เอกสารประกอบการสอน_403-25-16_IM_เผยแพร่_2020

เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 142

เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 143

เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 144

เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 145

แบบฝกึ หัดสัปดาห์ที่ 7 1. จงอธิบายหลักการทาํ งาน การใช้งานของเครอ่ื งปัน่ เหว่ียงแยกสาร พร้อมวธิ กี ารดแู ลรกั ษา ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ 2. ถ้าผู้ใช้งานต้องการใช้งานเคร่ืองป่ันเหว่ียงแยกสาร ปั่นแยกตัวอย่างท่ีอุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส ควรเลือกใช้ เคร่ืองมือใด และเคร่ืองน้มี ีการใชง้ านอย่างไร จงอธบิ าย ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ 3. จงอธิบายความแตกต่างของการใช้งานของตู้บ่มเชื้อควบคุมอุณหภูมิ กับ ตู้บ่มเชื้อควบคุมอุณหภูมิแบบเขย่า ใน การเลย้ี งเช้อื จลุ นิ ทรีย์ ลักษณะอาหารที่ใชเ้ ล้ียงเชื้อควรมีลักษณะทางกายภาพเป็นแบบใด ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ เทคนิคและการใชเ้ ครอื่ งมือทางจุลชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 146

4. กรณีศึกษา ในการเตรียมอาหารเล้ียงเชื้อท่ีต้องเติมสารบางชนิด หลังจากน่ึงฆ่าเชื้อ ปริมาณ 0.5 มิลลิลิตร 1 มิลลลิ ิตร 5 มิลลิลิตร และ 7.5 มลิ ลิลติ ร ควรเลือกใช้เครอื่ งมือชนิดใดบา้ ง พร้อมอธบิ ายเหตุผล ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ 5. จงยกตัวอย่างการใช้ประโยชน์ของตู้บ่มเช้ือควบคุมอุณหภูมิ และ ตู้บ่มเช้ือควบคุมอุณหภูมิแบบเขย่า ในงาน ทางด้านจุลชีววทิ ยา ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ เทคนคิ และการใช้เครือ่ งมือทางจลุ ชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 147

เฉลย แบบฝกึ หัดสปั ดาหท์ ่ี 7 1. จงอธิบายหลักการทํางาน การใช้งานของเครอ่ื งปนั่ เหวี่ยงแยกสาร พร้อมวิธกี ารดแู ลรักษา ระบบการทํางานของเครื่องปั่นเหว่ียงแยกสาร ควบคุมด้วยระบบไมโครโพรเซสเซอร์ ส่วนต้ังค่าความเร็ว รอบของการหมุนเหว่ียงของเคร่ืองมีค่าความถูกต้องของความเร็วรอบ ±1.5% หน้าจอ LED แสดงค่าต่างๆ เป็น ตัวเลข ดังน้ี ความเร็ว (Speed) / ค่าแรงหนีศูนย์กลางสัมพัทธ์ RCF, เวลาท่ีเคร่ืองทํางาน(running time) และ อุณหภูมิโดยแยกออกจากกัน สําหรับเครื่องปั่นเหวี่ยงแยกสารท่ีควบคุมอุณหภูมิได้ ปรับต้ังอุณหภูมิได้ตั้งแต่ -10 ถึง +40 องศาเซลเซียส โดยมีระบบการทําความเย็นล่วงหน้า และสารทําความเย็นชนิด CFC-freeมีปุ่ม quick กด ต้ังความเร็วรอบในการหมุนเหว่ียงตามท่ีผู้ใช้ต้องการในระยะเวลาส้ันได้ มีปุ่มกดต้ังช่วงเวลาท่ีต้องการป่ันเหวี่ยง แยกสารให้ตกตะกอน มรี ะบบความปลอดภัย ในกรณีทห่ี วั ป่ันไม่สมดุลย์ (imbalance switch-off) การดูแลรักษา ทุกคร้ังท่ีใช้เครื่องนี้เสร็จแล้ว นําสิ่งของออก แล้วเช็ดทําความสะอาดด้วย แอลกอฮอล์ 70% ชบุ หมาดๆ 2. ถ้าผู้ใช้งานต้องการใช้งานเคร่ืองปั่นเหว่ียงแยกสาร ปั่นแยกตัวอย่างท่ีอุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส ควรเลือกใช้ เครอ่ื งมือใด และเครอ่ื งนี้มีการใชง้ านอยา่ งไร จงอธบิ าย เลือกใช้เครื่องป่ันเหว่ียงแยกสาร แบบต้ังอุณหภูมิได้ ก่อนใช้งานผู้ปฏิบัติงานต้องต้ังอุณหภูมิที่ 4 องศา เซลเซียส ให้เคร่ืองได้ทําความเย็นก่อน ประมาณ 20 นาที จากนั้นจึงนําตัวอย่างทดลองมาใส่ลงในเครื่อง แล้วทํา การปน่ั ตกตะกอน แยกตวั อยา่ งออกจากสารละลาย 3. จงอธิบายกความแตกต่างของการใช้งานของตู้บ่มเช้ือควบคุมอุณหภูมิ กับ ตู้บ่มเช้ือควบคุมอุณหภูมิแบบเขย่า ในการเลย้ี งเช้อื จุลินทรยี ์ ลักษณะอาหารทีใ่ ชเ้ ลี้ยงเชือ้ ควรมลี ักษณะทางกายภาพเป็นแบบใด เครื่องตู้บ่มเชื้อ ใช้ในการบ่มเลี้ยงเช้ือจุลินทรีย์บนอาหารแข็งที่มีการใส่วุ้นลงไปในอาหาร เพื่อให้ เชื้อจุลินทรีย์เจริญเติบโต ในขณะที่ เครื่องบ่มเชื้อควบคุมอุณหภูมิแบบเขย่า ใช้เล้ียงเชื้อจุลินทรีย์ในอาหารเหลว เพอื่ เพิ่มจาํ นวนจุลินทรยี ์ ไว้ใช้ในงานต่างๆ ที่ตอ้ งการ เทคนคิ และการใช้เครอ่ื งมือทางจุลชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 148

4. กรณีศึกษา ในการเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อที่ต้องเติมสารบางชนิด หลังจากน่ึงฆ่าเชื้อ ปริมาณ 0.5 มิลลิลิตร 1 มลิ ลิลติ ร 5 มลิ ลลิ ติ ร และ 7.5 มลิ ลลิ ิตร ควรเลือกใช้เครื่องมอื ชนดิ ใดบา้ ง พรอ้ มอธบิ ายเหตุผล ผู้ปฏิบัติงานต้องดูปริมาตรของสารท่ีต้องการเติมเสียก่อน สําหรับสาร0.5 มิลลิลิตร 1 มิลลิลิตร ควร เลอื กใช้ micropipette สว่ นสารปรมิ าตร 5 มิลลิลิตร และ 7.5 มิลลิลติ ร ควรใช้ ปิเปตแก้ว ปรมิ าตร 10 มลิ ลิลติ ร 5. จงยกตัวอย่างการใช้ประโยชน์ของตู้บ่มเช้ือควบคุมอุณหภูมิ และ ตู้บ่มเช้ือควบคุมอุณหภูมิแบบเขย่า ในงาน ทางดา้ นจุลชวี วทิ ยา ตู้บ่มเช้ือควบคุมอุณหภูมิ หรือ ตู้บ่มเชื้อควบคุมอุณหภูมิแบบเขย่า ใช้ในการเล้ียงเช้ือจุลินทรีย์บนอาหาร แข็ง หรือ อาหารเหลวที่อยู่ในหลอดเพื่อตรวจสอบคุณสมบัติทางชีวเคมี เช่น ต้องการเพาะเล้ียงแบคทีเรีย Escherichia coli บนอาหาร EMB agar ต้องต้ังอุณหภูมิท่ีเหมาะสมเพ่ือการเจริญเติบโตที่ 37°C หรือ ต้องการ เลย้ี งเชื้อยสี ต์ Saccharomyces cerevisiae บนอาหาร YPD agar ต้องต้งั อณุ หภูมทิ ี่เหมาะสมเพ่ือการเจรญิ เติบโต ท่ี 30°C ส่วนการใช้งานตู้บ่มเชื้อควบคุมอุณหภูมิท่ีสามารถเขย่าได้ ใช้ในการเลี้ยงเช้ือจุลินทรีย์ในอาหารเหลวท่ีอยู่ ในขวดภาพชมพู่ หรือ หลอดทดลอง เพ่ือเพ่ิมอัตราการเจริญเติบโตในระยะเวลาสั้น โดยเล้ียงเชื้อจุลินทรีย์ตาม อุณหภมู ิทเ่ี หมาะสมต่อการเจริญเติบโต เทคนิคและการใชเ้ คร่ืองมือทางจลุ ชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 149

กจิ กรรมท่ี 3.1 ให้ผู้เรียนฝึกทักษะการใช้เคร่ืองมือ โดยกําหนดให้ผู้เรียนออกแบบการเล้ียงเช้ือจุลินทรีย์ให้เจริญในอาหาร เลี้ยงเช้ือที่เหมาะสม ด้วยตู้บ่มเช้ือควบคุมอุณหภูมิแบบเขย่า และฝึกทักษะการเก็บจุลินทรีย์ ด้วยเครื่องป่ันเหว่ียง แยกสาร ร่วมกับการใชเ้ คร่ืองดูดสารปริมาณนอ้ ย ในช่วงค้นคว้านอกเวลา เทคนคิ และการใชเ้ ครือ่ งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 150

ใบเตรียมการสอน แผนการสอนสัปดาห์ท่ี 8 รหสั วิชา 403 – 25 – 16 บทเรยี นท่ี 3.3 หนว่ ยท่ี 3 เครื่องมือเฉพาะทางจุลชวี วิทยา เวลาเรียน 2 ช่ัวโมง บทเรียนท่ี 3.3 เครอื่ งมือเฉพาะใช้ในการตรวจสอบจุลนิ ทรยี ์และดีเอน็ เอ จุดประสงค์การสอน 3.3 เขา้ ใจและประยุกตเ์ ครอื่ งมือเฉพาะใช้ในการตรวจสอบจุลินทรีย์และ 2 ชวั่ โมง ดเี อ็นเอไดเ้ หมาะสม 3.3.1 อธิบายและประยุกต์ใช้เครอื่ งวัดคา่ การดูดกลนื แสงได้ถูกตอ้ ง 3.3.2 ยกตัวอย่างและประยกุ ต์ใชต้ ู้เพาะเช้ือจุลินทรยี ์สภาพไรอ้ อกซิเจนได้ถูกตอ้ ง เทคนิคและการใช้เครอ่ื งมือทางจุลชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 151

หน่วยท่ี 3 เครือ่ งมอื เฉพาะทางจลุ ชีววิทยา (Specific Instruments in Microbiology) บทเรียนท่ี 3.3 เครือ่ งมอื เฉพาะใช้ในการตรวจสอบจุลินทรียแ์ ละดีเอ็นเอ บทนํา ในบทนี้จะกล่าวถึงเคร่ืองมือเฉพาะสําหรับนักจุลชีววิทยาต่อ ได้แก่ เคร่ืองวัดค่าการดูดกลืนแสง และ ตู้เพาะเช้ือจุลินทรีย์สภาพไร้ออกซิเจน เครื่องมือเหล่านี้ถูกจัดจําแนกอยู่ในกลุ่มเครื่องมือเฉพาะ ผู้ปฏิบัติงานหรือ นักจุลชีววิทยาต้องรู้ส่วนประกอบหลักของเครื่องมือ การใช้งานของเคร่ืองมือให้เหมาะสมกับชิ้นงาน การ บํารุงรักษาและการแก้ไขอาการผิดปกติเบ้ืองต้นได้อย่างเหมาะสม และการนําไปใช้ประโยชน์ร่วมกับงานด้านต่างๆ เชงิ บรู ณาการ 3.3.1 เคร่ืองวัดค่าการดูดกลืนแสง (UV-Vis Spectrophotometer) เครื่องวัดค่าการดูดกลืนแสง (ภาพท่ี 3.13) เป็นเครื่องมือที่ใช้ในการตรวจวัดปริมาณแสงและค่าความ เข้มของแสง ในช่วงรังสียูวีและช่วงแสงขาวท่ีทะลุผ่านหรือถูกดูดกลืนโดยตัวอย่างท่ีวางอยู่ในช่อง โดยท่ีความยาว คล่นื แสงจะมคี วามสัมพนั ธ์กับปริมาณและชนดิ ของสารทีอ่ ยู่ในตวั อยา่ ง (ก) เครื่องวัดการดูดกลนื แสงของสารแบบใช้คิวเวทท์ เทคนคิ และการใช้เคร่ืองมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 152

(ข) เครื่องวัดการดูดกลืนแสงของสารทีใ่ ช้สารปริมาณนอ้ ย (μl) (nanospectrophotometer) ภาพที่ 3.13 เครือ่ งวัดการดูดกลนื แสง (ที่มา: หอ้ งปฏิบตั กิ ารจุลชีววิทยา มทร.สุวรรณภมู ิ, 2559) สว่ นประกอบและหลกั การทาํ งาน 1. แหลง่ กาํ เนิดแสง รังสี ช่วงความยาวคลื่นของรังสียูวี และแสงสีขาว ที่ต้องการอย่างต่อเนื่องและคงที่ตลอดเวลา รวมท้ังมี ความเข้มแสงท่ีมากพอด้วย หลอดกําเนิดแสง มีหลายชนิดตามความยาวคลื่นแสงท่ีเปล่งออกมา ซึ่งต้องเลือกใช้ให้ ถูกต้องเหมาะสมกับของเหลวที่นํามาวัดค่าดูดกลืนแสง ค่าความยาวคลื่นแสงที่วัตถุแต่ละชนิดสามารถดูดกลืนแสง ได้ในช่วง 100-750 นาโนเมตร (nm) (ภาพท่ี 3.14) ภาพที่ 3.14 ค่าความยาวคลนื่ แสงของรงั สียูวีและแสงสีขาว (ที่มา: http://ec.europa.eu/health/scientific_committees/opinions_layman/glossary/ghi/infrared-radiation.html) เทคนคิ และการใช้เครื่องมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 153

2. Monochromator เปน็ สว่ นทใี่ ชค้ วบคุมแสงโดยจะทาํ ใหแ้ สงท่ีออกมาจากตน้ กําเนิดแสง ซง่ึ เปน็ พอลโิ ครเมติก ให้เปน็ แสงโม โนโครเมติก ซึ่งเป็นแถบแสงแคบๆ หรือมีความยาวคลื่นเดียว ใชฟ้ ิลเตอร์(กระจกสี) ปรซิ ึม (prism) หรือ เกรตตงิ้ (grating) 3. เซลล์ทีใ่ ชบ้ รรจสุ ารละลายตัวอย่าง เซลลท์ ี่ใส่สารตัวอย่าง (cell sample) หรอื อาจเรยี กว่า ควิ เวทท์ (cuvette) เปน็ ภาชนะสําหรับใส่ตัวอย่าง ของเหลวที่ต้องการนําไปวิเคราะห์ ทําจากวัสดุหลายประเภท โดยทั่วไป ได้แก่ เซลล์ท่ีทําด้วยแก้ว หรือ พลาสติก จะใช้ได้เฉพาะช่วงแสงสีขาว เพราะเน้ือแก้ว หรือพลาสติกสามารถดูดกลืนแสงในช่วงยูวีได้ ส่วนเซลล์ที่ทําด้วย ซิลิกา และควอร์ตซ์ (quartz) จะดูดกลืนแสงช่วงยูวีได้น้อยมาก จึงใช้ในการวิเคราะห์ค่าการดูดกลืนแสงได้ท้ังช่วง รังสยี วู ี และแสงสีขาว ดังน้นั การเลอื กใช้ควิ เวทท์จึงมีผลมากตอ่ การวิเคราะห์ คิวเวททแ์ กว้ และ พลาสติกใส ใช้งาน ในชว่ งแสงสขี าวเทา่ นั้น ในขณะที่ ควิ เวทท์ quartz หรอื fuse silica ใชง้ านได้ทั้งในชว่ งแสงสีขาวและรังสียูวี (ภาพ ท่ี 3.15) ชนดิ ของคิวเวทท์ และชว่ งความยาวคลืน่ ท่ีเหมาะสมกับวัสดทุ ่ีนํามาผลติ คิวเวทท์ -plasticor glass cuvette (acrylic) ส่วนใหญใ่ ชว้ ัดปรมิ าณเซลล์จุลินทรยี ์ หรอื สารที่ทาํ ปฏิกริ ิยากัน ประมาณ 0.5-1 ml -quartz cuvette ส่วนใหญใ่ ชว้ ัดปริมาณ สารพันธุกรรม ทีม่ ปี ริมาณนอ้ ย 0.1-0.5 ml -electroporation cuvette ใชใ้ นการ transformation plasmid จากแบคทเี รียเข้าสู่เซลล์จลุ ินทรีย์ ภาพท่ี 3.15 ช่วงความยาวคล่ืนทีเ่ หมาะสมกับวัสดทุ ่นี าํ มาผลิตคิวเวทท์ (ท่มี า: http://www.chem.ucla.edu/~bacher/General/30BL/tips/UV-VIS.html) เทคนิคและการใช้เครอ่ื งมือทางจลุ ชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 154

4. Detector ทําหน้าท่ีในการวัดความเข้มของรังสีที่ถูกดูดกลืนโดยการแปลงพลังงานคลื่นรังสีเป็นพลังงานไฟฟ้าเคร่ือง ตรวจจับสัญญาณท่ีดีต้องมีสภาพไวสูง คือแม้ปริมาณแสงจะเปล่ียนไปเล็กน้อย ก็สามารถตรวจจับสัญญาณความ แตกต่างได้ เคร่ืองวัดแสงที่ยังนิยมกันอยู่ในปัจจุบัน คือ หลอดโฟโตมัลติพลายเออร์ (photomultiplier tube, PMT) และเครอ่ื งวัดแสงชนิดซิลิกอนไดโอด (silicon diode detector) คณุ สมบัติในการดูดกลืนแสงของสาร เม่ือโมเลกุลของตัวอย่างถูกฉายด้วยแสงท่ีมีพลังงานเหมาะสมจะทําให้อิเล็กตรอนภายในอะตอมเกิดการ ดดู กลืนแสงแล้วเปลี่ยนสถานะไปอยู่ในช้ันท่ีมีระดับพลังงานสูงกว่าเม่ือทําการวัดปริมาณของแสงท่ีผ่านหรือสะท้อน มาจากตัวอย่างเทียบกับแสงจากแหล่งกําเนิดท่ีความยาวคลื่นค่าต่างๆ ตามกฎของ Beer-Lambert ค่าการดูดกลืน แสง (absorbance) ของสารจะแปรผันกับจํานวนโมเลกุลที่มีการดูดกลืนแสง ดังนั้นจึงสามารถใช้เทคนิคน้ีระบุ ชนิดและปริมาณของสารตา่ งๆ ทม่ี อี ยใู่ นตวั อยา่ งได้ ในทางจุลชีววิทยา ใช้หาความหนาแน่นของเซลล์โดยวัดความขุ่น ใช้หลักการดูดกลืนคลื่นแสงท่ีไม่เท่ากัน ของจํานวนจุลินทรีย์ท่ีมากขึ้น ปริมาณแสงที่ดูดกลืนไว้และกระจายออกจะเป็นสัดส่วนกับความหนาแน่นของเซลล์ นําสารละลายของจุลินทรีย์ใส่ในหลอดวัดท่ีเรียกว่าคิวเวทท์ อ่านเปอร์เซนต์แสงที่ผ่านออกมา (%transmittance) ถ้าสารละลายเซลล์จุลนิ ทรีย์ มคี วามขนุ่ มาก เปอรเ์ ซนต์ที่แสงผา่ นได้ มนี อ้ ย อา่ นคา่ optical density (OD) ซ่ึงเปน็ สดั สว่ นโดยตรงกบั ความหนาแนน่ หรอื จํานวนเซลล์ วิธกี ารใช้งานและการบํารงุ รักษา 1. เปิดเคร่ืองไว้ 15 นาที เลือกควิ เวทท์ ที่เหมาะสมกับการวดั 2. เตรียมตัวอย่างทีจ่ ะวัดใหเ้ รียบร้อย ใช้ micropipette ดดู สารเปรียบเทยี บ (blank) ใส่ลงในควิ เวทท์ตั้ง ค่าของสารเปรียบเทียบก่อน 3. ใช้ micropipette ดูดสารตวั อยา่ งใสล่ งในควิ เวทท์ วัดค่าความแตกตา่ งของการดูดกลนื แสงระหว่าง สารตัวอย่างกับสารเปรียบเทียบ 4. เม่ือใช้เครอ่ื งเสร็จแล้วควรตรวจสอบใหเ้ รียบร้อย ปดิ เครื่อง ดึงปลั๊กออกทุกคร้ังหลังใชง้ าน 5. หากมีปัญหา ไม่ว่ากรณีใดๆ เบ้อื งตน้ หากผใู้ ช้งานแก้ไขได้ใหป้ ฏบิ ัตกิ ารแก้ไข หากไม่สามารถแก้ไขไดใ้ ห้ รบี แจ้งอาจารย์ผู้ดแู ลหรือเจ้าหน้าที่วทิ ยาศาสตร์ทันที เทคนคิ และการใช้เคร่อื งมือทางจลุ ชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 155

ประโยชนใ์ นการใชง้ าน เครอื่ งวดั การดูดกลนื แสงของสาร และ เครอ่ื งวัดการดูดกลนื แสงสารปริมาณน้อย (ภาพที่ 3.14) นยิ มใช้วัด ปรมิ าณจุลินทรียใ์ นอาหารเหลว เพอื่ ศึกษาปัจจัยท่มี ีผลตอ่ การเจริญเติบโตของจุลินทรีย์ วดั ปรมิ าณ DNA หรือ สาร พันธุกรรม, RNA หรือโปรตีน วัดค่าการดูดกลืนแสงของสารที่ต้องการศึกษา เช่น การทํางานของเอนไซม์ การวัด ปริมาณนํา้ ตาลรีดิวซ์ 3.3.2 ต้เู พาะเชื้อจุลินทรียส์ ภาพไร้ออกซิเจน (Anaerobic chamber) ตู้เพาะเชื้อจุลินทรีย์สภาพไร้ออกซิเจน เป็นเครื่องมือที่ใช้ในการเพาะเช้ือจุลินทรีย์ท่ีไม่ใช้ออกซิเจนในการ เจริญเติบโต ถ้ามีออกซิเจนจะเป็นพิษต่อเซลล์ ต้องนําออกซิเจนออกจากอาหารเล้ียงเช้ือโดยใช้ ก๊าซไนโตรเจนใส่ เข้าไปแทน โดยเครอื่ งน้ี มีรปู แบบ 2 ลกั ษณะคอื โถเพาะเชื้อจุลินทรีย์ (anaerobic jar) (ภาพที่ 3.16) หรอื ตู้เพาะ เชื้อจุลินทรีย์ (anaerobic chamber) (ภาพที่ 3.17) ซึ่งใช้เล้ียงจุลินทรีย์ในกลุ่มแอนแอโรบิค โดยจุลินทรีย์ (microbes) แบ่งตามการใช้ออกซเิ จนได้เป็น 3 กลมุ่ ดังน้ี -จุลินทรียก์ ลุ่มแอโรบิค (aerobic microbes) คอื จุลนิ ทรียท์ ี่เจรญิ เตบิ โตตอ้ งใช้ออกซิเจน -จุลินทรีย์กลุ่มแอนแอโรบิค (anaerobic microbes) คอื จลุ นิ ทรีย์ท่เี จริญเติบโตโดยไม่ตอ้ งใชอ้ อกซิเจน และออกซิเจนจะเปน็ พิษต่อเซลล์ -จุลนิ ทรีย์กลุ่ม แฟกคัลเททีฟ (facultative microbes) คือ จุลินทรีย์ท่ีเจริญเติบโตได้ท้งั ในสภาวะที่ใช้ ออกซเิ จนและไมใ่ ชอ้ อกซิเจน ภาพท่ี 3.16 โถเพาะเช้ือสภาพไร้ออกซเิ จน (anaerobic jar) แบบมีแกส๊ แพค (ท่ีมา: http://www.labyindia.com /pdf_literature/20.pdf) เทคนคิ และการใชเ้ ครอื่ งมือทางจุลชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 156

ภาพที่ 3.17 ตู้เพาะเชื้อสภาพไร้ออกซิเจน (anaerobic chamber) (ทมี่ า: หอ้ งปฏิบัติการมหาวิทยาลยั เทคโนโลยีพระจอมเกล้าธนบรุ ี, 2557) ส่วนประกอบและหลักการทาํ งาน 1. เครื่องมือน้ีใช้ในการเพาะเล้ียงเชื้อจุลินทรีย์ที่ไม่ใช้ออกซิเจน หรือไม่ใช้อากาศ โดยใช้ร่วมกับสารเคมีที่ สรา้ งสภาวะปราศจากออกซิเจน 2. ประกอบด้วย 2 ส่วน คือ ส่วนโถและส่วนฝา ซ่ึงทําด้วยวัสดทุ ี่แข็งแรงทนทาน โดยส่วนฝาประกอบด้วย ตวั กดล็อกไม่น้อยกว่า 2 ตวั สําหรบั โถเพาะเชอ้ื สภาพไร้ออกซิเจน 3. ตู้ด้านในทาํ ดว้ ยสแตนเลส บริเวณทใี่ สข่ องหรือเชอื้ จุลนิ ทรียท์ ต่ี ้องการศึกษา 4. มีปุ่มกดต้ังค่าต่างๆ บริเวณหน้าเคร่ือง เช่น ต้ังค่าอุณหภูมิในการบ่มเชื้อจุลินทรีย์ มีระบบแพร่กระจาย อุณหภมู ิสมํา่ เสมอ 5. มีบริเวณท่ีปล่อยก๊าซอื่นๆ เข้าไปแทนก๊าซออกซิเจน มีระบบตัดการทํางานเม่ือเคร่ืองเกิดความผิดปกติ ในการนาํ กา๊ ซเข้า 6. มีบริเวณท่ีสอดมือเข้าไปปฏิบัติงานได้สะดวกในสภาพเลี้ยงเช้ือจุลินทรีย์ท่ีไม่ต้องการก๊าซออกซิเจนใน สภาพปลอดเช้ือ มีประตู 2 ช้ัน ช้ันท่ี 1 เป็นประตูทึบทําด้วยวัสดุไม่เป็นสนิม ไว้วางส่ิงของก่อนเข้าทํางานจริง ภายในเคร่ือง เพ่ือให้ก๊าซท่ีปล่อยออกมาแทนออกซิเจนที่ติดไปกับส่ิงของ ประตูชั้นที่ 2 เป็นกระจกใสไว้ เพ่ือ การ มองเห็นขณะปฏบิ ัติงาน และดผู ลการทดลอง 7. บริเวณใส่ภาชนะบ่มเชื้อจุลินทรีย์ท่ีไม่ต้องการออกซิเจนให้เจริญเติบโตที่อุหณภูมิต่างๆ เป็นช้ันวางทํา ด้วยสแตนเลส เทคนิคและการใช้เคร่อื งมือทางจลุ ชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 157

8. มีขดลวดนําความร้อนฝังอยู่ในผนังด้านใน หรือขดลวดให้ความร้อนด้านบนสามารถต้ังอุณหภูมิใน การ บ่มเชอ้ื จุลินทรยี ์ได้ วธิ กี ารใชง้ านและการบาํ รุงรักษา การเพาะเล้ียงจุลินทรีย์กลุ่มที่ไม่ต้องการออกซิเจนต้องกําจัดออกซิเจนออกให้หมดไปจากตู้เพาะเลี้ยงซึ่ง การกําจดั ออกซเิ จนน้นั มวี ธิ ีอยู่ดว้ ยกนั ดังเช่น 1. การใชโ้ ถเพาะเชอ้ื สภาพไร้ออกซิเจน เป็นทน่ี ิยมใชก้ นั มาก เรียกอีกอย่างวา่ gas pack jar เปน็ เคร่ืองมือ ใชเ้ ล้ียงจุลนิ ทรีย์ไมต่ ้องการออกซิเจนในการเจริญเตบิ โตเหมาะกบั หอ้ งปฏิบัติการขนาดเล็กและขนาดกลาง 2. เทคนิคการแทนที่ออกซิเจนในตู้บ่ม (anaerobic chamber) ด้วยก๊าซเฉื่อย (inert gas) เช่นก๊าซ ไนโตรเจน หรือก๊าซผสมระหว่างไนโตรเจน และคาร์บอนไดออกไซด์ เหมาะสําหรับห้องปฏิบัติการท่ีทํางาน เกี่ยวกับ obligate anaerobes อยู่เป็นประจํา ห้องปฏิบัติการขนาดกลางและขนาดใหญ่ สามารถใช้กับเช้ือที่ไม่ สามารถจะทนต่อออกซิเจนได้เลยแมป้ ริมาณน้อย และยงั เหมาะกับการเลี้ยงเชือ้ ในคร้ังเดยี วไดห้ ลายจานเพาะเชือ้ 3. หากมีปัญหา ไม่ว่ากรณีใดๆ เบ้ืองต้นหากผู้ใช้งานแก้ไขได้ให้ปฏิบัตกิ ารแก้ไข หากไม่สามารถแก้ไขได้ให้ รีบแจ้งอาจารยผ์ ูด้ ูแลหรือเจา้ หน้าทีว่ ิทยาศาสตร์ทนั ที ประโยชน์ในการใชง้ าน โถเพาะเชื้อสภาพไร้ออกซิเจน (ภาพท่ี 3.17) และ ตู้เพาะเชื้อสภาพไร้ออกซิเจน (ภาพที่ 3.18) ใช้ในการ เล้ียงเชื้อจุลินทรีย์ท่ีไม่ต้องการออกซิเจนในการเจริญเติบโต หรือใช้ในการคัดเลือกเช้ือจุลินทรีย์ที่ไม่ต้องการ ออกซเิ จน เทคนิคและการใชเ้ คร่ืองมือทางจุลชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 158

วิธกี ารสอนและกิจกรรม 1. ใชว้ ิธีการสอนบรรยายผา่ นส่ือการสอนทีเ่ หมาะสม ร่วมกับการอภิปราย หรือถาม-ตอบ 2. สอดแทรกและฝึกกระบวนการคิดอย่างมีหลักการและเหตุผล 3. สาธติ และยกตัวอย่างในเน้อื หา พร้อมภาพประกอบให้นักศึกษาได้เหน็ ภาพชัดเจน 4. มอบหมายใหน้ ักศึกษาทาํ แบบฝึกหัดทา้ ยบทเรยี น ส่ือการสอน เอกสารอ้างอิง หมายเลข ตามบรรณานุกรมท้ายเลม่ (4 9 และ 10) เอกสารประกอบการสอน เอกสารประกอบการสอนเทคนิคและการใชเ้ ครอ่ื งมือทาง จุลชวี วิทยา โสตทัศนวสั ดุ สอ่ื การสอนนําเสนอด้วยโปรแกรม Powerpoint ประกอบ การบรรยายสัปดาหท์ ่ี 8 Multimedia LCD projector งานท่ีมอบหมาย 1. ให้ศึกษาคน้ คว้าจาก หนงั สือ หรือ งานวิจัยทางจุลชวี วิทยา เพิ่มเติม 2. ใหศ้ ึกษาคน้ คว้าจาก ส่ือการสอนออนไลน์ จากเวป็ ไซต์ตา่ งๆ 3. ใหท้ ําแบบฝกึ หดั ท้ายบทเรียน การวัดผล - วิธีการสังเกต - ใบบนั ทึกเวลาเรียน - แบบฝึกหัดท้ายบทเรียน บันทึกการสอนและข้อสังเกต - สังเกตพฤติกรรมท่ีแสดงออกของนักศึกษา เช่น การมีวินัย การแตง่ กาย การตรง-ต่อเวลา รวมทง้ั การมี ส่วนร่วมของนักศึกษาในช้นั เรยี น - เช็คการมาเข้าเรียนของนักศึกษาทุกครั้งในช่ัวโมงตามตารางสอน - วัดจากการตอบคําถามแบบฝึกหดั ท้ายบทเรียน เมอ่ื จบเน้ือหาหน่วยท่ี 3 อยา่ งถูกตอ้ ง และส่งตามกาํ หนด ท่อี าจารย์ผสู้ อนนดั หมาย ในระยะเวลาไมเ่ กิน 5 วัน หลงั จากเรียนหนว่ ยท่ี 3 เสร็จสนิ้ แล้ว - วัดผลจากการทาํ ข้อสอบกลางภาค เทคนคิ และการใช้เครอ่ื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 159

ส่ือการสอนสปั ดาห์ท่ี 8 เทคนคิ และการใชเ้ คร่อื งมือทางจลุ ชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 160

เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 161

เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 162

เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 163

เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 164

แบบฝกึ หัดสปั ดาห์ที่ 8 1. จงบอกหลักการทํางาน การใชง้ านของเครอื่ งวัดค่าการดูดกลืนแสง ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ 2. จงอธบิ ายหลักการเลือกใชค้ ิวเวททใ์ ห้เหมาะสมกับตวั อย่างที่ใช้ศึกษาในงานดา้ นจุลชวี วทิ ยาและชีววิทยา ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ 3. ถ้าต้องการวัดความหนาแน่นของเซลล์จุลินทรีย์ต่างชนิดกัน เพ่ือพิจารณาอัตราการเจริญเติบโต (Growth rate) ต้องตง้ั คา่ การดดู กลนื แสง (OD) อยา่ งไร อธบิ ายพอสังเขป ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ 4. ถ้าต้องการวัดความเข้มข้นของดีเอ็นเอที่สกัดได้จากจุลินทรีย์ ต้องเลือกใช้เคร่ืองมือชนิดใด และมีวิธีการใช้งาน ของเครื่องอย่างไร อธิบาย ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ เทคนคิ และการใช้เคร่ืองมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 165

5. กรณศี ึกษา ผปู้ ฏบิ ตั งิ านต้องการคัดเลือกจุลนิ ทรยี ท์ ่ีไม่ตอ้ งการออกซิเจน เพ่อื ใช้ในการผลิตเอนไซม์ ผู้ปฏิบัติงาน ต้องเลอื กใชเ้ คร่อื งมือใด พรอ้ มอธิบายการใชง้ านของเครอ่ื งน้ี ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ เทคนคิ และการใช้เคร่อื งมือทางจลุ ชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 166

เฉลย แบบฝกึ หัดสัปดาห์ที่ 8 1. จงบอกส่วนประกอบและการใช้งานของเครือ่ งวัดค่าการดดู กลืนแสง 1. แหล่งกําเนิดแสง รังสี ช่วงความยาวคล่ืนของรังสียูวี และแสงสีขาว ท่ีต้องการอย่างต่อเนื่องและคงที่ ตลอดเวลา รวมท้ังมีความเข้มแสงท่ีมากพอด้วย หลอดกําเนิดแสง มีหลายชนิดตามความยาวคล่ืนแสงท่ีเปล่ง ออกมา ซึ่งต้องเลือกใช้ให้ถูกต้องเหมาะสมกับของเหลวที่นํามาวัดค่าดูดกลืนแสง ค่าความยาวคล่ืนแสงท่ีวัตถุแต่ละ ชนดิ สามารถดดู กลนื แสงไดใ้ นช่วง 100-750 นาโนเมตร (nm) 2. Monochromator เป็นส่วนที่ใช้ควบคุมแสงโดยจะทําให้แสงท่ีออกมาจากต้นกําเนิดแสง ซึ่งเป็นพอลิ โครเมติก ให้เป็นแสงโมโนโครเมติก ซึ่งเป็นแถบแสงแคบๆ หรือมีความยาวคล่ืนเดียว ใช้ฟิลเตอร์ (กระจกสี) ปริซึม (prism) หรอื เกรตต้ิง (grating) 3. เซลล์ท่ีใช้บรรจุสารละลายตัวอย่าง เซลล์ท่ีใส่สารตัวอย่าง (cell sample) หรืออาจเรียกว่า คิวเวทท์ (cuvette) ภาพแบบท่ีใช้กันท่ัวไปได้แก่เซลล์ท่ีทําด้วยแก้วธรรมดา จะใช้ได้เฉพาะช่วงวิสิเบิล เพราะเน้ือแก้ว ธรรมดาถกู ดูดกลนื แสงในช่วงยวู ีได้ และเซลล์ท่ีทําดว้ ยซิลิกา และควอรต์ ซ์ (quartz) ใช้ไดท้ ้งั ชว่ งรังสยี ูวี และ แสงสี ขาว 4. Detector ทําหน้าทีใ่ นการวัดความเข้มของรังสีที่ถูกดูดกลนื โดยการแปลงพลงั งานคล่นื รังสีเปน็ พลังงาน ไฟฟ้าเครื่องตรวจจับสัญญาณที่ดีต้องมีสภาพไวสูง คือแม้ปริมาณแสงจะเปล่ียนไปเล็กน้อย ก็สามารถตรวจจับ สัญญาณความแตกต่างได้ เครื่องวัดแสงท่ียังนิยมกันอยู่ในปัจจุบัน คือ หลอดโฟโตมัลติพลายเออร์ (photomultiplier tube, PMT) และเคร่ืองวดั แสงชนิดซิลิกอนไดโอด (silicon diode detector) ในทางจุลชีววิทยา ใช้หาความหนาแน่นของเซลล์โดยวัดความขุ่น ใช้หลักการดูดกลืนคลื่นแสงท่ีไม่เท่ากัน ของจํานวนจุลินทรีย์ที่มากขึ้น ปริมาณแสงที่ดูดกลืนไว้และกระจายออกจะเป็นสัดส่วนกับความหนาแน่นของเซลล์ นําสารละลายของจุลินทรีย์ใส่ในหลอดวัดคิวเวทท์ อ่านเปอร์เซนต์แสงที่ผ่านออกมา (%transmittance) ถ้า สารละลายของจุลินทรีย์ มีความขุ่นมาก เปอร์เซนต์ท่ีแสงผ่านได้ มีน้อย อ่านค่า optical density (OD) ซึ่งเป็น สัดส่วนโดยตรงกบั ความหนาแนน่ หรือจํานวนเซลล์ เทคนคิ และการใช้เครื่องมือทางจุลชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 167

2. จงอธบิ ายหลกั การเลอื กใชค้ ิวเวทท์ ใหเ้ หมาะสมกับตัวอยา่ งที่ใช้ศึกษาในงานด้านจุลชีววิทยาและชีววทิ ยา การเลือกชนดิ ของควิ เวทท์ และช่วงความยาวคลน่ื ทเี่ หมาะสมกบั วัสดุทน่ี าํ มาผลิตควิ เวทท์ มหี ลักการดงั น้ี -plasticor glass cuvette (acrylic) ส่วนใหญ่ใช้วัดปริมาณเซลล์จุลินทรีย์ หรือ สารท่ีทําปฏิกิริยากัน ปรมิ าณ ประมาณ 0.5-1 ml -quartz cuvette สว่ นใหญ่ใช้วัดปรมิ าณ สารพนั ธกุ รรม ท่มี ปี ริมาณน้อย 0.1-0.5 ml -electroporation cuvette ใชใ้ นการ transformation plasmid จากแบคทเี รยี เขา้ ส่เู ซลล์จลุ นิ ทรีย์ 3. ถ้าต้องการวัดความหนาแน่นของเซลล์จุลินทรีย์ต่างชนิดกัน เพื่อพิจารณาอัตราการเจริญเติบโต (growth rate) ตอ้ งตง้ั ค่าการดูดกลนื แสง (OD) อยา่ งไร อธิบายพอสังเขป เมอื่ ต้องการวัดความหนาแนน่ ของเซลล์จุลินทรยี ์ ผ้ปู ฏบิ ัตงิ านต้องมีความรวู้ ่า จุลินทรยี ์แต่ละชนิดมีค่าการ ดูดกลืนแสงที่ดีที่สุดอยู่ในช่วงไหน ยกตัวอย่างเช่น ยีสต์จะมีค่าการดูดกลืนแสงอยู่ท่ี 600-660 นาโนเมตร เป็นต้น ดังน้ัน เวลาวัดการเจรญิ เติบโตของยสี ต์จะตัง้ ค่า OD ท่เี ครอ่ื งคือ 600 นาโนเมตร 4. ถ้าต้องการวัดความเข้มข้นของดีเอ็นเอท่ีสกัดได้จากจุลินทรีย์ ต้องเลือกใช้เคร่ืองมือชนิดใด และมีวิธีการใช้งาน ของเคร่อื งอย่างไร อธบิ าย เลอื กใช้เครื่อง nano drop spectrophotometer เครอื่ งวดั การดดู กลืนแสงของสารท่ีใช้สารปริมาณน้อย (μl) การใช้งานของเครื่องน้ี จะใช้ร่วมกับ micropipette ดูดสารปริมาตรน้อยมาหยดลงบนช่องใส่สาร ปริมาตร 1 μl แล้วกดปุ่มอ่านท่ีหน้าจอคอมพิวเตอร์ ค่าท่ีได้จะข้ึนเป็นปริมาตรให้ผู้ปฏิบัติงานเห็นค่าท่ีวัดได้ เมื่อทําการวัด ตัวอยา่ งแรกเสร็จแล้ว ตอ้ งใช้กระดาษสะอาด ปาดเบาๆ ซับตวั อย่างแรกออกไปก่อน กอ่ นจะใสต่ ัวอย่างถัดไป 5. กรณีศึกษา ผู้ปฏบิ ัติงานต้องการคัดเลือกจุลนิ ทรยี ท์ ่ีไม่ตอ้ งการออกซิเจน เพอื่ ใช้ในการผลิตเอนไซม์ ผปู้ ฏบิ ัติงาน ตอ้ งเลือกใชเ้ คร่อื งมอื ใด พรอ้ มอธบิ ายการใชง้ านของเครื่องน้ี ใช้ตู้เพาะเชื้อจุลินทรีย์สภาพไร้ออกซิเจน เน่ืองจากเป็นเครื่องมือท่ีใช้ในการเพาะเชื้อจุลินทรีย์ที่ไม่ใช้ ออกซิเจนในการเจริญเติบโต ถ้ามีออกซิเจนจะเป็นพิษต่อเซลล์ ต้องนําออกซิเจนออกจากอาหารเลี้ยงเช้ือโดยใช้ ก๊าซไนโตรเจนใส่เข้าไปแทน จากนั้นจึงนําเชื้อจุลินทรีย์ที่เพาะเล้ียงได้มาสกัดเอนไซม์ โดยผ่านการวิเคราะห์บน column เพื่อแยกเอนไซมซ์ ่ึงเป็นโปรตีนออกจากสว่ นอนื่ ๆ เทคนคิ และการใชเ้ ครอ่ื งมือทางจุลชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 168

ใบเตรียมการสอน รหัสวชิ า 403 – 25 – 16 เวลาสอบ 2 ชว่ั โมง แผนการสอนสัปดาห์ท่ี 9 สอบกลางภาค เทคนิคและการใชเ้ คร่ืองมือทางจลุ ชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 169

ใบเตรียมการสอน แผนการสอนสัปดาห์ท่ี 10 รหสั วชิ า 403 – 25 – 16 บทเรยี นที่ 3.4 หนว่ ยท่ี 3 เครอื่ งมือเฉพาะทางจุลชีววิทยา เวลาเรียน 2 ช่ัวโมง บทเรยี นท่ี 3.4 เครือ่ งมือเฉพาะใช้ในงานทางจุลชีววิทยา จุดประสงคก์ ารสอน 2 ชว่ั โมง 3.4 เข้าใจเครื่องมอื เฉพาะใช้ในงานทางจุลชวี วิทยาได้เหมาะสม 3.4.1 ยกตัวอย่างการใช้เครื่องกล่นั ระเหยสารแบบหมุน 3.4.2 สรุปการใชเ้ ครอื่ งไลโอฟไิ ลเซอร์ เทคนคิ และการใช้เครอ่ื งมือทางจลุ ชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 170

หน่วยท่ี 3 เครื่องมือเฉพาะทางจุลชีววิทยา (Specific Instruments in Microbiology) บทเรยี นที่ 3.4 เคร่อื งมอื เฉพาะใช้ในงานทางจุลชีววิทยา บทนํา ในบทนี้จะกล่าวถึงเคร่ืองมือเฉพาะสําหรับนักจุลชีววิทยาต่อ ได้แก่ เคร่ืองกลั่นระเหยสารแบบหมุน และ เครอ่ื งไลโอฟิไลเซอร์ เครื่องมอื เหล่าน้ีถูกจัดจําแนกอยู่ในกลุ่มเคร่อื งมือเฉพาะ ผู้ปฏบิ ตั ิงานหรือนักจุลชีววิทยา ต้องรู้ส่วนประกอบหลักของเครอ่ื งมือ การใชง้ านของเคร่อื งมือใหเ้ หมาะสมกับชิน้ งาน การบาํ รุงรักษาและการแก้ไข อาการผดิ ปกติเบ้ืองต้นได้อย่างเหมาะสม และการนําไปใช้ประโยชนร์ ่วมกับงานด้านต่างๆ เชิงบูรณาการ 3.4.1 เครอ่ื งกลน่ั ระเหยสารแบบหมุน (Rotary evaporator) เครื่องกล่ันระเหยสารแบบหมุน และส่วนประกอบของเคร่ือง (ภาพที่ 3.18) เคร่ืองมือชนิดน้ีใช้ในการ ระเหยสารตัวอย่างท่ีเป็นของเหลว กลั่นเพ่ือแยกตัวทําละลายอินทรีย์ท่ีผสมอยู่ออกจากสารตัวอย่างท่ีสนใจ ทําให้ สารตัวอย่างที่สนใจเข้มข้นขึ้น ตัวทําละลายอินทรีย์ท่ีละลายสารตัวอย่างท่ีสนใจจะถูกทําให้กลายเป็นไอ ด้วยการ ควบคุมความดัน ระบบสูญญากาศจากปั้ม และให้ความร้อนแก่ตัวอย่าง เพื่อทําให้การกลายเป็นไอของตัวทํา ละลายง่ายขึ้น ไอสารละลายจะผ่านคอนเดนเซอร์ท่ีมีระบบหล่อเย็น ทําให้ไอสารควบแน่นกลายเป็นของเหลว ไหล ลงสู่ receiving flask สว่ นประกอบและหลัการทํางาน 1. ส่วนที่ให้ความรอ้ นและกลัน่ แยกสาร มีอ่างนํ้าควบคุมอุณหภูมิ (water bath) บริเวณด้านในของอ่างน้ําทําด้วยสแตนเลส ให้ความร้อนได้ อ่าง น้ํานี้สามารถต้ังอุณหภูมิได้ต้ังแต่ 20 องศาเซลเซียสจนถึง 85 องศาเซลเซียส สําหรับของเหลวท่ีเป็นนํ้า ส่วน ของเหลวที่เปน็ น้ํามนั สามารถตั้งอุณหภูมิได้สงู ถึง 250 องศาเซลเซียส 2. สว่ นสูญญากาศภายในระบบ มีส่วนกลนั่ ไอนํ้าและควบแน่นมาเป็นไอที่คอนเดนเซอร์ส่วนใหญ่เป็นปั้มสูญญากาศ เคร่ืองควบคุมความดัน อัตโนมตั ิ และส่วนเกบ็ ตวั ทาํ ละลายอินทรีย์ (collecting flask) เทคนคิ และการใชเ้ ครือ่ งมือทางจลุ ชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 171

3. สว่ นควบคมุ อุณหภูมิในระบบ มีส่วนควบคุมอุณหภูมิ (temperature control panel) และส่วนควบคุมความเร็วรอบในการหมุน (rotary control panel) ของ ส่วนทเี่ ก็บสารตัวอยา่ ง (rotary flask) ภาพท่ี 3.18 ส่วนประกอบของเครอ่ื งกล่ันระเหยสารแบบหมนุ (ทม่ี า: http://www.chem.ucalgary.ca/courses/351/laboratory/rotavap.pdf) วธิ กี ารใช้งานและการบํารงุ รักษา 1. เปิดเคร่ืองทําความเย็นหมุนเวียน ตั้งอุณหภูมิที่อ่างนํ้าให้ความร้อน ก่อนใช้งานคร่ึงช่ัวโมง อ่างนํ้า จะตอ้ งมีนา้ํ อยใู่ นระดับที่กําหนด 2. นําตัวอย่างใส่ใน rotary flask ต่อเข้ากับส่วนที่ทําการหมุน ให้ความร้อนตามเหมาะสมกับสารตัวอย่าง และตวั ทําละลายอินทรีย์ 3. เปิดป้ัมลดความดัน และต้ังค่าความดันให้เหมาะสมกับตัวทําละลายแต่ละชนิด สามารถดูค่าแนะนําได้ จาก solvent library 4. กด start เครือ่ งจะเริ่มทํางาน ความรอ้ นจากอา่ งนํา้ จะช่วยแยกความแตกตา่ งของสารตัวอย่างกับตัวทํา ละลายอนิ ทรีย์ และหยุดอตั โนมัติตามเวลาทต่ี ั้งไว้ 5. หากมีปัญหา ไม่ว่ากรณีใดๆ เบ้ืองต้นหากผู้ใช้งานแก้ไขได้ให้ปฏิบัตกิ ารแก้ไข หากไม่สามารถแก้ไขได้ให้ รบี แจ้งอาจารยผ์ ูด้ ูแลหรอื เจา้ หน้าทวี่ ทิ ยาศาสตรท์ นั ที 6. เม่ือใช้งานเคร่ืองเสร็จเรียบร้อยแล้ว ต้องนําส่วน collecting flask และ rotary flask ออกมาทําล้าง ทําความสะอาด อ่างนํ้าควรปล่อยนํ้าทง้ิ ทุกครัง้ หลังการใช้งาน เทคนิคและการใช้เครือ่ งมือทางจลุ ชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 172

ตัวทําละลายท่ีนิยมใช้ในการสกัด ได้แก่ น้ํา เอทานอล เบนซิน อีเทอร์ อะซิเตต และเฮกเซน สําหรับการ สกัดน้ํามันพืชนิยมใช้เฮกเซน สิ่งที่ต้องปฏิบัติหลังแยกตัวทําละลายสารเสร็จแล้ว เมื่อตัวทําละลายระเหยออกได้ ตามที่ต้องการ ตัวทําละลายที่ระเหยออกมาอยู่ใน collection flask ให้นําไปท้ิงในถังบําบัดของเสียที่เหมาะสม ตามชนดิ ตัวทําละลาย เพ่อื นําไปกําจัดให้ถูกต้อง เพราะตวั ทําละลายพวกนี้ ถ้าทิ้งตาม อ่างนา้ํ จะไม่ละลายน้ํา แยก ชนั้ ชดั เจน เมื่อออกสูส่ ่งิ แวดล้อมกเ็ ป็นพิษต่อระบบนิเวศ ประโยชนใ์ นการใช้งาน เคร่ืองกลั่นระเหยสารแบบหมุน ใช้แยกสารตัวอย่างออกจากตัวทําละลายอินทรีย์ที่เป็นของเหลว เพ่ิม ความเข้มข้นของสารที่ผู้ปฏิบัติงานสนใจมากข้ึน ก่อนนําไปวิเคราะห์คุณสมบัติของสารตัวอย่างและระบุสารตัวย่าง ท่ีแน่นอน ผ่านเครือ่ ง GC หรอื HPLC 3.4.2 เครือ่ งไลโอฟไิ ลเซอร์ (Lyophilizer freeze dyer) เคร่ืองไลโอฟิไลเซอร์ (ภาพที่ 3.19) เป็นเคร่ืองมือท่ีใช้ในการทําแห้งแบบแช่เยือกแข็ง (freeze dehydration หรือ lyophilization) หมายถงึ การทาํ แหง้ (dehydration) ดว้ ยการแชเ่ ยอื กแขง็ (freezing) ใหน้ ้ํา เปล่ียนสถานะเป็นผลึกน้ําแข็งก่อน แล้วจึงลดความดันเพื่อให้ผลึกน้ําแข็งระเหิด (sublimation) เป็นไอ ด้วยการ ลด ความดันให้ตํ่ากว่าบรรยากาศขณะควบคุมให้อุณหภูมิตํ่า (ที่อุณหภูมิ เท่ากับ หรือตํ่ากว่า 0 องศาเซลเซียส นาํ้ แข็งระเหดิ ทคี่ วามดันเท่ากบั 4.7 มิลลิเมตรปรอทหรอื ต่าํ กว่า) ภาพที่ 3.19 เครอ่ื งไลโอฟิไลเซอร์ (ทม่ี า: http://www.esquirebiotech.com/lyophilizer-1393620.html) เทคนิคและการใชเ้ ครื่องมือทางจุลชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 173

ส่วนประกอบและหลักการทาํ งาน ประกอบดว้ ย 3 สว่ น ไดแ้ ก่ 1. chamber สาํ หรบั บรรจุตวั อย่าง อาจจะหมายถึงภาชนะบรรจุตัวอย่าง เช่น ขวด vial flask เปน็ ต้น 2. condenser ทําหน้าท่ีลดอุณหภูมิในระบบให้ต่ํา (ประมาณ -50 ถึง -80 องศาเซลเซียส ปัจจุบันมีรุ่นท่ี ทําได้ถึง -110 องศาเซลเซียส เหมาะสําหรับงานที่ต้องการเอาแอลกอฮอล์ออกจากตัวอย่าง) เพ่ือให้นํ้าเปล่ียน สถานะจากของเหลวเป็นของแข็ง และนอกจากน้ียังเป็นตัวดักจับความชื้นของน้ํา ที่ออกมาจาก chamber ก่อน ความชื้นจะเขา้ สู่ vacuum Pump 3. vacuum Pump ทําหน้าที่ลดความดันในระบบให้ตํ่า (ย่ิงต่ํายิ่งดี) เพื่อให้เกิดการระเหิดของนํ้า นอกจากนย้ี งั เป็นตัวกําหนดทศิ ทางการดูดเอาไอนํา้ ที่ระเหิดออกมาจากตัวอย่างใหเ้ ข้ามายงั condenser อีกด้วย วิธีการใช้งานและการบํารงุ รักษา 1. ใชง้ านอยา่ งถกู วธิ ีตามขน้ั ตอนในคู่มือ 2. ก่อนใช้งาน ควรเปิด condenser ประมาณ 30 นาที ให้เครื่องทําอุณหภูมิให้ถึง set point ก่อนเปิด vacuum pump เพือ่ ป้องกนั ความชืน้ เข้าสู่ vacuum pump 3. หลังใช้งาน ควรปิด condenser ก่อน และเปิด vacuum pump ท้ิงไว้ประมาณ 2 ชั่วโมง เพ่ือให้ pump ดูดไอของสารต่างๆ ออกจากระบบ 4. เลือกใช้ภาชนะท่ีเหมาะสม หากบางเกินไป ภาชนะอาจแตก เนื่องจากไม่สามารถทนต่อความดันตํ่าๆ ได้ 5. ตรวจสอบ sensor วัดอุณหภูมิของ condenser ว่ายังอยู่ในตําแหน่งปกติหรือไม่ ยังสามารถทํางานได้ เป็นปกติหรอื ไม่ ข้ัวตอ่ ยงั อย่ใู นสภาพปกตหิ รือไม่ 6. ทาํ ความสะอาด compressor ดว้ ยการเป่าฝนุ่ 7. ตรวจสอบพัดลมระบายความรอ้ นของ condenser ให้อยู่ในสภาพพรอ้ มใช้งาน 8. ตรวจสอบแผงวงจรควบคุมหลัก ให้อยู่ในสภาพพร้อมใช้งาน เช่น ฟิวส์ รอยไหม้ของแผงวงจร สภาพ ของ component ต่างๆ เป็นต้น 9. ตรวจสอบสภาพของ capacitor start ของ vacuum pump หากพบว่า บวม มรี อยปริ หรือมรี อยไหม้ ฯลฯ ให้เปล่ยี นใหม่ 10. ตรวจสอบระดับและสีของน้ํามัน vacuum pump หากระดับต่ําเกินไป ให้เติม หากเปลี่ยนเป็นสี น้ําตาล ให้เปล่ียนใหม่ 11. หมน่ั สังเกตอาการและการทํางานของเครอื่ ง หากพบสิ่งผิดปกติ ให้แจง้ ผูร้ บั ผิดชอบทนั ที 12. ดูแลรกั ษาความสะอาดของเคร่ืองอย่างสมํา่ เสมอ เทคนิคและการใชเ้ ครอื่ งมือทางจลุ ชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 174

13. หากมีปัญหา ไม่ว่ากรณีใดๆ เบ้ืองต้นหากผู้ใช้งานแก้ไขได้ให้ปฏิบัติการแก้ไข หากไม่สามารถแก้ไขได้ ให้รบี แจ้งอาจารยผ์ ู้ดแู ลหรือเจ้าหน้าที่วิทยาศาสตร์ทนั ที ประโยชน์ในการใช้งาน เครื่องไลโอฟิไลเซอร์ (ภาพท่ี 3.20) นิยมใช้เก็บรักษาผลิตภัณฑ์อาหาร และยา เช่น การเตรียมผลิตภัณฑ์ ยาชนดิ ผงสําหรับละลายน้ํา ผลติ ภัณฑ์จากสมุนไพรในภาพผงแห้ง การเก็บรักษาผัก ผลไม้ และเกบ็ รักษาผลิตภัณฑ์ อาหารในภาพของแห้ง เช่น กาแฟ รวมถึงเก็บรักษาผลิตภัณฑ์ทางชีวภาพ เช่น เอนไซม์ ฮอร์โมน ยาปฏิชีวนะ วิตามิน เลือด วัคซีนและแอนติไบโอติก รวมทั้งเก็บรักษาเชื้อจุลินทรีย์การทําแห้งวิธีนี้ ทําให้สามารถเก็บรักษา ผลิตภัณฑ์ไว้ได้เป็นเวลานานหลายปี โดยไม่เกิดการเสียหาย และสามารถนํากลับละลายน้ําใช้ใหม่ได้ง่าย โดยที่ คณุ สมบัติของผลิตภัณฑ์ยังอยู่ครบถ้วน ใชพ้ ้ืนท่ใี น การเกบ็ รักษานอ้ ย งา่ ยต่อการขนส่ง บทสรุปทา้ ยหน่วยท่ี 3 เครอ่ื งมอื เฉพาะสําหรับการทํางานของนักจุลชีววิทยา ผปู้ ฏิบัตงิ านต้องไดร้ ับการอบรมจากผู้เชี่ยวชาญให้มี ความรู้เร่ืองส่วนประกอบหลักของเครื่องมือ และมีความเช่ียวชาญการใช้งานของเครื่องมือท่ีถูกวิธี ในขณะ ปฏิบัติงาน ต้องอยู่ในการดูแลของผู้เชี่ยวชาญเคร่ืองมือน้ันๆ ทุกคร้ัง ผู้ปฏิบัติงานต้องทราบวิธีการบํารุงรักษา เคร่ืองมือ หากเคร่ืองมือมีอาการผิดปกติ ผู้ปฏิบัติงานต้องแจ้งผู้เชี่ยวชาญทันที รวมท้ังผู้ปฏิบัติงานสามารถคิด วิเคราะห์และเลือกเคร่ืองมือไปใช้ประโยชน์ในด้านต่างๆ ท่ีเหมาะสม อาทิเช่น การเลือกใช้กล้องจุลทรรศน์แบบ ฟลูออเรสเซนต์ เคร่ืองน้ีใช้ตรวจสอบองค์ประกอบภายในเซลล์จุลินทรีย์เฉพาะตําแหน่ง โดยมีการติดโปรตีนเรือง แสง หรือสารเรืองแสงบริเวณตําแหน่งท่ีผู้ปฏิบัติงานต้องการศึกษา เคร่ืองน่ึงความดันไอน้ําร้อน หรือเรียกว่า autoclave เป็นเคร่ืองมือเฉพาะท่ีจําเป็นอย่างยิ่งต่อการทํางานทางด้านจุลชีววิทยา ขาดไม่ได้ ดังนั้นผู้ปฏิบัติงาน หรือนักจุลชีววิทยา ต้องมีความสามารถในการใช้เครื่องนี้ได้อย่างถูกต้องและเหมาะสมกับชิ้นงาน เครื่องมือนี้ใช้ หลักการสร้างไอนํ้าร้อนสูงและความดันช่วยกันฆ่าเชื้อที่ผิวของส่ิงของที่ผู้ปฏิบัติงานต้องการให้ปลอดเชื้อจุลินทรีย์ ชนิดต่างๆ โดยเฉพาะจุลินทรีย์ในสิ่งแวดล้อม หรือจุลินทรีย์ก่อโรค ที่อาจมีผลกระทบต่อผลปฏิบัติการ และใช้ ป้องกันการปนเปื้อนของเช้ือจุลินทรีย์ออกสู่ส่ิงแวดล้อมด้วย เคร่ืองมือชนิดถัดมา ตู้ปลอดเช้ือ เคร่ืองมือนี้ใช้ คัดเลือกเช้ือบริสุทธ์ิที่ผู้ปฏิบัติงานต้องการศึกษา เคร่ืองปั่นเหวี่ยง ถูกประดิษฐ์ข้ึนเพ่ือใช้ในการแยกของแข็งออก จากของเหลวท่ีผสมกันอยู่ เช่น แยกจุลินทรีย์ออกจากอาหารเลี้ยงเชื้อ เพ่ือนําไปสกัดดีเอ็นเอ ตู้บ่มเช้ือ ใช้ในการ เล้ียงเช้ือจุลินทรีย์ได้ท้ังในอาหารเหลวและอาหารแข็ง ตู้บ่มเช้ือสามารถตั้งอุณหภูมิได้ตามความต้องการในการ เจรญิ เตบิ โตของเช้ือจุลินทรีย์แต่ละชนดิ ให้เหมือนการเจริญเตบิ โตตามธรรมชาติ เครอ่ื งวัดค่าการดดู กลืนแสงในช่วง ยูวีหรือแสงสีขาว ใช้ในการตรวจวัดการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์ เช่น แบคทีเรีย ยีสต์ จุลินทรีย์เหล่าน้ีมีคุณสมบัติ การดูดกลืนแสงท่ีแตกต่างกัน วัดปริมาณสารชีวโมเลกุล หรือ วัดความเข้มข้นของสารที่มีคุณสมบัติดูดกลืนแสงได้ เทคนคิ และการใชเ้ ครื่องมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 175

ในช่วง 100-750 นาโนเมตร (nm) เป็นต้น เคร่ืองดูดสารปริมาณตํ่า นิยมใช้ร่วมกับงานทางด้านอณูโมเลกุล ดูด สารท่ีต้องการในปริมาตรท่ีน้อยกว่า 1000 ไมโครลิตร เคร่ืองกลั่นระเหยสาร ถูกนํามาใช้ในการแยกสารท่ีผู้ ปฏิบัติการต้องการวิเคราะห์ออกจากตัวทําละลายโดยอาศัยหลักการความแตกต่างกันของจุดเดือดของสาร เพ่ือ แยกสาร 2 ชนิดออกจากกัน สารที่ผู้ปฏิบัติการต้องการศึกษา อาจนําไปใช้เป็นสารต้านจุลชีพ สารต้านอนุมูลอิสระ เป็นต้น เครื่องทําแห้งแบบเยือกแข็ง เครื่องมือนี้ถูกสร้างข้ึนเพ่ือยืดอายุเก็บรักษาจุลินทรีย์ท่ีมีประโยชน์ หรือ สารสําคัญให้คงสภาพดี ส่วนตู้บ่มเช้ือสภาพไร้ออกซิเจน ถูกนํามาใช้ในการศึกษาจุลินทรีย์ท่ีไม่ต้องการออกซิเจน เพื่อการเจริญเติบโต จะเห็นได้ว่า เคร่ืองมือเฉพาะทางจุลชีววิทยาเหล่าน้ี ผู้ปฏิบัติงานจะเลือกใช้ได้อย่างถูกต้อง เหมาะสมกับช้ินงานนั้น ผู้ปฏิบัติงานต้องได้รับความรู้จากผู้เช่ียวชาญ ผ่านการอบรม หรือ ศึกษาหาข้อมูลได้จาก แหล่งต่างๆ ที่น่าเช่ือถือ รู้ส่วนประกอบของเคร่ืองมือแล้ว จะต้องมีความชํานาญในการใช้และหลักการทํางานของ เคร่ืองมือแต่ละชนิด เพื่อให้ได้งานท่ีมีประสิทธิภาพมากท่ีสุด ลดการเกิดความผิดพลาดให้น้อยท่ีสุด หากผู้ ปฏบิ ตั กิ ารไมม่ ีความรู้ ไม่มีความชาํ นาญ และไมม่ ีความรอบคอบ ย่อมเกิดความเสียหายกับเคร่อื งมือน้ันๆ เทคนิคและการใช้เคร่ืองมือทางจลุ ชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 176

วิธกี ารสอนและกิจกรรม 1. ใชว้ ิธกี ารสอนบรรยายผ่านสื่อการสอนที่เหมาะสม ร่วมกับการอภิปราย หรอื ถาม-ตอบ 2. สอดแทรกและฝึกกระบวนการคิดอยา่ งมหี ลักการและเหตุผล 3. ยกตัวอยา่ งในเนอื้ หา พร้อมภาพประกอบให้นักศึกษาได้เห็นภาพชดั เจน 4. มอบหมายให้นักศึกษาทําแบบฝึกหดั ทา้ ยหน่วยเรียน 5. มอบหมายใหน้ ักศึกษาทํากจิ กรรม ฝกึ ใช้เครื่องมอื ของจรงิ ณ หอ้ งปฏิบัติการทางจุลชวี วทิ ยา ดว้ ยตนเอง ช่วงคน้ คว้านอกเวลา ส่อื การสอน เอกสารอ้างองิ หมายเลข ตามบรรณานุกรมท้ายเลม่ (3 และ 9) เอกสารประกอบการสอน เอกสารประกอบการสอนเทคนิคและการใช้เครือ่ งมือทาง จลุ ชวี วิทยา โสตทัศนวัสดุ ส่อื การสอนนาํ เสนอด้วยโปรแกรม Powerpoint ประกอบ การบรรยายสัปดาหท์ ี่ 10 Multimedia LCD projector งานทม่ี อบหมาย 1. ใหศ้ ึกษาค้นคว้าจาก หนงั สอื หรือ งานวิจัยทางจุลชีววทิ ยา เพ่ิมเติม 2. ใหศ้ ึกษาค้นคว้าจาก ส่ือการสอนออนไลน์ จากเว็ปไซต์ต่างๆ 3. ให้ทําแบบฝกึ หัดท้ายหน่วยเรยี น 4. ทาํ กิจกรรมที่ 3.2 ผู้สอนพานกั ศึกษาเรียนร้เู ครอื่ งมอื ของจรงิ ณ ห้องปฏบิ ัติการทาง จลุ ชวี วทิ ยา โดยอธิบาย และสาธิต เทคนคิ วธิ ีการปฏิบัติ มีการถาม-ตอบระหวา่ งการสาธติ และใหน้ ักศึกษาฝึกใชเ้ คร่ืองมือด้วยตนเอง ภายใต้การควบคุมดูแลของผสู้ อน การวัดผล - วิธีการสังเกต - ใบบนั ทึกเวลาเรียน - แบบฝึกหัดทา้ ยบทเรียน - กิจกรรมทมี่ อบหมาย เทคนิคและการใช้เครื่องมือทางจลุ ชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 177

บันทึกการสอนและข้อสงั เกต - สงั เกตพฤติกรรมท่ีแสดงออกของนักศึกษา เชน่ การมีวินัย การแตง่ กาย การตรง-ตอ่ เวลา รวมทั้งการมี สว่ นร่วมของนักศึกษาในชัน้ เรียน - เช็คการมาเข้าเรียนของนักศึกษาทุกครงั้ ในชวั่ โมงตามตารางสอน - วัดจากการตอบคําถามแบบฝึกหดั ทา้ ยบทเรียน เมื่อจบเนือ้ หาหน่วยท่ี 3 อยา่ งถูกต้อง และส่งตามกําหนด ทอี่ าจารย์ผ้สู อนนดั หมาย ในระยะเวลาไมเ่ กิน 5 วนั หลังจากเรียนหนว่ ยท่ี 3 เสร็จสน้ิ แล้ว - วัดผลจากการทาํ ข้อสอบยอ่ ย - สงั เกตพฤติกรรมการมีสว่ นร่วม ความกระตือรอื รน้ ในการทํากิจกรรมของนักศึกษา - สงั เกตความสามารถในการใช้เครื่องมือท่ถี ูกตอ้ งของผู้เรียน ชว่ งค้นควา้ นอกเวลา ระดับการประเมนิ มดี ังน้ี 1. ระดบั พน้ื ฐาน ผเู้ รียนปฏิบตั ิการใช้เครอ่ื งมือไดต้ ามคําบอกของผู้สอนทุกข้นั ตอน 2. ระดับกลาง ผเู้ รียนปฏบิ ตั ิการใช้เครอ่ื งมอื ไดถ้ ูกต้อง โดยผู้สอนแนะนาํ ข้นั ตอน 50% 3. ระดับสูง ผเู้ รียนปฏิบัติการใช้เคร่อื งมือได้ถูกตอ้ ง โดยผู้สอนไมต่ อ้ งอธิบายใดๆ เทคนิคและการใช้เครื่องมือทางจลุ ชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 178

ส่อื การสอนสัปดาห์ท่ี 10 เทคนคิ และการใชเ้ คร่อื งมือทางจลุ ชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 179

เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 180

เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 181

เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 182

เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 183

แบบฝกึ หัดสัปดาหท์ ี่ 10 1. จงอธบิ ายการใชง้ านเครือ่ งกลน่ั ระเหยสารแบบหมุน กับงานทางจุลชีววิทยา ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ 2. จงยกตวั อย่างการใช้ประโยชน์ของเคร่ืองกลนั่ ระเหยสารแบบหมนุ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ 3. จงอธบิ ายหลักการทาํ งาน การใช้งานของเครือ่ งไลโอฟิไลเซอร์ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ 4. จงยกตัวอย่างการใชป้ ระโยชนจ์ ากเคร่ืองไลโอฟิไลเซอร์ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ เทคนคิ และการใช้เครือ่ งมือทางจลุ ชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 184

เฉลย แบบฝกึ หัดสัปดาห์ท่ี 10 1. จงอธบิ ายการใช้งานเครือ่ งกลน่ั ระเหยสารแบบหมนุ กับงานทางจลุ ชีววิทยา เคร่ืองกล่ันระเหยสารแบบหมุน เคร่ืองมือชนิดน้ีใช้ในการระเหยสารตัวอย่างที่เป็นของเหลว กล่ันเพื่อ แยกตัวทําละลายอินทรีย์ท่ีผสมอยู่ออกจากสารตัวอย่างเช้ือจุลินทรีย์ที่สนใจ ทําให้สารที่สนใจเข้มข้นขึ้น ตัวทํา ละลายอินทรีย์ที่ละลายสารท่ีสนใจจะถูกทําให้กลายเป็นไอ ด้วยการควบคุมความดัน ระบบสูญญากาศจาก pump และให้ความร้อนแก่ตัวอย่าง เพ่ือทําให้การกลายเป็นไอของตัวทําละลายง่ายขึ้น ไอสารละลายจะผ่าน condenser ทีม่ ีระบบหล่อเยน็ ทําให้ไอสารควบแน่นกลายเป็นของเหลว ไหลลงสู่ receiving flask 2. จงยกตวั อย่างการใช้ประโยชนข์ องเคร่ืองกล่ันระเหยสารแบบหมุน เครื่องกล่ันระเหยสารแบบหมุน ใช้แยกสารตัวอย่างออกจากตัวทําละลายอินทรีย์ท่ีเป็นของเหลว เพิ่ม ความเข้มข้นของสารที่ผู้ปฏิบัติงานสนใจมากข้ึน ก่อนนําไปวิเคราะห์คุณสมบัติของสารตัวอย่างและระบุสารตัวย่าง ทีแ่ นน่ อน ผ่านเครือ่ ง GC หรือ HPLC 3. จงอธิบายหลักการทํางาน การใช้งานของเครือ่ งไลโอฟิไลเซอร์ เคร่ืองไลโอฟิไลเซอร์ หรือ การทําแห้งแบบแช่เยือกแข็ง (lyophilization)หรือ freeze dehydration) หมายถึง การทําแห้ง (dehydration) ด้วยการแช่เยือกแข็ง (freezing) ให้น้ําเปลี่ยนสถานะเป็นผลึกน้ําแข็งก่อน แลว้ จึงลดความดนั เพอ่ื ให้ผลึกน้าํ แข็งระเหดิ (sublimation) เปน็ ไอ ด้วยการลด ความดันให้ต่าํ กว่าบรรยากาศขณะ ควบคุมให้อุณหภูมิตํ่า (ท่ี อุณหภูมิ เท่ากับหรือ ตํ่ากว่า 0 องศาเซลเซียส นํ้าแข็งระเหิดท่ีความดันเท่ากับ 4.7 มิลลเิ มตรปรอทหรอื ตํ่ากว่า) เทคนคิ และการใชเ้ ครือ่ งมือทางจลุ ชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 185

4. จงยกตวั อย่างการใช้ประโยชน์จากเคร่อื งไลโอฟิไลเซอร์ ใชป้ ระโยชนใ์ นการเก็บรักษาผลิตภัณฑอ์ าหาร และยา เชน่ การเตรียมผลติ ภัณฑ์ ยาชนดิ ผงสําหรบั ละลาย น้ํา ผลิตภัณฑ์จากสมุนไพรในรปู ผงแห้ง การเก็บรักษาผัก ผลไม้ และเก็บรักษาผลิตภัณฑ์อาหารในรูปของแห้ง เช่น กาแฟ รวมถึงเก็บรักษาผลิตภัณฑ์ทางชีวภาพ เช่น เอนไซม์ ฮอร์โมน ยาปฏิชีวนะ วิตามิน เลือด วัคซีนและแอน ตไิ บโอตกิ เกบ็ รกั ษาเช้อื จุลินทรีย์การทาํ แห้งวิธีน้ี ทําใหส้ ามารถเก็บรักษาผลติ ภัณฑ์ไว้ไดเ้ ปน็ เวลานานหลายปี โดยไม่ เกิดการเสียหาย และสามารถนํากลับละลายน้ําใช้ใหม่ได้ง่าย โดยท่ีคุณสมบัติของผลิตภัณฑ์ยังอยู่ครบถ้วน ใช้พื้นท่ี ใน การเก็บรักษานอ้ ย ง่ายต่อการขนสง่ เทคนคิ และการใชเ้ ครอ่ื งมือทางจุลชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 186

กจิ กรรมท่ี 3.2 ผู้สอนนําผู้เรียนศึกษาเครื่องมือของจริง และสาธิตการใช้งานเครื่องมือเฉพาะใช้ศึกษาจุลินทรีย์และเตรียม อาหารเล้ียงเชื้อจุลินทรีย์ เคร่ืองมือเฉพาะใช้ในการเลี้ยงจุลินทรีย์และเก็บเซลล์จุลินทรีย์ เครื่องมือเฉพาะใช้ในการ ตรวจสอบจุลินทรีย์และดีเอ็นเอ และเคร่ืองมือเฉพาะใช้ในงานทางจุลชีววิทยาได้เหมาะสม พร้อมให้นักศึกษามี ทกั ษะใชเ้ ครือ่ งมือบางชนดิ ด้วยตนเอง เทคนคิ และการใชเ้ ครอื่ งมือทางจลุ ชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 187

หน่วยที่ 4 เครือ่ งมอื ข้ันสูงทางจุลชวี วิทยา (Advanced Instruments in Microbiology) เทคนคิ และการใช้เครื่องมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 188

ใบเตรียมการสอน แผนการสอนสัปดาห์ที่ 11 รหสั วชิ า 403 – 25 – 16 บทเรียนที่ 4.1 หนว่ ยที่ 4 เครื่องมือขั้นสูงทางจุลชีววิทยา เวลาเรียน 2 ชัว่ โมง บทเรยี นที่ 4.1 เครือ่ งมือข้นั สูงใช้ศึกษาสัณฐานวทิ ยาจุลนิ ทรีย์ จุดประสงค์การสอน 2 ชั่วโมง 4.1 เขา้ ใจเครื่องมือขน้ั สงู ใช้ศึกษาสัณฐานวิทยาจุลนิ ทรีย์ได้เหมาะสม 4.1.1 อธบิ ายการใช้กล้องจุลทรรศน์อเิ ล็กตรอนชนิดส่องกราดไดถ้ ูกต้อง 4.1.2 อธบิ ายการใช้กล้องจุลทรรศนอ์ เิ ล็กตรอนชนิดส่องผา่ นได้ถูกต้อง เทคนิคและการใช้เคร่ืองมือทางจลุ ชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 189

หนว่ ยที่ 4 เครื่องมอื ข้ันสงู ทางจลุ ชีววิทยา (Advanced Instruments in Microbiology) บทเรียนท่ี 4.1 เคร่ืองมอื ขัน้ สูงใช้ศึกษาสณั ฐานวทิ ยาจุลินทรีย์ บทนํา ในบทน้ีจะกล่าวถึงเคร่ืองมือข้ันสูงสําหรับนักจุลชีววิทยา เครื่องมือขั้นสูงน้ีเป็นเครื่องมือท่ีผู้ปฏิบัติงาน ต้องได้รับการอบรมการใช้งานจากผู้เชี่ยวชาญไม่น้อยกว่า 3 คร้ัง ต้องผ่านการประเมินจากผู้เช่ียวชาญว่า ผู้ปฏิบัติงานสามารถใช้งานเครื่องมือขั้นสูงได้ด้วยตนเอง และต้องมีผู้เชี่ยวชาญกํากับดูแลระหว่างการใช้งาน เครื่องมือนั้นๆ ทุกคร้ัง เคร่ืองมือขั้นสูง ได้แก่ กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด (scanning electron microscope) กลอ้ งจลุ ทรรศน์อเิ ล็กตรอนแบบสอ่ งผา่ น (transmission electron microscope) เครื่องมอื เหล่าน้ี ถูกจัดจําแนกอยู่ในกลุ่มเครื่องมือข้ันสูง ผู้ปฏิบัติงานหรือนักจุลชีววิทยาต้องมีความรู้ส่วนประกอบหลักของ เครื่องมือ และมีความเชี่ยวชาญในการใช้งานเครื่องมือให้เหมาะสมกับชิ้นงาน ต้องมีความรอบคอบในการใช้งาน เครื่องมือทุกครั้ง เน่ืองจากเครื่องมือกลุ่มนี้ใช้หลักการ ทฤษฏีเฉพาะทาง และเคร่ืองมือมีราคาสูง หากผู้ปฏิบัติงาน พบอาการผิดปกตขิ ณะใช้เคร่อื งมือ ต้องแจ้งผเู้ ชี่ยวชาญทนั ที ผ้ปู ฏิบัติงานตอ้ งรู้วิธีดูแลบํารงุ รักษาเคร่ืองมือให้อยู่ใน สภาพดี และสามารถนาํ ไปใชป้ ระโยชน์ร่วมกบั งานดา้ นต่างๆ เชงิ บูรณาการ เคร่ืองมือขั้นสูงทางจุลชีววิทยา เป็นเครื่องมือเฉพาะทางข้ันสูงที่ผู้ใช้งานจําเป็นต้องมีความรู้ความ เชี่ยวชาญชํานาญในระดับสูง จึงสามารถใช้เคร่ืองมือในกลุ่มนี้ได้ ต้องผ่านการอบรม หรือ ได้รับใบรับรองจาก หน่วยงานที่มีการรับรองมาตรฐานสากล ผู้ท่ีต้องการใช้เคร่ืองมือในกลุ่มนี้ต้องมีความรู้ ขณะใช้งานจะต้องมี ผู้เชยี่ วชาญทไี่ ด้ผา่ นการอบรมการใชเ้ ครอ่ื งมอื คอยกํากับดูแลตลอดการใช้งานทุกครั้ง 4.1.1. กลอ้ งจุลทรรศน์อเิ ล็กตรอนชนดิ ส่องกราด (Scanning electron microscope) กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนชนิดส่องกราด (scanning electron microscope, SEM) แสดงดงั ภาพท่ี 4.1 เป็นกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนท่ีมีกําลังขยายสูงสุดประมาณ 10 นาโนเมตร) การเตรียมตัวอย่างเพ่ือท่ีจะดู ด้วยเคร่ือง SEM น้ีไม่จําเป็นต้องท่ีตัวอย่างจะต้องมีขนาดบางเท่ากับเม่ือดูด้วยเคร่ือง TEM ก็ได้ (เพราะไม่ได้ ตรวจวัดจากการท่ีอิเล็กตรอนเคลื่อนท่ีทะลุผ่านตัวอย่าง) การสร้างภาพทําได้โดยการตรวจวัดอิเล็กตรอนที่สะท้อน เทคนคิ และการใชเ้ คร่ืองมือทางจลุ ชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 190

จากพ้ืนผิวหน้าของ ตัวอย่างท่ีทําการสํารวจ ซึ่งภาพที่ได้จากเครื่อง SEM น้ีจะเป็นภาพลักษณะของ 3 มิติ ดังนั้น เครื่อง SEM จึงถูกนํามาใช้ในการศึกษาสัณฐานของจุลินทรีย์ หรือสิ่งมีชีวิตขนาดเล็ก หรือรายละเอียดของลักษณะ พื้นผิวของตัวอย่าง เช่น ลักษณะพื้นผิวด้านนอกของเนื้อเย่ือและเซลล์ หน้าตัดของโลหะและวัสดุ เป็นต้น (ภาพท่ี 4.2) ภาพที่ 4.1 กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด (ท่มี า: http://www.nano.kmitl.ac.th/index.php/tool/218-scaning-eletron-microscopysem-.html) ส่วนประกอบและหลกั การทํางาน กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราดประกอบด้วย แหล่งกําเนิดอิเล็กตรอนทําหน้าทีผ่ ลิตอิเล็กตรอน เพอื่ ป้อนให้กบั ระบบ โดยกลุ่มอิเล็กตรอนที่ได้จากแหล่งกําเนดิ จะถูกเร่งด้วยสนามไฟฟา้ จากนนั้ กลุ่มอิเล็กตรอนจะ ผ่านเลนส์รวบรวมรังสี (condenser lens) เพื่อทําให้กลุ่มอิเล็กตรอนกลายเป็นลําอิเล็กตรอน สามารถปรับให้ ขนาดของลําอิเล็กตรอนใหญ่หรือเล็กได้ตามต้องการ หากต้องการภาพที่มีความคมชัดจะปรับให้ลําอิเล็กตรอนมี ขนาดเล็ก หลังจากน้ันลําอิเล็กตรอนจะถูกปรับระยะโฟกัสโดยเลนส์ใกล้วัตถุ (objective lens) ลงไปบนผิวช้ินงาน ที่ต้องการศึกษา หลังจากลําอิเล็กตรอนถูกกราดลงบนช้ินงานจะทําให้เกิดอิเล็กตรอนทุติยภูมิ (secondary electron) ข้ึนซึ่งสัญญาณจากอิเล็กตรอนทุติยภูมินี้จะถูกบันทึก และแปลงไปเป็นสัญญาณทางอิเล็กทรอกนิกส์ ภาพถกู สง่ ไปยงั หนา้ จอด้วยโปรแกรมวิเคราะห์ผล เทคนคิ และการใช้เคร่ืองมือทางจลุ ชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 191