโรค เคลื่อนไปกับระบบเลือดไหลเวียนทั่ว ลำตัวแมลง และยังมีหน้ำที่เป็นระบบภูมิคุ้มกันในแมลงอีกด้วย โดยเฉพำะหน้ำที่ antibacterial (Hillyer and Estevez-Lao, 2010; Nappi et al., 2000) กำรทำลำยเช้ือโรคโดยผ่ำนกระบวนกำรท่ีเรียกว่ำ lysis ส่วนใหญ่แล้วจะเป็น antimicrobial peptides (AMPs) เป็นโปรตีนที่มีขนำด 2-20 KDa มีกำรศึกษำในห้องปฏิบัติกำร ว่ำสำมำรถยับยั้งกำร เจริญของเช้ือโรคได้ (Hoffmann, 1990; Vizioli et al., 2001) จำกข้อมูลทำงด้ำนโครงสร้ำงและข้อมูล sequence สำมำรถจำแนก AMPs ออกเป็น 4 กลุ่ม ซ่ึงแมลงแต่ละอันดับมี AMPs แตกต่ำงกัน (He et al., 2015; Imler, 2014; Yi et al., 2014) กล่มุ ท่ี 1 Dedensin and Defensin-like peptides เปน็ Cysteine-rich peptides มี AMPs ได้แก่ Dedensin, Drosomycin, Holiricin และ Sapecin others กลุ่มที่ 2 Cecropin and cecropin-like peptides เปน็ 2-helical peptides ชนดิ ของ AMPs ไดแ้ ก่ Moricins กล่มุ ที่ 3 Attacin เป็น Glycine-rich peptides ชนดิ ของ AMPs คอื Attacin และ Gloverins กลมุ่ ที่ 4 Lebocins เป็น proline -rich peptides AMPs ได้แก่ Drosocin และ Metchnikowin RNA interference RNAi กำรยับย้ังกำรแสดงออกของยีนที่ระดับอำร์เอ็นเอ (RNA interference หรือ RNAi) เป็น กระบวนกำรยับยัง้ กำรทำงำนของยีนโดยกำรแทรกแซงอำร์เอ็นเอ (RNA) ด้วยอำร์เอ็นเอสำยคู่ (double- stranded RNA; dsRNA) ท่ีมีควำมจำเพำะเจำะจง แล้วส่งผลให้สำย mRNA เหล่ำน้ันถูกทำลำยและหยุด กำรสรำ้ งโปรตนี ในทสี่ ดุ กระบวนกำรน้ถี กู ค้นพบเมือ่ ปี พ.ศ. 2541 โดยนกั วิทยำศำสตร์สองท่ำน คอื Prof. Dr. Andrew Z. Fire จำกมหำวิทยำลัยสแตนฟอร์ด ในมลรัฐแคลิฟอร์เนีย และ Prof. Dr. Craig Mello จำกโรงเรียนแพทย์แห่งมหำวิทยำลัยแมสซำชูเซตต์ ของสหรัฐอเมริกำ และท้ัง 2 ท่ำนได้รับรำงวัลโนเบล สำขำกำรแพทย์และสรีรวิทยำในปี พ.ศ. 2549 นักวิทยำศำสตร์ได้ใช้ประโยชน์ของ RNAi มำประยุกต์ใช้ ในศึกษำโครงสร้ำงของยนี ต่ำง ๆ ในแมลงเพ่อื ประโยชน์ในกำรควบคุมและจัดกำรแมลงศัตรู นอกจำกนี้ยัง ป้องกันกำรเข้ำทำลำยของไวรัสได้อีกทำงหนึ่งด้วย (Scott et al., 2013; Blair and Olson, 2014; Bronkhorst and van Rij, 2014; Karlikow et al., 2014; Sim et al., 2014)

ควำมตำ้ นทำนของแมลงอำศัย 243 กลไกกำรทำงำนของ RNAi (ภำพท่ี 10-8) เริ่มต้นจำกกำรที่อำร์เอ็นเอสำยคู่ท่ีได้จำก กำรสังเครำะห์ข้ึนอย่ำงจำเพำะเจำะจงต่อสำย mRNA เป้ำหมำยถูกนำส่งเข้ำไปภำยในเซลล์ แล้วถูกตัดโดยเอนไซม์ ribonuclease ท่ีมีช่ือว่ำ Dicer-2 (Dcr2) ซ่ึงทำงำนประสำนกับ R2D2 ทำให้ได้อำร์เอ็นเอสำยคู่ขนำดส้ันมีขนำด 21 นิวคลีโอไทด์ เรียกว่ำ small interfering RNAs (siRNAs) จำกน้ัน siRNAs เหล่ำน้ีจะถูกแยกสำยออกจำกกันและรวมตัวกับโปรตีนหลำยชนิดเกิดเป็นสำรประกอบ เชิงซ้อนขนำดใหญ่ เรียกว่ำ pre-RNA-induced silencing complexes (RISC) จะมีองค์ประกอบของ Argonaute-2 (Ago2) รวมอยู่ดว้ ย สำยหน่ึงของอำรเ์ อ็นเอสำยคู่ จะถูกย่อยออกไป ส่วนทเ่ี หลอื จะไปจับคู่ กับ virus RNA โดยสำรประกอบเชิงซ้อนนี้จะทำหน้ำที่ตรวจจับสำย mRNA เป้ำหมำยแล้วย่อยสำย mRNA เหล่ำนั้นให้มีขนำดเล็กลงโดยเอนไซม์ endonuclease ท่ีอยู่ภำยใน RISC ทำให้เกิดกำรสลำยตัว ของสำย mRNA เป้ำหมำยซึ่งเป็นโมเลกุลสำคัญในกำรนำรหัสพันธุกรรมจำกดีเอ็นเอเพื่อสังเครำะห์ โปรตีน ซึ่งส่งผลให้เกิดกำรยับย้ังกระบวนกำรแสดงออกของยีน และกำรยับย้ังกำรสร้ำงโปรตีนเป้ำหมำย ภำยในเซลล์ (อัจฉรำ ศรีสดใส, 2550; Hillyer, 2016) ซ่ึงเรียกกระบวนกำรน้ีว่ำ post-transcriptional gene silencing หรือ gene silencing กระบวน กำรดังกล่ำว เป็นกระบวนกำรที่สำคัญในกำรต้ำนเชื้อ ไวรัส (Sabin el al., 2010)

ควำมต้ำนทำนของแมลงอำศัย 244 ภำพท1ี่ 0-8 กระบวนกำรยับยั้งกำรแสดงออกของยีนทรี่ ะดับอำร์เอน็ เอ (Hillyer, 2016) Autophagy Autophagy เป็นกลไกกำรกินตัวเองของเซลล์ หรือกำรกำจัดเซลล์ท่ีเส่ือมสภำพ เป็น กระบวนกำรฟื้นฟูทำงธรรมชำติ ท่ีเกิดข้ึนในระดับเซลล์ในร่ำงกำย เกิดข้ึนท้ังในส่ิงมีชีวิตทั้งสัตว์มีกระดูก สันหลังช้ันสูงและสัตว์ไม่มีกระดูกสันหลัง (Lamiable and Imler, 2014; Moy and Cherry, 2013; Shibutani et al., 2015) กลไกน้ีเป็นกระบวนกำร ซึ่งเซลล์สลำยตัวและเริ่มนำส่วนประกอบของเซลล์ กลับมำใช้ใหม่ และยังช่วยให้พลังงำนและสร้ำงพ้ืนท่ีสำหรับใช้ในกำรฟื้นฟูเซลล์ข้ึนมำใหม่ นอกจำกน้ียัง กำจัดโปรตีนและออร์แกเนลล์ท่ีเสียหำย ช่วยลดโอกำสในกำรเกิดโรคบำงอย่ำงลงได้ รวมทั้งทำให้มีอำยุ ยืนข้ึนด้วย ในปี 2016 นักวิทยำศำสตร์ชำวญ่ีปุ่น Professor Yoshinori Ohsumi ได้ศึกษำกระบวนกำร

ควำมตำ้ นทำนของแมลงอำศยั 245 ต่ำง ๆ จำกยีนท่ีเก่ียวข้องกับ Autophagy ในยีสต์ ได้รับรำงวัลโนเบลสำขำกำรแพทย์จำกกำรค้นพบ เกย่ี วกับกลไกกำรกินตัวเองของเซลล์ ทำใหม้ ีควำมเขำ้ ใจเกยี่ วกบั โรคตำ่ ง ๆ ในมนุษยไ์ ด้ดขี ้นึ เชน่ โรคพำร์ กินสัน และโรคสมองเส่ือม กลไกกำรกินตัวเองของเซลล์สำมำรถทำลำยแบคทีเรียและไวรัสต่ำง ๆ ที่เข้ำ ทำลำยร่ำงกำยได้ เรียกว่ำ Xenophagy (Levine, 2005; Sabin et al., 2010) สำหรับกำรทำงำนของ Autophagy ในระดับโมเลกลุ นัน้ เริ่มจำกกำรทำงำนของปฏิกริ ิยำ Toll-7 ใน plasma membrane และ มีหลำยกระบวนกำรต่ำง ๆ เข้ำร่วมกล่ำวคือ phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)-Akt pathway และ target of rapamycin (TOR) ในข้ัน ตอนของ TOR มีโปรตีนหลำยชนิดเข้ำมำร่วม เช่น Protein kinase Atg1 และ phosphoprotein Atg13 ทำให้เกิดกำรทำลำยนิวเคลียสของเซลล์ท่ีถูกกำจัด อีก หลำยรอบ จน กระทั่งเสื่อมสภ ำพ ลง กระบ วน กำรดำ เนิ นต่อไป จน Atg5/Atg12 ไป จับกับ phosphatidylethanolamine อยู่ในรูปของ Atg8 แล้วไปรวมกับ lysosomes เพื่อทำกำรกำจัดออกไป (Amano et al., 2006) ในกำรศึกษำ Autophagy ในแมลงหว่ี Drosophila พบว่ำกระบวนกำรทำลำย เกิดข้ึนเมื่อมีกำรเข้ำทำลำยของ vesicular stomatitis virus และ Rift Valley fever virus ซ่ึงเป็นโรค ไวรัสที่พบในสัตว์พวก วัว ควำย แพะ แกะ สำมำรถนำเชื้อมำสู่มนุษย์ได้โดยมียุงเป็นพำหะ (Moy et al., 2014; Shelly et al., 2009) Apoptosis โปรแกรมกำรตำยของเซลล์ เป็นโปรแกรมท่ีทำงำนประสำนกันเพื่อควบคุมรูปแบบกำรตำยของ เซลล์ทำงพันธุกรรม โดยปกติส่ิงท่ีมีชีวิตประกอบด้วยเซลล์ต่ำง ๆ มำกมำยหลำยล้ำน ๆ เซลล์ อัตรำกำร สร้ำงเซลล์ใหม่จะเท่ำกับอัตรำกำรตำยของเซลล์ เพ่ือรักษำขนำดให้คงท่ี เม่ือมีอำยุมำกข้ึนจะมีเซลล์ท่ีถูก ทำลำย (damaged cell) โดยเม่ือเกดิ apoptosis เซลลจ์ ะเรมิ่ มกี ำรเปล่ยี นแปลงจำกเซลล์ปกติ โดยเซลล์ จะเกิดกำรหดตัวและมีกำรรวมตัวกันของ chromatin จำกนั้นจะเกิด nuclear fragment โดยสำย DNA จะถูกย่อยเป็นท่อนส้ัน ๆ โดย endonuclease ในขณะเดียวกันเซลล์จะค่อย ๆ เหี่ยวฝ่อลง (organ atrophy) หดตัวและห่อหุ้มเอำสำรต่ำง ๆ ภำยในเซลล์ไว้ แล้วรวมตัวกันกลำยเป็นก้อน เรียกว่ำ apoptotic body จำกนั้นจะเกิดกำรสลำยตัวหรือถูกจับกินโดย phagocyte หรือ macrophage ซ่ึงจะ ไม่เกิดปฏิกิรยิ ำกำรอกั เสบของเซลล์หรือเนื้อเยื่อที่อยู่ขำ้ งเคียง สำหรับกลไกกำรเกิด apoptosis น้ัน มีอยู่ 2 pathways ได้แก่ mitocondrial pathway และ death receptor pathway โดยอำศัยกำรทำงำน อย่ำงเป็นข้ันตอนของ cysteine protease ที่มีช่ือว่ำ caspase โดย caspase นั้นเดิมจะอยู่ในสภำพที่ไม่ ทำงำน (inactive) เรียกว่ำ procaspase เม่ือมีสัญญำณกำรเกดิ apoptosis เกิดขนึ้ procaspase จะเร่ิม ทำงำน หำกกระบวนกำรของส่ิงมีชีวิตไม่เกิด apoptosis ขึ้นทำให้มีเซลล์ท่ีผิดปกติ (abnormal cell) เพ่ิมมำกขึ้น ซ่ึงจะไปรบกวนกำรทำหน้ำท่ีของอวัยวะปกติ จึงต้องกำจัดเซลล์ที่ตำยหรือผิดปกติออก อย่ำงไรก็ตำม กำรตำยของเซลล์โดยปกติไม่ได้เป็นกระบวนกำรแบบสุ่ม (random process) แต่จะมี โปรแกรมกำรตำยของเซลล์ ซึ่งมีควำมสำคัญสำหรบั กำรฝ่อตัวของอวยั วะ (organ atrophy) ระหว่ำงกำร เกิดโรค ซงึ่ ทำให้จำนวนเซลล์ลดลง (พเิ ชษฐ์ เกียรตพิ รศักดำ, 2553 )

ควำมตำ้ นทำนของแมลงอำศยั 246 สำหรับ apoptosis ในแมลงพวกหนอนผีเส้ือ จะเกิดกำรตำยของเซลล์ขึ้น ในตำแหน่งท่ีถูกเช้ือ baculoviruses เข้ำทำลำย (Clem, 2007) ในยุงนั้น เกิดขึ้นเม่ือ West Nile Virus และ Sindbis virus เข้ำทำลำยขณะเป็นลูกน้ำยุง (Vaidyanathan and Scott, 2006; Wang et al., 2012) ในแมลงหวี่ D. melanogaster นั้นใช้ Drosophila S2 cells culture ทดลองโดยกำรให้เชื้อไวรัส Drosophila C virus (DCV) เพ่ือกระตุ้นให้เกิด apoptotic cell death เม่ือไวรัสเข้ำทำลำย พบว่ำ เกิดกระบวนกำร phagocytes ใน S2 cell cultures และ ลดกำรเพิ่มจำนวนของอนุภำคไวรัส นอกจำกนี้ยังทดลองในตัว ของแมลงหว่ี (in vivo) โดยกำรฉีดเช้ือไวรัส DCV เข้ำภำยในลำตัว แล้ววัดพำรำมิเตอร์ต่ำง ๆ ผลกำร ทดลองสรุปว่ำ apoptosis-dependent, phosphatidylserine-mediated phagocytosis เป็นระบบ ภูมิคมุ้ กนั ข้นั พืน้ ฐำนท่ตี ่อตำ้ นกำรเขำ้ ทำลำยของเชื้อไวรสั (Nainu et al., 2015) 10.8 สรุป สำหรบั กำรคัดเลือกสำยพันธขุ์ องแมลงให้ต้ำนทำนต่อเชื้อสำเหตุโดยท่ัวไปจะคัดเลือกโดยกำรให้ เช้ือดังกลำ่ วกับกลุ่มของประชำกรแมลงแล้วเลือกเอำตัวท่ีรอดชีวติ ออกมำผสมพันธ์ุกันตอ่ ยกตัวอย่ำงเช่น ในแมลงวันบ้ำนสำมำรถต้ำนทำนต่อเช้ือ BT เม่ือทำกำรคัดเลือกสำยพันธ์ุไปท่ี 27-50 วงจรชีวิต (generation) สำหรับกระบวนกำรต้ำนทำนต่อเชื้อ BT นั้นมีรำยงำนว่ำ แมลงสำมำรถพัฒนำควำม ต้ำนทำนต่อสำรชีวภัณฑ์ ซ่ึงมีกำรศึกษำในแมลงหลำย ๆ ชนิดเช่นหนอนใยผัก (diamonback moth) ลูกน้ำยุง แมลงในกลุ่มผีเส้ือต่ำง ๆ แมลงที่พัฒนำควำมต้ำนทำนต่อสำรเคมีจะมีวิวัฒนำกำรที่แตกต่ำงกัน กบั ควำมต้ำนทำนเช้ือสำเหตุโรคแมลงต่ำง ๆ ซึ่งท้ังนี้อำจจะเกิดเน่ืองจำกมีกำรใช้สำรเคมีอยำ่ งแพร่หลำย และต่อเน่ืองเมอ่ื เปรียบเทียบกับสำรชีวภัณฑน์ ัน้ มีกำรใชใ้ นวงท่จี ำกัด ปัจจัยท่ีทำให้แมลงสร้ำงควำมต้ำนทำน ได้แก่ อำยุของแมลงและช่วงชีวิต ปัจจัยทำงด้ำนธำตุ อำหำร ปัจจัยด้ำนสำรต้ำนจุลินทรีย์ ปัจจัยทำงฟิสิกส์ นอกจำกน้ี แมลงยังมีพฤติกรรมท่ีหลีกเล่ียงจำก เชื้อจุลินทรีย์ เช่น พฤติกรรมกำรหลีกเลี่ยง โดยทั่ว ๆ ไปส่ิงมีชีวิตจำพวกแมลงจะมีพฤติกรรมในกำรหลบ หลีกจำกกำรเข้ำทำลำยของเชื้อจุลินทรีย์ พฤติกรรมกำรทำควำมสะอำด พฤติกรรมน้ีส่วนใหญ่จะพบใน แมลงที่เป็นแมลงสังคม พฤติกรรมน้ีเรียกว่ำ Grooming เป็นพฤติกรรมที่กำจัดสปอร์หรือเชื้อโรคท่ีติดมำ กับผนังลำตัวแมลงเป็นพฤติกรรมกำรส่ันหรือสลัดร่ำงกำยทำให้สปอร์ท่ีติดอยู่หลุดออกจำกลำตัวก่อนท่ี สปอร์เหล่ำน้ันจะก่อให้เกิดโรคในแมลง ส่วนกำรป้องกันทำงด้ำนสัณฐำนวิทยำและกำยวิภำค ได้แก่ ผนัง ลำตัว ต่อมผลติ สำร ระบบหำยใจ และระบบย่อยอำหำร ระบบเลือดในแมลง ระบบภูมิคุ้มกันในแมลง เป็นระบบท่ีป้องกันแมลงจำกสิ่งแปลงปลอม ซ่ึงก็ คือเลือดของแมลง หรือ haemocytes เลือดหรือของเหลวในลำตัวของแมลงโดยท่ัวไปจะอยู่ประมำณ 10-40% ของน้ำหนักตัวแมลง ซึ่งจะประกอบไปด้วย 2 ส่วน คือ ส่วนท่ีเรียกว่ำ ของเหลวหรือพลำสมำ (noncellular) เป็นระบบภูมิคุ้มกันตำมธรรมชำติ ภูมิคุ้มกันน้ีเกิดขึ้นเริ่มแรกและเป็นระบบพื้นฐำนไม่ ยุ่งยำกซับซ้อน ส่วนประกอบทำงเคมีมีไม่มำกเมื่อเปรียบเทียบกับระบบ antibodies ในสัตว์มีกระดูก สันหลังช้ันสูง และส่วนทสี่ องเรียกว่ำ เซลล์เม็ดเลือดหรือ haemocytes ในส่วนของเลือดที่ขบวนกำรเพ่ิม จำนวนขน้ึ เรำเรียกวำ่ hemopoiesis

ควำมต้ำนทำนของแมลงอำศัย 247 กระบวนกำรต่ำง ๆ ในระบบภูมิคุ้มกันในแมลง ได้แก่ กำรกำจัดเช้ือโรค ประกอบไปด้วย กระบวนกำรต่ำง ๆ ดังน้ี phagocytosis, melanization, encapsulation, nodulation, lysis, RNAi- mediated virus destruction, autophagy และ apoptosis โดย Phagocytosis หมำยถึง กำรกลืน กิน ในกระบวนกำร phagocytosis เม็ดเลือดที่เรียกว่ำ granulocytes จะเข้ำไปจับกับอนุภำคของส่ิง แปลกปลอม แล้วโอบล้อมเซลล์ และทำกำรกำจัด ในกระบวนกำรดังกล่ำว เช้ือโรคจะถูกตรึงอยู่กับ phagosome และปล่อยสำรท่ีเป็นพิษกับเชื้อโรคที่เรยี กว่ำ releases reactive oxygen intermediates (ROIs) และ reactive nitrogen intermediates (RNIs) (Lavine and Strand, 2002) ซึ่ง ROIs และ RNIs จะส่งสัญญำณไปยังระบบภูมิคุ้มกัน humoral ท่ีจะผลิต antimicrobial peptides ออกมำช่วย ทำลำยเชื้อโรคอีกทำงหนง่ึ ด้วย กระบวนกำร melanization เริ่มเมอื่ เช้ือโรคเขำ้ สชู่ ่องว่ำงภำยในลำตัว จะ ถูกจดจำโดย pattern recognition receptors (PRRs) เช่น ß-1,3 glucan recognition receptors (ßGPPs), C-type lectins (CTL) แ ล ะ Gram-negative binding proteins (GNBP) ก ระ บ ว น ก ำร encapsulation เป็น cellular immune โดยท่ัว ๆ ไปจะเกิดขึ้นเม่ือมีสิ่งแปลกปลอมหรือเชื้อโรคหรือ parasite มีขนำดใหญ่ เช่น พวกแมลงเบียนต่ำง ๆ และไส้เดือนฝอย เน่ืองจำกอนุภำคท่ีใหญ่กว่ำท่ี กระบวนกำร phagocytosis จะทำกำรกำจัดได้ ระบบเลือดท่ีจะเข้ำมำล้อมรอบสิ่งแปลกปลอมนั้น กระบวนกำร nodules จะเกิดขึ้นเม่ือเช้ือโรคที่เข้ำทำลำยแมลงมีควำมเข้มข้นสูง หรือมีเชื้อจำนวนมำก เข้ำสู่ระบบเลือดของแมลง ซึ่งระบบนี้จะเกิดข้ึนได้อย่ำงรวดเร็วภำยใน 24 ช่ัวโมงของกำรเข้ำทำลำย กระบวนกำร Lysis Lysozymes เป็นโปรตีนอีก family หนึ่งท่ีมีสมบัติในกำรช่วยย่อยหรือกำจัดเชื้อโรค โดยเฉพำะเช้ือแบคทีเรีย นอกจำกนี้ Lysozymes ยังกำจัดเช้ือชนิดอ่ืน ๆ ด้วย เช่น anti-Plasmodium ซง่ึ เป็นเชอื้ โพรโทซัว หรือต่อต้ำนเช้ือรำ ส่วน RNA interference (RNAi) กำรยับย้งั กำรแสดงออกของยีน ท่ีระดับอำร์เอ็นเอ (RNA interference หรือ RNAi) เป็นกระบวนกำรยับย้ังกำรทำงำนของยีนโดยกำร แทรกแซงอำร์เอ็นเอ (RNA) ด้วยอำร์เอ็นเอสำยคู่ (double-stranded RNA; dsRNA) ท่ีมีควำมจำเพำะ เจำะจง ทำให้สำย mRNA เหล่ำนั้นถูกทำลำยและหยุดกำรสร้ำงโปรตีนในที่สุด Autophagy เป็นกลไก กำรกินตัวเองของเซลล์ หรือกำรกำจัดเซลล์ท่ีเส่ือมสภำพ สุดท้ำยกระบวนกำร Apoptosis โปรแกรมกำร ตำยของเซลล์ เป็นโปรแกรมท่ีทำงำนประสำนกันเพ่ือควบคุมรูปแบบกำรตำยของเซลล์ทำงพันธุกรรม โดยปกติสิ่งที่มีชีวิตประกอบด้วยเซลล์ต่ำง ๆ มำกมำยหลำยล้ำน ๆ เซลล์ อัตรำกำรสร้ำงเซลล์ใหม่จะ เทำ่ กับอัตรำกำรตำยของเซลล์

ควำมต้ำนทำนของแมลงอำศยั 248 10.9 เอกสำรอำ้ งองิ อัจฉรำ ศรีสดใส. 2550. RNA interference : แนวทำงใหม่ในกำรรักษำโรค. คอลัมน์ : เวชภัณฑ์น่ำรู้ วำรสำรคลินกิ , 269 พิเชษฐ์ เกียรติพรศักดำ. 2553. ควำมเป็นพิษและกลไกกำรเหน่ียวนำกำรตำยแบบ apoptosis โดยสำร สกัดจำกเปลือกมังคุดในเซลล์มะเร็งต่อมลูกหมำก. ปริญญำนิพนธ์. บัณฑิตวิทยำลัย มหำวิทยำลัย ศรนี ครนิ ทรวโิ รฒ. 40 หนำ้ Adamo, S.A. 1998. The specificity of behavioral fever in the cricket Acheta domesticus. J. Parasitol. 84, 529-533. Aizawa, K. 1962. Antiviral substance in the gut-juice of the silkworm, Bombyx mori (Linnaeus). J. Insect Pathol. 4, 72-76. Alma, C.R., D.R. Gillespie, B.D. Roitberg and M.S. Goettel. 2010. Threat of infection and threat-avoidance behavior in the predator Dicyphus hesperus feeding on whitefly nymphs infected with an entomopathogen. J. Insect Behav. 23, 90-99. Anugs, T.A. 1956. The reaction certain lepidopterous and hymenopterous larvae to Bacillus sotto toxin. Can. Entomol. 88, 280-283. An, C., A. Budd, M.R. Kanost and K. Michel. 2011. Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes. Cell Mol. Life Sci. 68, 1929-1939. An, C., J. Ishibashi, E.J. Ragan, H. Jiang and M.R. Kanost. 2009. Functions of Manduca sexta haemolymph proteinases HP6 and HP8 in two innate immune pathways. J. Biol. Chem. 284, 19716-19726. Aruga, H. and H. Watanabe. 1964. Resistance to per os infection with cytoplasmicpolyhedrosis virus in the silkworm, Bombyx mori (Linnacus). J. Insect Pathol. 6, 387-394. Ashida, M., M. Ochiai and T. Niki. 1988. Immunolocalization of prophenoloxidase among haemocytes of the silkworm, Bombyx mori. Tissue Cell 20, 599-610. Bailey, L. 1965. Paralysis of the honey bee, Apis mellifera Linnacus. J. Invertebr. Pathol. 7, 132-140. Bailey, L. 1967. The effect of temperature on the pathogenicity of the fungus Ascosphacra apis for larvae of the honey bee, Apis mellifera, In “Proc. Int. Coll. Insect Pathol Microb. Contr.” (P. A. van der Laan, ed.). pp. 162-167, North-Holland. Amsterdam.

ควำมตำ้ นทำนของแมลงอำศัย 249 Bailey, L. 1969. The multiplication and spread of sacbrood virus of bees. Ann. Appl. Biol. 63, 483-491. Bailey, L. 1981. “Honey Bee Pathology.” Academic Press. London. Bedding, R.A. and A.S. Molyneux. 1982. Penetration of insect cuticle by infective juveniles of Heterorhabditis spp. (Heterorhabditidae : Nematoda). Nematologi ca. 28, 354-359. Bienvenu, R.J., F.W. Atchison and E.A. Cross. 1968. Microbial inhibition by prepupae of the alkali bee, Nomia melanderi. J. Invertebr. Pathol. 12, 278-282. Blair, C.D. and K.E. Olson. 2014. Mosquito immune responses to arbovirus infections. Curr. Opin. Insect Sci. 3, 22-29. Bogus, M.I., M. Czygier, M. Go1ebiowski, E. Kedra, J. Kucinska, J. Mazgajska, J. Samborski, W. Wieloch and E. W1óka. 2010. Effects of insect cuticular fatty acids on in vitro growth and pathogenicity of the entomopathogenic fungus Conidiobolus coronatus. Exp. Parasitol. 125, 400-408. Boman, H.G. and D. Hultmark. 1987. Cell-free immunity in insects. Annu.Rev. Microbiol. 41, 103-126. Bronkhorst, A.W. and R.P. van Rij. 2014. The long and short of antiviral defense : small RNA-based immunity in insects. Curr. Opin. Virol. 7, 19-28. Buchon, N., N.A. Broderick, M. Poidevin, S. Pradervand and B. Lemaitre. 2009. Drosophila intestinal response to bacterial infection : activation of host defense and stem cell proliferation. Cell Host Microbe. 5, 200-211. Buys, B. 1972. Nosema in brood. S. Afr. Bee J. 44, No. 6, 2-4. Carton, Y., F. Frey, D.W. Stanley, E. Vass and A.J. Nappi. 2002. Dexamethasone inhibition of the cellular immune response of Drosophila melanogaster against a parasitoid. J. Parasitol. 88, 405-407. Castillo, J.C., A.E. Robertson and M.R. Strand. 2006. Characterization of haemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 36, 891-903. Champlin, F.R., P.Y.K. Cheung, S. Pekrul, R. J. Smith, R.L. Burton and E.A. Grula. 1981. Virulence of Beauveria bassiana mutants for the pecan weevil. J. Econ. Entomol. 74, 617-621. Christensen, B.M., J. Li, C.C. Chen and A.J. Nappi. 2005. Melanization immune responses in mosquito vectors. Trends Parasitol. 21, 192-199.

ควำมตำ้ นทำนของแมลงอำศัย 250 Clark, T.B. 1980. A second microsporidian in the honeybee. J. Invertebr. Pathol. 35, 290-294. Clem, R.J., 2007. Baculoviruses and apoptosis : a diversity of genes and responses. Curr. Drug Targets. 8, 1069-1074. Costa-Leonardo, A.M., L.T. Laranjo, V. Janei and I. Haifig. 2013. The fat body of termites : functions and stored materials. J. Insect Physiol. 59, 577-587. Cremer, S., S.A. Armitage and P. Schmid-Hempel. 2007. Social immunity. Curr. Biol. 17, 693-702. Crossley, A.C. 1975. The cytophysiology of insect blood. In “Advances in Insect Physiology.” (J.E. Treherne, M.J. Berridge, and V.B. Wigglesworth, eds.). Vol. 11, pp. 117-221. Academic Press, New York. Debnath, L.R., P. Rajak and A. Kumar- Pal. 2017. The mechanisms of innate immunity in insects. B. N. Seal Journal of Science. 9, 146-159. Dillon, R.J. and A.K. Charnley. 1986. Inhibition of Metarhizium anisopliae by the gut bacterial flora of the desert locust, Schistocerca gregaria : Evidence for an antifungal toxin. J. Invertebr. Pathol. 47, 350-360. Dudzic, J.P., S. Kondo, R. Ueda, C.M. Bergman and B. Lemaitre. 2015. Drosophila innate immunity : regional and functional specialization of prophenoloxidases. BMC Biol. 13, 81-86. Dunphy, G.B. and G.S. Thurston. 1990. Insect immunity. In “Entomopathogenic Nematodes in Biological Control.” (R. Gaugler and H.K. Kaya, eds.). pp. 301-323 CRC Press. Boca Raton. Florida. Elmogy, M., T.T. Bassal, H.A. Yousef, M.A. Dorrah, A.A. Mohamed and B. Duvic. 2015. Isolation, characterization, kinetics, and enzymatic and nonenzymatic microbi cidal activities of a novel c-type lysozyme from plasma of Schistocerca grega ria (Orthoptera : Acrididae). J. Insect Sci. 15. Evans, J.D., K. Aronstein, Y.P. Chen, C. Hetru, J.-L. Imler, H. Jiang, M. Kanost, G.J. Thompson, Z. Zou and D. Hultmark. 2006. Immune pathways and defence mechanisms in honey bees Apis mellifera. Insect Mol. Biol. 15, 645-656. Evans, J.D. and M. Spivak. 2010. Socialized medicine : individual and communal disease barriers in honey bees. J. Invertebr. Pathol. 103, 62-72.

ควำมตำ้ นทำนของแมลงอำศยั 251 Evlakhova, A.A. and T.A Chekhourina. 1963. Antifungal action of the cuticle of Eurygaster integriceps Put. Dokl. Akad. Nauk SSSR. 148, 977-978. (English translation. 48, 199-201. Feir, D. 1979. Multiplication of haemocytes. In “Insect Haemocytes.” (A.P. Gupta, ed.). pp. 67-82. Cambridge University Cambridge. Fernández-Marŕn, H., J.K. Zimmerman, S.A. Rehner and W.T. Wcislo. 2006. Active use of the metapleural glands by ants in controlling fungal infection. Proc. R. Soc. B. 273, 1689-1695. Gaugler, R., J.F. Campbell and P. Gupta. 1991. Characterization and basis of enhanced host-finding in a genetically improved strain of Steinernema carpocapsae. J. Invertebr. Pathol. 57, 234-241. Gochnauer, T.A., R. Boch and V.J. Margetts. 1979. Inhibition of Ascrosplicera apis by citral and geraniol. J. Invertebr. Pathol. 34, 57-61. Grégoire, C. 1974. Haemolymph coagulation. In“The Physiology oInsecta.”(M.Rockstein, ed.), Second Ed. Vol. 5. pp. 309-360. Academic Press, New York. Gupta, A.P. 1985a. Cellular elements in the haemolymph. In “Comprehensive Insect Physiolgy Biochemistry and Pharmacology. Integument, Respiration and Circu lation.” (G.A. Kerkut and L.I. Gilbert, eds.), Vol.3, pp. 401-451. Pergamon Press, New York. Gupta, L., A. Molina-Cruz, S. Kumar, J. Rodrigues, R. Dixit, R.E. Zamora and C. Barillas- Mury. 2009. The STAT pathway mediates late-phase immunity against Plasmodium in the mosquito Anopheles gambiae. Cell Host Microbe. 5, 498-507. Hayashiya, K., J. Nishida and Y. Uchida. 1976a. The mechanism of formation of the red fuorescent protein in the digestive juice of silkworm larvae-the formation of chlorophyllidea. Jpn. J. Appl. Entomol. Zool. 20, 37-43. Hayashiya, K., Y. Uchida and J. Nishida. 1976b. Comparison of anti-viral activities of the silkworm larvae reared in light and in darkness in relation to the formation of red fluorescent protein (RFP). Jpm. J. Appl. Entomol. Zool. 20, 139-143. Ha, E.M., C.T. Oh, Y.S. Bae and W.J. Lee. 2005. A direct role for dual oxidase in Drosophila gut immunity. Science. 310, 847-850. Hedin, P.A., O.H. Lindig, P.P. Sikorowski and M. Wyatt. 1978. Suppressants of gut bacteria in the boll weevil from the cotton plant. J. Econ. Entomol. 71, 394-396.

ควำมตำ้ นทำนของแมลงอำศัย 252 Heimpel, A.M. 1955. The pH in the gut and blood of the larch sawfly, Pristiphora erichsonii (Htg.), and other insects with reference to the pathogenicity of Bacillus cereus Fr. and Fr. Can. J. Zool. 33, 99-106. He, Y., X. Cao, K. Li, Y. Hu, Y.R. Chen, G. Blissard, M.R. Kanost and H. Jiang. 2015. A genome-wide analysis of antimicrobial effector genes and their transcription patterns in Manduca sexta. Insect Biochem. Mol. Biol. 62, 23-37. Hillyer, J.F., 2010. Mosquito immunity. Adv. Exp. Med. Biol. 708, 218-238. Hillyer, J.F. and M.R. Strand. 2014. Mosquito haemocyte-mediated immune responses. Curr. Opin. Insect Sci. 3, 14-21. Hillyer, J.F. and T.Y. Estevez-Lao. 2010. Nitric oxide is an essential component of the haemocyte-mediated mosquito immune response against bacteria. Dev. Comp. Immunol. 34, 141-149. Hillyer, J.F., S.L. Schmidt and B.M. Christensen. 2003a. Haemocyte-mediated phagocyto sis and melanization in the mosquito Armigeres subalbatus following immune challenge by bacteria. Cell Tissue Res. 313, 117-127. Hillyer, J.F., S.L. Schmidt and B.M. Christensen. 2003b. Rapid phagocytosis and melanization of bacteria and Plasmodium sporozoites by haemocytes of the mosquito Aedes aegypti. J. Parasitol. 89, 62-69. Hillyer, J.F. 2016. Insect immunology and hematopoiesis. Developmental and Comparative Immunology. 58, 102-118. Hoffmann, J.A. and D. Hoffmann. 1990. The inducible antibacterial peptides of dipteran insects. Res. Immunol. 141, 910-918. Honti, V., G. Csordas, E. Kurucz, R. Markus and I. Ando. 2014. The cell-mediated immu nity of Drosophila melanogaster : haemocyte lineages, immune compartments, microanatomy and regulation. Dev. Comp. Immunol. 42, 47-56. Hughes, M.N. 2008. Chemistry of nitric oxide and related species. Methods Enzymol. 436, 3-19. Imler, J.L. 2014. Overview of Drosophila immunity : a historical perspective. Dev. Comp. Immunol. 42, 3-15. Jarosz, J. 1979a. Gut flora of Galleria mellonella suppressing ingested bacteria. J. Invertebr. Pathol. 34, 192-198. Jones, J.C. 1977. “The Circulatory System of Insects.” Thomas, Springfield, Illinois.

ควำมต้ำนทำนของแมลงอำศัย 253 Kajla, M.K., L. Shi, B. Li, S. Luckhart, J. Li and S.M. Paskewitz. 2011. A new role for an old antimicrobial : lysozyme c-1 can function to protect malaria parasites in Anopheles mosquitoes. PLoS One 6, e19649. Karlikow, M., B. Goic and M.C. Saleh. 2014. RNAi and antiviral defense in Drosophila : setting up a systemic immune response. Dev. Comp. Immunol. 42, 85-92. Kobayashi, M., S. Inagaki, and S. Kawase. 1981. Effect of high temperature on the development of nuclear polyhedrosis virus in the silkworm, Bombyx mori. J. Invertebr. Pathol. 38, 386-394. Koidsum, K. 1957. Antifungal action of cuticular lipids in insects. J. Insect Physiol. 1, 40- 51. Kwon, H., K. Bang, M. Lee and S. Cho. 2014b. Molecular cloning and characterization of a lysozyme cDNA from the mole cricket Gryllotalpa orientalis (Orthoptera : Gryllotalpidae). Mol. Biol. Rep. 41, 5745-5754. Lamiable, O. and J.L. Imler. 2014. Induced antiviral innate immunity in Drosophila. Curr. Opin. Microbiol. 20, 62-68. Lavine, M.D. and M.R. Strand. 2002. Insect haemocytes and their role in immunity. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1295-1309. Le Conte, Y., C. Alaux, J.-F. Martin, J.R. Harbo, J.W. Harris, C. Dantec, D. Se´verac, S. Cros- Arteil and M. Navajas. 2011. Social immunity in honeybees (Apis mellifera) : transcriptome analysis of varroa-hygienic behaviour. Insect Mol. Biol. 20, 399-408. Lee, P.E. and B. Fursala. 1967. Viruslike particles in adult honey bees (Apis mellifera Linnaeus) following injection with sacbrood virus. Virology. 32, 11-17. Li, B. and S.M. Paskewitz. 2006. A role for lysozyme in melanization of Sephadex beads in Anopheles gambiae. J. Insect Physiol. 52, 936-942. Maschwit, U., K. Koob and H. Schildknecht. 1970. Ein Beitrag zur Function der Metathoracaldrüse der Ameisen. J. Insect Plysiol. 16, 387-404. Wanjoya and A. Hassanali. 2009. Relationship between virulence and repellency of entomopathogenic isolates of Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana to the termite Macrotermes michaelseni. J. Insect Physiol. 55, 774-780. McLaughlin, R.E. and P.P. Sikorowski. 1978. Observations of boll weevil midgut when fed natural food or on bacterially contaminated artificial diet. J. Invertebr. Pathol. 32, 64-70.

ควำมต้ำนทำนของแมลงอำศยั 254 Meyling, N.V. and J.K. Pell. 2006. Detection and avoidance of an entomopathogenic fungus by a generalist insect predator. Ecol. Entomol. 31, 162-171. Milne, C.P., Jr. 1982. Laboratory measurement of brood disease resistance in the honeybee. Uncapping and removal of freeze-killed brood by newly emerged workers in laboratory test cages. J. Apic. Res. 21, 111-114. Milne, C.P., Jr. 1983. Honey bee (Hymenoptera : Apidae) hygienic behavior and resistance to chalkbrood. Ann. Entomol. Soc. Am. 76, 384-387. Moy, R.H. and S. Cherry. 2013. Antimicrobial autophagy : a conserved innate immune response in Drosophila. J. Innate Immun. 5, 444-455. Moy, R.H., B. Gold, J.M. Molleston, V. Schad, K. Yanger, M.V. Salzano, Y. Yagi, K.A. Fitzgerald, B.Z. Stanger, S.S. Soldan and S. Cherry. 2014. Antiviral autophagy restricts Rift Valley fever virus infection and is conserved from flies to mammals. Immunity. 40, 51-65. Nappi, A.J., E. Vass, F. Frey and Y. Carton. 2000. Nitric oxide involvement in Drosophila immunity. Nitric Oxide. 4, 423-430. Nainu, F., Y. Tanaka, A. Shiratsuchi and Y. Nakanishi. 2015. Protection of insects against viral infection by apoptosis-dependent phagocytosis. J. Immunol. 195, 5696-5706. Neilson, M.M. 1965. Effects of a cytoplasmic polyhedrosis on adult Lepidoptera. J. Inivertebr. Pathol. 7, 306-314. Ormond, E.L., A.P.M. Thomas, J.K. Pell, S.N. Freeman and H.E. Roy. 2011. Avoidance of a generalist entomopathogenic fungus by the ladybird, Coccinella septem punctata. FEMS Microbiol. Ecol. 77, 229-237. Oxley, P.R., M. Spivak, and B.P. Oldroyd. 2010. Six quantitative traitloci influence task thresholds for hygienic behaviour in honeybees (Apis mellifera). Mol. Ecol. 19, 1452-1461. Parker, B.J., B.D. Elderd and G. Dwyer. 2010. Host behaviour and exposure risk in an insectepathogen interaction. J. Anim. Ecol. 79, 863-870. Poulsen, M., A.N.M. Bot and J.J. Boomsma. 2003. The effect of metapleural gland secretion on the growth of a mutualistic bacterium on the cuticle of leaf-cutting ants. Naturwissenschaften. 90, 406-409. Rao, X.J., E. Ling and X.Q. Yu. 2010. The role of lysozyme in the prophenoloxidase activation system of Manduca sexta : an in vitro approach. Dev. Comp. Immunol. 34, 264-271.

ควำมตำ้ นทำนของแมลงอำศัย 255 Rothenbuhler, W.C., J.M. Kulinčeić and W.E. Kerr. 1968. Bee genetics. Annu. Rev. Genet. 2, 413-438. Rothenbuhler, W.C. 1964. Behavior genetics of nest cleaning in honey bees. IV. Responses of F1 and backcross generations to disease-killed brood. Am. Zool. 4, 111-123. Santoyo-Gonzalez, I. and A. Aguilar-Cordoba. 2011. Phenoloxidase : A key component of the insect immune system. Entomol. Exp. Appl. 142, 1-16. Satyavathi, V.V., A. Minz and J. Nagaraju. 2014. Nodulation : an unexplored cellular defense mechanism in insects. Cell Signal. 26, 1753-1763. Scott, J.G., K. Michel, L.C. Bartholomay, B.D. Siegfried, W.B. Hunter, G. Smagghe, K.Y. Zhu and A.E. Douglas. 2013. Towards the elements of successful insect RNAi. J. Insect Physiol. 59, 1212-1221. Scott, M.T. 1971. A naturally occurring hemagglutinin in the haemolymph of the American cockroach. Arch. Zool. Exp. Gen. 112, 73-80. Shapiro, M. 1979. Changes in haemocyte populations. In “Insect Haemocytes Development, Forms, Functions, and Techniques.” (A.P. Gupta, ed.), pp. 475-523. Cambridge University Press, Cambridge. Shelly, S., N. Lukinova, S. Bambina, A. Berman and S. Cherry. 2009. Autophagy is an essential component of Drosophila immunity against vesicular stomatitis virus. Immunity. 30, 588-598. Shiao, S.H., S. Higgs, Z. Adelman, B.M. Christensen, S.H. Liu and C.C. Chen. 2001. Effect of prophenoloxidase expression knockout on the melanization of microfilariae in the mosquito Armigeres subalbatus. Insect Mol. Biol. 10, 315-321. Shibutani, S.T., T. Saitoh, H. Nowag, C. Munz and T. Yoshimori. 2015. Autophagy and autophagy-related proteins in the immune system. Nat. Immunol. 16, 1014-1024. Sidorov, N.G., V.S. Kuptevand and I.A. Mugalimov. 1975. Resistance of honey bees to Nosema disease and a genetic method of control. Veterinariya (Moscow). 7, 63-65. Sigle, L.T. and J.F. Hillyer. 2016. Mosquito haemocytes preferentially aggregate and phagocytose pathogens in the periostial regions of the heart that experience the most haemolymph flow. Dev. Comp. Immunol. 55, 90-101.

ควำมตำ้ นทำนของแมลงอำศยั 256 Sim, S., N. Jupatanakul and G. Dimopoulos. 2014. Mosquito immunity against arboviruses. Viruses 6, 4479-4504. Smirnoff, W.A. 1972. Effects of volatile substances released by foliage of Abies balsamea. J. Invertebr. Pathol. 19, 32-35. Sowa-Jasilek, A., A. Zdybicka-Barabas, S. Staczek, J. Wydrych, P. Mak, T. Jakubowicz and M. Cytrynska. 2014. Studies on the role of insect haemolymph polypeptides : Galleria mellonella anionic peptide 2 and lysozyme. Peptides 53, 194-201. Stiles, B. and J.D. Paschke. 1980. Midgut pH in different instars of three Aedes mosquito species and the relation between pH and susceptibility of larvae to a nuclear polyhedrosis virus. J. Invertebr. Pathol. 35, 58-64. Stow, A. and A.J. Beattie. 2008. Chemical and genetic defenses against disease in insect societies. Brain Behav. Immun. 22, 1009-1013. Strand, M.R., 2008. The insect cellular immune response. Insect Sci. 15, 1-14. Swanson, J.A.I., B. Torto, S.A. Kells, K.A. Mesce, J.H. Tumlinson and M. Spivak. 2009. Odorants that induce hygienic behavior in honeybees : identification of volatile compounds in chalkbrood infected honeybee larvae. J. Chem. Ecol. 35, 1108-1116. Tembhare, D. B. 2016. Modern Entomology. 2nd edition, pp: 470-476. Toledo, A.V., A.M. Alippi and A.M.M. de Remes Lenicov. 2011. Growth inhibition of Beauveria bassiana by bacteria isolated from the cuticular surface of the corn leafhopper, Dalbulus maidis and the planthopper, Delphacodes kuscheli, two important vectors of maize pathogens. J. Insect Sci. 11, 29. Tsao, I.Y., J.W. Chen, C.J. Li, H.L. Lo, B.M. Christensen and C.C. Chen. 2015. The dual roles of Armigeres subalbatus prophenoloxidase V in parasite melanization and egg chorion melanization in the mosquito Ar. subalbatus. Insect Biochem. Mol. Biol. 64, 68-77. Vaidyanathan, R. and T.W. Scott. 2006. Apoptosis in mosquito midgut epithelia associated with West Nile virus infection. Apoptosis. 11, 1643-1651. Vail, P.V. and D. Gough. 1970. Effects of cytoplasmic-polyhedrosis virus on adult cabbage loopers and their progeny. J. Invertebr. Pathol. 15, 397-400. Vizioli, J., P. Bulet, J.A. Hoffmann, F.C. Kafatos, H.M. Muller and G. Dimopoulos. 2001. Gambicin : a novel immune responsive antimicrobial peptide from the malaria vector Anopheles gambiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98, 12630-12635.

ควำมต้ำนทำนของแมลงอำศยั 257 Wang, H., T. Gort, D.L. Boyle and R.J. Clem. 2012. Effects of manipulating apoptosis on Sindbis virus infection of Aedes aegypti mosquitoes. J. Virol. 86, 6546-6554. Wang, J.L., L. Chen, L. Tang, H.B. Zhao, X.S. Liu and Y.F. Wang. 2014a. 20- hydroxyecdysone transcriptionally regulates humoral immunity in the fat body of Helicoverpa armigera. Insect Mol. Biol. 23, 842-856. Wang, J.L., Q. Zhang, L. Tang, L. Chen, X.S. Liu and Y.F. Wang. 2014b. Involvement of a pattern recognition receptor C-type lectin 7 in enhancing cellular encapsulation and melanization due to its carboxyl-terminal CRD domain in the cotton bollworm, Helicoverpa armigera. Dev. Comp. Immunol. 44, 21-29. Watanabe, H. and Y. Tanada. 1972. Infection of a nuclear-polyhedrosis virus in armyworm, Pseudaletia unipuncta Haworth (Lepidoptera : Noctuidae), reared at a high temperature. Appl. Entomol, Zool. 7, 43-51. Watanabe, H. 1965. Resistance to peroral infection by the cytoplasmic-polyhedrosis virus in the silkworm, Bombyx mori (Linnaeus). J. Invertebr. Pathol. 7, 257-258. Watanabe, H. 1967. Development of resistance in the silkworm, Bombyx mori, to peroral infection of a cytoplasmic-polyhedrosis virus. J. Invertebr. Pathol. 9, 474-479. White, J.W., Jr., M.H. Subers and A.I. Schepartz. 1963. The identification of inhibine, the antibacterial factor in honey, as hydrogen peroxide and its origin in a honey glucose oxidase system. Biochem. Biophys. Acta. 73, 57-70. Yi, H.Y., M. Chowdhury, Y.D. Huang and X.Q. Yu. 2014. Insect antimicrobial peptides and their applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98, 5807-5822.

ควำมต้ำนทำนของแมลงอำศยั 258

บทที่ 11 กำรจำแนกเชอ้ื สำเหตขุ องโรคแมลงเบอ้ื งตน้ (Identification of Entomopathogenic Microorganisms) กำรจำแนกเช้ือสำเหตุโรคของแมลง โดยท่ัวไป มีวัตถุประสงค์เพื่อกำรวินิจฉัย หรือเพื่อยืนยัน สำเหตุเบื้องต้นของกำรเป็นโรคของแมลง วำ่ เกดิ จำกปัจจัยของเชอ้ื สำเหตุ หรือปัจจัยทำงกำยภำพ ในบำง กรณีอำกำรของโรคท่ีแสดงหรอื พบบนตัวแมลงอำจเป็นตัวบ่งบอกถึงสำเหตุของโรคได้ ในทำงตรงกันข้ำม โรค ติ ด เชื้ อ ใน แ ม ล งบ ำงช นิ ด อำจ จ ะไม่ ส ำม ำรถ บ อกถึ งส ำ เห ตุ ท่ี ท ำให้ เกิ ด โรค ใน แ ม ล งได้ ใน ทั น ที ตวั อยำ่ งเช่น โรคทเี่ กดิ จำกกำรติดเชื้อสำเหตจุ ำกเช้ือรำ แบคทีเรีย และไส้เดือนฝอย ท่ีจะพบว่ำส่วนใหญ่มี เชื้อสำเหตุนั้นอยู่บรเิ วณผนังลำตัวของแมลง หรืออำศัยอยู่ตำมสว่ นต่ำง ๆ ของแมลงท่ีเป็นโรค หรืออยู่ใน บริเวณที่แมลงเป็นโรค ในระยะเวลำ 50 ปีที่ผ่ำนมำมีกำรใช้ประโยชน์จำกเช้ือโรคในแมลงโดยกำรพัฒนำ เป็นสำรชีวภัณฑ์สำหรับควบคุมแมลงอย่ำงแพร่หลำย ส่งผลให้อตั รำกำรใช้เชื้อจุลินทรีย์เพื่อควบคุมกำจัด แมลงศัตรูพชื เพมิ่ มำกขน้ึ เห็นไดจ้ ำกจำนวนสำรชีวภัณฑใ์ นท้องตลำด รวมถึงเอกสำรวิชำกำรทั้งในประเทศ และต่ำงประเทศ ท่ีศึกษำและวิจัยเกี่ยวกับโรคในแมลงมีจำนวนเพ่ิมมำกขึ้น มีกำรสำรวจหำเช้ือจุลินทรีย์ ท้องถ่ินเพ่ือนำมำกำจัดแมลงศัตรูพืชทำงกำรเกษตร รวมทั้งกำรตรวจสอบโรคในแมลงโดยใช้วิธีทำงอณู พันธุศำสตร์ ท่ีใช้ระยะเวลำอันสั้นทำให้หำวิธีกำรป้องกันกำรเกิดโรคในแมลงสำคัญทำงเศรษฐกิจที่สำคัญ เช่น ผ้ึงและไหม ได้ทันท่วงที มีกำรจำแนกชนิดของเชื้อจุลินทรีย์ และกำรหำลำดับนิวคลีโอไทด์ของสำย พนั ธุ์เชอ้ื จลุ ินทรีย์ แลว้ นำไปไวใ้ นฐำนข้อมลู ของ Genbank เพ่ือให้เกิดประโยชนต์ อ่ นกั โรควทิ ยำของแมลง และนักวิทยำศำสตร์รุ่นต่อไปนอกจำกน้ียังมีกำรหำสำรท่ีเชื้อจุลินทรีย์ผลิตออกมำ (secondary metabolite) เพื่อนำไปใชป้ ระโยชน์ทำงกำรแพทย์และอุตสำหกรรม ในปัจจุบันแมว้ ่ำจะมีวธิ ีกำรทำงด้ำน ชีวโมเลกุลเข้ำมำมีบทบำทในกำรช่วยตรวจวิเครำะห์โรคท่ีเกิดในแมลงอย่ำงแพร่หลำย แต่ก็ยังแสดงให้ เหน็ หรอื มีข้อจำกัดในหลำยด้ำน อย่ำงไรก็ตำม กำรแยกเช้ือก่อโรคในแมลง ยังนับเปน็ วธิ ีกำรที่จำเป็นหรือ มีควำมสำคัญที่ตอ้ งกระทำในระหว่ำงที่มกี ำรพิสจู นเ์ พื่อใหท้ รำบถึงสำเหตทุ ี่แทจ้ ริงของเช้ือสำเหตโุ รคแมลง เพ่ือให้เกิดประโยชน์สูงสุดในแง่ของกำรป้องกันกำจัด อีกทั้งยังสำมำรถใช้ประโยชน์ในด้ำนอื่น ๆ ได้ เช่น กำรศึกษำลักษณะทำงกำยภำพของเชื้อ กำรศึกษำเรื่องโรคระบำดวิทยำแมลง กำรศึกษำปฏิสัมพันธ์ ระหว่ำงเช้ือสำเหตุกับแมลงอำศัย เป็นต้น ก่อนจะมีกำรจัดจำแนกเช้ือโรคสำเหตุในแมลง ต้องมีกำรออก สำรวจหำตัวอย่ำงโรคแมลงในภำคสนำม แยกเช้ือโรคให้บริสุทธ์ิ ทดสอบศักยภำพในกำรเป็นเช้ือก่อโรคท่ี แท้จรงิ ในแมลงชนิดนั้น และศึกษำทำงด้ำนสัณฐำนวิทยำของเชื้อเบื้องต้น ซึ่งวิธีกำรศึกษำทำงด้ำนต่ำง ๆ นั้นขึ้นกับชนิดของเช้ือและวัตถุประสงค์ของงำนเป็นหลัก และสำหรับกำรจัดจำแนกเช้ือสำเหตุโรคของ แมลงน้ันจะอำ้ งองิ คมู่ ือในกำรจดั จำแนกของ Lacey, 1997

กำรจำแนกเชอื้ สำเหตุของโรคแมลงเบือ้ งต้น 260 11.1 ควำมผดิ ปกติทเ่ี กดิ จำกกำรถกู เข้ำทำลำยดว้ ยเชอ้ื โรคในแมลง (Recognition of diseased insects) แมลงที่เป็นโรคท่ีมีสำเหตุอันเนื่องมำจำกกำรติดเชื้อจุลินทรีย์ จะมีลักษณะอำกำรบ่งชี้ท่ีแสดง ออกมำให้เห็นได้ชัดเจน 2 ทำง คือ อำกำรทำงพฤติกรรม (symptoms) โดยแมลงจะไม่ค่อยกินอำหำร เหมือนปกติ กำรเคลอื่ นไหวนอ้ ยลง เซ่ืองซมึ กระสบั กระส่ำย ไม่สำมำรถลอกครำบหรือเข้ำดักแด้หรอื ตำย ในระยะดักแด้ และตัวแมลงหรือบนซำกแมลงแสดงอำกำรทำงลักษณะปรำกฏ (signs) บำงอย่ำง เช่น สี ของผนังลำตัวเปล่ียนแปลงไปจำกปกติ เกิดกำรเจริญของเชื้อจุลินทรีย์เกิดขึ้นท่ีซำกของแมลง หรือกำร มองเห็นสิ่งผิดปกตเิ กิดขึ้นภำยในลำตัวแมลงผำ่ นทำงผนังลำตัว ขนำดของลำตัวหดสัน้ ลง หรือบวม ขยำย ใหญ่ข้ึน ท้ังน้ีอำกำรที่เห็นเด่นชัดว่ำซำกหรือแมลงท่ีพบตำยจำกกำรติดเช้ือสำมำรถตรวจสอบได้ตำม ลักษณะ ดงั นี้ 1. สขี องแมลงเปล่ยี นแปลงจำกปกติ (colour change) บอ่ ยคร้ังที่อำกำรของโรคที่พบติดเชอ้ื ในประชำกรแมลงในระยะเร่ิมแรกนน้ั สังเกตเห็นได้งำ่ ยจำก กำรเปลี่ยนแปลงไปจำกเดิมของแมลงที่ปกติสู่แมลงที่เป็นโรค จำกกำรศึกษำและสังเกตแมลงที่มีชีวิต อำศัยในกลุ่มประชำกรปกติและแมลงท่ีเป็นโรคพบว่ำ ในบำงกรณีหลังจำกท่ีแมลงติดเชื้อโรคจะพบกำร เปล่ียนแปลงสีของผนังลำตัวอันเนื่องมำจำกกำรถูกเชื้อโรคเข้ำทำลำย ซ่ึงอำจแสดงควำมผิดปกติท่ัวตัว แมลงหรือเพียงเฉพำะจุดหรือบำงอวัยวะ เช่นท่ีพบใน white grubs ที่ถูกเข้ำทำลำยด้วยเชื้อแบคทีเรีย Bacillus popilliae ทำให้เป็นโรค milky disease นอกจำกนี้พบว่ำกำรติดเช้ือไวรัสทำให้เกิดกำร เปลย่ี นแปลงของลำตวั ในระยะหนอนของมอด หนอนแมลงอันดับ Hymenoptera และหลำย ๆ กลุ่มของ ตัวอ่อนแมลงทอ่ี ำศัยในนำ้ มำกไปกว่ำนั้นคือ ก่อให้เกิดโรคกับแมลงในอนั ดับ Diptera และในกำรพบซำก แมลงที่ตำยแล้วมีกำรเปล่ียนแปลงของสีผนังลำตัวส่วนใหญ่สำมำรถพบเห็นสีผิดไปจำกปกติเป็น สีขำว จำกกำรติดเชื้อรำ Beauveria bassiana ในหนอนไหม สีเทำ สีแดง จำกกำรติดเชื้อแบคทีเรียในระยะ หนอนของ Popillia japonica และกำรติดเชื้อไวรัสในระยะหนอนของมอด สีส้ม สีเหลือง สีฟ้ำ สีเขียว จนกระทั่งมีสีน้ำตำล และสีดำ ในระยะหนอนของ Popillia japonica จำกกำรติดเช้ือรำ Matarhizium anisopliae หรืออำจพบเปน็ จุดสดี ำบนผนังลำตัวของแมลงเฉพำะบำงที่ 2. กำรเปลี่ยนแปลงทำงด้ำนกำยภำพ (physical signs of the entomopathogen) สำมำรถ สังเกตอำกำรของแมลงท่ีพบเป็นโรคว่ำเกิดจำกเชื้อสำเหตุชนิดใดได้ ยกตัวอย่ำงเช่น โรคในแมลงที่มี สำเหตุของโรคจำกเช้ือรำ เชื้อจะสร้ำงเส้นใยและสปอร์สีสันต่ำง ๆ ปกคลุมบนซำกของแมลง หำกแมลง เกิดโรคจำกไสเ้ ดือนฝอยจะพบว่ำช่องว่ำงภำยในลำตัวแมลง ทั้งแมลงที่มีชวี ิตและซำกแมลงมไี สเ้ ดือนฝอย อำศัยอยู่เป็นจำนวนมำก หำกระยะหนอนของแมลงตำยจำกเช้ือไวรัสพบว่ำหนอนจะมีลักษณะลำตัวอ่อน นมุ่ และแตกงำ่ ย 3. พฤติกรรมเปล่ียนแปลงไปจำกปกติ (aberrant behaviour) สว่ นใหญ่แล้วแมลงท่ีเกิดโรคจะมพี ฤติกรรมทเี่ หมอื นกันอยำ่ งหนึ่ง คือ กำรไม่ยอมกนิ อำหำร แสดงพฤติกรรมแตกตำ่ งกบั ชว่ งปกติ ไม่ว่ำจะเปน็ กำรเคล่ือนไหว กำรตอบสนองต่อสิ่งแวดลอ้ มทเ่ี หน็ ไดช้ ัด ได้แก่ แมลงที่ถูกเชื้อไวรัสเข้ำทำลำย จะมีพฤติกรรมไต่ข้ึนบนท่ีสงู ต่อต้ำนกับแรงโน้มถว่ งของโลก แล้วใช้

กำรจำแนกเชอ้ื สำเหตุของโรคแมลงเบ้อื งต้น 261 ขำเทียมยึดเกำะกับใบไม้ ก่ิงไม้ หรือส่วนของพืช แล้วห้อยหัวลงมำ แล้วตำยในท่ีสุด ซึ่งเป็นพฤติกรรม จำเพำะสำหรับหนอนทีไ่ ดร้ บั เชือ้ ไวรสั 3.1 เกดิ กำรเปล่ยี นแปลงทำงดำ้ นรูปร่ำงและโครงสร้ำง (changes in form and texture) เป็นกำรเปล่ียนแปลงทำงกำยภำพที่เกิดขึ้นหลังจำกท่ีแมลงได้รับเช้ือแล้วเช้ือทำให้แมลงตำย ภำยหลังจำกที่แมลงตำยพบว่ำซำกของแมลงจะมีลักษณะแข็งคล้ำยมัมมี่ หรือซำกแมลงอ่อนนุ่ม และ บำงครัง้ มีลกั ษณะคลำ้ ยซสี หรือแขง็ แหง้ คล้ำยหนังสตั ว์ 3.2 เกิดกลิ่น (odour) ภำยหลังจำกแมลงได้รับเชื้อโรคโดยเฉพำะเชื้อโรคที่มีเชื้อแบคทีเรียเป็นสำเหตุ เมื่อแมลงตำย ลำตัวมักเน่ำเละ เป็นสีดำหรือสีเข้ม และมีกล่ินเหม็น ซึ่งเห็นได้อย่ำงชัดเจนในตัวอ่อนของผ้ึงที่ติดเชื้อ แบคทีเรีย Paenibacillus larvae ตัวอ่อนผ้ึงที่ตำยด้วยโรคน้ีจะมีสีเข้มกว่ำปกติ ยุบตัวแบนรำบติดผนัง ดำ้ นล่ำงของหลอดรวงผง้ึ เมือ่ เนำ่ สลำยจะเปลีย่ นเป็นสีน้ำตำลถึงดำ และเห็นฝำปดิ หลอดรวงผ้งึ มีลกั ษณะ เป็นรพู รุน ทำให้เหน็ รวงผงึ้ ในรังทต่ี ิดเชื้อเปน็ จดุ สดี ำ ตัวอ่อนเปลย่ี นจำกสีขำวเป็นสีนำ้ ตำลออกดำ เนำ่ เละ มีกล่ินเหม็น ถ้ำใช้ไม้เข่ียตัวอ่อนผึ้งท่ีเน่ำจะมีลักษณะเป็นของเหลวเหนียวยืดเป็นสำยยำวติดปลำยไม้ ออกมำ 11.2 กำรเกบ็ ขอ้ มลู ทเ่ี กยี่ วขอ้ งกับตวั อยำ่ ง และขอ้ มลู ของสภำพธรรมชำติ (Collection of field data) ในช่วงท่ีมีกำรออกสำรวจเพื่อเก็บตัวอย่ำงซำกแมลงที่ตำยจำกเช้ือโรค กำรบัน ทึกข้อมูล สงิ่ แวดล้อมส่วนต่ำง ๆ ไว้ โดยละเอียดครอบคลมุ จะเป็นประโยชน์และมีควำมสำคัญอย่ำงมำกสำหรบั กำร ใช้อ้ำงอิง รวมถึงใช้ประกอบกำรวินิจฉัยกำรติดเช้ือโรคในแมลงให้มีควำมถูกต้องและแม่นยำขึ้น โดยจะมี กำรบันทึก ข้อมูลชื่อชนิดของแมลง ระยะกำรเจริญเติบโต อำกำร ระดับควำมรุนแรง อำจรวมไปถึงช่ือ และปริมำณของเชื้อท่ีปรำกฏบนซำกแมลง ในกรณีแมลงมีสำเหตุกำรตำยจำกเชื้อรำ บันทึกข้อมูลของพืช อำหำร แหล่งท่ีอยู่ของแมลง และแหล่งที่พบซำกแมลง บันทึกข้อมูลของควำมถ่ีในกำรพบซำกแมลงท่ีมี กำรตำยจำกเชื้อโรค บันทึกข้อมูลของสภำพภูมิอำกำศ ควำมสูงของระดับน้ำทะเล พิกัดจุด ในขณะน้ัน และสุดทำ้ ยต้องบันทึกสถำนท่ี วันที่ ช่ือผู้เก็บตวั อย่ำง ในกำรจดบันทึกข้อมูลที่มคี วำมสำคัญและเก่ียวขอ้ ง กับตัวอย่ำงซำกแมลงทเี่ ก็บ (ภำพท่ี 11-1) ควรทำกำรบันทึกลงบนกระดำษโดยใช้ดินสอ ไม่ควรใชป้ ำกกำ แบบหมึก หรือปำกกำหมึกซึม เน่ืองจำกควำมช้ืนในสภำพกำรเก็บรักษำตัวอย่ำงจะทำให้หมึกถูกลบและ เกดิ กำรสูญเสียขอ้ มลู ท่สี ำคัญ

กำรจำแนกเชือ้ สำเหตุของโรคแมลงเบื้องต้น 262 ภำพที่ 11-1 ตัวอยำ่ งแบบบนั ทกึ ข้อมูลตัวอย่ำงซำกแมลง กำรเก็บตวั อย่ำงแมลงท่ีเป็นโรค แมลงท่ีถูกเช้ือโรคเข้ำทำลำยอำจจะยังคงมีชีวิตอยู่หรือตำยไปแล้วก็ได้ ซึ่งสำมำรถสำรวจได้จำก ทุกสภำพพ้ืนที่ท่ีมีแมลงอำศัยอยู่ ทั้งระบบนิเวศบนบก ในพื้นที่ทำกำรเกษตร ในระบบนิเวศของป่ำชนิด ต่ำง ๆ ซ่ึงมีควำมหลำกหลำยทำงชนิดของแมลง และในระบบนิเวศที่แมลงอำศัยอยใู่ นแหล่งนำ้ ต่ำง ๆ กำร ค้นหำแมลงท่ีเปน็ โรคในธรรมชำติ ผูท้ ี่ทำหน้ำที่ในกำรออกสำรวจเพ่อื เก็บรวบรวมแมลงท่ีเกิดโรค ต้องแต่ง กำยอยำ่ งมิดชิดและเหมำะสม โดยเฉพำะกำรเก็บตวั อย่ำงแมลงท่ีถูกเช้ือรำเข้ำทำลำย จะพบมำกและเห็น ได้อย่ำงชดั เจน ในสภำพปำ่ ในช่วงฤดูฝน ซง่ึ ชว่ งดังกลำ่ วจะมี ทำกดดู เลอื ดระบำด (ภำพที่ 11-2) พร้อมท้ัง ต้องมคี วำมรู้พืน้ ฐำน มคี วำมเข้ำใจสภำพกำรเกิดโรคในธรรมชำติ มคี วำมชำนำญด้ำนกำรวินิจฉยั โรคแมลง รวมถึงปัจจยั เสริมในกำรเกิดโรค และทรำบลักษณะอำกำรของแมลงทเ่ี กิดจำกเช้ือโรคชนิดต่ำง ๆ เช่น ใน กรณีของแมลงท่ีติดเช้ือไวรัส จะพบแมลงนอนตำยห้อยหัวเป็นรูปตัว V หัวกลับอยู่บนยอดไม้หรือก่ิงไม้ (ภำพท่ี 11-3 ) ลำตัวเปรำะบำง พร้อมท่ีจะแตกทันทีหำกถูกสัมผัส ส่วนแมลงที่ถูกเชื้อรำเข้ำทำลำยน้ัน จะพบตำมใบไม้ กิ่งไม้ บนขอนไม้ หรอื บนพ้ืนดินท่ีมีใบไม้ปกคลุม ลักษณะของแมลงท่ีตำยจะมีเส้นใยของ เช้ือรำสีต่ำง ๆ ขึ้นปกคลุม (ภำพที่ 11-5) บำงคร้ังยังพอมองเห็นว่ำแมลงท่ีถูกเชื้อรำเข้ำทำลำยเป็นแมลง ชนิดใด เป็นต้น เพ่ือท่ีจะสำมำรถพิจำรณำตัดสินใจถึงควำมเหมำะสมของกำรนำตัวอย่ำงแมลงเป็นโรคท่ี ได้ไปเก็บรักษำ หรือแยกเชื้อให้บริสุทธ์ิ เพื่อให้สะดวกในกำรวินิจฉัยและจำแนกชนิดของเชื้อก่อโรค กำร เก็บตัวอย่ำงแมลงที่ตำยจำกเชื้อโรคในสภำพธรรมชำติ ในบำงครั้งจะค่อนข้ำงเปน็ ไปได้ยำก เช่นในกรณีท่ี กำรเกิดโรคติดต่อพบในกลุ่มประชำกรของแมลงที่มีควำมหนำแน่นค่อนข้ำงต่ำ หรือท่ีเรียกว่ำ enzootic disease แต่ในทำงตรงกันข้ำม หำกมีกำรเกิดกำรแพร่ระบำดติดต่อกันเป็นวงกว้ำงของโรคจะเรียกว่ำ epizootic จะทำให้พบแมลงที่ตำยด้วยเชื้อโรคง่ำยข้ึน กำรเก็บตัวอย่ำงโดยกำรใช้คีมคีบหยิบจับซำก แมลงต้องเป็นไปด้วยควำมควำมระมัดระวัง ตัวอย่ำงเช้ือรำท่ีเข้ำทำลำยแมลงบำงชนิด ต้องใช้กำรขุดหำ ตัวอย่ำงแมลงท่ีฝังอยู่ในดินลึก เพื่อให้ได้ตัวอย่ำงแมลงที่สมบูรณ์ที่สุด ไม่ให้เกิดกำรบอบช้ำจำกกำรกด หรือบีบอัด หรือกระแทก และต้องวำงซำกแมลงไว้ในภำชนะที่เหมำะสม ไม่ควรเก็บตัวอย่ำงใส่ใน ถงุ พลำสติก ควรแยกตัวอย่ำงไว้เดี่ยว ๆ เช่น เกบ็ ไว้ในกล่องพลำสติก หรือจำนอำหำรพลำสติกเป็นต้น ไม่ เก็บปะปนกัน (ภำพที่ 11-4) เพื่อป้องกันตัวอย่ำงเสียหำย แตกหัก และเกิดกำรปนเป้ือนขณะขนย้ำย

กำรจำแนกเชอื้ สำเหตุของโรคแมลงเบ้อื งต้น 263 นอกจำกน้ีหำกบริเวณท่ีเก็บตัวอย่ำงมีแมลงชนิดน้ันในปริมำณมำก ควรเก็บแมลงท่ีปกติที่ทรำบว่ำเป็น ชนิดเดยี วกนั กับตวั ทเ่ี กดิ โรคมำดว้ ย สำหรบั ใช้เป็นตัวเปรยี บเทียบ ภำพท่ี 11-2 กำรแต่งกำยขณะออกทำกำรสำรวจตัวอยำ่ งแมลงทเี่ ป็นโรค ภำพท่ี 11-3 ซำกของหนอนแมลงที่ถูกเข้ำทำลำยด้วยเช้ือไวรสั (Vega and Kaya, 2012)

กำรจำแนกเช้อื สำเหตุของโรคแมลงเบ้ืองตน้ 264 ภำพที่ 11-4 วธิ ีเก็บตวั อยำ่ งซำกแมลงท่ีมสี ำเหตโุ รคจำกเชอื้ รำ จำกสภำพธรรมชำติ

กำรจำแนกเช้อื สำเหตุของโรคแมลงเบอื้ งตน้ 265 ภำพที่ 11-5 ลักษณะของแมลงและแมงท่ีถูกเข้ำทำลำยดว้ ยเชือ้ รำชนดิ ตำ่ ง ๆ ในสภำพธรรมชำติ

กำรจำแนกเชื้อสำเหตขุ องโรคแมลงเบ้อื งต้น 266 11.3 กำรจดั กำรเบื้องตน้ กบั ตัวอยำ่ งซำกแมลงทม่ี สี ำเหตกุ ำรตำยมำจำกเชอ้ื โรค (Initial handling of specimens) เมื่อเก็บซำกแมลงที่คำดว่ำมีสำเหตุกำรตำยเกิดจำกเชื้อโรคมำจำกสภำพแปลงปลูกหรือสภำพ ธรรมชำติด้วยวิธีท่ีถูกต้องดังท่ีกล่ำวมำข้ำงต้นแล้ว กำรเลือกวิธีในกำรจัดกำรกับตัว อย่ำงนับเป็นอีก ขั้นตอนหน่ึงท่ีผู้เก็บตัวอย่ำงต้องให้ควำมสำคัญ เนื่องจำกกำรตัดสินใจเลือกใช้วิธีกำรจัดกำรกับตัวอย่ำง ด้วยวิธีกำรใดน้ัน ข้ึนอยู่กับชนิดของเชื้อ ขนำด ระยะของแมลงที่เป็นโรค รวมไปถึงวัตถุประสงค์ในกำร เก็บรักษำและกำรศึกษำ และหลังจำกน้ันให้ทำกำรตรวจสอบตำมขั้นตอนที่ถูกต้องตำมหลักกำรทำง วิทยำศำสตร์อย่ำงเร็วที่สุด หำกปล่อยทิ้งไว้จะทำให้เชื้ออื่น ๆ ที่อยู่ในธรรมชำติเข้ำทำลำยซำกแมลงเพิ่ม (saprophytics organisms) อำจทำให้กำรวินิจฉัยโรคผิดไปจำกควำมเปน็ จรงิ หำกแมลงยังมีชีวติ อยแู่ ละ อำกำรของโรคยังปรำกฏไม่ชัดเจน ให้เลี้ยงแมลงไว้เพ่ือสังเกตอำกำรโดยให้อำหำรท่ีเป็นอำหำรตำม ธรรมชำติของแมลง เมื่อเก็บตัวอย่ำงแมลงท่ีเกิดโรคมำจำกแหล่งธรรมชำติ ควรเก็บไว้ในท่ีแห้ง ไม่ปะปนกับตัวอย่ำงอ่ืน ๆ สำหรับซำกแมลงท่ีมีขนำดเล็ก เช่น scale insect พวกเพลี้ยหอย เพลี้ยแป้ง หรือ เพล้ียไฟ แมลงหวข่ี ำว เก็บไวใ้ นภำชนะที่มอี ำกำศถ่ำยเท และควรใส่สำรดูดควำมช้ืน เช่น silica gel เพ่ือป้องกันกำรเข้ำทำลำยซ้ำของพวก saprophytics ส่วนในกรณีของแมลงท่ีถูกไส้เดือนฝอยหรือโพรโท ซัวเข้ำทำลำยไม่ควรปล่อยให้ตัวอย่ำงแห้ง อำจเก็บรักษำซำกแมลงไว้ในโหลช้ืน ในส่วนของตัวอย่ำงซำก แมลงท่ีมีลำตัวเปรำะบำงหรือแตกหักง่ำย (fragile cadavers) เช่น แมลงท่ีอำศัยอยู่ในน้ำ ให้เก็บโดยกำร วำงไว้บนกระดำษกรองหรือบนแผ่น slide หรือเก็บในหลอด vial ท่ีบรรจุ 2-4% formalin และไม่ควร เก็บตัวอย่ำงสดไว้ในรถ เพรำะควำมรอ้ นอำจทำใหต้ ัวอย่ำงแมลงเสียหำย สีสันเปลี่ยนไป หำกเป็นไปได้ให้ เก็บไว้ในท่ีเย็น เช่น บนน้ำแข็งแห้งหรือในกระติกน้ำแข็งขณะมีกำรเคล่ือนย้ำยซำกแมลงไปยัง หอ้ งปฏิบตั ิกำร 11.4 กำรตรวจวเิ ครำะหต์ วั อยำ่ งโรคแมลงในหอ้ งปฏบิ ตั กิ ำร กำรวินิจฉัยโรคแมลงโดยใช้สำยตำเพียงอย่ำงเดียว อำจทำให้กำรวินิจฉัยกำรตำยของแมลงท่ีมี สำเหตุจำกกำรติดเชื้อโรคเกิดควำมผิดพลำด ดังนั้นต้องใช้เครื่องมือมำช่วยในกำรวินิจฉัยร่วมด้วย เช่น วินิจฉัยภำยใต้กล้องจุลทรรศนช์ นิดต่ำง ๆ โดยสังเกตจำกอำกำรที่ปรำกฏ หรือควำมผิดปกตบิ นซำกแมลง และกำรเพำะเลี้ยงเชื้อ ท่ีพบบนซำกแมลงบนอำหำรเล้ียงเช้ือแล้วทำกำรแยกเช้ือให้บริสุทธิ์ (ในกรณีพบเส้นใยเช้ือรำข้ึนปกคลุมบนซำกแมลง) เพ่ือให้ง่ำยและเพิ่มควำมแม่นยำในกำรวนิ ิจฉัยเช้ือที่ก่อ โรคในซำกแมลงน้ัน ๆ วิธีกำรเตรียมตวั อย่ำงและตรวจสอบหำเช้อื กอ่ โรคในแมลงในห้องปฏิบัตกิ ำร มขี ัน้ ตอนหรอื วิธีกำรดงั ตอ่ ไปนี้

กำรจำแนกเชือ้ สำเหตขุ องโรคแมลงเบอ้ื งตน้ 267 1. กำรทำควำมสะอำดพน้ื ผวิ ภำยนอกหรอื ผนงั ลำตวั (surface sterilization) ของซำกแมลง วธิ นี เ้ี ปน็ ท่ี นยิ มใชแ้ ยกเชื้อจำกซำกแมลงทตี่ ำยดว้ ยเชอ้ื รำ 1. แชต่ ัวอยำ่ งแมลงใน 70% alcohol นำน 2-3 นำที 2. วำงในนำ้ กลั่นเบำ ๆ 2-3 ครงั้ 3. แชใ่ น sodium hypochlorite (NaCIO) เป็นเวลำ 1 นำที หรือนำนกว่ำ ข้นึ อยกู่ บั ขนำดของ แมลง (หรอื อำจจะใช้ Clorox ซ่ึงเทียบเทำ่ ได้กับ NaCIO 5% ซง่ึ NaCIO นีส้ ำมำรถเตรียมที่ ควำมเข้มข้นระหว่ำง 0.5–1% ข้ึนอยู่กับระยะและขนำดของแมลง) 4. ล้ำงในน้ำกลนั่ 2-3 คร้งั 5. วำงบนกระดำษกรอง เพ่ือรอให้ตัวอยำ่ งแห้ง นอกจำกน้ีสำมำรถผสมสำรเคมีลดแรงตึงผิว เช่น Tween 80 ใน NaCIO เพื่อท่ีจะช่วยเพิ่ม ประสิทธิภำพกำรทำงำนของสำรฆ่ำเชื้อภำยนอกได้ดียิ่งข้ึน นอกจำกนี้มีสำรเคมีชนิดอ่ืน ๆ ท่ีถูกนำมำใช้ ฆ่ำเชื้อที่ผิวนอกของซำกแมลง เช่น Hyamine และ Zephiran chloride ในซำกแมลงท่ีมีขนำดเล็ก เช่น scale insects เพลี้ยไฟหรือแมลงหวี่ขำว ข้อควรระวังหำกใช้วิธีกำรฆ่ำเช้ือที่ผิวโดยวิธีน้ี อำจทำให้เชื้อรำ สำเหตุโรคท่ีอยูภ่ ำยในตวั แมลงถูกทำลำยได้ ในกรณีของเชอ้ื รำท่ีพบในซำกแมลงทีม่ ีขนำดเลก็ ให้ใชเ้ ขม็ เข่ีย เช้ือที่ผ่ำนกำรฆ่ำเช้ือแล้วเขี่ยหรือตักสปอร์ของเช้ือรำ ย้ำยไปวำงลงบนอำหำรเล้ียงเชื้อที่เหมำะสม เช่น อำหำร PDA โดยตักเชอ้ื มำวำงหลำย ๆ จุด โดยทุกขั้นตอนต้องปลอดเชื้อ หรือควรทำในต้เู ข่ียเชื้อ จำกน้ัน ทำกำรจดบันทึกทุกขั้นตอนกำรทำงำนอย่ำงละเอียดและติดตำมกำรพัฒนำกำรของเช้ือท่ีอยู่บนอำหำร อย่ำงใกล้ชิด เม่ือเช้ือเจรญิ ใหท้ ำกำร sub-cultures ไปเรอื่ ยจนกระท่ังได้เชือ้ บริสทุ ธ์ิ 2. กำรผำ่ ตดั (dissection) สำหรบั กำรตรวจสอบอำกำรของโรคท่ีเน้ือเยื่อหรืออวัยวะภำยในของแมลง กำรผ่ำเข้ำไปดอู วัยวะ ภำยในเป็นส่ิงจำเป็น ตรวจหำสิ่งปกติที่อยูภ่ ำยในลำตัวแมลง เพ่ือเอำเน้ือเย่ือดังกล่ำวไปตรวจละเอียดอีก ครั้ง สำหรับอุปกรณ์กำรผ่ำตัดแมลงมีควำมสำคัญมำก อุปกรณ์และเครื่องมือต่ำง ๆ ต้องสะอำด ผ่ำนกำร อบเพ่ือฆ่ำเช้ือโรคต่ำง ๆ รวมถึงประสิทธิภำพของเครื่องมือต้องมีควำมพร้อม มีควำมคมของกรรไกรและ มีดผ่ำตัด เพ่ือลดกำรกระทบกระเทือนของเนื้อเย่ือ สำรละลำยต่ำง ๆ ท่ีใช้สำหรับกำรผ่ำตัดแมลง ควรมี กำรใช้สำรละลำยท่ีช่วยรกั ษำเน้ือเยอ่ื ในขณะผ่ำตัด ในดำ้ นคุณภำพ เช่น กำรใช้ Ringer’s solution แทน กำรใช้น้ำเปลำ่ Ringer’s solution Sodium chloride (NaCl) 8.0 g Calcium chloride (CaCl2) 0.25 g Potassium chloride (KCl) 0.25 g Sodium bicarbonate (NaHCO3) 0.25 g นำ้ กลัน่ ท่ีผำ่ นกำรฆ่ำเชอ้ื แล้วใหค้ รบ 1000 ml

กำรจำแนกเชือ้ สำเหตุของโรคแมลงเบอื้ งตน้ 268 Eide and Reinecke’s Physiological Saline (Eide and Reinecke, 1970) Sodium chloride (NaCl) 0.45 g Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O) 0.3 g Sodium bicarbonate (NaHCO3) 0.04 g Dextrose (C6H12O6) 0.16 g Potassium chloride (KCl) 0.11 g Monosodium phosphate (NaH2PO4H2O) 0.04 g Sodium acetate (C2H3O2Na) 0.03 น้ำกลน่ั ท่ีผำ่ นกำรฆำ่ เช้อื แลว้ ให้ครบ 100 ml 3. กำรเตรยี มตวั อยำ่ งบนแผน่ slides (preparation of slides) กำรเตรียมตัวอย่ำงบนสไลด์จะข้ึนกับวัตถุประสงค์ของกำรศึกษำเป็นหลักกำรเตรียมตัวอย่ำงบน สไลด์มีหลำกหลำยวิธี ซึ่งท่ีพบโดยท่ัวไปคือกำรเตรียมตัวอย่ำงสไลด์แบบช่ัวครำวหรือสไลด์ตัวอย่ำงสด “wet-mounts” ซึ่งกำรทำสไลด์แบบนี้จะใช้น้ำกลั่นเป็นสำรช่วยค้ำจุนตัวอย่ำง ข้อจำกัดของวิธีกำรนี้ คือตัวอย่ำงไม่สำมำรถเก็บไว้ได้นำน กำรเตรียมสไลด์แบบกึ่งถำวรจะใช้สำรช่วยค้ำจุนตัวอย่ำงเป็น lactophenol cotton blue ตัวอย่ำงท่ีถูกเตรียมแบบน้ีจะเก็บไว้ได้นำนหลำยวันหรือเดือน และสุดท้ำย เป็นกำรเตรียมตัวอย่ำงบนสไลด์แบบถำวรวิธีกำรน้ีจะใช้สำรค้ำจุนตัวอย่ำงเป็น glycerol วิธีกำรนี้จะช่วย ยืดอำยุในกำรเก็บตัวอย่ำงได้นำนเป็นปี เทคนิคหรือวิธีกำรเตรียมตัวอย่ำงเหล่ำนี้จะถูกใช้เมื่อซำกแมลงมี ขนำดเล็กซ่ึงในข้ันตอนกำรทำอำจใช้แมลงท้ังตัววำงบนแผ่นสไลด์ (microscope slides) หรือใช้อวัยวะ ส่วนต่ำง ๆ เช่น ท่อทำงเดินอำหำร อวัยวะสืบพันธ์ุ รวมถึงเลือดและของเหลวภำยในร่ำงกำยของแมลง จำกนั้นหยดสำรหรือน้ำยำสำหรับค้ำจุนตัวอย่ำงดังท่ีกล่ำวมำแล้วข้ำงต้นปิดทับตัวอย่ำงด้วยกระจกปิด สไลด์ (cover slide) จำกนัน้ ใชน้ ำ้ ยำเคลือบสเี ล็บตรึงบรเิ วณขอบแลว้ ตรวจดูภำยใต้กลอ้ งจลุ ทรรศน์ 4. กำรเตรยี มเนอ้ื เยอื่ ของแมลงเพ่ือศึกษำทำงด้ำนเนอ้ื เย่ือวิทยำ (preparation of tissue for histological sections) กำรเตรียมเนื้อเย่ือแมลง เพ่ือศึกษำทำงด้ำนเน้ือเยื่อวิทยำ และกำรเกิดโรค ต้องศึกษำเน้ือเย่ือ เบื้องต้น ด้วย light microscopy จำกน้นั ไปศึกษำอย่ำงละเอียดภำยใต้กล้องกำลังขยำยสูง ต้องอำศัยผู้ท่ี มีควำมชำนำญ เนื่องจำกมีควำมซับซ้อน ต้องทำตำมลำดับอย่ำงถูกวิธี มีข้ันตอนต่ำง ๆ มีกำรเตรียม ตัวอย่ำงเนื้อเย่ือ อย่ำงถูกข้ันตอน เน้ือเย่ือท่ีพบว่ำถูกเข้ำทำลำยโดยเช้ือโรค เช่นเชื้อไวรัส ต้องผ่ำน กระบวนกำรต่ำง ๆ เช่น กำรตรึงเนื้อเย่ือ กำรย้อมสี แล้วต้องส่องดูภำยใต้กล้องกำลังขยำยสูง Transmission electron microscopy (TEM) และ Scanning electron microscopy (SEM) สำหรับ เช้ือไวรัส เช้อื แบคทเี รยี และเชือ้ รำ รวมถึงไส้เดือนฝอย

กำรจำแนกเช้อื สำเหตุของโรคแมลงเบอื้ งต้น 269 สำรละลำยสำหรบั ตรึงตัวอย่ำงสำหรบั light microscopy Buffered neutral formalin Formalin (CH2O, 37-40%) 100.0 ml นำ้ กล่ันที่ผำ่ นกำรฆำ่ เชอ้ื แล้ว 900.0 ml Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4 H2O) 4.0 g Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) 6.5g Carnoy’s fixative Absolute ethanol (C2H5OH) 60 ml Chloroform (CHCl3) 30 ml Glacial acetic acid (C2H4O2) 10 ml Bouins’s fixative 75 ml Saturated aqueous picric acid 25 ml Formalin (CH2O, 37-40%) 5 ml Glacial acetic acid (C2H4O2) 7 ml 2 ml TAF (Southey, 1970) 91 ml Formalin (CH2O, 37-40%) Triethanolamine (C6H15NO3) นำ้ กลั่นท่ีผำ่ นกำรฆำ่ เช้ือแล้ว สียอ้ มตวั อย่ำงสำหรบั light microscopy 2.5 g Mordant 100 ml Iron alum (ferric ammonium sulphate (FeNH4(SO4)2•2H2O) (Iron alum crystals should have a violet-pinkish colour) Distilled water Whealtey’s modified Gomori trichrome stain 100 ml Distilled water 1.0 ml Glacialacetic acid (C2H4O2) Phosphotungstic acid

กำรจำแนกเช้อื สำเหตุของโรคแมลงเบ้อื งตน้ 270 (12WO3•H3PO4• H2O) 0.7 g Chormotrope 2R 0.4 g 0.3 g (C16H10N2Na2O8S2) 0.1 g Bright green SF, certified 5g Bismarck brown, certified 100 ml Eosin Y stain Eosin Y Distilled water Filter the eosin solution and add a few drops of glacial acetic acid just before use. Lactophenol and cotton blue 100 g Phenol crystals (C6H6O2) 80 ml Lactic acid (USP 85%) 159 ml Glycerin 100 ml Distilled water Mix ingredients and heat until hot; add 0.5% cotton blue. 11.5 กำรตรวจพิสจู นส์ ำเหตขุ องโรค กำรพิสูจน์กำรติดเชื้อด้วยวิธี Koch’s postulates กำรจำแนกชนิดของเช้ือสำเหตุโรคในแมลงนั้น บำงครั้งไม่ใช่เร่ืองง่ำยที่จะจำแนกได้ถูกต้อง ควรระมัดระวังต้ังแต่กำรเก็บตัวอย่ำงมำจำกสภำพแปลงมำ จนถึงห้องปฏิบัติกำร และควรแยกเช้ือโดยเร็ว เนื่องจำกจะมีเชื้ออ่ืน ๆ (symphophy) เข้ำทำลำยต่อ ซ่ึง ไม่ใช่สำเหตโุ รคในแมลงท่ีแท้จริง และควรอ้ำงอิงถึงทฤษฎีต่ำง ๆ ทีน่ ักโรควิทยำของแมลงได้ศึกษำไว้ เช่น กำรศึกษำของ Steinhaus, 1963; Lacey,1997; Tanada and Kaya, 1993 และเมื่อแยกเชื้อจำกแมลง ได้อย่ำงบริสุทธ์ิแล้วควรจะพิสูจน์ศักยภำพกำรเปน็ เชื้อสำเหตุโรคแมลงท่ีแท้จริงกลับไปยังแมลงอำศยั เดิม ตำมทฤษฎีหรือวิธีกำรของ Koch’s postulates เพื่อเป็นกำรพิสูจน์ขั้นสุดท้ำยของกำรเป็นสำเหตุโรค ดัง ขน้ั ตอนตอ่ ไปนี้ 1. ทำกำรแยกเช้ือจำกแมลงที่เป็นโรคให้บริสุทธ์ิ ด้วยวิธีท่ีถูกต้องตำมหลักกำรทำง วิทยำศำสตร์ พร้อมทั้งบันทึก และถ่ำยภำพลักษณะอำกำร/พฤติกรรม (signs and symptoms) ของแมลงกอ่ นทีจ่ ะตำย หรือซำกท่พี บ 2. เมื่อได้เชื้อมำแล้วนำไปเลี้ยงเพิ่มปริมำณในอำหำรเล้ียงเช้ือท่ีเหมำะสมสำหรับเชื้อท่ีเป็น non-obligate pathogens เช่น เชื้อรำ หรือเล้ียงบนแมลงที่อ่อนแอและมีควำม เฉพำะเจำะจงสำหรบั เชื้อทีเ่ ปน็ obligate pathogens เช่น เช้ือไวรสั

กำรจำแนกเชื้อสำเหตขุ องโรคแมลงเบื้องตน้ 271 3. นำเชื้อที่ได้ปลูกเชื้อ (inoculated) ในแมลงท่ีแข็งแรงและเป็นชนิดเดียวกันกับแมลงท่ีพบ เป็นโรคในครั้งแรก จำกน้ันสังเกตลักษณะอำกำรและกำรแสดงออกของโรคหลังจำกท่ี แมลงได้รบั เชอ้ื ซงึ่ ตอ้ งเหมอื นหรอื ใกลเ้ คยี งกันกบั แมลงตวั แรกท่ีเปน็ โรค 4. เมื่อแมลงตัวใหม่เป็นโรค ต้องแยกเชื้อให้บริสุทธ์ิ และนำเช้ือมำเลี้ยงในอำหำรเลี้ยงเชื้ออีก คร้งั หนึ่ง จำกนั้นให้ศึกษำลักษณะทำงสัณฐำนวิทยำ เช่น รูปร่ำงของเส้นใย สปอร์ โคโลนี และสี ซึ่งต้องเหมือนกับเชื้อโรคที่แยกได้จำกข้อ 2 จึงจะสรุปได้ว่ำเช้ือโรคท่ีแยกได้เป็น สำเหตุท่ที ำให้เกิดโรคทแี่ ท้จริงในแมลงชนิดนนั้ กำรพิสูจน์กำรติดเชื้อตำมวิธีกำร Koch’s postulates สำมำรถพิสูจน์โรคได้เฉพำะเชื้อโรคที่มี รูปแบบกำรติดเชื้อในผู้ให้อำศัยแบบ facultative parasites คือเชื้อก่อโรคในผู้ให้อำศัยท่ีสำมำรถเล้ียง เพิ่มปริมำณได้บนอำหำรเลี้ยงเช้ือ เช่น เช้ือรำ และแบคทีเรีย ส่วนแบบ obligate parasites ได้แก่ เชื้อ ไวรสั โพรโทซวั และรกิ เกทเซีย ต้องอำศยั เทคนิคอนื่ ๆ ในกำรเลี้ยงเพ่ือเพม่ิ ปริมำณ หรือกำรทำใหบ้ ริสุทธิ์ หรือกำรตรวจจำแนกชนิด และกำรตรวจสอบควำมสำมำรถในกำรก่อโรค ได้แก่ กำรใช้กล้องจุลทรรศน์ อิเล็กตรอน (electron microscope) กำรใช้เทคนิคทำง serological หรือ molecular genetics ใน กำรพิสูจน์โรค เช่น enzyme-linked immunosorbent assays (ILISA), sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis, restriction endonuclease analyses of DNA, randomly amplified polymorphic DNA technology และ biochemical analyses. 11.6 กำรจำแนกกลุม่ ของเชอื้ สำเหตทุ ีท่ ำใหแ้ มลงเกดิ โรค 1. กญุ แจในกำรจำแนกกลุ่มของเช้ือสำเหตุทที่ ำให้แมลงเกดิ โรค (Key to the major entomopathogen groups) (Lacey, 1997) 1a เหน็ กำรเจริญเตบิ โตบริเวณภำยนอกลำตัวแมลงอย่ำงชัดเจน……………...........................2 1b ไมเ่ หน็ กำรเจรญิ เตบิ โตบรเิ วณภำยนอกลำตวั แมลง.........................................................3 2a กลุ่มของสิ่งมีชีวิตคล้ำยไส้เดือนขนำดเล็ก (ลำตัวไม่แบ่งเป็นปล้อง) อยู่บริเวณผิวลำตัว แมลง………………………………………..................................ไสเ้ ดอื นฝอย 2b เจริญเติบโตบนผนังลำตัวแมลง บำงคร้ังมีลักษณะเป็นผงฝุ่นสีต่ำงๆ เช่น สีขำว เขียว แดง ปกคลุมลำตัวแมลง บำงชนดิ งอกออกมำเป็นแทง่ จำกขอ้ ตอ่ ของแมลง........................................................เชือ้ รำ 3a แมลงมีลักษณะปกติ บำงคร้ังแคระแกรน รูปร่ำงไม่สมส่วน เมื่อผ่ำดูจะพบตัวหนอน อยู่ ภำยใน............................................................................ตวั เบยี น 3b แมลงแสดงลกั ษณะปกติ หรืออำจผดิ ปกติ เม่อื ผ่ำดูไมพ่ บตัวหนอนอยูภ่ ำยใน…………..4 4a แมลงทอ่ี ำศยั อย่ใู นน้ำ หรือแมลงทีม่ ีผนงั ลำตัวโปร่งแสง ใส............................................5 4b แมลงที่อำศัยอยบู่ นบก โดยปกติแล้วผนงั ลำตวั จะไม่โปร่งแสง......................................12 5a แมลงเรืองแสง หรือมีสีเหลือบเหมือนสีรุ้งหรือเห็นส่วนของอวัยวะที่เรืองแสงโดย เฉพำะที่ fat body...…………………………………………………………….…………………………....6

กำรจำแนกเชือ้ สำเหตุของโรคแมลงเบื้องตน้ 272 5b แมลงไม่เกิดกำรเรอื งแสง ...............................................................................................7 6a แมลง โดยเฉพำะในกลุ่มตัวหนอนของด้วง มผี นังลำตัวสีขำว ออกฟ้ำ พบผลึกอย่ภู ำยใน และพบสิ่งมีชีวิตคล้ำยแบคทีเรียมีรูปร่ำงกลมและรี (pleomorphic) เมื่อมองภำยใต้ กล้อง light microscopy………………………….…………..…รกิ เกทเซีย 6b แมลงมีลำตัวสีส้ม เขียว ฟ้ำ เชื้อสำเหตุน้ีไม่สำมำรถมองเห็นด้วย กล้อง light microscopy...................................................................ไวรัส 7a เลือดของแมลง (Hemolymph) เม่ือมองผ่ำนผนังลำตัวจะมีสีขำวขุ่นคล้ำยน้ำนม ส่อง ด้วยกล้องจุลทรรรศน์แบบ phase microscopy จะเห็นรูปร่ำงเป็นแท่ง (rod) เคลอ่ื นไหวไปมำได้และสร้ำง spore ………………………….แบคทีเรีย 7b เลือดของแมลง (Hemolymph) ใส มีลกั ษณะปกต.ิ .......................................................8 8a รปู รำ่ งคลำ้ ยหนอน เคลอ่ื นไหวรวดเรว็ สำมำรถมองผำ่ นเข้ำไปในลำตัวของแมลงได้ โดยใช้กล้องกำลงั ขยำยต่ำ...............................................................................................9 8b ไม่พบทัง้ ไส้เดือนฝอย และ โพรโทซัว (ciliated organism)……………………….……..….10 9a สง่ิ มีชวี ติ รปู ร่ำงคล้ำยหนอน ลำตวั ยำวไมแ่ บง่ เป็นข้อปล้อง ........................................................................................ไส้เดือนฝอย 9b สิ่งมีชีวิตรูปร่ำงแบน (pyriform) มีขนำดเล็ก เคลื่อนท่ีโดยใช้ขนเล็กๆ ที่อยู่รอบลำตัว (cilia)……………………………………………………………………..โพรโทซัว 10a ลำไส้ผิดปกติ มสี ีขำวทึบแสง เมื่อส่องภำยใต้กล้องกำลังขยำยสงู จะเห็นอนุภำค เป็นผลึก วงกลมหลำยเหล่ยี ม (polyhedral)……………………………ไวรสั 10b ลำไสป้ กต.ิ .....................................................................................................................11 11a เกิดควำมผิดปกติในช่องว่ำงภำยในลำตัวแมลง พบก้อนสีขำว คล้ำย fat body หรือพบ ในเลอื ดของแมลง............................................................โพรโทซวั 11b ภำยในช่องว่ำงลำตัวแมลง (โดยเฉพำะตัวอ่อนของยุง) อัดแน่นไปด้วยเส้นใย และสปอร์ .........................................................................................เชือ้ รำ 12a ผนังลำตัวของแมลงค่อนข้ำงแข็ง ลกั ษณะคล้ำยมมั มี่ ปกคลุมไปดว้ ยเสน้ ใย และ resting spore …………………………………………………………..……….เช้อื รำ 12b ผนังลำตวั ของแมลงไม่แข็ง บำงครั้งพบลกั ษณะแคระแกร็น หรอื อวัยวะบำงสว่ นผิดปกติ ผดิ รปู ร่ำง......................................................................................................................13 13a ผนังลำตัวแมลงหย่อนยำน เห่ียว ไม่เต่งตึง สีซีดจนไม่มีสี บำงคร้ังผิวบอบบำง เปรำะ แตกง่ำย............................................................................................................. ...........15 13b แมลงอำจจะแคระแกรน็ มรี ปู ร่ำงท่ผี ิดปกติ แต่มผี นงั ลำตัวปกติ...................................14 14a เนื้อเย่ือและเซลล์ต่ำง ๆ ของแมลง ประกอบไปด้วย refringent สปอร์ หรือ cysts ไม่ สำมำรถเคลื่อนท่ีได้ ในบำงกรณีลำไส้ของแมลงพบสิ่งมีชีวิตที่เคลื่อนท่ีโดยใช้ flagellated มขี นำดค่อนขำ้ งใหญ่ เคลอ่ื นไหวช้ำ............โพรโทซัว

กำรจำแนกเช้อื สำเหตขุ องโรคแมลงเบ้อื งต้น 273 14b เนื้อเย่ือและเซลล์ต่ำง ๆ ของแมลง ประกอบไปด้วย สิ่งมีชีวิตขนำดเล็กมำก ไม่สำมำรถ เคลื่อนที่ได้ มีรูปร่ำงคล้ำยแบคทีเรีย สำมำรถมองเห็นได้ด้วยกล้อง light microscopy ส่วนใหญ่จะเกิดเป็นคู่หรือต่อกันเป็นสำยยำวอำจจะสร้ำงผลึกหรือไม่สร้ำงก็ ได้ .............................................................................................รกิ เกทเซยี 15a พบสิ่งมีชีวิตรูปร่ำงคล้ำยหนอน ไม่แบ่งออกเป็นข้อปลอ้ งในเน้ือเยื่อของแมลง มีลักษณะ เป็นของเหลว หรือขน้ คลำ้ ยครมี มีสีเทำ หรือสแี ดงเรื่อ........ไส้เดอื นฝอย 15b ไม่พบไสเ้ ดือนฝอยในเนือ้ เยือ่ หรอื ในลำตวั แมลง...........................................................16 16a แมลงที่ตำยแลว้ มักมีกลน่ิ เหมน็ ลำตัวมีสนี ้ำตำลจนถงึ สดี ำ หรอื สีแดงเรอ่ื เนื้อเย่ือเละ ฉ่ำ น้ำ ส่องดูภำยใต้กล้องจุลทรรศน์ พบสปอร์มีรูปร่ำงเป็นแท่งตรง เคล่ือนไหวได้ ..............................................................................................แบคทเี รีย 16b แมลงมีผนังลำตัวหย่อนยำน เห่ียว ไม่เต่งตึง และไม่มีสี ผนังลำตัวบอบบำง เปรำะแตก ง่ำย เห็นอนุภำค เป็นผลึกวงกลมหลำยเหล่ียม (polyhedral) ภำยใต้กล้องกำลังขยำย สูง ลักษณะกำรตำยของแมลงจำพวกหนอนจะไต่ไปที่ยอดไม้หรือกิ่งไม้ แล้วใช้ขำเทียม เกำะทใี่ บแล้วหอ้ ยหัวลงมำเป็นรูปตัว V กลบั หวั ...................ไวรสั สำหรับเชอ้ื รำสำเหตโุ รคในแมลง ทเ่ี กบ็ ตัวอยำ่ งไดจ้ ำกในสภำพป่ำ หรอื ในสภำพธรรมชำติ ใช้ กุญแจในกำรจำแนกชนิดโดย Luangsa-ard et al., 2007, 2008, 2010 and 2012 11.7 สรปุ กำรจำแนกเชื้อสำเหตุโรคของแมลง มีวัตถุประสงค์เพ่ือกำรวินิจฉัย หรือเพื่อยืนยันสำเหตุ เบื้องต้นของกำรเป็นโรคของแมลง ว่ำเกิดจำกปัจจัยของเชื้อสำเหตุ หรือปัจจยั ทำงกำยภำพ โรคติดเช้ือใน แมลงบำงชนิดอำจจะไม่สำมำรถบอกถึงสำเหตุท่ีทำให้เกิดโรคในแมลงได้ในทันที ตัวอย่ำงเช่น โรคที่เกิด จำกกำรติดเชื้อสำเหตุจำก เชื้อรำ แบคทีเรีย และไส้เดือนฝอย ท่ีจะพบว่ำส่วนใหญ่มีเชื้อสำเหตุนั้นอยู่ บริเวณผนังลำตัวของแมลง หรืออำศัยอยู่ตำมส่วนต่ำง ๆ ของแมลงที่เป็นโรค หรืออยู่ในบริเวณที่แมลง เป็นโรค ในปัจบุ ันแมว้ ่ำจะมีวิธีกำรทำงด้ำนชีวโมเลกุลเข้ำมำมีบทบำทในกำรช่วยตรวจวิเครำะห์โรคทเ่ี กิด ในแมลงอย่ำงแพร่หลำย แต่ก็ยังแสดงให้เห็นหรือมีข้อจำกัดในหลำยด้ำน อย่ำงไรก็ตำม กำรแยกเชื้อก่อ โรคในแมลงยังนบั เปน็ วธิ ีกำรทจ่ี ำเป็นหรอื มคี วำมสำคัญท่ีตอ้ งกระทำในระหว่ำงที่มีกำรพสิ จู น์เพ่ือใหท้ รำบ ถงึ สำเหตุท่ีแทจ้ ริงของเชอ้ื สำเหตุโรคแมลง เพ่ือให้เกิดประโยชน์สูงสุดในแง่ของกำรป้องกนั กำจัด อกี ทั้งยัง สำมำรถใช้ประโยชน์ในด้ำนอ่ืน ๆ ได้ เช่น กำรศึกษำลักษณะทำงกำยภำพของเช้ือ กำรศึกษำเร่ืองโรค ระบำดวิทยำแมลง กำรศึกษำปฏิสัมพันธ์ระหว่ำงเช้ือรำสำเหตุกับแมลงอำศัย เป็นต้น ก่อนจะมีกำรจัด จำแนกเชื้อโรคสำเหตุในแมลงต้องมีกำรออกสำรวจหำตัวอย่ำงโรคแมลงในภำคสนำม แยกเช้ือโรคให้ บรสิ ุทธ์ิ ทดสอบศักยภำพในกำรเป็นเชื้อก่อโรคท่ีแท้จริงในแมลงชนดิ นน้ั และศึกษำทำงด้ำนสัณฐำนวิทยำ ของเชื้อเบ้ืองต้น และสำหรับกำรจัดจำแนกเชื้อสำเหตุโรคของแมลงน้ันจะอ้ำงอิงคู่มือในกำรจัดจำแนก

กำรจำแนกเช้ือสำเหตุของโรคแมลงเบอ้ื งต้น 274 ของ Lacey, 1997 และสำหรับเชือ้ รำสำเหตุโรคในแมลง กุญแจทใี่ ช้ในกำรจำแนกชนดิ โดย Luangsa-ard et al., 2007, 2008, 2010 and 2012 11.8 เอกสำรอำ้ งองิ Eide, P.E. and J.P. Reinecke. 1970. A physiological saline solution for sperm of the house fly and the black blow fly. J. of Econ. Entomol. 63, 1006. Lacey, L.A (ed.). 1997. Manual of Techniques in insect pathology. Harcourt Brace, Chatham, Kent, United Kingdom. 409 pp. Luangsa-ard, J.J., Tasanathai, K., Mongkolsamrit, S., and N.L. Hywel-Jones. 2007. Atlas of Invertebrate-Pathogenic Fungi of Thailand, vol. 1. National Center for Genetic Engineering and Biotechnology, National Science and Technology Development Agency, Pathum Thani, Thailand. Luangsa-ard, J.J., Tasanathai, K., Mongkolsamrit, S., and N.L. Hywel-Jones. 2008. Atlas of invertebrate-pathogenic fungi of Thailand. National Center for Genetic Engineering and Biotechnology, National Science and Technology Development Agency, Pathum Thani, Thailand. Luangsa-ard, J.J., Tasanathai, K., Mongkolsamrit, S., and N.L. Hywel-Jones. 2010. Atlas of invertebrate-pathogenic fungi of Thailand. Thailand. National Center for Genetic Engineering and Biotechnology. Luangsa-ard, J.J., Tasanathai, K., Mongkolsamrit, S. and N.L. Hywel-Jones. 2012. Atlas of invertebrate-pathogenic fungi of Thailand. National Center for Genetic Engineering and Biotechnology, National Science and Technology Development Agency, Pathum Thani, Thailand. Southey, J.F (ed.). 1970. Laboratory methods for work with plant and soil nematodes. Ministry of Agriculture, Fisheries and Food, Technical Bulletin 2. HMSO, London. Steinhaus, E.A. 1963. Background for the diagnosis of insect diseases. pp 549-589 In E.A Steinhaus (ed). Insect pathology an advanced treatise, Vol. 2. Academic Press, New York. Tanada, Y. and H.K. Kaya. 1993. Insect Pathology. Academic Press, New York, USA. Vega, F.E. and H.K. Kaya, (eds.). 2012. Insect Pathology. Elsevier, New York, USA.

บทที่ 12 กำรเกบ็ รกั ษำเชอ้ื จลุ นิ ทรยี ์ (Preservation of Microorganisms) กำรศึกษำกำรเก็บรักษำเช้ือจุลินทรีย์ที่มีชีวิต ให้คงควำมมีชีวิตโดยลดอัตรำกำรเจริญเติบโตของ เชือ้ จุลินทรีย์ลง โดยจำกดั ปจั จัยที่จำเป็นต่อกำรดำรงชีวิตของเช้อื จุลินทรยี ์ เชน่ อุณหภูมิ สำรอำหำร โดย มีวัตถุประสงค์เพ่ือรักษำลักษณะทำงพันธุกรรมของเช้ือจุลินทรีย์ไว้ ไม่ให้เกิดกำรเปล่ียนแปลง วิธีกำรใน กำรเก็บเชื้อให้มีชีวิตยืนยำวและยังคงรักษำสภำพทำงพันธุกรรมไว้ และคงประสิทธิภำพในกำรทำให้เกิด โรคและควำมแข็งแรงของเช้ือไว้ มีหลำยวธิ ีกำรซ่ึงแต่ละวิธีมีทั้งข้อดีและข้อด้อยขึ้นอยู่กับจุดประสงค์ของ กำรเกบ็ รกั ษำ ชนิดของเชือ้ จลุ ินทรีย์ และกำรนำมำใชง้ ำน 12.1 ประเภทของจลุ ินทรยี ท์ ี่เก็บรกั ษำ 1. เช้อื รำ วธิ ีกำรเก็บรักษำเช้ือรำทำได้หลำยวิธี หำกไม่ตอ้ งกำรเก็บไว้เป็นระยะเวลำนำนอำจจะใช้วิธที ี่ง่ำย ที่สุด ได้แก่ กำรทำ subculture หรือ serial transfer แต่มีข้อควรระวังสำหรับกำรเก็บไว้ภำยใต้น้ำมัน คือ ต้องค่อย ๆ ใส่น้ำมัน เพรำะจะมีผลทำให้สปอร์หลุดออกจำกผิวอำหำร และกำรเก็บเช้ือรำไว้ในดิน หรือน้ำกลั่น หรือเก็บในซิลิกำเจลท่ีทำให้แห้งแล้ว หำกต้องกำรเก็บเช้ือรำไว้ใช้ในระยะยำวควรเก็บไว้ใน ไนโตรเจนเหลวเหมือนกับกำรเกบ็ แบคทีเรีย หรอื กำรทำใหแ้ ห้งแบบเยือกแข็ง (lyophilization) 2. เชอ้ื แบคทเี รีย กำรเก็บรักษำเช้ือแบคที เรียโดยกำรทำให้แห้งแบบเยือกแข็ ง (Freeze drying หรือ lyophilization) เป็นวิธีกำรเก็บเชื้อท่ดี ที ีส่ ุด สำมำรถเกบ็ ได้เปน็ ระยะเวลำยำวนำนเชน่ เดียวกับกำรเกบ็ ใน ไนโตรเจนเหลว หรอื อำจทำโดยวิธี subculture ในกรณที ีต่ อ้ งกำรใช้งำนในระยะเวลำสั้น ๆ 3. เช้ือโพรโทซัว กำรเก็บรักษำเช้ือโพรโทซัว ส่วนใหญ่จะใช้วิธีกำรต่อเชื้อ subculture แล้วเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 10-15C หรือเกบ็ ในตเู้ ย็นอณุ หภูมิ 4C โพรโทซัวบำงชนิดสำมำรถเก็บไวไ้ ด้ โดยกำรทำให้แหง้ แบบเยอื ก แขง็ หรอื เก็บในไนโตรเจนเหลว โดยตอ้ งใสส่ ำรปอ้ งกนั กำรแข็งตัว 4. ไส้เดอื นฝอย ถำ้ ต้องกำรเก็บในช่วงระยะเวลำส้ัน ๆ สำมำรถเก็บไว้ในน้ำกล่นั ที่อุณหภูมิ 4-15C หำกเก็บไวใ้ ช้ ในระยะเวลำนำน ให้ผสมกับสำรป้องกันกำรแข็งตัวแล้วแช่ในไนโตรเจนเหลว

กำรจำแนกเชือ้ สำเหตุของโรคแมลงเบื้องต้น 276 12.2 กำรเกบ็ เชอื้ จุลินทรยี ใ์ ห้มีควำมคงทนควรคำนึงถึงปจั จัย ดังนี้ (สมบรู ณ์, 2539) 1. กำรรักษำจุลินทรยี ใ์ หร้ อดชีวติ (maintenance of viability) วิธีกำรเก็บรักษำเช้ือจุลินทรีย์แต่ละวิธีมีทั้งข้อดีและข้อเสีย ควรพิจำรณำถึงควำมคุ้มทุนในกำร เกบ็ รกั ษำและวิธที ่ีจะรกั ษำเชื้อจุลินทรยี ท์ ำใหม้ ีชีวิตรอดได้มำกที่สุด หรอื ไมท่ ำใหเ้ ชอ้ื เสอื่ มสภำพลง 2. กำรคดั เลอื กทำให้ประชำกรเปลีย่ นแปลง (population change through selection) ตำมหลักกำรของกำรคัดเลือกตำมธรรมชำติน้ัน เชื้อท่ีมีควำมอ่อนแอก็จะถูกธรรมชำติคัดทิ้ง ทำให้เช้ือจุลินทรีย์ท่ีเลี้ยงไว้นำน ๆ มีจำนวนเซลล์หรือมีสัดส่วนของประชำกรลดลงเมื่อเปรียบเทียบกับ เช้ือท่ีเล้ียงใน generation รุ่นแรก ๆ เพ่ือหลีกเลี่ยงกำรสูญเสียควรคำนึงถึงวิธีกำรเก็บรักษำท่ีทำให้เช้ือมี ชีวติ รอดมำกท่ีสุด ในช่วงที่ทำกำรเกบ็ รกั ษำและระหว่ำงกำรเกบ็ รักษำ 3. เกิดกำรเปลีย่ นแปลงลักษณะทำงพันธกุ รรม (genetic change) เชื้อจุลินทรีย์บำงชนิดมีพันธุกรรมท่ีจำเพำะเจำะจง เช่น จุลินทรีย์ท่ีผลิตสำรที่ใช้ประโยชน์ทำง กำรแพทย์ หรือจุลินทรีย์ที่ใช้สำหรับอุตสำหกรรม หรือแม้แต่จุลินทรีย์ท่ีมีสมบัติท่ีทำให้เกิดโรคอย่ำง รุนแรงในแมลง หำกเก็บรักษำไม่ดีจะทำให้เกิดกำรกลำยพันธุ์ทำให้เช้ือจุลินทรีย์เหล่ำนั้น สูญเสีย คุณลักษณะพิเศษดังกล่ำวไป ดังน้ันวิธกี ำรเก็บรักษำควรคำนงึ ถึงจุดน้ีดว้ ย ซึ่งเป็นประเด็นที่สำคัญสำหรับ ขนั้ ตอนและกระบวนกำรในกำรเกบ็ รกั ษำ 4. ควำมบริสุทธิข์ องเชื้อจุลนิ ทรยี ์ (purity) ในข้ันตอนของกำรเก็บรักษำ กำรนำเชื้อจุลินทรีย์ออกมำใช้อำจมีบำงข้ันตอนท่ีถูกเช้ืออื่น ๆ เข้ำปนเปื้อน จงึ ควรแยกหลอดทำในแตล่ ะคร้งั และตรวจดูลักษณะก่อนนำไปเกบ็ ไว้ 5. คำ่ ใช้จำ่ ย (expense) ในกำรเก็บรักษำเช้ือจุลินทรีย์บำงวิธีมีกรรมวิธีและวธิ ีกำรที่ค่อนข้ำงยุ่งยำก ใช้อุปกรณ์และวัสดุที่ มีรำคำแพง เช่น freezing dry และกำรเก็บในไนโตรเจนเหลว ซึ่งต้องเติมไนโตรเจนเหลวเป็นระยะ ๆ หรือเก็บไวใ้ นตู้ -80C ซึง่ มคี ำ่ ใชจ้ ่ำยในกำรเก็บรักษำ 6. จำนวนเชอ้ื จลุ ินทรียท์ ่ีตอ้ งกำรเกบ็ รักษำ (number of cultures) เพรำะถ้ำมีจำนวนเช้ือจุลินทรีย์มำก ค่ำใช้จ่ำยของอุปกรณ์ในกำรเก็บรักษำ กำรจัดกำรดูแล ก็มำกขน้ึ ตำมไปด้วย 7. คุณคำ่ ของเช้ือจุลนิ ทรยี ์ (value of cultures) เช่น เชื้อที่มีควำมสำคัญไม่สำมำรถพบได้ท่ัวไป เมื่อเกิดกำรสูญหำยหรือเชื้อตำยแล้วไม่สำมำรถ หำได้อีก กำรเก็บรักษำควรจะต้องพิจำรณำอย่ำงระมัดระวัง ส่วนเช้ือจุลินทรีย์ท่ีมีควำมสำคัญลดลงมำก็ ควรคำนึงถงึ คำ่ ใชจ้ ่ำยในกำรดูแลรักษำดว้ ย 8. กำรบริกำรและกำรขนส่งเชือ้ จลุ ินทรีย์ (supply and transportation of cultures) กำรเคล่ือนย้ำยเชื้อจุลินทรีย์จำกท่ีหน่ึงไปยังอีกท่ีหนึ่ง ควรมีกำรจัดส่งที่เห มำะสมไม่ให้ เชื้อจุลินทรีย์เกิดกำรสูญเสียสภำพในช่วงของกำรขนส่ง หรือเกิดกำรสูญหำย หำกเป็นกำรขนส่งระหว่ำง ประเทศควรศึกษำกฎและขอ้ บงั คับระหว่ำงประเทศดว้ ย

กำรจำแนกเชอ้ื สำเหตุของโรคแมลงเบ้ืองตน้ 277 9. ควำมถี่ในกำรใชเ้ ช้ือจุลินทรยี ์ (frequency of use of cultures) เช่น เช้ือท่ีต้องใช้เป็นประจำ เช่นใช้สำหรับสอนและวิจัย หรือใช้วิเครำะห์ในกำรผลิตทำง อุตสำหกรรมควรแบ่งออกเป็นส่วน ๆ แล้วนำออกมำใช้ ทำให้ลดกำรปนเปื้อน หรือวิธีกำรเก็บรักษำ อำจจะเปน็ วธิ ีท่ีใช้โดยทวั่ ไป มคี ่ำใชจ้ ำ่ ยไมส่ ูงมำกนกั 12.3 ประเภทของกำรเก็บรักษำเชอื้ จลุ นิ ทรยี ์ กำรเก็บตวั อย่ำงเช้ือจุลินทรยี ท์ ี่อุณหภูมิ  0C Serial transfer เปน็ กำรเก็บรักษำในระยะสน้ั เช่น สปั ดำห์ถึงหน่ึงเดือน เช่น กำรทำ subculture ของเชือ้ รำ แต่ หำกทำกำร subculture หลำย ๆ ครั้ง ก็จะทำให้เช้ือสูญเสียควำมสำมำรถในกำรทำให้เกิดโรค (pathogenicity) ควำมรุนแรงของเช้ือ (virulence) หรือกำรสร้ำงสปอร์ลดลง กำรเก็บเช้ือจุลินทรีย์วิธีน้ี ตอ้ งคอยดอู ำหำรวุ้นไม่ให้แห้ง และควรระวังกำรเขำ้ ทำลำยของไร กำรเก็บเช้ือโดยวิธีน้ีต้องเก็บอย่ำงน้อย 2 หลอด หลอดหนง่ึ ไว้เปน็ seed stock อีกหลอดหนง่ึ เอำไวใ้ ช้งำน working culture กำรศึกษำชนิดของ อำหำรท่ีใช้มีควำมสำคัญเพรำะมีผลต่อกำรต่อเชื้อ หรือส่วนประกอบของอำหำรท่ีมีส่วนประกอบของ คำร์โบไฮเดรตมำกจะทำให้เกิดเชื้อผลิตสำรชนิดหน่ึงออกมำ ซ่ึงมีฤทธิ์เป็นกรดไปทำลำยเซลล์ของ จลุ นิ ทรยี ์ กำรเกบ็ ภำยใต้ mineral oil หรอื liquid paraffin เป็นกำรเก็บเชื้อที่ใช้กันมำเป็นระยะเวลำนำน เน่ืองจำกสะดวก ทำใด้ง่ำยและเป็นวิธีท่ีประหยัด ส่วนใหญ่จะใช้กับกำรเก็บรักษำเช้ือรำ น้ำมันช่วยป้องกันกำรระเหยและลดกำรแลกเปล่ียนของก๊ำซ ทำให้กระบวนกำรเมแทบอลิซึมของเชื้อรำลดลง ทำให้เก็บเชื้อได้นำนขึ้น กำรเก็บรักษำเชื้อในน้ำมันน้ี สำมำรถรักษำควำมมีชีวิตของเช้ือรำได้นำนถึง 10 ปี ในแบคทีเรียจำพวก Bacillus thuringiensis ก็ใช้ วธิ กี ำรเก็บวิธีนเี้ ชน่ เดียวกนั กำรเก็บในน้ำกลน่ั เป็นวิธที ี่ใช้ในกำรเก็บรักษำเช้ือรำหลำย ๆ ชนิด ทั้งเชื้อรำท่ีทำให้เกิดโรคในคนและเช้ือรำสำเหตุ โรคพืช วธิ ีนเ้ี หมำะสำหรับเช้อื รำที่ไมส่ ำมำรถเก็บดว้ ยวิธี freeze-dried เช่น เชอ้ื รำ Oomycetes ควำมมี ชีวิตของเชื้อรำสำมำรถอยู่ได้นำนถึง 20 ปี แต่มีรำยงำนพบว่ำ เช้ือรำบำงชนิดสูญเสียควำมมีชีวิตใน ระยะเวลำอันสนั้ เทคนิคทำได้ง่ำยโดยกำรฆ่ำเช้ือภำชนะทีใ่ ส่เช้อื เช่น หลอด vial หรือ tube พร้อมท้ังจุก ปิด น้ำอำจจะใช้น้ำประปำก็ได้ในกรณีที่ไม่มีน้ำกล่ัน หรือ deionized water และต้องฆ่ำเชื้อโดยกำรใช้ autoclave ท่ีอุณ หภูมิ 121C นำนประมำณ 30 นำที ปล่อยให้เย็นแล้วตัดชิ้นวุ้นท่ีมีปลำย เสน้ ใยของเช้อื รำที่กำลังเจริญใส่เช้ือลงไป ควรทำในตู้ปลอดเช้ือ (laminar airflow) หลังจำกนั้นนำไปเก็บ ที่อุณหภูมหิ ้องหรือเก็บไวใ้ นตูเ้ ย็น สำหรับปญั หำของวธิ กี ำรเก็บเชอ้ื โดยวิธนี ้ี คือ กำรระเหยของน้ำหำกปิด

กำรจำแนกเชอ้ื สำเหตุของโรคแมลงเบ้อื งต้น 278 ฝำไม่สนิท วิธีทำงแก้ไข คือ เติมน้ำให้มำกกว่ำปริมำณเชื้อประมำณ 40 เท่ำ และหม่ันตรวจดูกำรระเหย ของนำ้ กำรเก็บรักษำเชื้อไวใ้ นดนิ หรือทรำย เป็นกำรเก็บเชื้อจุลินทรีย์อีกวิธีหน่ึง เช้ือท่ีจะนำมำเก็บน้ีอำจจะเป็นเช้ือแบคทีเรียหรือเชื้อรำก็ได้ ส่วนใหญ่แล้วเชื้อจุลินทรีย์ดังกล่ำวมีชีวิตบำงช่วงอยู่ในดิน หรือสำมำรถอยู่ข้ำมฤดูในดินได้ เช่น เชื้อ แบคทีเรีย Bacillus thuringiensis หรือเชื้อรำซ่ึงเกิดกำรกลำยพันธ์ุได้ง่ำยเมื่อเล้ียงบนอำหำรเป็นระยะ เวลำนำน ๆ วิธีกำรโดยกำรนำดินมำร่อนแล้วเข้ำหม้อน่ึงควำมดัน (เครื่อง autoclave) และนำมำใส่ใน ขวดปิดฝำแล้วนำไปน่ึงฆ่ำเช้ืออีกคร้ังหน่ึง ปล่อยให้เย็นแล้วนำสำรละลำยเช้ือมำใส่แล้วท้ิงไว้ท่ี อุณหภูมิห้อง จนกระท่ังเชื้อเจริญ แล้วนำไปเก็บไว้ในตู้เย็น เม่ือต้องกำรใช้งำนแบ่งตัวอย่ำงดินมำวำงบน อำหำรเลยี้ งเช้อื บ่มเช้อื ไว้ในอุณหภูมหิ ้องจนเห็นกำรเจริญของเชือ้ กำรเกบ็ รักษำเชือ้ บนกระดำษกรอง นำกระดำษกรองที่ผ่ำนกำรฆ่ำเช้ือแล้วมำวำงบนจำนอำหำร ตัดชิ้นวุ้นท่ีมีเช้ือรำเจริญอยู่ด้วย cork borer วำงบนจุดศูนย์กลำงของจำนอำหำร หยดน้ำกลั่นรอบบริเวณช้ินวุ้น 1-2 หยด นำไปเลี้ยงเชื้อ จนกระทั่งเช้ือเจริญคลุมกระดำษกรอง ทิ้งไว้จนกระดำษกรองแห้งสนิท อำจใช้เวลำนำนถึง 3-5 สัปดำห์ หลังจำกน้ันนำกระดำษกรองไปตัดเป็นช้ินเล็ก ๆ ภำยใต้ตู้ปลอดเชื้อ หรือ laminar airflow แล้วนำไปใส่ หลอดปิดฝำให้สนิท นำไปเก็บไว้ในตู้เย็น เม่ือต้องกำรจะใช้นำแผ่นกระดำษกรองท่ีตัดไว้มำวำงบนอำหำร เลยี้ งเช้อื กำรเกบ็ ตวั อยำ่ งเช้อื จุลนิ ทรีย์ทีอ่ ุณหภูมเิ ยอื กแขง็ < -20C กำรเก็บเชอื้ ทอ่ี ุณหภมู เิ ยือกแขง็ -20C เกบ็ เชื้อไว้ใน silica gel กำรเก็บ spore บน anhydrous silica gel ที่ผ่ำนกำรฆ่ำเช้ือเป็นเทคนิคกำรเก็บรักษำเช้ือไว้ที่ อุณหภูมิ -20C สปอร์ของเชื้อรำท่ีเก็บด้วยวิธีนี้สำมำรถรักษำควำมช้ืนของสปอร์ได้นำนถึง 10 ปี silica gel มีขำยท่ัวไปตำมร้ำนขำยอุปกรณ์สำรเคมีทำงวิทยำศำสตร์ มีหลำยชนิดให้เลือกใช้ สำหรับกำร นำมำใช้ในกำรเก็บตวั อยำ่ งเช้ือจุลินทรียน์ ้ัน ผลึกของ silica gel ควรมีขนำดใหญ่และควรไม่มีสี เน่ืองจำก สีท่ีใส่เข้ำไปเพื่อเป็น indicator dye โดยทั่วไปจะมีสีฟ้ำ เมื่อมีควำมช้ืนจะเปล่ียนเป็นสีชมพู ซ่ึงสีเหล่ำนี้ อำจจะไปมีผลต่อเช้ือ วธิ กี ำรเกบ็ รักษำ 1. ใส่ผลึก silica gel ขนำด 6-12 mesh. Grade 40 เลอื กทีไ่ ม่มสี ี ใส่ในหลอด viral ประมำณ 1 ใน 3 ของหลอดปดิ ฝำ

กำรจำแนกเชอ้ื สำเหตุของโรคแมลงเบ้อื งตน้ 279 2. นำหลอดไปอบในตู้ oven ท่ีอุณหภูมิ 160-180C นำนประมำณ 6 ชั่วโมง เอำมำวำงไว้ จนเยน็ 3. เตรียมเชื้อโดยกำรใส่น้ำกล่ัน 1-5 ml ลงบนจำนอำหำรท่ีมี spore ของเชื้อ หรือแบคทีเรีย หรืออำจจะใช้ skim milk ทค่ี วำมเขม้ ข้น 5-7% (v/v) ทีผ่ ่ำนกำรฆ่ำเชื้อโดยวธิ ี autoclave 4. นำสำรแขวนลอยของเช้ือประมำณ 1-2 ml ใส่ในหลอด vial ในข้อ 2 ค่อย ๆ เขย่ำหลอดเชื้อ ใหส้ ำรแขวนลอยเขำ้ ไปยงั silica gel 5. เกบ็ หลอดไวอ้ ุณหภมู ิห้อง 2-3 วัน แลว้ นำไปเก็บไว้ในอุณหภมู ิ -20C 6. ตรวจสอบควำมมีชีวิตและกำรปนเป้ือนหลังจำกเก็บไว้ 2 สัปดำห์ เมื่อจะนำเชื้อมำใช้ นำหลอด vial ออกจำกตูอ้ ณุ หภูมิ -20C นำผลกึ silica gel มำ 1-3 ผลึกวำงบนอำหำรเลยี้ งเชื้อ กำรเก็บท่ีอุณหภูมิภำยใต้ควำมเย็นยิ่งยวด (cryogenic preservation in mechanical or liquid nitrogen freezers) ข้อควรพจิ ำรณำและวิธกี ำร กำรเก็บโดยวิธีน้ีเป็นกำรเก็บรักษำเช้ือที่มีชีวิตท่ีใช้โดยทั่วไปในห้องปฏิบัติกำร เป็นกำรเก็บที่ อณุ หภูมิต่ำมำก ต้ังแต่ -20 ถึง -80C เป็นวิธีกำรเก็บรักษำเช้ือจุลินทรีย์ท่ีดีท่ีสุดแบบหน่ึง แต่มีค่ำใช้จ่ำย สงู และใช้อปุ กรณท์ ่มี รี ำคำแพงเช่น ตู้ -80C 1. สำรป้องกนั กำรแข็งตวั ของเซลล์ (cryoprotectant) เป็ น ส ำรท่ี ช่ วย ท ำให้ เซ ล ล์ ไม่ ถู ก ท ำล ำย โด ย ก ำรก ล ำย เป็ น น้ ำแ ข็ ง เช่ น glycerol, dimethylphoxide (DMSO), polyethylene glycol และ propylene glycol แต่โดยทั่วไปแล้วใน ห้องปฏิบัติกำรที่ทำงำนเกี่ยวกับเชื้อรำจะเก็บเชื้อไว้ใน 10% glycerol และมีเช้ือรำบำงชนิดที่ใช้ DMSO 6% (v/v) เปน็ สำรป้องกนั กำรแขง็ ตัว แต่โดยทว่ั ไปแล้ว DMSO ไมเ่ หมำะที่จะนำมำใช้เปน็ สำรป้องกันกำร แขง็ ตวั สำหรบั เช้อื รำ นอกจำกนี้ยังมีสำรป้องกันกำรแข็งตัวของเซลล์จำพวกกรด เช่น กลูตำเมต มำเลต (malate) และแอสปำรำจีน (asparagine) และสำรจำพวกเบส เช่น ไลซีน (lysine) และอำร์จินิน (arginine) และ สำรที่ได้จำกธรรมชำติ เช่น แอลบูมิน (albumin) skim milk และซีรัม กำรจะเลือกใช้สำรป้องกันกำร แขง็ ตัวชนิดใด ควรเลือกให้เหมำะสมกับเชอื้ จุลินทรยี ์ทจี่ ะนำไปเกบ็ รักษำด้วย 2. วสั ดุทใี่ ช้ในกำรเกบ็ เชอ้ื อำจจะใช้หลอดพลำสติกสำหรับกำรเก็บเชื้อโดยวิธี cryogenic preservation โดยเฉพำะ หรือ หลอดดูดพลำสติก รวมถึงหลอดแก้ว ampoules กำรจะเลือกใช้วัสดุประเภทไหนขึ้นอยู่กับควำม สะดวกสบำยของกำรใช้ รำคำ และกำรพิจำรณำถงึ ควำมปลอดภัย โดยทั่วไปแล้วยังนิยมใช้หลอดที่ผลิตข้ึนมำโดยเฉพำะ ถึงแม้ว่ำจะมีรำคำแพงก็ตำม หรือกำรใช้ หลอดกำแฟก็มีคนนิยมใช้กันอยู่เน่ืองจำกรำคำถูก และหลอด ampoules มีกำรเลือกใช้น้อยลงเนื่องจำก

กำรจำแนกเชื้อสำเหตุของโรคแมลงเบอื้ งต้น 280 วิธีกำรใช้ค่อนข้ำงยุ่งยำกและควำมไม่ปลอดภัยในช่วงกำรเปล่ียนถ่ำยอำจทำให้หักและเป็นอันตรำยต่อ ผ้ปู ฏิบัติงำนได้ สำหรับวิธีกำรเกบ็ รักษำเชอ้ื จุลินทรีย์ที่เจริญบนอำหำรแข็ง ใส่ cryoprotoctant ในภำชนะอำจเป็นหลอด vials หรือหลอดกำแฟ ตัดชิ้นวุ้นท่ีมีเช้ือ เจรญิ อยู่ ตดั เป็นชนิ้ เล็ก ๆ โดยให้มีอตั รำส่วน  40 : 1 (cryoprotectant : inoculum) กำรเกบ็ เชื้อในกระเบอ้ื งลกู ปดั (cryobeads) วิธีกำรนี้เหมำะสำหรับกำรเก็บเชื้อรำและเช้ือแบคทีเรีย โดยกำรผสมสำรละลำยของแบคทีเรีย หรือเช้ือรำกับสำรป้องกันกำรแข็งตัว (cryopreservation fluid) เช่น กลีเซอรอล ไว้ในหลอด vial แล้ว นำลูกปัดมำแช่ทิ้งไว้ เนื่องจำกลูกปัดมีรูพรุนจะช่วยดูดซับสำรละลำยเอำไว้ภำยใน ปิดฝำให้แน่น แล้ว นำไปเก็บไว้ท่ีตู้เยือกแข็ง -80C เมื่อต้องกำรนำไปใช้หรือตรวจสอบกำรมีชีวิตรอดของเช้ือจุลินทรีย์ นำ ลูกปดั ออกมำวำงในอำหำรเหลว หรอื บนอำหำรเล้ียงเช้ือท่ีเหมำะสม กำรเกบ็ ในไนโตรเจนเหลว เป็นวิธีกำรเก็บเช้ือจุลินทรีย์ที่ดีที่สุดวิธีหนึ่ง กำรรอดชีวิตและควำมคงที่ของเชื้อจุลินทรีย์ ที่เก็บโดยวิธีน้ีมีสูง ส่วนใหญ่นิยมเก็บรักษำ seed stock cultures เชื้อจะอยู่ในสภำพพักตัวไม่มีกำร เปลี่ยนแปลงลักษณะทำง genotype และ phenotype วิธีกำรเก็บโดยกำรเตรียมสำรละลำยเช้ือที่ผสม สำรป้องกันกำรแข็งตัว แล้วค่อย ๆ ลดอุณหภูมิลงจนถึง -35C และทำให้เยือกแข็งอย่ำงรวดเร็วโดยกำร แช่ในไนโตรเจนเหลว ซ่ึงมีอุณหภูมิ -196C หรือแช่ในไอของไนโตรเจนเหลวอุณหภูมิจะเพ่ิมข้ึนเป็น -140C กำรทำใหแ้ ห้งแบบเยอื กแขง็ (freeze-drying หรอื lyophilization) เป็นวิธีกำรที่ทำให้ของเหลวระเหยไปจำกสำรละลำยเช้ือที่ผ่ำนกำรทำให้เยือกแข็งแล้ว โดยกำร เตรียมสำรละลำยเชื้อใน skim milk หรือ ใน glucose serum แล้วนำไปเข้ำเคร่ืองทำให้เซลล์แข็งตัว ในสภำพสูญญำกำศ หรือในสภำพแก๊สเฉื่อย ทำให้น้ำในเซลล์ของจุลินทรีย์ถูกดูดออกโดยกำรระเหิด จลุ ินทรีย์จะอยู่ในสภำพแห้งและยังคงมีชีวิตอยู่ เหมำะสำหรับกำรเก็บเช้ือเป็นจำนวนมำก และเก็บรักษำ ได้ยำวนำนโดยไม่ต้องดูแล ขนสง่ งำ่ ย ไม่สิ้นเปลืองระหว่ำงกำรเก็บรักษำ ส่วนใหญ่จะเก็บอย่ใู นหลอดแก้ว ขนำดเล็กทีเ่ รยี กวำ่ ampoules กำรเก็บรักษำไสเ้ ดอื นฝอย กำรเก็บในระยะส้นั ไส้เดือนฝอยสำเหตุโรคในแมลง สำมำรถเก็บรักษำได้ในน้ำกลั่น โดยไส้เดือนฝอย steinernematids เก็ บ ได้ ท่ี อุ ณ ห ภู มิ 4 -1 5 C เป็ น เว ล ำ 6 -9 เดื อ น ใน ข ณ ะ ที่ ไส้ เดื อ น ฝ อ ย heterorhabditids เก็บไดท้ ่อี ณุ หภูมิเดยี วกนั แต่ระยะเวลำสัน้ กว่ำ คือ 3-4 เดือน กำรเก็บในระยะยำว

กำรจำแนกเช้ือสำเหตุของโรคแมลงเบือ้ งต้น 281 คือเก็บไว้ท่ีอุณ หภูมิต่ำมำก คือ ต่ำกว่ำ -130C แต่ต้องใส่สำรป้องกันกำรแข็งตัว (cryoprotectants) วิธกี ำร 1. ผสม nematode กับ glycerol ให้เขำ้ กนั โดยใช้ magnetic stirrer 2. เทใสจ่ ำนแก้ว แลว้ วำงไว้ในตูป้ รับอณุ หภมู ทิ ี่ 23C เป็นเวลำ 72 ชวั่ โมง 3. กรอง nematode โดยใช้เครื่องดูด (suction) บนกระดำษกรองเบอร์ 42 ซึ่งใน ข้ันตอนน้ี nematode จะมี 2 ส่วน คือ ส่วนหน่ึงท่ีมีขนำดใหญ่จะอยู่บนกระดำษกรอง อีกส่วนหน่ึงจะ ผ่ำนกระดำษกรองอย่ใู นด้ำนล่ำง 4. ล้ำง nematode ทอี่ ยบู่ นกระดำษกรองดว้ ย methanol 70% อุณหภูมปิ ระมำณ 5°C แล้วนำไปใส่หลอด แล้วนำไปปัน่ ในเครือ่ ง centrifuge ท่ีปรับอณุ หภูมิตำ่ ได้ เอำน้ำใสด้ำนบนทิ้ง สว่ น nematode ส่วนที่ 2 ที่ผ่ำนกระดำษกรอง นำมำปั่นแลว้ เติม methanol 70% อุณหภูมิ 23°C นำเอำน้ำ ใสทงิ้ 5. ลำ้ ง nematode อีกคร้ังดว้ ย 70% methanol รอใหต้ กตะกอน 6. ดูดตะกอนซ่ึงมี nematode มำใส่ในหลอด cryotubes ประมำณ 2 ml ปิดฝำให้ สนิทแลว้ ใสใ่ นถัง nitrogen เหลว 7. เมื่อจะนำ nematode ออกมำใช้ เปิดฝำแล้วใส่ Ringer’s solution 15-30 ml ที่ อุณหภมู ิ 23C ท้ิงไว้ 24 ชวั่ โมง

กำรจำแนกเชือ้ สำเหตขุ องโรคแมลงเบอ้ื งตน้ 282 12.4 สถำนท่เี กบ็ เช้ือจุลินทรยี ์ในต่ำงประเทศ ตำรำงที่ 12-1 รำยชอ่ื ของเช้ือจลุ ินทรีย์ที่เก็บอยู่ตำมสถำนท่ีต่ำง ๆ ทว่ั โลก และประเภทของกำรบริกำร Culture Acronym Types of holdings URL Country Services collections Agricultural NRRL Bacteria, fungi, yeast, http://nrrl.ncaur.usda.gov/ USA Deposit and Research Service distribution Culture Collection American Type ATCC Bacteria, viruses, fungi, http://www.atcc.org USA GD, SD, IDA Culture Collection yeast mycoplasma testing, cell authentication, DNA, RNA supply from ATCC strains Belgian LMG Fungi, yeasts, plasmids, http://bccm.belspo.be/ind Belgium GD, SD, IDA Coordinated DNA libraries, bacteria, ex.php identification and Collections of mycobacteria, polar supply Microorganisms/lmg Cyanobacteria Bacteria Collection Belgian BCCM/IHEM Biomedical fungi and yeast http://bccm.belspo.be/ab Belgium GD, SD, IDA supply Coordinated out/ihem.php cultures and Collections of identification Microorganisms Czech Collection of CCM Bacteria (aerobic), fungi, http://sci.muni.cz/ccm/ind Czech GD, SD, IDA Microorganisms yeast, viruses, archaea ex.html identification and supply Microbial Type MTCC Bacteria, fungi, yeast, http://mtcc.imtech.res.in India GD, SD, IDA Culture Collection Actinomycetes, identification and and Gene Bank Cynobacteria supply Microbial Culture MCC Bacteria, fungi, yeast, http://www.nccs.res.in/ India GD, SD, IDA Collection Actinomycetes identification and supply Deutsche DSMZ Bacteria fungi, yeast, http://www.dsmz.de Germany GD, SD, IDA Sammlung von viruses, archaea, plasmid identification and Mikroorganismen supply strains and und Zellkulturen DNA GmbH Japan Collection of JCM Bacteria, fungi, yeast, http://www.jcm.riken.jp/ Japan GD, supply of DNA Microorganisms Actinomycetes, archaea and strains NITE Biological NBRC Bacteria, Archaea, yeasts, http://www.nbrc.nite.go.jp Japan GD, SD, IDA supply Resource Center filamentous fungi, /e/index.html cultures and bacteriophages, algae identification