เอกสารประกอบการสอน_403-25-16_IM_เผยแพร่_2020

ภาพท่ี 4.2 อนุภาคและจุลินทรีย์ ภายใต้กลอ้ งจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด (ท่ีมา: http://www.microscopic.center.sci.buu.ac.th/images/website/EM.pdf) ข้อดีของกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด คือ ไม่ต้องตัดช้ินส่วนตัวอย่างให้บางมาก สามารถ มองเห็นภาพแบบ 3 มิติจงึ ใช้ศึกษาสัณฐานวิทยาและลักษณะพนื้ ผิวของจุลินทรีย์ได้การทาํ งานของกล้องจุลทรรศน์ อิเล็กตรอนแบบส่องกราดมีส่วนคล้ายกันกับกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านคือระบบแสงและสูญญากาศ มสี ่วนแตกตา่ งกันอยูท่ รี่ ะบบภาพเปน็ การส่งสัญญาณคล่ืน โดยลําอเิ ล็กตรอนผา่ นเลนส์แม่เหล็กไฟฟ้าจะถูกโฟกัสลง ที่ผิวของจุลินทรีย์ และเคล่ือนทไ่ี ปตามบริเวณท่ีศึกษาด้วยระบบกวาดภาพ(scan) แสงอิเล็กตรอนกระทบจุลินทรีย์ ทําให้อิเล็กตรอนของจุลินทรีย์หลุดออกมาเป็นอิเล็กตรอนทุติยภูมิ และสะท้อนไปยังตําแหน่งท่ีรวบรวมอิเล็กตรอน เพือ่ ส่งสัญญาณไปทีต่ ัว detector เพ่อื แปรเปน็ ภาพที่หลอดแคโทดบนจอคอมพิวเตอร์ เทคนิคและการใช้เครือ่ งมือทางจลุ ชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 192

4.1.2. กล้องจุลทรรศน์อเิ ล็กตรอนชนิดส่องผ่าน (Transmission electron microscope) ภาพที่ 4.3 ส่วนประกอบของกล้องจุลทรรศน์อเิ ล็กตรอนแบบส่องผ่าน (ทม่ี า: ภาควิชาพยาธวิ ิทยา โรงพยาบาลศิริราช, 2555) ส่วนประกอบและหลกั การทํางาน กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (transmission electron microscope, TEM) (ภาพที่ 4.3) ประกอบด้วย แหล่งกําเนิดกลุ่มอิเล็กตรอนทําหน้าที่ผลิตอิเล็กตรอนเพ่ือป้อนให้กับระบบ โดยกลุ่มอิเล็กตรอนที่ได้ จากแหล่งกําเนิดจะถูกเร่งด้วยสนามไฟฟ้า จากน้ันกลุ่มอิเล็กตรอนจะผ่านเลนส์รวบรวมรังสี (condenser lens) เพื่อทําให้กลุ่มอิเล็กตรอนกลายเป็นลําอิเล็กตรอนสามารถปรับให้ขนาดของลําอิเล็กตรอนใหญ่หรือเล็กได้ ตามต้องการ จากนั้นลําอิเล็กตรอนจะเคล่ือนท่ีผ่านตัวอย่างที่จะศึกษา (specimen) ไป ซ่ึงตัวอย่างท่ีจะศึกษา จะต้องมีลักษณะท่ีแบนและบางมาก (ระหว่าง 1-100 นาโนเมตร) เกิดการกระเจิงอนุภาคขึ้น เม่ืออิเล็กตรอนทะลุ ผ่านตัวอย่างไปอิเล็กตรอนท่ีทะลุผ่านตัวอย่างจะถูกปรับโฟกัสของภาพโดยเลนส์ใกล้วัตถุ (objective lens) ทํา หน้าที่ขยายภาพให้ได้รายละเอียดมากท่ีสุด ภาพท่ีได้ขยายด้วยเลนส์ทอดภาพไปสู่จอรับ (projector lens) และ ปรับโฟกัสของลําอนุภาคอิเล็กตรอนให้ยาวพอดีท่ีจะปรากฏบนฉากเรืองแสง และส่งภาพไปยังโปรแกรมวิเคราะห์ ภาพแสดงผลดังภาพที่ 4.4 โดยที่กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบน้ี มีหลักการทํางานแตกต่างกันกับกล้อง จุลทรรศนท์ ีม่ ใี ช้ในหอ้ งปฏิบัติการทวั่ ไป ดงั ตารางที่ 4.1 เทคนคิ และการใชเ้ ครื่องมือทางจลุ ชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 193

ภาพที่ 4.4 ไมโทรคอนเดรียภายในเซลล์ยีสต์ ภายใตก้ ล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (ทม่ี า: Tangsombatvchit, et al. 2015) ตารางท่ี 4.1 ความแตกต่างของกล้องจุลทรรศนอ์ เิ ล็กตรอนแบบส่องผา่ นกบั กล้องจุลทรรศนแ์ บบใช้แสงธรรมดา คณุ สมบตั ิ กล้องจลุ ทรรศนอ์ ิเล็กตรอนแบบ กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง ส่องผา่ น ธรรมดา แหลง่ กําเนิดแสง อเิ ล็กตรอน แสงที่ตามองเห็น ตัวกลางทีแสงส่องผา่ น สญู ญากาศ อากาศ วสั ดุที่วางตวั อยา่ งหรอื จุลินทรีย์เพอื่ ตาข่ายทองแดง (copper grid) สไลดแ์ ก้ว ตรวจสอบ ชนดิ ของเลนส์ เลนส์แม่เหล็กไฟฟ้า เลนส์แกว้ การจบั ภาพให้ชดั เจน ใช้กระแสไฟฟ้าผา่ นเพื่อใหเ้ กิด เลือ่ นเลนส์วัตถุ สนามแมเ่ หล็กเหน่ยี วนําและเบน แสงอิเล็กตรอน กาํ ลังขยายของภาพ ใช้กระแสไฟฟ้าผา่ นเข้าไปใน เปล่ียนไปตามเลนส์วัตถุ ขดลวดของโพรเจกเตอร์เลนส์ ท่มี า:นงลกั ษณ์, 2544 เทคนคิ และการใช้เครอื่ งมือทางจุลชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 194

สรปุ ท้ายบท เครื่องมือข้ันสูงที่ใช้ศึกษาสัณฐานวิทยาของจุลินทรีย์น้ัน ได้แก่ กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนชนิดส่องกราด หรือ เรียกว่า SEM และ กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่านหรือ เรียกว่า TEM กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน ท้ัง 2 ชนิดน้ี แหล่งกําเนิดแสงเป็นลําอิเล็กตรอนเหมือนกัน แต่การทํางานของตัวกล้อง และการวิเคราะห์ตัวอย่าง แตกต่างกัน คือ กล้อง SEM ใช้ศึกษาโครงสร้างภายนอกโดยรวมของชิ้นงาน ในขณะท่ี กล้อง TEM ใช้ศึกษา โครงสร้างส่วนประกอบภายในเซลล์ระดับลึก กล้องทั้ง 2 ชนิดนี้จะให้รายละเอียดของชิ้นงานที่ชัดเจนมากกว่า กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง ดังนั้น ผู้ใช้งานจําเป็นต้องมีความรู้ความเชี่ยวชาญชํานาญในระดับสูง จึงสามารถใช้ เคร่ืองมือในกลุ่มนี้ได้ ต้องผ่านการอบรม หรือ ได้รับใบรับรองจากหน่วยงานที่มีการรับรองมาตรฐานสากล ผู้ท่ี ต้องการใช้เคร่ืองมือในกลุ่มน้ีต้องมีความรู้ ขณะใช้งานจะต้องมีผู้เช่ียวชาญที่ได้ผ่านการอบรมการใช้เครื่องมือคอย กํากับดูแลตลอดการใช้งานทุกครั้ง ผู้ปฏิบัติงานต้องมีความรู้ความเชี่ยวชาญเก่ียวกับส่วนประกอบและหลักการ ทาํ งานของเคร่ือง มที ักษะรู้วิธกี ารใชง้ าน และการดแู ลรักษาอยา่ งมาก เทคนิคและการใชเ้ ครอ่ื งมือทางจุลชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 195

วิธกี ารสอนและกิจกรรม 1. ใช้วิธีการสอนบรรยายผ่านสื่อการสอนท่เี หมาะสม รว่ มกับการถาม-ตอบ 2. สอดแทรกและฝึกกระบวนการคิดอย่างมหี ลักการและเหตุผล 3. ยกตัวอยา่ งในเน้ือหา พรอ้ มภาพประกอบให้นักศึกษาได้เห็นภาพชดั เจน ส่อื การสอน เอกสารอ้างองิ หมายเลข ตามบรรณานุกรมท้ายเลม่ (12 18 และ 19) เอกสารประกอบการสอน เอกสารประกอบการสอนเทคนิคและการใช้เคร่อื งมือทาง จุลชวี วทิ ยา โสตทัศนวสั ดุ สื่อการสอนนาํ เสนอด้วยโปรแกรม Powerpoint ประกอบ การบรรยายสัปดาห์ท่ี 11 Multimedia LCD projector งานท่มี อบหมาย 1. ใหศ้ ึกษาค้นคว้าจาก หนงั สือ หรือ งานวิจัยทางจุลชีววิทยา เพ่ิมเติม 2. ใหศ้ ึกษาคน้ คว้าจาก สื่อการสอนออนไลน์ จากเวป็ ไซต์ตา่ งๆ การวัดผล - วิธีการสังเกต - ใบบันทึกเวลาเรียน บนั ทึกการสอนและข้อสังเกต - สังเกตจากพฤติกรรมทีแ่ สดงออกของนกั ศึกษา เช่น การมีวินัย การแตง่ กาย การตรง-ต่อเวลา รวมทั้ง การมีส่วนร่วมของนักศึกษาในชั้นเรยี น - เช็คการมาเขา้ เรียนของนักศึกษาทุกคร้ังในชัว่ โมงตามตารางสอน - วัดผลจากการทําขอ้ สอบยอ่ ย เทคนคิ และการใช้เครอ่ื งมือทางจลุ ชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 196

ส่อื การสอนสัปดาห์ท่ี 11 เทคนคิ และการใชเ้ คร่อื งมือทางจลุ ชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 197

เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 198

เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 199

เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 200

เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 201

ใบเตรียมการสอน แผนการสอนสัปดาห์ท่ี 12 รหสั วชิ า 403 – 25 – 16 บทเรียนที่ 4.2 หนว่ ยที่ 4 เครอื่ งมือขัน้ สูงทางจุลชีววทิ ยา เวลาเรียน 2 ชั่วโมง บทเรียนท่ี 4.2 เครอื่ งมอื ขน้ั สูงใช้ในงานทางจลุ ชีววทิ ยา จุดประสงค์การสอน 2 ช่วั โมง 4.2 เข้าใจเคร่ืองมอื ข้นั สูงใช้ในงานทางจุลชีววทิ ยาได้เหมาะสม 4.2.1 อธิบายการใช้โครมาโทกราฟแี บบแก๊สได้ถูกต้อง 4.2.2 อธบิ ายและยกตัวอย่างการใชโ้ ครมาโทกราฟีแบบของเหลว ประสิทธภิ าพสงู ได้ถูกตอ้ ง เทคนิคและการใชเ้ ครือ่ งมือทางจุลชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 202

หนว่ ยที่ 4 เครื่องมือข้ันสงู ทางจุลชีววิทยา (Advanced Instruments in Microbiology) บทเรียนท่ี 4.2 เคร่ืองมือขั้นสูงใช้ในงานทางจุลชีววิทยา บทนํา ในบทนี้จะกล่าวถงึ เครื่องมือขนั้ สูงสาํ หรับนักจลุ ชีววิทยาต่อ เครื่องมอื ข้ันสงู นีเ้ ป็นเครอื่ งมอื ทผ่ี ู้ปฏิบัติงาน ต้องได้รับการอบรมการใช้งานจากผู้เช่ียวชาญไม่น้อยกว่า 3 ครั้ง ต้องผ่านการประเมินจากผู้เช่ียวชาญว่า ผู้ปฏิบัติงานสามารถใช้งานเคร่ืองมือข้ันสูงได้ด้วยตนเอง และต้องมีผู้เช่ียวชาญกํากับดูแลระหว่างการใช้งาน เครื่องมือนั้นๆ ทุกครั้ง เครื่องมือขั้นสูง ได้แก่ โครมาโทรกราฟีแบบแกส๊ (gas chromatography) และโครมาโทรก ราฟีแบบของเหลวประสิทธิภาพสูง (high performance liquid chromatography) เครื่องมือเหล่าน้ีถูกจัด จาํ แนกอยู่ในกลุ่มเคร่อื งมือขั้นสูง ผปู้ ฏิบตั ิงานหรือนักจุลชีววทิ ยาตอ้ งมีความรู้ส่วนประกอบหลักของเคร่ืองมือ และ มีความเช่ียวชาญในการใช้งานเคร่ืองมือให้เหมาะสมกับชิ้นงาน ต้องมีความรอบคอบในการใช้งานเคร่ืองมือทุกครั้ง เนื่องจากเคร่ืองมือกลุ่มนี้ใช้หลักการ ทฤษฏีเฉพาะทาง และเครื่องมือมีราคาสูง หากผู้ปฏิบัติงานพบอาการผิดปกติ ขณะใช้เครื่องมือ ต้องแจ้งผู้เช่ียวชาญทันที ผู้ปฏิบัติงานต้องรู้วิธีดูแลบํารุงรักษาเคร่ืองมือให้อยู่ในสภาพดี และ สามารถนําไปใช้ประโยชนร์ ว่ มกบั งานด้านต่างๆ เชงิ บูรณาการ เคร่อื งมือขั้นสูงท่ีใชใ้ นงานทางด้านจุลชวี วทิ ยา โครมาโทรกราฟี (chromatography) เปน็ เครอ่ื งมือท่ีอาศัยสมบัติ2ประการคอื ประการแรก สารต่างชนิด กันมีความสามารถในการละลายในตัวทําละลายได้ต่างกัน และประการที่ 2 สารต่างชนิดกันมีความสามารถในการ ถกู ดดู ซบั ด้วยตัวดูดซบั ได้ตา่ งกนั ใช้หลักการแยกสารผสม (2 ชนดิ ขน้ึ ไป) ท่ีมีสี หรอื สารท่ที ําให้เกดิ สีไดป้ ระกอบด้วย เฟส 2 เฟส คือ เฟสอยู่กับที่ (stationary phase) ทําหน้าท่ีดูดซับ (adsorb) สารผสมด้วยแรงไฟฟ้าสถิตย์ วัสดุที่ สามารถดูดซับได้ดี เช่นกระดาษ ซ่ึงสารท่ีทําหน้าท่ีดูดซับในเฟสอยู่กับที่ คือ น้ํา และ เฟสเคล่ือนที่ (mobile phase) จะทําหน้าที่ชะ (elute) เอาสารผสมแยกจากเฟสอยู่กับท่ีให้เคลื่อนท่ีไป การเคลื่อนท่ีได้มากหรือน้อย ข้ึนอยกู่ บั แรงดงึ ดดู ระหวา่ งสารแต่ละชนิดในสารผสมกับตวั ดูดซับในเฟสอยู่กับท่ี สารทใ่ี ช้เปน็ เฟสเคลื่อนท่ีจึงได้แก่ ตัวทาํ ละลาย เช่น ปิโตรเลียมอเี ทอร์ เฮกเซน คลอโรฟอรม์ เบนซนี เทคนิคและการใช้เครือ่ งมือทางจลุ ชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 203

4.2.1. โครมาโทกราฟแี บบแกส๊ (Gas Chromatography) โครมาโทกราฟีแบบแก๊ส (gas chromatography, GC) (ภาพท่ี 4.5) ใช้สําหรับแยก และวิเคราะห์ สารอินทรีย์ผสม (organic analysis) โดยมีเฟสเคลื่อนที่เป็นแก๊ส แต่ไม่ทําปฏิกริ ิยากับสารผสม เช่น ฮีเลียม จะทํา หน้าที่เป็นตัวพา (carrier) สารผสม และเฟสอยู่กับที่จะเป็นของแข็งหรือของเหลวท่ีบรรจุอยู่ในคอลัมน์ เมื่อทั้งตัว พาและสารผสมเคลอื่ นที่ผา่ นคอลัมน์นี้ เฟสอยกู่ บั ท่ใี นคอลัมน์จะดึงดูดด้วยแรงดึงดูดไฟฟ้าสถิตยต์ ามสภาพการมีขั้ว ของสารกับโมเลกุลในสารผสมทําให้องค์ประกอบในสารผสมถูกพาไปด้วยอัตราเร็วที่ต่างกัน สารผสมก็จะแยกออก จากกนั ภาพท่ี 4.5 เครื่องโครมาโทกราฟแี บบแก๊ส (ทมี่ า: https://www.scientific-equipment.com/equipment-for-sale/gas-chromatography-gc/5890e-series-ii-plus- gc-gas-chromatograph?ln=3168) ปัจจุบันเทคนิคของโครมาโทกราฟีได้ถูกพัฒนาให้สามารถทํางานได้รวดเร็ว และใช้แยกสารตัวอย่างได้ครั้ง ละหลายสารตัวอย่าง เช่น gas-liquid chromatography (GLC) หรือ high performance liquid chromato- graphy (HPLC) เทคนิคและการใช้เครือ่ งมือทางจลุ ชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 204

4.2.2. โครมาโทรกราฟีแบบเหลวสมรรถนะสงู (High performance liquid chromatography) ภาพท่ี 4.6 เครือ่ งโครมาโทรกราฟีแบบเหลวสมรรถนะสงู (ท่มี า: http://www.rollabiotech.com/agilent-1260-series-dad-system-hplc-lc-system) โครมาโทรกราฟีแบบเหลวสมรรถนะสูง (high performance liquid chromatography, HPLC) แสดง ดังภาพที่ 4.6 เป็นเครื่องมือที่สามารถนําสารท่ีต้องการแยกมาละลายในตัวทําละลายที่เหมาะสมแล้วฉีดเข้าเคร่ือง ให้เคลื่อนท่ีไปบนตัวดูดซับ การเคลื่อนท่ีของสารบนตัวดูดซับข้ึนอยู่กับความสามารถในการละลายของสารแต่ละ ชนิดในตัวทําละลาย และความสามารถในการดูดซับท่ีมีต่อสารน้ัน กล่าวคือ สารท่ีละลายในตัวทําละลายได้ ดี และถูกดูดซับน้อยจะถูกเคลอื่ นที่ออกมาก่อน ส่วนสารที่ละลายได้น้อยและถูกดูดซับได้ดี จะเคล่ือนท่ีออกมาที หลัง ถา้ ใชต้ วั ดดู ซับมาก ๆ จะสามารถแยกสารออกจากกันได้ โครมาโทรกราฟีแบบเหลวสมรรถนะสูงจําแนกได้อย่างกว้างตามกลไกการแยกได้ 4 ประเภท ได้แก่ 1. adsorption chromatography โครมาโทรกราฟแี บบดูดซับ 2. partition chromatography โครมาโทรกราฟแี บบแบ่งละลาย 3. ion-exchange chromatography โครมาโทรกราฟีแบบแลกเปล่ียนประจุไฟฟ้า 4. size exclusion chromatography โครมาโทรกราฟีแบบใช้ขนาดอนภุ าคแยกสาร เทคนิคและการใช้เคร่อื งมือทางจลุ ชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 205

ส่วนประกอบและหลกั การทํางาน -ตัวทําละลาย (solvent) เป็นเฟสเคล่ือนที่ (mobile phase) เป็นตัวแปรท่ีมีความสําคัญมากในการแยก สารตัวอย่างออกเป็นองค์ประกอบย่อย ตัวทําละลายที่ใช้เป็นเฟสเคลื่อนที่ใน HPLC ได้แก่ ตัวทําละลายท่ีเป็น สารอนิ ทรยี ์ รวมทัง้ aqueous solution ของเกลือชนิดต่างๆ คณุ สมบัตทิ ี่สาํ คัญบางประการของเฟสเคล่ือนที่ ทใี่ ชใ้ น HPLC ได้แก่ 1. ไมท่ ําปฏิกริ ิยากบั column หรือ packing material ซ่งึ จะเป็นใหค้ ณุ สมบัติในการแยกสารผิด 2. สามารถละลายสารตัวอย่างได้ 3. ไม่รวมตัวเป็นก้อนของแข็ง (ทําให้เกิดการอุดตันใน column เป็นการเพ่ิมความดันในระบบ) และ dissolved gassolvent และสารละลายตัวอย่างทุกชนิดก่อนการวิเคราะห์โดยใช้ HPLC ควรกรองผ่านกระดาษ กรองที่มีรูพรุนขนาด 0.45–0.5 ไมครอน, ป่ันเหว่ียงแยกสารละลาย เพ่ือกําจัดแก๊สซึ่งละลายในสารละลายทั้งหมด ซง่ึ อาจทาํ ได้โดยใช้ Ultrasonic bath 4. บริสุทธ์ิปราศจากสิ่งเจือปนซึ่งรวมถึงพวก preservative และ stabilizer ต่างๆ สําหรับนํ้ากล่ันจะต้อง ปราศจากสารอนิ ทรีย์และแบคทีเรียต่างๆ 5. เหมาะสมกบั ชนิดของส่วนตรวจวิเคราะห์สญั ญาณ (Detector) ท่ใี ช้ การดดู กลืนแสงของเฟสเคล่ือนท่ี 1. ความบริสุทธ์ิของตัวทําละลายมีความสําคัญต่อการใช้ประโยชน์ของเครื่องตรวจวัด HPLC ที่มี sensitivity สงู 2. ออกซิเจนที่ละลายอยู่ในเฟสเคลื่อนท่ีทําให้เพ่ิม background ในช่วงรังสียูวีตํ่า การไล่อากาศสามารถ ช่วยแก้ปญั หาได้ 3. เกลอื ที่เปน็ สาร ion-pairing เช่น tetramethylammonium salts (TMA) มักมสี ารปนเปื้อนทีด่ ูดกลืน แสงชว่ งรงั สียวู ี จึงควรเลือกชนิดท่ีมีความบรสิ ทุ ธ์ิสงู เทา่ ที่จะหาได้ -ป้ัม ทําหน้าที่สูบเฟสเคลื่อนท่ี เพ่ือส่งเข้าสู่ column ในอัตราเร็วที่ผู้ปฏิบัติงานเลือก ความดันของระบบ จะขึ้นอยู่กับอัตราการเคล่ือนที่ของเฟสเคลื่อนที่ (ถ้าความเร็วสูงจะทําให้เกิดความดันสูง) นอกจากน้ียังขึ้นอยู่กับ viscosity ของเฟสเคลื่อนท่ี ขนาดของ packing material และความยาวของ column อีกด้วย โดยปกติความดัน ท่ีใช้มักไม่เกิน 4,000 psi โดย pump สามารถแบ่งออกได้เป็น 2 แบบคือ isocratic pump ใช้อัตราส่วนของเฟส เคลื่อนที่ได้คงท่ีตลอดเวลา และ gradient pump เป็น pump ท่ีสามารถควบคุมการเปล่ียนแปลงอัตราส่วนของ เฟสเคลอื่ นท่ีได้ตามเวลาที่กาํ หนด เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจลุ ชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 206

การเขา้ กนั ไดร้ ะหวา่ งตวั ทาํ ละลาย และปม้ั วัสดุท่ีสัมผัสกับของเหลวในระบบ HPLC ได้แก่ stainless steel, โพลิเมอร์ หลีกเล่ียงการใช้ตัวทําละลาย ที่สามารถกัดกร่อนโลหะได้แก่ บัฟเฟอร์ หรือกรดที่มีธาตุ halogen โดยเฉพาะท่ีความเข้มข้นเกิน 2M หรือ pH ต่ํา กว่า 2 ควรหลีกเลี่ยงการใช้ตัวทําละลายที่มีธาตุ halogen อยู่ในโมเลกุลมาก เช่น trifluroacetic acid (TFA) หลีกเลี่ยงการใช้ตัวทําละลายที่สามารถเกิดกรด HCl เช่น CCl4, CHCl3 หลีกเลี่ยงการใช้ cyclohexane เนื่องจาก การเกิดการแข็งตัวในป้ัมทอ่ี ุณหภูมหิ ้อง และควรหลีกเลีย่ งการใช้สารละลาย buffer ท่มี ี pH มากกว่า 10 -Injector เป็นตําแหน่งท่ีฉีดสารเข้าสู่ column มี 2 แบบ ได้แก่ manual injector และ auto samples injector ที่นยิ มใชม้ าก -คอลัมน์ (column) ทําด้วย stainless steel แก้ว หรือ Teflonมีขนาดเล็ก เส้นผ่านศูนย์กลางประมาณ 1-25 มลิ ลเิ มตร ในงานวเิ คราะห์ใช้ขนาด 1–5 มิลลเิ มตร และใชข้ นาดใหญก่ ว่านก้ี ับงาน preparative separation -detector เป็นตัวตรวจจับสัญญาณท่ีนิยมใช้กันมากมี 3 ชนิด ได้แก่ ชนิดท่ี 1 เรียกว่า UV- detector สารท่ีจะวิเคราะห์ต้องสามารถดูดกลืนแสงรังสียูวีได้ เมื่อต้องการใช้ UV detector อาจเตรียม derivative ของ สารประกอบท่ีวิเคราะห์เพื่อให้ได้สารซึ่งดูดกลืนคล่ืนแสงรังสียูวี ชนิดที่ 2 เรียกว่า RI detector จะใช้เมื่อต้องการ เปรียบเทียบความแตกต่างของ refractive index ของสารตัวอย่างและสาร reference และ ชนิดท่ี 3 เรียกว่า fluorescence detector ใช้ได้กับสารท่ีเม่ือดูดกลืนคล่ืนแสงรังสียูวี จากแหล่งแสงใน detector แล้วสามารถ เปลง่ fluorescence ได้ การเลือกตัวทําละลายและตัวดูดซบั 1. ตัวทําละลายและสารทต่ี ้องการแยกจะตอ้ งมกี ารละลายไม่เทา่ กนั 2. ควรเลือกตัวดดู ซับทม่ี ีการดดู ซับสารได้ไม่เทา่ กนั 3. ถา้ ต้องการแยกสารท่ีผสมกนั หลายชนิดอาจต้องใช้ตวั ทําละลายหลายชนิดหรอื ใชต้ ัวทาํ ละลายผสม 4. ตัวทาํ ละลายทีน่ ิยมใช้ ได้แก่ เฮกเซน ไซโคลเฮกเซน เบนซนี อะซโี ตน คลอไรฟอร์ม เอธานอล 5. ตัวดดู ซับที่นิยมใช้ ได้แก่ อะลูมนิ าเจค (Al2O3) ซิลิกาเจล (SiO2) เทคนิคและการใชเ้ ครื่องมือทางจลุ ชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 207

วิธีการใช้งานและการบํารงุ รกั ษา 1. ใช้งานอย่างถูกวิธตี ามขนั้ ตอนในคู่มือ 2. กอ่ นใช้งาน ควรเปดิ เคร่อื งประมาณ 15 นาที ก่อนเร่มิ การใช้งาน 3. เปิด stabilizer เปิด detector มี 2 ชนิด ด้านบนเป็น RI detector ด้านล่างเป็น UV detector เปิด เฉพาะ detector ทจ่ี ําเปน็ ตอ้ งใชง้ าน เปดิ pump water 600 และเปดิ แก๊ส Helium 4. กรณี run แบบ semi-prep ต้อง เปลี่ยน flow cell ของ UV detector ให้เหมาะสม ซ่ึงจะมีขนาด ของ flow cell ใหญ่กว่า หากใช้ RI detector ให้ต่อท่อลดปริมาตรของ mobile phase ให้ถูกต้อง ก่อนต่อเข้า กับ RI detector ไมเ่ ชน่ นัน้ detector จะเสยี หายได้ 5. การต้งั ค่า UV detector กอ่ นใช้งาน หลังจากเปดิ เคร่ืองแล้ว -data not found กด enter, system not calibrate, enter, warm up 5 นาที -method not found, enter, error, กดปุ่ม shift, กดปุ่ม calibrate, calibrate successful, enter เคร่ืองจะแสดงค่า Absorbance ทศนยิ ม 4 ตําแหนง่ ขอ้ ความ<error>จะหายไป 6. การตง้ั คา่ RI detector ก่อนใชง้ าน -หน้าจอแสดง non-volatile RAM, LED intensity too low จึงจะสามารถทําข้ันตอนอื่นได้, factory default set 7. การเปลี่ยนเฟสเคล่ือนท่ี ให้นําท่อที่มีชุดกรอง จุ่มลงไปในเฟสเคล่ือนท่ี ที่ต้องการและสังเกต ตัวอักษร ภาษาองั กฤษ A B C และ D ที่ทอ่ แสดงถึงการความสัมพันธร์ ะหวา่ งทอ่ กบั ปั้ม 8. ท่ีหน้าจอควบคุมปั้ม กด direct เลือกปั้มให้ตรงสายท่อที่จุ่มลงในเฟสเคลื่อนท่ี และตั้งค่า 100% ปั้ม อ่ืนๆ ใหต้ ้ังค่า 0% หรือตั้งคา่ ตามต้องการ (หาก run เป็นแบบ gradient) หลังจากตั้งค่าเสร็จให้ enter เพื่อรับค่า ท่ีต้ังไว้ 9. ตั้งค่า flow rate 1.0 ml/min และกดปุ่ม enter แล้ว กด stop flow หลังจาก run ไปแล้วประมาณ 30 วนิ าที 10. ใช้ siringดูดเฟสเคล่ือนท่ีออก เพื่อใล่อากาศในท่อ ในตําแหน่ง draw และปิดในตําแหน่ง run เพ่ือนํา เฟสเคลอื่ นทีท่ ิ้ง ทําเช่นน้ี 3 ครัง้ 11. ตั้งค่า flow rate 1.00 ml/min กด enter และ เปิดปุ่ม purge เพ่ือไล่อากาศออก ประมาณ 2 นาที ปิปุ่ม purge และ stop flow จากนั้นนําสายที่เฟสเคลื่อนท่ี ออกจากปั้มต่อเข้ากับ guard column, column HPLC และต่อเข้ากับ detector ตามลาํ ดบั 12. ทดสอบการไหล และตรวจสอบข้อต่อต่างๆ ว่ามีการร่ัวหรือไม่ โดยการตั้งค่า flow rate เท่ากับอัตรา การไหลที่ต้องการ เช่น 1.00 มิลลิลิตร/นาทีโดยค่อยๆ เพ่ิมอัตราการไหลท่ีละ step ดังน้ี 0.2 0.5 0.8 1.0 มิลลิลติ ร/นาที (step ละ 1 นาที) เทคนคิ และการใชเ้ คร่ืองมือทางจลุ ชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 208

13. กรณีใช้ RI detector ปล่อยให้เฟสเคล่ือนท่ี ไหลผ่านประมาณ 10 นาที ท่ีหน้าจอยังข้ึน LED intensity too low, กดปุ่ม shift purge ปล่อยให้เฟสเคลื่อนที่ไหลผ่านอีกประมาณ 10 นาที กด shift purge ซ้ํา อกี ครงั้ , กด shift configure, ใช้ลูกศรเล่อื นมาที่ inject, กด 1(high), และกดปุม่ HOME 14. เม่ือเลิกใช้เคร่ืองแล้วให้ กด stop pump ที่หน้า control panel, ปิดโปรแกรม empower, ปิดหน้า processing และ shut down computer และถอดการด์ คอลมั น์ และคอลมั นอ์ อก ปิดคอลัมนด์ ว้ ย nut พลาสติก ใหเ้ รียบร้อย 15. ดงึ สาย pump ทีจ่ มุ่ ลงในเฟสเคลือ่ นท่ี ใหอ้ ยู่เหนือระดบั สารละลาย 16. ดูดสารละลายที่อยู่ในท่อออกให้หมด โดยใช้ syringe ดูดออกที่ตําแหน่ง draw หลังจากดูดออก หมดแล้วใหห้ มนุ มาทต่ี ําแหน่งเดิม (run) 17. ล้าง sample loop ด้วยนํ้ากล่ัน โดยฉีดน้ํากล่ัน 2-3 คร้ังเข้าไปในเคร่ืองท่ีสวิทซ์inject ในตําแหน่ง load 18. ปิดแกส๊ He, ปิดสวิทซป์ ัม้ water 600, ปดิ สวทิ ซd์ etector, ปิด UPS computer, ปดิ printer, สวิทซ์ รวม (ดา้ นหลงั เครือ่ ง computer) และปดิ stabilizer 19. หมั่นสงั เกตอาการและการทํางานของเครอ่ื ง หากพบสง่ิ ผิดปกติ ให้แจง้ ผ้รู บั ผิดชอบทนั ที 20. ดแู ลรักษาความสะอาดของเครื่องอยา่ งสมาํ่ เสมอ 21. หากมีปัญหา ไม่ว่ากรณีใดๆ เบื้องต้นหากผู้ใช้งานแก้ไขได้ให้ปฏิบัติการแก้ไข หากไม่สามารถแก้ไขได้ ให้รบี แจง้ อาจารย์ผู้ดูแลหรอื เจา้ หนา้ ทวี่ ทิ ยาศาสตร์ทันที เทคนิคและการใชเ้ ครอ่ื งมือทางจลุ ชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 209

บทสรุปท้ายหนว่ ยท่ี 4 เคร่ืองมือข้ันสูงสําหรับการทํางานของนักจุลชีววิทยา ผู้ปฏิบัติงานต้องได้รับการอบรมจากผู้เชี่ยวชาญให้มี ความรู้เรื่องส่วนประกอบหลักของเคร่ืองมือ มีความเชี่ยวชาญการใช้งานของเครื่องมือที่ถูกต้อง รู้วิธีการบํารุงรักษา เคร่ืองมือ ขณะปฏิบัติงานต้องมีผู้เช่ียวชาญอยู่ร่วมด้วยทุกครั้ง รวมท้ังผู้ปฏิบัติงานสามารถคิดวิเคราะห์และเลือก เคร่ืองมือไปใช้ประโยชน์ในด้านต่างๆ ที่เหมาะสม เคร่ืองมือข้ันสูง ได้แก่ กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด (scanning electron microscope) กล้องจุลทรรศน์ชนิดน้ีถูกเลือกใช้ในการศึกษาโครงสร้างภายนอกของ จุลินทรีย์ได้ในระดับลึก ภาพที่แสดงจะเป็นแบบ 3 มิติ (3D) ในขณะท่ีกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (transmission electron microscope) ถูกใช้ในการศึกษาโครงสร้างภายในเซลล์ ดูองค์ประกอบต่างๆ ของเซลล์ ในระดับลึก ซ่ึงภาพที่แสดงจะเป็นแบบ 3 มิติ (3D) เช่นกันกับกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด แต่ กระบวนการข้ันตอนในการเตรียมตัวอย่างก่อนนําไปตรวจสอบภายใต้กล้องมีความแตกต่างกัน เครื่องมือถัดไปคือ โครมาโทรกราฟีแบบแก๊ส (gas chromatography) หรือ โครมาโทรกราฟีแบบเหลวสมรรถนะสูง (high performance liquid chromatography) เคร่ืองมือ 2 ชนิดน้ีใช้ในการตรวจวิเคราะห์สารบริสุทธ์ิให้มีความ แม่นยํามากข้ึนกว่าเคร่ืองมือชนิดอื่น โดยอาศัยหลักการท่ีตัวทําละลายพาตัวถูกละลายเคลื่อนที่ไป สารท่ีต้องการ ศึกษามีตัวมาตรฐานไว้ใช้เปรียบเทียบ สารท่ีศึกษาอยู่ในรูปก๊าซหรือของเหลว ดังน้ัน ผู้ปฏิบัติงานกับเคร่ืองมือขั้น สงู ต้องปฏบิ ตั ิงานด้วยความรอบคอบ ตอ้ งรูส้ ่วนประกอบสําคัญของเคร่ืองมือ หลักการทํางานของเครอื่ งมือ มีความ ชํานาญการใช้เครื่องมือเหล่าน้ี ต้องรู้วิธีการบํารุงรักษาเคร่ืองมือ ต้องมีความสามารถในการพิจารณาแก้ไขเบ้ืองต้น หากเกิดความผิดปกติของเคร่ืองมือท่ีนั้นๆ และต้องรีบแจ้งผู้เช่ียวชาญทันที เครื่องมือเหล่าน้ีใช้ทฤษฏีที่เฉพาะทาง มรี าคาสูง รวมท้ังส่วนประกอบของเครอ่ื งมือบางชนิดไม่มีให้เปลี่ยน ผู้ปฏบิ ตั ิงานตอ้ งมีความระมัดระวังอย่างมากใน การทาํ งานกบั เครอื่ งมือ เทคนคิ และการใช้เครือ่ งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 210

วิธีการสอนและกิจกรรม 1. ใช้วิธกี ารสอนบรรยายผ่านสื่อการสอนที่เหมาะสม ร่วมกับการถาม-ตอบ 2. สอดแทรกและฝึกกระบวนการคดิ อยา่ งมหี ลักการและเหตุผล 3. ยกตัวอย่างในเนอื้ หา พรอ้ มภาพประกอบให้นักศึกษาไดเ้ ห็นภาพชัดเจน 4. มอบหมายให้นักศึกษาทาํ แบบฝึกหัดท้ายหน่วยเรียน ส่ือการสอน เอกสารอา้ งองิ หมายเลข ตามบรรณานุกรมท้ายเล่ม (7 9 และ 10) เอกสารประกอบการสอน เอกสารประกอบการสอนเทคนิคและการใช้เครอื่ งมือทาง จลุ ชวี วทิ ยา โสตทัศนวัสดุ สอื่ การสอนนาํ เสนอด้วยโปรแกรม Powerpoint ประกอบ การบรรยายสัปดาหท์ ี่ 12 Multimedia LCD projector งานที่มอบหมาย 1. ใหศ้ ึกษาคน้ คว้าจาก หนังสือ หรอื งานวิจัยทางจุลชีววทิ ยา เพิ่มเติม 2. ใหศ้ ึกษาคน้ คว้าจาก สื่อการสอนออนไลน์ จากเวป็ ไซต์ตา่ งๆ 3. ให้ทําแบบฝึกหดั ทา้ ยหนว่ ยเรยี น การวัดผล - วิธีการสังเกต - ใบบันทึกเวลาเรียน - แบบฝึกหัดท้ายหน่วยเรียน บันทกึ การสอนและข้อสังเกต - สังเกตพฤติกรรมที่แสดงออกของนักศึกษา เชน่ การมวี นิ ัย การแตง่ กาย การตรง-ตอ่ เวลา รวมทง้ั การมี สว่ นร่วมของนักศึกษาในชั้นเรยี น - เชค็ การมาเขา้ เรียนของนักศึกษาทุกครงั้ ในชั่วโมงตามตารางสอน - วัดจากการตอบคําถามแบบฝึกหดั ทา้ ยบทเรียน เม่ือจบเน้ือหาหน่วยท่ี 4 อยา่ งถูกตอ้ งและส่งตามกาํ หนดที่ อาจารย์ผู้สอนนดั หมาย ในระยะเวลาไม่เกิน 5 วันหลังจากเรียนหน่วยที่ 4 เสรจ็ ส้นิ แล้ว - วัดผลจากการทาํ ขอ้ สอบย่อย เทคนคิ และการใชเ้ ครื่องมือทางจลุ ชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 211

ส่อื การสอนสัปดาห์ท่ี 12 เทคนคิ และการใชเ้ คร่อื งมือทางจลุ ชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 212

เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 213

เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 214

เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 215

เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 216

แบบฝึกหัดสัปดาหท์ ่ี 12 1. กล้องจลุ ทรรศน์อิเล็กตรอนมีก่ชี นดิ อะไรบา้ ง ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ 2. จงเปรียบเทยี บการใชง้ านของกล้องจลุ ทรรศนอ์ เิ ล็กตรอนกับกล้องจลุ ทรรศน์แบบใช้แสงธรรมดา ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ 3. จงอธิบายหลกั การทํางานและการใชป้ ระโยชนข์ องเคร่อื งโครมาโทกราฟีแบบแก๊ส ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ 4. จงอธบิ ายหลกั การทํางานและการใช้ประโยชนข์ องเคร่อื งโครมาโทกราฟีแบบเหลวสมรรถนะสูง ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ เทคนิคและการใชเ้ ครื่องมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 217

5. จงอธิบายหลักการเลือกตัวทําละลายและตัวดูดซับ สําหรับการใช้ประโยชน์จากเคร่ืองแยกสารโครมาโทกราฟี แบบแกส๊ กบั เคร่อื งโครมาโทกราฟีแบบเหลวสมรรถนะสงู ต่อการวเิ คราะหต์ ัวอยา่ ง ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ เทคนคิ และการใชเ้ ครือ่ งมือทางจุลชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 218

เฉลย แบบฝกึ หัดสัปดาห์ท่ี 12 1. กล้องจุลทรรศนอ์ ิเล็กตรอนมีกชี่ นดิ อะไรบ้าง 2 ชนิด ได้แก่ กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนชนิดส่องกราด (scanning electron microscope: SEM) และ กลอ้ งจุลทรรศนอ์ เิ ล็กตรอนชนิดส่องผ่าน (transmission electron microscope: TEM) 2. จงเปรยี บเทยี บการใช้ประโยชน์จากกล้องจุลทรรศนอ์ ิเล็กตรอนกบั กลอ้ งจุลทรรศน์แบบใชแ้ สงธรรมดา คุณสมบตั ิ กล้องจลุ ทรรศน์อิเล็กตรอนแบบ กล้องจุลทรรศนแ์ บบใช้แสง ส่องผา่ น ธรรมดา แหลง่ กําเนิดแสง อเิ ล็กตรอน ตวั กลางทีแสงส่องผา่ น สูญญากาศ แสงท่ตี ามองเหน็ วสั ดทุ ีว่ างตวั อย่างหรอื จุลนิ ทรยี ์เพ่ือ อากาศ ตาข่ายทองแดง (copper grid) สไลดแ์ ก้ว ตรวจสอบ ชนดิ ของเลนส์ เลนส์แม่เหล็กไฟฟา้ เลนส์แกว้ การจบั ภาพให้ชัดเจน ใช้กระแสไฟฟ้าผ่านเพ่ือใหเ้ กิด เล่อื นเลนส์วตั ถุ สนามแม่เหล็กเหนยี่ วนําและเบน กาํ ลังขยายของภาพ เปล่ียนไปตามเลนส์วตั ถุ แสงอเิ ล็กตรอน ใช้กระแสไฟฟ้าผ่านเข้าไปใน ขดลวดของโพรเจกเตอร์เลนส์ 3. จงอธบิ ายหลักการทาํ งานและการใชป้ ระโยชน์ของเครือ่ งโครมาโทกราฟีแบบแก๊ส โครมาโทกราฟีแบบแก๊ส (gas chromatography , GC) ใช้สําหรับแยกสารอินทรีย์ผสม (organic analysis) โดยมีเฟสเคลื่อนที่เป็นแก๊ส แต่ไม่ทําปฏิกิริยากับสารผสม เช่น ฮีเลียม จะทําหน้าที่เป็นตัวพา (carrier) สารผสม และเฟสอยู่กับท่ีจะเป็นของแข็งหรือของเหลวที่บรรจุอยู่ในคอลัมน์ เม่ือทั้งตัวพาและสารผสมเคล่ือนท่ี ผ่านคอลัมน์นี้ เฟสอยู่กับท่ีในคอลัมน์จะดึงดูดด้วยแรงดึงดูดไฟฟ้าสถิตย์ตามสภาพการมีข้ัวของสารกับโมเลกุลใน สารผสมทําให้องค์ประกอบในสารผสมถูกพาไปด้วยอัตราเร็วท่ีต่างกัน การใช้ประโยชน์จากเครื่องน้ี คือ แยกสาร ผสมกจ็ ะแยกออกจากกนั ดว้ ยตัวทาํ ละลายทเี่ ปน็ แกส็ เทคนคิ และการใชเ้ คร่ืองมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 219

4. จงอธบิ ายหลักการทาํ งานและการใชป้ ระโยชน์ของเครอื่ งโครมาโทกราฟีแบบเหลวสมรรถนะสูง เคร่ืองโครมาโทกราฟีแบบเหลวสมรรถนะสูง(high performance liquid chromatography) เป็น เครื่องมอื ท่สี ามารถนําสารที่ต้องการแยกมาละลายในตัวทําละลายทเ่ี หมาะสมแลว้ ฉดี เข้าเครือ่ งให้เคลื่อนท่ีไปบนตัว ดูดซับ การเคล่ือนที่ของสารบนตัวดูดซับข้ึนอยู่กับความสามารถในการละลายของสารแต่ละชนิดในตัวทํา ละลาย และความสามารถในการดูดซบั ที่มีตอ่ สารนั้น คอื สารทล่ี ะลายในตวั ทาํ ละลายได้ดี และถกู ดดู ซับน้อยจะถูก เคลื่อนท่ีออกมาก่อน ส่วนสารที่ละลายได้น้อยและถูกดูดซับได้ดี จะเคล่ือนท่ีออกมาทีหลัง ถ้าใช้ตัวดูดซับมาก ๆ จะสามารถแยกสารออกจากกันได้ การใช้ประโยชน์จากเคร่ืองน้ี คือ แยกสารผสมก็จะแยกออกจากกันด้วยตัว ทําละลายทีเ่ ปน็ สารอินทรยี ์ 5. จงอธิบายหลักการเลือกตัวทําละลายและตัวดูดซับ สําหรับการใช้ประโยชน์จากเครื่องแยกสารโครมาโทกราฟี แบบแก๊ส กับ เครอ่ื งโครมาโทกราฟีแบบเหลวสมรรถนะสงู ต่อการวิเคราะหต์ ัวอย่าง 1. ตวั ทาํ ละลายและสารทีต่ ้องการแยกจะต้องมีการละลายไมเ่ ทา่ กนั 2. ควรเลอื กตวั ดดู ซบั ที่มีการดูดซบั สารได้ไมเ่ ทา่ กนั 3. ถา้ ตอ้ งการแยกสารทผ่ี สมกันหลายชนิดอาจต้องใชต้ ัวทําละลายหลายชนิดหรือใชต้ ัวทําละลายผสม 4. ตวั ทําละลายท่ีนิยมใช้ ได้แก่ เฮกเซน ไซโคลเฮกเซน เบนซีน อะซีโตน คลอไรฟอรม์ เอธานอล 5. ตวั ดดู ซับทน่ี ิยมใช้ ได้แก่ อะลมู ินาเจค (Al2O3) ซลิ ิกาเจล (SiO2) เทคนคิ และการใช้เคร่อื งมือทางจลุ ชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 220

หน่วยท่ี 5 เคร่ืองมือด้านอณูโมเลกุลทางจุลชีววิทยา (Molecular Instruments in Microbiology) เทคนิคและการใชเ้ ครอ่ื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 221

ใบเตรียมการสอน แผนการสอนสัปดาห์ที่ 13 รหสั วชิ า 403 – 25 – 16 บทเรยี นที่ 5.1 หนว่ ยที่ 5 เครอื่ งมือทางอณโู มเลกลุ ทางจุลชีววทิ ยา เวลาเรียน 2 ชั่วโมง บทเรียนที่ 5.1 เครอ่ื งมือทางอณูโมเลกุลใช้ตรวจสอบดีเอ็นเอของจุลินทรีย์ จุดประสงค์การสอน 5.1 เขา้ ใจและประยุกต์เคร่อื งมอื ทางอณโู มเลกลุ ใชต้ รวจสอบดเี อ็นเอ 2 ชว่ั โมง ของจุลนิ ทรีย์ได้ถูกตอ้ ง 5.1.1 อธบิ ายและประยุกต์ใชเ้ ครอื่ งเพ่ิมปริมาณดเี อน็ เอได้ถูกตอ้ ง 5.1.2 อธบิ ายการใชเ้ ครอื่ งเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอและวเิ คราะห์คุณภาพผลลัพธ์ได้ 5.1.3 สรปุ และประยุกตใ์ ช้เครอื่ งแยกสารชีวโมเลกลุ ด้วยไฟฟ้าได้ถูกตอ้ ง เทคนคิ และการใชเ้ ครื่องมือทางจลุ ชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 222

หนว่ ยท่ี 5 เครอื่ งมอื ดา้ นอณโู มเลกุลทางจลุ ชีววิทยา (Molecular Instruments in Microbiology) บทเรียนท่ี 5.1 เครื่องมอื ทางอณูโมเลกุลใช้ตรวจสอบดีเอ็นเอของจุลินทรีย์ บทนํา ด้วยวิวฒั นาการทางวทิ ยาศาสตร์ ความร้คู วามก้าวหนา้ ของเทคโนโลยีสมัยใหม่ ทาํ ใหอ้ งค์ความร้ทู างอณู โมเลกุล (molecular genetics) ของจุลินทรีย์ เป็นท่ีนา่ สนใจและไดร้ ับการศึกษาอย่างต่อเน่ืองในระดับลึก ความรู้ ทางด้านอณูโมเลกุลเป็นการรวมศาสตร์หลายแขนงเข้าด้วยกัน เช่น จุลชีววิทยา ชีววิทยาเชิงฟิสิกส์ พันธุศาสตร์ ชีวเคมี รวมไปถึงคอมพิวเตอร์เทคโนโลยีสารสนเทศ ความรเู้ หล่าน้ีนํามาซึ่งการพัฒนาในดา้ นต่างๆ เชน่ การคิดค้น ยาต้านจุลชีพสําหรับฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ก่อโรคได้อย่างมีประสิทธิภาพ การหาสารต้านอนุมูลอิสระ หรือการผลิตสาร secondary metabolize การถ่ายยนี ที่มีคณุ สมบตั ทิ ่ตี ้องการเข้าส่เู ซลล์จุลนิ ทรยี ์เพ่อื เพ่ิมปริมาณให้มาก การศกึ ษา องค์ความรู้เหล่านี้ มีความจําเป็นอย่างมากที่ต้องมีเคร่ืองมือทางอณูโมเลกุลมาช่วยให้ผู้ปฏิบัติงาน สร้างผลการ ทดลองได้แม่นยํา และถูกต้องมากข้ึน เคร่ืองมือทางอณูโลเลกุล ได้แก่ เคร่ืองเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ (PCR machine/Real-time PCR) เคร่ืองแยกสารพันธุกรรม ดีเอ็นเอ (electrophoresis) ในบทน้ี ผู้ปฏิบัติงานทางด้าน จุลชวี วิทยา หรอื นักวจิ ัยต้องเรียนรู้สว่ นประกอบของเคร่ืองมือ เขา้ ใจหลักการทํางานของเคร่ืองมือ มีความชํานาญ ในการใช้เครื่องมือเป็นอย่างดี รู้วิธีบํารุงรักษาให้เครื่องมือมีอายุการใช้งานยาวนาน และหากเกิดความผิดปกติท่ี เครอื่ งมือนน้ั ๆ ผปู้ ฏบิ ตั ิงานสามารถตัดสนิ ใจในการแก้ไขปญั หาเบ้ืองตน้ ได้ และรีบแจง้ ให้อาจารยผ์ ้ดู ูแลทราบทนั ที เคร่ืองมือด้านอณูโมเลกุลทางจุลชีววิทยา เป็นเครื่องมือเฉพาะทางสําหรับงานทางด้านอณูโมเลกุล เช่น ดี เอ็นเอ อาร์เอ็นเอ โปรตีน ยีน ที่ผู้ใช้งานจําเป็นต้องมีความรู้และความเชี่ยวชาญชํานาญในระดับสูง จึงสามารถใช้ เคร่ืองมือในกลุ่มนี้ได้ ต้องผ่านการอบรมหรือได้รับใบรับรองจากหน่วยงานที่มีการรับรองมาตรฐานสากล เช่นเดียวกันกับเครื่องมือขัน้ สูง หากผู้ที่ต้องการใช้เครื่องมือในกลุ่มนี้มีความรู้ในระดับพื้นฐาน ขณะใช้งานจะต้องมี ผเู้ ชยี่ วชาญการใช้เคร่ืองมือนนั้ ๆ คอยกํากับดแู ลตลอดการใช้งานทุกครงั้ เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 223

5.1.1 เครือ่ งเพมิ่ ปรมิ าณดีเอน็ เอ (PCR machine) เครื่องเพ่ิมปริมาณดีเอ็นเอ เป็นเคร่ืองมือท่ีใช้เพ่ิมปริมาณดีเอ็นเอตามตําแหน่งท่ีผู้ปฏิบัติงาน ต้องการศึกษา PCR ย่อมาจาก Polymerase Chain Reaction การเพิ่มปริมาณสาย DNA ช่วงหน่ึงที่ต้องการ หลักการเป็นการเลียนแบบขั้นตอนกระบวนการ replication ภายในเซลล์ (ภาพที่ 5.1) ซ่ึง PCR เป็นเทคนิคท่ีถูก นํามาใช้ในงานทางด้านอณูวิทยา (molecular biology) โดยนักวิทยาศาสตร์ท่ีมีชื่อว่า Karry Mullis เป็นผู้คิดค้น เทคนิคนี้เปน็ บคุ คลแรก เร่มิ ใช้ศกึ ษางานวจิ ัยในทางการแพทย์ ภาพที่ 5.1 กระบวนการจําลองดีเอ็นเอภายในเซลล์สิง่ มชี ีวิต (DNA replication) (ทมี่ า: Baveja, 2014) ผู้ปฏิบัติงานจะใช้เครื่องมือนี้ได้ถูกต้อง จะต้องมีความเข้าใจในกระบวนการจําลองดีเอ็นเอ โดยเริ่มต้นจาก ดีเอ็นเอสายคู่ จะแยกออกจากกันเป็นดีเอ็นเอสายเด่ียว อยู่ด้านบนและด้านล่าง ทั้งสายบนและสายล่างจะมีตัวพา เบส A T C G มาต่อเข้ากับเบสคู่สม (complementary fragment) โดยการทํางานของเอนไซม์ DNA polymerase III จนได้ดีเอ็นเอสายใหม่ท่ีมีคุณสมบัติกึ่งอนุรักษ์ (semiconservative region) ดังน้ันองค์ประกอบ ท่ีสําคัญในการทํา PCR ได้แก่ ดีเอ็นเอแม่แบบ (template DNA) ไพรเมอร์ Primersเอ็นไซม์ DNA polymerase ชนิดทนความร้อน (Taq DNA polymerase III) Deoxy nucleotide triphosphate (dNTPs) บัฟเฟอร์สําหรับ เอน็ ไซมด์ ีเอน็ เอพอลเิ มอเรส (PCR Buffer) และ แมกนเี ซยี มคลอไรด์ (MgCl2) เทคนคิ และการใช้เคร่อื งมือทางจุลชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 224

เคร่อื งมือทส่ี ําคญั ในการทําพีซอี าร์ได้แก่ Thermal cycler หรอื PCR machine ภาพที่ 5.2 เครื่องเพิม่ ปรมิ าณชิน้ ดีเอน็ เอ (ทมี่ า: ห้องปฏิบัตกิ ารมหาวิทยาลยั เทคโนโลยีพระจอมเกลา้ ธนบรุ ี, 2557) สว่ นประกอบและหลกั การทํางาน 1. ตัวเครื่องทําด้วยวัสดุอย่างดีป้องกันความร้อน ไม่เป็นสนิม ใช้สําหรับเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมใน หลอดทดลอง มชี ่องสําหรบั ใสห่ ลอดทดลองได้อยา่ งน้อย 48 ชอ่ ง 2. ฝาปิดดา้ นบนสาํ หรับกระจายความรอ้ น (heated lid) ตามอณุ หภูมิที่กาํ หนดให้ทัว่ ทกุ พนื้ ท่ี 3. ฝาปิดสามารถปรับระดับให้เหมาะสมกับความสูงของหลอดทดลองเพ่ือสะดวกใช้งาน โดยมีระบบ ควบคุมแรงกดเพือ่ ความถูกตอ้ งในการควบคมุ อุณหภูมิและปอ้ งกันการควบแนน่ 4. หน้าจอแสดงผลแบบดิจิตอล สามารถบอกโปรแกรมที่ตั้งใช้งาน ช่วงเวลาในการทํา อุณหภูมิที่ใช้ในแต่ ละช่วง ท่ีชัดเจน 5. สามารถต้ังอุณหภูมิได้ตั้งแต่ 4 องศาเซลเซียสถึงอย่างน้อย 105 องศาเซลเซียสโดยมีค่าความคาด เคลอ่ื นของอุณหภมู ิไม่เกนิ +0.4 องศาเซลเซยี สสามารถตั้งอุณหภูมิทห่ี ลากหลาย (Temperature gradient) ได้ 6. ระบบมีโปรแกรมตน้ แบบในการทํา PCR แบบต่างๆ ไม่นอ้ ยกวา่ 15 โปรแกรม 7. หลังจากจบโปรแกรมการทาํ งานแล้วสามารถต้งั อุณหภูมิของเครอ่ื งอยู่ที่ 4 องศาเซลเซียสเพ่อื รักษาการ เปลยี่ นสภาพของดีเอ็นเอ 8. มรี ะบบเปิดเครื่องอัตโนมัตเิ ม่ือไฟฟ้าดับ (auto restart) และสามารถทํางานต่อเนือ่ งได้ เทคนิคและการใช้เครอ่ื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 225

วิธกี ารใช้งานและการบํารงุ รักษา 1. เสียบปลกั๊ และเปดิ เครื่อง พจิ ารณาสภาพโดยรวมของเครื่องว่าอยใู่ นสภาพพรอ้ มใช้งานหรอื ไม่ 2. ตั้งคา่ โปรแกรมตามที่ต้องการเพ่ิมจาํ นวนดเี อ็นเอ 3. เปิดฝาเครือ่ ง จากนั้นนําตวั อย่างวางลงบนช่องสําหรบั ใสห่ ลอด PCR ปิดฝาเครื่องให้ลอ๊ คสนทิ 4. กด start แลว้ พจิ ารณาว่าเครื่องเร่ิมปรับอุณหภูมิขึน้ ตามที่ผู้ปฏบิ ตั ิงานต้งั ค่าในโปรแกรมไว้แล้วหรอื ไม่ 5. เมอ่ื โปรแกรมทาํ งานเสร็จแลว้ ผ้ปู ฏิบตั ิงานสามารถนําตัวอย่างออกจากเคร่อื งได้ ปิดเคร่อื ง ดงึ ปลกั๊ ออก 6. เม่ือใช้งานทุกคร้ังต้องลงบันทึกการใช้งาน และหลังจากใช้เสร็จแล้วต้องตรวจสอบความเรียบร้อยและ ความสะอาดทกุ ครงั้ 7. หมน่ั สังเกตอาการและการทาํ งานของเครอื่ ง หากพบสงิ่ ผิดปกติ ให้แจ้งผรู้ บั ผดิ ชอบทันที 8. ดแู ลรักษาความสะอาดของเครื่องอย่างสมาํ่ เสมอ 9. หากมีปัญหา ไม่ว่ากรณีใดๆ เบ้ืองต้นหากผู้ใช้งานแก้ไขได้ให้ปฏิบัติการแก้ไข หากไม่สามารถแก้ไขได้ให้ รีบแจ้งอาจารย์ผดู้ ูแลหรือเจา้ หน้าท่วี ิทยาศาสตร์ทันที ประโยชน์ในการใช้งาน เครื่องเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ หรือ PCR machine (ภาพที่ 5.2) มีความสําคัญมากในงานอณูชีวโมเลกุล ทั้ง ในส่วนท่ีเป็นงานพื้นฐานในห้องปฏิบัติการ ตลอดจนการประยุกต์ใช้ทางการแพทย์ และการเกษตรสามารถใช้ใน การวินิจฉัยโรคต่างๆ ทั้งโรคติดเช้ือและโรคจากพันธุกรรม ศึกษาความผันแปรทางพันธุกรรม ศึกษากลายพันธ์ุ ของยีน ทําแผนท่ียีน และศึกษาลําดับเบสของยีนของส่ิงมีชีวิตได้ทุกชนิด ด้านการศึกษา ใช้ในการเรียนการสอน พื้นฐานการเพิ่มจํานวนดีเอ็นเอจากชิ้นดีเอ็นเอที่กําหนด ด้านการแพทย์การตรวจหาเช้ือไวรัสหรือแบคทีเรียที่เป็น สาเหตุของโรค (เช่น โรคเอดส์ วัณโรค มาเลเรยี ) การตรวจหายีนกอ่ มะเร็ง (เชน่ มะเรง็ เตา้ นม มะเรง็ ลําไส้ใหญ)่ ทาํ ให้การวินิจฉัยโรค เพ่ือป้องกันและรักษาเป็นไปอย่างมีประสิทธิภาพมากยิ่งขึ้น รวมท้ังปัจจุบันการตรวจวิเคราะห์ หลักฐานจากที่เกิดเหตุ เช่น เลือด ผิวหนัง เส้นผม ได้ถูกนํามาเป็นหลักฐานสําคัญในการสอบสวน และการเอาผิด กับผู้ต้องหาในหลายคดี ซึ่งจากตัวอย่างที่ได้จากที่เกิดเหตุเหล่าน้ี สามารถนํามาเพิ่มปริมาณ ดีเอ็นเอของผู้ต้อง สงสัยได้ด้วยเทคนิคพีซีอาร์ และจากการศึกษาด้านลายพิมพ์ดีเอ็นเอ ได้ถูกนํามาใช้ในการระบุชี้ตัวบุคคล จึงทําให้ สามารถบ่งช้ีบุคคลท่ีอยู่ในที่เกิดเหตุได้ นอกจากน้ียังสามารถใช้ในการตรวจหาผู้กระทําผิดคดีข่มขืนเด็กและหญิง สาว และการตรวจสอบพ่อแม่ลูกดว้ ย เทคนคิ และการใชเ้ ครอ่ื งมือทางจุลชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 226

5.1.2 เครือ่ งเพิม่ ปรมิ าณดีเอ็นเอและวิเคราะห์คุณภาพผลลัพธ์ (Real-time PCR machine) ภาพท่ี 5.3 เคร่ืองเพ่มิ ปริมาณดเี อ็นเอและวเิ คราะหค์ ุณภาพผลลัพธ์ (ทม่ี า: ห้องปฏิบัตกิ ารมหาวทิ ยาลัยเทคโนโลยีพระจอมเกลา้ ธนบรุ ี, 2557) เครื่องเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอและวิเคราห์คุณภาพผลลัพธ์ (ภาพที่ 5.3) หรือ เรียกอีกอย่างว่า quantitative PCR ใช้หลกั การเดียวกับ เครือ่ ง PCR คือเลยี นแบบกระบวนการจําลองดีเอน็ เอ เพอื่ เพมิ่ จาํ นวนดเี อ็นเอในตําแหน่ง ที่ผู้ปฏิบัติงานสนใจ มีความแตกต่างกันตรงท่ี real-time PCR ถูกพัฒนาข้ึนมาจาก PCR ธรรมดาสามารถตรวจ ผลลัพธ์ผ่านโปรแกรมคอมพิวเตอร์ได้เลยระหว่างเครื่องกําลังทํางานในการเพ่ิมจํานวนดีเอ็นเอ โดยใช้สารเรืองแสง เช่น SYBR green tag ช่วยในการแสดงผลลัพธ์ ในขณะท่ี PCR ธรรมดาจะต้องรอให้ระบวนการเสร็จส้ินก่อนแล้ว นําผลลัพธ์มาตรวจสอบบน agarose gel ย้อมสีเรืองแสงถึงจะเห็นผล ทําให้เสียเวลามากหากเกิดการผิดพลาดข้ึน ในระหว่างการทาํ งานของเครือ่ ง เช่น ไฟฟ้าดบั กระทันหัน ดงั ตารางที่ 5.1 การนําไปใชป้ ระโยชน์ ด้วยวิวัฒนาการและกระบวนการพัฒนาทางวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีอย่างต่อเนื่องและทันสมัย ใน ปัจจุบันเครื่องน้ีใช้ในการตรวจสอบการแสดงออกของยีนในส่ิงมีชีวิต 2 ลักษณะ เม่ือถูกกระตุ้นด้วยสภาวะใด สภาวะหนึ่ง เพ่ือตรวจสอบว่ายีนใด้มีการทํางานมากหรือน้อย นิยมใช้ในงานทางการแพทย์ ตรวจสอบยีนที่มีผลต่อ การเกิดโรค หรือใช้ในงานทางจุลชีววิทยา เพื่อตรวจสอบการแสดงออกของยีนที่มีผลกระทบต่อการด้ือยาปฏิชีวนะ ของเชือ้ ก่อโรค เทคนคิ และการใช้เครื่องมือทางจลุ ชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 227

ตารางท่ี 5.1 เปรียบเทียบระหว่าง Conventional PCRและ Real-time PCR Conventional PCR Real-time PCR (qPCR) ใชต้ รวจสอบDNA จากตัวอย่าง ใช้ตรวจสอบการแสดงออกของยีน และ DNA จาก ตวั อย่าง ไมเ่ ห็นปฏิกิริยาท่เี กิดขน้ึ จนกว่าจะเสร็จสมบรู ณ์ สามารถเห็นปฏกิ ิริยาทเ่ี กดิ ขึ้นไดท้ ุกระยะ ระหวา่ งท่ีเครอื่ ง ทาํ งาน ไมต่ อ้ งรอถงึ cycle สุดท้าย ตอ้ งนาํ ตัวอย่าง DNA มา run gel ดูปรมิ าณและ ไมต่ อ้ งนําตวั อย่างมา run gel ดูปริมาณและขนาดของ ขนาดของผลติ ภณั ฑ์ (product) หลังสิ้นสดุ การเพิ่ม ผลิตภัณฑ์ (product) จาํ นวน DNA ผลที่ได้ไม่สามารถนาํ มาวิเคราะห์ต่อได้ สามารถกําหนดจดุ ท่ีจะเก็บข้อมลู เพอื่ นาํ ผลที่ได้มา วเิ คราะห์ เปรียบเทียบหาความแตกตา่ ง และวเิ คราะห์ ปริมาณของ product ได้ 5.1.3 เคร่ืองแยกสารชีวโมเลกุลด้วยไฟฟ้า (Electrophoresis) เครอ่ื งแยกสารชวี โมเลกุลดว้ ยไฟฟ้า เปน็ เครื่องมือที่ใชแ้ ยกตัวอย่าง ดีเอ็นเอ (DNA) อาร์เอน็ เอ (RNA) หรือโปรตนี (protein) ที่ตอ้ งการศึกษา (ภาพที่ 5.4) อาศัยหลักการของคุณสมบัติการมปี ระจขุ องโมเลกลุ และใช้ กระแสไฟฟา้ พาโมเลกลุ ท่ีมีประจนุ ้ันๆ เคล่ือนท่ีไป ภาพที่ 5.4 เครือ่ งแยกสารชีวโมเลกุลดว้ ยระบบไฟฟ้า (ท่ีมา: หอ้ งปฏิบัตกิ ารมหาวิทยาลัยเทคโนโลยีพระจอมเกลา้ ธนบรุ ี, 2557) เทคนิคและการใช้เคร่ืองมือทางจุลชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 228

สว่ นประกอบและหลักการทํางาน 1. ตวั เครอื่ งพร้อมฝาดา้ นบนมีชอ่ งระบายความรอ้ น ทาํ ด้วยวสั ดอุ ย่างดีป้องกนั การรว่ั ไหลของกระแสไฟฟ้า ได้ และสําหรับใส่สารละลายบัฟเฟอร์ บริเวณตัวเครอื่ งมีข้ัวไฟฟ้าเพือ่ ต่อเข้ากับตวั จ่ายไฟ 2. มีส่วนของอุปกรณ์สําหรับเซตเจลเพ่ือตรวจสอบสารสกัดดีเอ็นเอบน เจลอะกาโรส (agarose gel) มีหวี สาํ หรบั กาํ หนดชอ่ งใสต่ วั อยา่ ง 3. เคร่ืองจ่ายไปหรือ power supply เป็นตัวกระจายสัญญาณไฟให้กับตัวเคร่ืองเพื่อกระตุ้นให้ ดีเอ็นเอ เคลอ่ื นทไี่ ปตามประจุของตัวดเี อน็ เอ จากขัว้ ลบไปหาขั้วบวก วธิ กี ารใชง้ านและการบาํ รงุ รักษา 1. เตรียมเจลสําหรับหยอดตัวอย่าง (DNA หรือ RNA) บนถาดเตรียมเจลท่ีมีการใส่ซี่หวีเพ่ือสร้างช่องใน การใส่ตัวอย่าง 2. เตรยี ม สารละลายบฟั เฟอรส์ าํ หรบั รกั ษาตัวอย่างใหอ้ ยใู่ นสภาพสมดุล 3. นาํ ตัวอยา่ งใส่ลงในชอ่ งบนเจล ดว้ ย micropipette 4. ตัวอย่างเคล่ือนท่ีไปดว้ ยกระแสไฟฟ้า ที่ขวั้ ลบ ข้ัวบวก 5. หลังจากใช้งานเคร่ืองเสร็จแล้ว นาํ ตัวอยา่ งออกจากตวั เคร่ือง (caution EtBr) เทสารละลายบัฟเฟอร์ใส่ ภาชนะท่ีมีฝาปิดมิดชิด ตัวเคร่ืองถอดข้ัวกระแสไฟฟ้าออก นําไปล้างนํ้าเปล่าให้สะอาดปล่อยให้แห้งแล้วเก็บเข้าที่ ให้เรียบรอ้ ย ประโยชน์ในการใชง้ าน เคร่ืองมือนี้ใช้แยกสารชีวโมเลกุลของจุลินทรีย์ หรือส่ิงมีชีวิตต่างๆ ได้แก่ โปรตีน ดีเอ็นเอ อาร์เอนเอ โดย มีเคร่ืองหมายดีเอ็นเอมาตรฐานเป็นแทบเปรียบเทียบขนาด และปริมาณสารชีวโมเลกุลที่ผู้ปฏิบัติงานต้องการ ตรวจสอบ ด้วยเคร่ืองมือน้ีสามารถตรวจสอบหาคนร้ายในคดีฆ่าข่มขืน หรือการตรวจดีเอ็นเอพิสูจน์ความเป็น สายเลือดเดียวกัน (ภาพท่ี 5.5) เทคนคิ และการใชเ้ ครอ่ื งมือทางจุลชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 229

ภาพท่ี 5.5 ดีเอ็นเอทมี่ ีขนาดโมเลกุลแตกต่างกันบน 1% agarose gel (ทีม่ า: Tangsombatvichit, 2014) เทคนิคและการใช้เครือ่ งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 230

สรปุ ท้ายบท เคร่ืองมือด้านอณูโมเลกุลทางจุลชีววิทยาน้ัน ผู้ปฏิบัติงานทางด้านจุลชีววิทยา หรือ นักวิจัยต้องเรียนรู้ ส่วนประกอบของเคร่ืองมือ เข้าใจหลักการทํางานของเครื่องมือ มีความชํานาญในการใช้เคร่ืองมือเป็นอย่างดี รู้วิธี บํารุงรักษาให้เครื่องมือมีอายุการใช้งานยาวนาน และหากเกิดความผิดปกติที่เคร่ืองมือน้ันๆ ผู้ปฏิบัติงานสามารถ ตัดสินใจในการแก้ไขปัญหาเบื้องต้นได้ และรีบแจ้งให้ผู้ดูแลทราบทันที เคร่ืองมือเหล่าน้ี ใช้องค์ความรู้เฉพาะทาง ข้ันสูง ผู้ปฏิบัติงานกับเครื่องน้ีต้องมีความรู้ทางพันธุศาสตร์ควบคู่ไปกับองค์ความรู้ทางจุลชีววิทยา ในการ ปฏิบัติงานผู้ปฏิบัติงานต้องมีความระมัดระวังอย่างมาก เนื่องจากเคร่ืองมือเหล่าน้ีค่อนข้างไวต่อการกระทบ และ เครื่องมือมีราคาแพงมาก รวมท้ังส่วนประกอบต่างๆ ก็มีราคาแพงไปด้วย ไม่ว่าจะเป็นเครื่องเพ่ิมปริมาณดีเอ็นเอ (PCR machine) เคร่ืองเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอและวิเคราะห์คุณภาพผลลัพธ์ (Real-time PCR) เคร่ืองแยกสาร พันธกุ รรม ดเี อน็ เอ (electrophoresis) เครอ่ื งมือเหล่าน้ีเปน็ เครอ่ื งมอื ท่ีถูกออกแบบมาเพือ่ งานทางดา้ นอณูโมเลกุล เช่น DNARNA หรือ โปรตีนท่ีเกี่ยวข้องกับยีนภายในเซลล์สิ่งมีชีวิต เครื่องเพ่ิมปริมาณดีเอ็นเอ (PCR machine/Real-time PCR) ทั้ง 2 แบบนี้ มีการพัฒนาโดยนักพันธุศาสตร์อย่างต่อเน่ือง เพื่อวัตถุประสงค์ของงาน ท่ีแตกต่างกัน เคร่ืองเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ จะทําหน้าที่เพ่ิมจํานวนชิ้น DNA ท่ีผู้ปฏิบัติงานต้องการให้มากขึ้นในการ ใช้ประโยชน์ต่อไป ในขณะที่ เคร่ืองเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอและวิเคราะห์คุณภาพผลลัพธ์ ใช้เพ่ือวิเคราะห์การ แสดงออกของยีน และการควบคุมการแสดงออกของยีน โดยไม่ต้องรอให้เคร่ืองประมวลผลสุดท้ายก็สามารถทราบ ผลได้เลยอย่างรวดเร็ว เมื่อเทียบกับวิธีเดิม ในส่วนเคร่ืองแยกสารพันธุกรรม ดีเอ็นเอ (electrophoresis) ใช้ศึกษา DNA หรือชิ้น DNA จากเครอื่ งเพ่ิมปริมาณดีเอ็นเอซ่งึ สามารถเก็บไว้ศึกษาในงานสว่ นตอ่ ไปได้ เทคนิคและการใช้เครอ่ื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 231

วิธกี ารสอนและกิจกรรม 1. ใช้วิธกี ารสอนบรรยายผา่ นส่ือการสอนทเ่ี หมาะสม ร่วมกับการถาม-ตอบ 2. สอดแทรกและฝึกกระบวนการคดิ อย่างมีหลักการและเหตุผล 3. ยกตัวอย่างในเนอื้ หา พร้อมภาพประกอบให้นกั ศึกษาได้เห็นภาพชดั เจน 4. สาธิตการใช้เครอื่ งมือจริงท่ีมีอยู่ในหอ้ งปฏิบัตกิ าร 5. มอบหมายให้นักศึกษาทําแบบฝึกหัดท้ายหนว่ ยเรียน ส่ือการสอน เอกสารอ้างอิง หมายเลข ตามบรรณานุกรมท้ายเล่ม (16-19) เอกสารประกอบการสอน เอกสารประกอบการสอนเทคนิคและการใชเ้ ครอ่ื งมือทาง จุลชวี วิทยา โสตทัศนวสั ดุ สื่อการสอนนาํ เสนอด้วยโปรแกรม Powerpoint ประกอบ การบรรยายสัปดาหท์ ่ี 13 Multimedia LCD projector งานท่ีมอบหมาย 1. ใหศ้ ึกษาคน้ คว้าจาก หนังสือ หรอื งานวิจัยทางจุลชวี วทิ ยา เพ่ิมเติม 2. ใหศ้ ึกษาคน้ คว้าจาก สื่อการสอนออนไลน์ จากเว็ปไซต์ต่างๆ 3. ให้ทาํ แบบฝึกหัดท้ายหนว่ ยเรยี น 4. ทาํ กิจกรรมคน้ คว้านอกเวลา ผู้สอนพานักศึกษาเรียนรู้เคร่ืองมือของจริง ณ หอ้ งปฏบิ ัติการทาง จุลชีววิทยา โดยอธบิ าย และสาธติ เทคนคิ วธิ ีการปฏิบัติ มีการถาม-ตอบระหวา่ งการสาธิต และใหน้ ักศึกษาฝึกใช้เคร่อื งมือด้วยตนเอง การวัดผล - วิธีการสังเกต - ใบบันทึกเวลาเรียน - แบบฝกึ หดั ทา้ ยหนว่ ยเรยี น - กิจกรรมค้นคว้านอกเวลา บนั ทกึ การสอนและข้อสังเกต - สงั เกตพฤติกรรมที่แสดงออกของนักศึกษา เช่น การมีวินัย การแต่งกาย การตรง-ต่อเวลา รวมทั้งการมี ส่วนร่วมของนักศึกษาในชัน้ เรียน - เชค็ การมาเข้าเรียนของนักศึกษาทุกครงั้ ในช่วั โมงตามตารางสอน - วัดจากการตอบคําถามแบบฝึกหดั ท้ายบทเรียน เม่ือจบเน้อื หาหน่วยที่ 5 อย่างถูกต้องและสง่ ตามกาํ หนดท่ี อาจารย์ผู้สอนนัดหมาย ในระยะเวลาไม่เกิน 5 วนั หลังจากเรยี นหน่วยที่ 5 เสรจ็ ส้ินแล้ว เทคนิคและการใชเ้ ครอ่ื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 232

- วัดผลจากการทาํ ข้อสอบปลายภาค - สงั เกตพฤติกรรมการมีส่วนร่วม ความกระตอื รือรน้ ในการทํากิจกรรมของนักศึกษา - สังเกตความสามารถในการใช้เครื่องมือทีถ่ ูกตอ้ งของผ้เู รียน ช่วงค้นควา้ นอกเวลา ระดบั การประเมนิ มีดังนี้ 1. ระดับพื้นฐาน ผเู้ รียนปฏิบัติการใช้เคร่ืองมือไดต้ ามคําบอกของผู้สอนทกุ ขั้นตอน 2. ระดบั กลาง ผ้เู รียนปฏิบตั ิการใช้เคร่ืองมอื ไดถ้ ูกตอ้ ง โดยผู้สอนแนะนาํ ขน้ั ตอน 50% 3. ระดับสงู ผเู้ รียนปฏิบัติการใช้เคร่อื งมอื ไดถ้ ูกต้อง โดยผู้สอนไม่ตอ้ งอธบิ ายใดๆ เทคนิคและการใช้เคร่อื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 233

ส่อื การสอนสัปดาห์ท่ี 13 เทคนคิ และการใชเ้ คร่อื งมือทางจลุ ชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 234

เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 235

เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 236

เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 237

เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 238

เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 239

แบบฝกึ หัดสปั ดาหท์ ี่ 13 1. จงอธิบายหลักการทํางานการใช้งานของเคร่ืองเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอพร้อมท้ังอธิบายทฤษฎีทางพันธุศาสตร์ที่ เก่ียวขอ้ ง ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ 2. จงยกตัวอย่างการใช้ประโยชนข์ องเครอื่ งเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอสําหรับงานดา้ นจุลชีววิทยา ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ 3. จงเปรียบเทยี บความแตกตา่ งของการใช้เคร่ืองเพมิ่ ปรมิ าณดีเอ็นเอกับ เพม่ิ ปรมิ าณดเี อ็นเอและวิเคราะห์คุณภาพ ผลลพั ธ์ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ 4. จงอธบิ ายหลักการทํางาน การใช้งานของเครื่องแยกสารชีวโมเลกุลดว้ ยไฟฟ้า ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ เทคนคิ และการใชเ้ ครือ่ งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 240

5. จงยกตวั อย่างการใชป้ ระโยชน์ ของเคร่อื งแยกสารชวี โมเลกุลด้วยไฟฟา้ และการดูแลรกั ษา ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ เทคนคิ และการใช้เครื่องมือทางจลุ ชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 241