เอกสารประกอบการสอน_403-25-16_IM_เผยแพร่_2020

เฉลย แบบฝกึ หัดสปั ดาห์ท่ี 13 1. จงอธิบายหลักการทํางาน การใช้งานของเครื่องเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ พร้อมท้ังอธิบายทฤษฎีทางพันธุศาสตร์ท่ี เกี่ยวขอ้ ง เครื่องเพ่ิมปริมาณดีเอ็นเอ มีหลักการทํางานของเคร่ืองจากการปรับอุณหภูมิแต่ละข้ันตอนภายในเคร่ือง เมื่อผู้ปฏิบัติงานนําตัวอย่างใส่ลงในช่อง วางหลอด PCR จากน้ันต้ังโปรแกรมท่ีหน้าปัดดิจิตอลของเคร่ือง ตาม ทฤษฎีกระบวนการจําลองดีเอ็นเอภายในเซลล์ (DNA replication) ทางพันธุศาสตร์ โดยเริ่มต้นจาก ดีเอ็นเอสายคู่ จะแยกออกจากกันเป็นดีเอ็นเอสายเด่ียว อยู่ด้านบนและด้านล่าง ท้ังสายบนและสายล่างจะมีตัวพาเบส A T C G มาต่อเข้ากับเบสคู่สม (complementary fragment) โดยการทํางานของเอนไซม์ DNA polymerase III จนได้ดี เอ็นเอสายใหม่ท่ีมีคุณสมบัติก่ึงอนุรักษ์ (semiconservative region) ดังนั้นองค์ประกอบท่ีสําคัญในการทํา PCR ได้แก่ ดีเอ็นเอแม่แบบ (template DNA) ไพรเมอร์ primersเอ็นไซม์ DNA Polymerase ชนิดทนความร้อน (Taq DNA polymerase III) Deoxy nucleotide triphosphate (dNTPs) บัฟเฟอร์สําหรับเอ็นไซม์ดีเอ็นเอพอลิเมอ เรส (PCR buffer) และ แมกนเี ซียมคลอไรด์ (MgCl2) การใชง้ านของเครอ่ื ง เมอ่ื ทาํ การเปดิ เครอ่ื งแล้ว ทาํ การตั้งคา่ โปรแกรมในการทาํ PCR ซ่ึงการทดลองแต่ละ ตัวอย่างจะตั้งค่าอุณหภูมิแตกต่างกัน เมื่อทุกอย่างพร้อม เร่ิมต้นเคร่ืองทํางานจนสิ้นสุดกระบวนการ จากน้ันนํา ตวั อยา่ งออกจากเคร่อื ง ดูการจับของไอน้าํ ทีฝ่ า ถ้ามไี อนาํ้ เกาะท่ฝี าให้ใช้กระดาษซับ ซับให้แห้งกอ่ นปดิ เครอ่ื ง 2. จงยกตัวอย่างการใชป้ ระโยชนข์ องเครือ่ งเพ่ิมปรมิ าณดีเอ็นเอ สําหรับงานด้านจลุ ชวี วทิ ยา เคร่ืองเพ่ิมปริมาณดีเอ็นเอ หรือ PCR machine มีความสําคัญมากในงานอณูชีวโมเลกุล ท้ังในส่วนที่เป็น งานพ้ืนฐานในห้องปฏิบัติการ ตลอดจนการประยุกต์ใช้ทางการแพทย์ และการเกษตรสามารถใช้ในการวินิจฉัยโรค ต่างๆ ทั้งโรคติดเช้ือและโรคจากพันธุกรรม ศึกษาความผันแปรทางพนั ธุกรรม ศึกษากลายพันธ์ุของยีน ทําแผนท่ี ยีน และศึกษาลําดับเบสของยีนของสิ่งมีชีวิตได้ทุกชนิด ด้านการศึกษา ใช้ในการเรียนการสอนพื้นฐานการเพ่ิม จํานวนดีเอ็นเอจากช้ินดีเอ็นเอที่กําหนด ด้านการแพทย์การตรวจหาเชื้อไวรัสหรือแบคทีเรียท่ีเป็นสาเหตุของโรค (เช่น โรคเอดส์ วณั โรค มาเลเรีย) เทคนิคและการใช้เครื่องมือทางจลุ ชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 242

3. จงเปรียบเทียบความแตกต่างของการใช้เคร่ืองเพ่ิมปริมาณดีเอ็นเอ (PCR) กับ เพ่ิมปริมาณดีเอ็นเอและวิเคราะห์ คุณภาพผลลพั ธ์ (Real-time PCR) Conventional PCR Real-time PCR (qPCR) ใชต้ รวจสอบDNA จากตวั อยา่ ง ใช้ตรวจสอบ DNA expression และ DNA จากตวั อย่าง ไม่เห็นปฏิกิรยิ าทเี่ กิดข้นึ จนกว่าจะเสรจ็ สมบูรณ์ สามารถเห็นปฏกิ ริ ิยาทเี่ กิดขึ้นได้ทุกระยะ ระหว่างทเ่ี คร่ือง ทํางาน ไมต่ ้องรอถึง cycle สุดท้าย ต้องนําตัวอย่าง DNA มา run gel ดูปริมาณและ ไม่ต้องนําตัวอย่างมา run gel ดูปริมาณและขนาดของ ขนาดของproduct หลงั สิน้ สุดการเพิ่มจํานวน DNA product ผลที่ได้ไมส่ ามารถนํามาวเิ คราะหต์ ่อได้ สามารถกําหนดจุดท่ีจะเก็บข้อมูลเพื่อนําผลท่ีได้มา วิเคราะห์ เปรียบเทียบหาความแตกต่าง และวิเคราะห์ ปริมาณของ product ได้ 4. จงอธบิ ายหลกั การทาํ งาน การใชง้ านของเครือ่ งแยกสารชวี โมเลกุลด้วยไฟฟ้า 1. ตวั เครือ่ งพรอ้ มฝาด้านบนมีช่องระบายความรอ้ น ทําด้วยวัสดุอย่างดปี ้องกันการรวั่ ไหลของกระแสไฟฟ้า ได้ และสาํ หรับใสส่ ารละลายบฟั เฟอร์ บริเวณตัวเครอื่ งมีขั้วไฟฟ้าเพ่อื ต่อเข้ากบั ตัวจ่ายไฟ 2. มีส่วนของอุปกรณ์สําหรับเซตเจลเพ่ือตรวจสอบสารสกัดดีเอ็นเอบน เจล agarose มีหวีสําหรับกําหนด ช่องใสต่ วั อย่าง 3. เครื่องจ่ายไปหรือ power supply เป็นตัวกระจายสัญญาณไฟให้กับตัวเครื่องเพื่อกระตุ้นให้ ดีเอ็นเอ เคล่ือนทีไ่ ปตามประจุของตัวดเี อน็ เอ จากขว้ั ลบไปหาข้ัวบวก 5. จงยกตวั อย่างการใช้ประโยชน์ ของเคร่อื งแยกสารชวี โมเลกุลด้วยไฟฟา้ และการดูแลรกั ษา เคร่ืองมือน้ีใช้แยกสารชีวโมเลกุลของจุลินทรีย์ หรือสิ่งมีชีวิตต่างๆ ได้แก่ โปรตีน ดีเอ็นเอ อาร์เอนเอ โดย มีเครื่องหมายดีเอ็นเอมาตรฐานเป็นแทบเปรียบเทียบขนาด และปริมาณสารชีวโมเลกุลท่ีผู้ปฏิบัติงานต้องการ ตรวจสอบ การดูแลรักษาเคร่ืองน้ี เมื่อใช้เสร็จแล้วต้องเทบัฟเฟอร์ออกจากเครื่องให้หมดทุกคร้ัง ไม่ท้ิงค้างไว้ท่ี เคร่ือง ดึงเครื่องจ่ายไฟออกและถอดปลั๊กออก จากน้ันล้างตัวเครื่องด้วยน้ําเปล่าให้สะอาดปล่อยให้แห้งแล้วเก็บเข้า ท่ีใหเ้ รียบรอ้ ย ไม่ควรใหน้ ้าํ เปยี กกระแสไฟฟา้ เทคนิคและการใช้เครือ่ งมือทางจุลชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 243

ใบเตรียมการสอน แผนการสอนสัปดาห์ท่ี 14 รหสั วิชา 403 – 25 – 16 บทเรียนที่ 5.2 หน่วยท่ี 5 เครอื่ งมือทางอณูโมเลกลุ ทางจุลชีววทิ ยา เวลาเรียน 2 ชั่วโมง บทเรยี นที่ 5.2 เครอื่ งมือทางอณูโมเลกุลขัน้ สงู ทางจุลชวี วิทยา จุดประสงคก์ ารสอน 5.2 เข้าใจเครื่องมอื ทางอณูโมเลกุลขนั้ สูงทางจุลชีววิทยาไดเ้ หมาะสม 2 ชั่วโมง 5.2.1 สรุปการใช้เคร่อื งวเิ คราะหล์ ําดับเบสดีเอ็นเอได้ 5.2.2 อธิบายการใช้เครอื่ งดีเอน็ เอไมโครอะเรย์ได้ 5.2.3 ยกตวั อยา่ งการใชเ้ ครื่องวเิ คราะห์การแสดงออกของยีนทงั้ จโี นมได้ เทคนิคและการใช้เครอ่ื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 244

หนว่ ยที่ 5 เครื่องมอื ดา้ นอณโู มเลกุลทางจุลชีววิทยา (Molecular Instruments in Microbiology) บทเรยี นท่ี 5.2 เครอื่ งมอื ทางอณูโมเลกุลข้ันสูงทางจุลชีววิทยา บทนํา ในบทน้ีจะกล่าวถึงเคร่ืองมือด้านอณูโมเลกุลทางจุลชีววิทยาต่อ การถ่ายยีนท่ีมีคุณสมบัติท่ีต้องการเข้าสู่ เซลล์จุลินทรีย์เพ่ือเพ่ิมปริมาณให้มาก การศึกษาโปรตีนท่ีควบคุมการแสดงออกของยีนในสภาวะกระตุ้นต่างๆ การศึกษาองค์ความรู้เหล่านี้ มีความจําเป็นอย่างมากท่ีต้องมีเครื่องมือทางอณูโมเลกุลมาช่วยให้ผู้ปฏิบัติงาน สร้าง ผลการทดลองได้แม่นยํา และถูกต้องมากข้ึน เครื่องมือทางอณูโลเลกุล ได้แก่ เครื่องวิเคราะห์ลําดับเบสดีเอ็นเอ (DNA sequencing) เคร่ืองอ่านค่ายีนท้ังจีโนม (DNA microarray) เคร่ืองวิเคราะห์การแสดงออกของยีนท้ัง จี โนม (ChIP on Chip microarray) ผู้ปฏิบัติงานทางด้านจุลชีววิทยา หรือ นักวิจัยต้องเรียนรู้ส่วนประกอบของ เครื่องมือ เข้าใจหลักการทํางานของเครื่องมือ มีความชํานาญในการใช้เครื่องมือเป็นอย่างดี รู้วิธีบํารุงรักษาให้ เคร่ืองมือมีอายุการใช้งานยาวนาน และหากเกิดความผิดปกติที่เครื่องมือน้ันๆ ผู้ปฏิบัติงานสามารถตัดสินใจในการ แกไ้ ขปัญหาเบื้องตน้ ได้ และรบี แจง้ ใหผ้ ู้ดแู ลทราบทันที 5.2.1 เครอื่ งมือวิเคราะห์ลําดับเบสของดีเอ็นเอ (DNA sequencing) ภาพที่ 5.6 เครือ่ งมือวเิ คราะห์หาลาํ ดบั เบสของดีเอน็ เอ A T C G ในสิ่งมีชวี ิต (ทีม่ า: https://www.flickr.com/photos/ricardipus/2789438971/) เทคนคิ และการใช้เครือ่ งมือทางจลุ ชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 245

เครื่องมือวิเคราะห์หาลําดับเบสของดีเอ็นเอ (ภาพท่ี 5.6) เป็นเครื่องมือที่ใช้วิเคราะห์ลําดับเบส A T C G ในส่ิงมีชีวิตซ่ึงเบสแต่ละเบสเชื่อมกันด้วยพันธะไฮโดรเจนต่อกันเป็นสายยาวจนเป็นส่วนของยีนซึ่งยีนเป็นส่วนหน่ึง อยู่บนดีเอ็นเอสายยาว วิธีการหาลําดับเบสดีเอ็นเอ พัฒนาข้ึนโดยนักวิทยาศาสตร์ Allan Maxam และ Walter Gilbert (ภาพที่ 5.7) โดยใช้สารเคมตี ัดสาย DNA ท่ีตาํ แหนง่ ต่างๆ กัน วธิ นี ้เี รยี กว่า Maxam-Gilbert sequencing ส่วนอีกวิธีหนึ่งนั้นเรียกว่า dideoxy sequencing หรือ Sanger sequencing ซึ่งพัฒนาข้ึนมาโดย Fred Sanger โดยวิธีการใช้ enzyme มาต่อสาย DNA จาก primer ในปัจจุบันวิธี dideoxy เป็นวิธีท่ีนิยมใช้มากที่สุด วิธีการหา ลําดับเบสน้ันได้รับการพัฒนามาตลอด จนปจั จบุ นั นี้สามารถทําได้ง่าย และไมซ่ ับซ้อนยุ่งยากนัก การหาลําดับเบสนี้ เป็นประโยชน์อย่างมากในการศึกษายีนต่างๆ ท้ังในคน สัตว์ และพืช โดยในคน human genome project เป็น โครงการที่จะศึกษาลําดับเบสทงั้ หมดของคน ซึ่งไดเ้ ร่มิ และดาํ เนินการตดิ ตอ่ กันมาหลายปีแลว้ ภาพที่ 5.7 ภาพถา่ ยของ Allan Maxam และ Walter Gilbert (ที่มา: https://www.slideshare.net/jordanfuller32/dna-sequencing-10632407) DNA Sequencing เป็นวิธีการที่ใช้ปฏิกิริยาทางเคมีที่จะตัดสาย DNA ท่ีตําแหน่งจําเพาะ โดยที่สําคัญ DNA ที่ผู้ปฏิบัติงานจะนํามาทําการหาลําดับเบสนั้นจะต้องเป็น DNA ชนิดเดียวกัน และมีขนาดประมาณ 200- 1000 bp ขัน้ ตอนตา่ งๆ ในการหาลําดบั nucleotide (ภาพท่ี 5.8) โดยวธิ ี Maxam-Gilbert มีดังน้ี คือ -ข้ันท่ี 1 ติดฉลากสาย DNA ด้วยสารกัมมันตภาพรังสี (P32) โดยแต่ละ strand ของ double-stranded DNA จะถูกติดฉลากที่ปลาย 5’ หรือ 3’ จากนั้น DNA น้ันจะถูกนํามา denature ให้เป็น single strand โดยท่ีใน แต่ละ strand จะถกู ตดิ ฉลากทปี่ ลายข้างหนึ่งขา้ งใดเทา่ นน้ั -ข้ันท่ี 2 การตัดสาย DNA โดยในขณะนี้ สาย DNA จะมีลักษณะเป็น 32P 5’ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 3’ DNA จะถูกแบ่งเป็น 4 ส่วน แต่ละส่วนจะถูกนํามาทําปฏิกิริยาเคมีที่ต่างกัน โดยจะทําการตัดสาย DNA น้ันท่ี ตําแหน่งของ base 1 ใน 4 นั้นๆ เช่น ในส่วนท่ี 1 จะถูกนําไปทําปฏิกิริยาทางเคมี โดยจะตัดที่ตําแหน่งท่ีมี base เทคนคิ และการใช้เครื่องมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 246

เป็น T หรือ C เท่านั้น สําหรับส่วนที่กําหนดให้ตัดท่ีตําแหน่ง G นั้น จะตัดท่ีตําแหน่ง A ด้วย แต่จะตัดที่ตําแหน่งท่ี เป็น G มากกว่า ในทํานองเดียวกัน ส่วนท่ีถูกกําหนดให้ตัดที่ตําแหน่ง A จะตัดที่ G ด้วย แต่จะตัดที่ตําแหน่ง A มากกวา่ -ข้ันที่ 3 เป็นการแยกขนาดของ DNA ท่ีได้จากการทําปฏิกิริยาทางเคมีตามขั้นตอนท่ี 2 DNA ที่ได้จะถูก นํามาแยกขนาดตามความยาวของเบสโดยใช้วิธี polyacrylamide gel electrophoresis (เหมือนกับ agarose gel electrophoresis เพียงแต่ว่า polyacrylamide gel สามารถที่จะใช้แยกขนาดของ DNA ท่ีต่างกันเพียงแค่ 1 bp ได)้ ภาพท่ี 5.8 ขน้ั ตอนการเกดิ ปฏกิ ริ ิยาการวเิ คราะห์หาลําดับเบสของดีเอ็นเอ (ท่ีมา: https://biologydictionary.net/dna-sequencing/) วิธีของ Sanger คิดค้นขึ้นในปีคศ.1975 โดย Frederick Sanger นักชีวเคมีชาวอังกฤษ และได้รับรางวัล โนเบลสาขาเคมีในปี คศ.1980 และวธิ ีนี้ก็ยังใชก้ ันอยู่จนถึงทกุ วนั นี้ DNA sequencing ก็มีข้อจํากัดคือ หาลาํ ดับนวิ คลีโอไทด์ได้ครั้งละประมาณ 300-1000 bp เท่านัน้ ถา้ จะ หาลําดับนิวคลีโอไทด์ของชิ้นส่วน DNA ท่ียาวกว่าน้ี เช่น ยีนท้ังยีน หรือท้ังโครโมโซม ต้องตัดด้วย restriction endonuclease ให้เป็นชิ้นๆ ท่ีส้ันลงก่อน หรือใช้วิธี PCR เพ่ิมปริมาณของ DNA แต่ละส่วนออกมา โดยให้มีส่วนที่ overlap กัน เพ่อื จะได้หาลาํ ดับนิวคลีโอไทด์ของแต่ละชิ้น แลว้ นําข้อมลู ลาํ ดบั ท่ีได้มาเชือ่ มต่อกนั อีกที วธิ กี ารของ Sanger ทีท่ าํ อยใู่ นปัจจุบัน มีหลักการคลา้ ยกับการทํา PCR คอื นําชิน้ ส่วน DNA ที่ตอ้ งการทํา sequencing มาให้ความร้อน (denature) แล้วเติม primer, DNA polymerase และ dNTP (dATP, dGTP, เทคนิคและการใช้เครอ่ื งมือทางจุลชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 247

dCTPและ dTTP) ลงไป เพ่ือให้เกิดการสังเคราะห์สาย polynucleotide เส้นใหม่โดยมี DNA ที่ผู้ปฏิบัติงาน ตอ้ งการหาลาํ ดบั นวิ คลโี อไทด์เปน็ แมแ่ บบ Dideoxy (Sanger DNA sequencing) เช่นเดียวกับ Maxam-Gilbert sequencing โดยที่การหาลําดับ เบสด้วยวิธนี ้ีตอ้ งการ DNA ทเ่ี ปน็ ชนิดเดียวกัน ซึ่งเปน็ DNA สายคูท่ ่ีจะถูก denature ใหเ้ ป็นสายเดี่ยวโดยใช้ความ ร้อน และ oligonucleotide สายส้นั ๆ ซงึ่ complementary กบั DNA สว่ นทีใ่ กล้เคียงกบั ลาํ ดบั เบสทผี่ ปู้ ฏิบัติงาน ตอ้ งการทราบ (sequencing primer) โดยที่จะ anneal กบั สาย DNA สายเดยี วเทา่ น้นั oligonucleotide primer จะถูกออกแบบให้ด้าน 3’ อยู่ใกล้กับส่วนของ DNA ท่ีผู้ปฏิบัติงานต้องการทราบลําดับของเบส โดย oligonucleotide น้ี จะทําหน้าที่เป็น primer เพื่อให้มีการสังเคราะห์ DNA สายท่ี complementary กับ DNA template ตอ่ ไป จากน้ัน DNA ที่ anneal กับ oligonucleotide primer แล้ว (เรียก DNA ท่ีต้องการจะหาลําดับเบสน้ีว่า เปน็ template หรอื DNA template) จะถูกแบง่ เป็น 4 ส่วนแต่ละสว่ นจะมี normal precursors ของ DNA เชน่ dATP, dTTP, dCTP, dGTP แ ล ะ DNA polymerase แ ล ะ ตั ว precursor น้ี จ ะ ถู ก ติ ด ฉ ล า ก ด้ ว ย ส า ร กัมมันตภาพรังสี (32P) เพ่ือท่ีจะสามารถตรวจสอบสาย DNA ท่ีสร้างใหม่ ใน DNA แต่ละส่วนนั้นจะต่างกันท่ีจะใช้ modified nucleotide คือ dideoxy nucleotide ต่างชนิดกัน dideoxy nucleotide กับ deoxynucleotide น้นั จะตา่ งกนั ที่ dideoxy nucleotide มี 3’-H ท่ี deoxyribose sugar แทนท่ี 3’-OH ถ้าผูป้ ฏบิ ตั งิ านใช้ dideoxy nucleotide ในขบวนการสังเคราะห์ DNA dideoxy จะเข้าไปใน สาย DNA ท่ีกําลังสังเคราะห์อยู่ได้ แต่สาย DNA นัน้ จะไมส่ ามารถท่จี ะสงั เคราะห์ให้มีความยาวต่อไปได้อีก การสงั เคราะห์ DNA สายน้ันก็จะหยุด เพราะเหตุว่าการ ท่ีไม่มี 3’-OH จะป้องกันการเกิด phosphodiester bond กับ 5’P ของ DNA precursor ตัวที่จะเข้ามาใหม่ sequencing reaction แต่ละส่วนจะมี ddATP, ddCTP, ddTTP หรือ ddGTP อย่างใดอย่างหนึ่งร่วมกับมี normal precursor ทั้ง 4 ชนิดคือ dATP, dTTP, dCTP และ dGTP ในการสังเคราะห์ DNA สายใหม่ จะมีการใช้ ท้งั ddNTP และ dNTP แบบสมุ่ ตัวอย่าง แต่โดยท่ัวไป dideoxyจะมีปรมิ าณ 1 ใน 100 ของ normal precursors ดังนั้นส่วนใหญ่ก็จะมีการใช้ deoxynucleotideเหมือนเช่นการสังเคราะห์ DNA ตามปกติ ซึ่ง primer ก็จะถูกต่อ โดย DNA polymerase โดยมีลําดับเบสท่ี complementary กับ template ถ้า dideoxynucleotideถูก incorporate เข้าไปในสาย DNA ท่ีกําลังสร้างอยู่ การสร้าง DNA สายนั้นก็จะหยุดลงไม่สามารถสร้างต่อไปได้อีก ส่วนสายท่ีมี deoxynucleotide incorporate เข้าไป ก็สามารถสังเคราะห์ไปได้เร่ือยๆ จนกว่าจะ incorporate dideoxynucleotideเขา้ ไป ดังนั้น DNA สายใหม่ที่กําลังสร้างอาจจะหยุดได้ทุกตําแหน่งที่มีการ incorporate dideoxynucleotide เข้าไป เช่น ใน ddA reaction สายใหม่ขนาดต่างๆ ท่ีถูกสร้างเหล่าน้ี จะมีปลายสุดท้ายเป็น ddA เสมอ ใน เทคนคิ และการใชเ้ ครอ่ื งมือทางจลุ ชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 248

ขณะเดียวกัน ddG ddC ddT reaction ก็จะมี DNA สายใหม่ที่มีเบสสุดท้ายเป็น ddG, ddC และ ddT ท้ังส้ิน จากนั้นสาย DNA จะถูกนํามาแยกขนาด โดย polyacrylamide gel electrophoresis แล้วนําไปประกบกับฟิล์ม x-ray ซ่ึงเมื่อนํามาลา้ งและ develop แลว้ จะสามารถมองเห็นสาย DNA ไดโ้ ดย autoradiogram ประโยชนใ์ นการใชง้ าน 1. ใช้ในการหาลําดับเบสดีเอ็นเอในส่ิงมีชีวิตชนดิ ตา่ งๆ เพือ่ หาความหลากหลายทางชีวภาพ พันธุประวตั ิ และเปน็ ข้อมูลในการศึกษาหนา้ ท่ีของยีน 2. ใช้ในการศึกษาลาํ ดับเบสดีเอน็ เอส่วนของยีนท่ีกอ่ ให้เกดิ โรค เชน่ ยนี ทกี่ ระตนุ้ การเกิดเซลล์มะเรง็ 3. ใช้ในการตรวจสอบลําดับเบสดีเอ็นเอของบคุ คลทีเ่ ปน็ อาชญากรขา้ มชาติ 4. ใชต้ รวจสอบลาํ ดบั เบสดีเอ็นเอส่วนของยนี ทีต่ ้านทานต่อโรคและแมลงในพืชเศรษฐกิจ 5. ใชต้ รวจสอบลําดบั เบสดีเอ็นเอของส่ิงมีชีวิตสายพนั ธ์ทุ ี่ค้นพบใหมท่ ม่ี ีประโยชน์ในงานดา้ นตา่ งๆ 5.2.2. เครือ่ งมอื ดีเอน็ เอ ไมโครอะเรย์ (DNA microarray) เทคโนโลยีไมโครแอเรย์ของดีเอ็นเอ เป็นเทคนิคท่ีถูกพัฒนาขึ้นเพื่อใช้ในการศึกษา”การแสดงออก ของยีน” ภายในสิ่งมีชีวิตได้ท้ังจีโนม (high-throughput technique) แทนการทํา PCR หรือ Real-time PCR ท่ี มีข้อจํากัดในการศึกษาการแสดงออกของยีนได้เพียงไม่ก่ียีนเท่าน้ันใน 1 รอบการทํางาน การจะทําความเข้าใจใน เทคนคิ นไ้ี ดต้ อ้ งรู้หลักการพ้นื ฐานทางพนั ธุศาสตรก์ ่อนว่า ยีน (gene) มีหนา้ ที่ควบคมุ การทํางานของเซลล์ในสภาวะ ต่างๆ โดยควบคุมให้เกิดการสร้างโปรตีน เช่น โปรตีนบางชนิดทําหน้าท่ีเป็นเอนไซม์ กระบวนการสร้างโปรตีน เร่ิมต้นท่ีการถอดรหัสดีเอ็นเอ (transcription) เป็น mRNA และจะถูกแปลรหัส (translation) เพื่อสังเคราะห์เป็น โปรตีน จากความรู้น้ีสามารถนํามาสร้างกระบวนการจําลองเพื่อศึกษาการแสดงออกของยีนได้โดย เริ่มจาก ผู้ปฏิบัติงานทําการสกัด RNA จากสิ่งมีชีวิตใดๆ ที่สนใจออกมาแล้วทําการเปล่ียน RNA ให้เป็น cDNA (complementary DNA) จากน้ัน นํา cDNA สายเดี่ยวที่สะอาดติดเข้ากับสารเรืองแสงเพื่อให้จับคู่กันกับ ดีเอ็นเอ คู่สมอีกสายบนแผ่นไมโครแอเรย์ เมื่อเกิดการจับคู่กันของดีเอ็นเอคู่สม (hybridization) จะเกิดการแสดงออกของ สารเรืองแสง ซึ่งความเข้มข้นของสีบนสารเรืองแสงสามารถบอกปริมาณดีเอ็นเอที่ถูกจับไว้ได้ แปลผลกลับไปเป็น การทํางานของ RNA จึงบอกไดว้ ่า มกี ารแสดงออกของยนี นน้ั ๆ หรือไม่ เทคนคิ และการใชเ้ คร่อื งมือทางจลุ ชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 249

เทคนิคน้ีได้ถูกพัฒนาข้ึนอย่างรวดเร็วในช่วงทศวรรตท่ีผ่านมาและถูกนํามาใช้ในการตรวจหาความ ผิดปรกติของโครโมโซมในปัจจุบัน เป็นเทคนิคท่ีรวมเอาข้อดีของเทคนิค G-banding และเทคนิค FISH เข้าไว้ ด้วยกัน ส่งผลให้เทคนิคไมโครอะเรย์สามารถตรวจหาความผิดปรกติของโครโมโซมทุกแท่งได้ท่ีความละเอียด (resolution) สูงกว่าเทคนิคอ่ืนๆ อาศัยหลักการไฮบริไดเซชัน (hybridization) ระหว่างดีเอ็นเอกับโพรบ (probe) ท่ีจําเพาะต่อตําแหน่งบนโครโมโซมที่นํามาเรียงกันบนวัสดุ เช่น แผ่นสไลด์แก้ว หรือแผ่นชิป (chip) ท่ีมี DNA probe สายส้ันท้ังจโี นมของยีสต์ Saccharomyces cerevisiae ขนาด 8 x 15K (ภาพท่ี 5.9) ภาพท่ี 5.9 แผ่นสไลด์แกว้ ท่ีมี DNA probe (ทมี่ า: Turcotte laboratory, Canada) การตรวจโครโมโซมด้วยเทคนิคไมโครอะเรย์จึงเทียบเท่ากับการตรวจด้วยเทคนิค FISH หลายๆ ครั้งในคราวเดียวกันสามารถตรวจหาความไม่สมดุลของจีโนม (genome) ซึ่งเกิดจากความแปรผันของจํานวนซ้ํา (copy number variants, CNVs) ของบริเวณต่างๆ ในจีโนม ได้แก่ การลดลงของจํานวนซ้ํา (copy number loss) ทเ่ี กดิ จาก deletion และการเพิม่ ขนึ้ ของจํานวนซ้ํา (copy number gain) ที่เกิดจาก duplication เทคนิคไมโครอะเรย์มีข้อดี คือ ไม่จําเป็นต้องเพาะเล้ียงเซลล์ และใช้กับสิ่งส่งตรวจที่ไม่มีเซลล์ท่ีมี ชีวิตได้ เช่น ชิ้นเน้ือในพาราฟิน ตัวอ่อนท่ีเร่ิมเน่าแล้ว (macerated fetus) หรือสิ่งส่งตรวจท่ีไม่สามารถเพาะเล้ียง เพื่อให้ได้โครโมโซมในระยะเมทาเฟส เน่ืองจากตรวจวิเคราะห์เฉพาะดีเอ็นเอ รวมท้ังยังสามารถตรวจความ ผิดปรกติและความแปรผันของจีโนมหลายๆ ตําแหน่งได้ในเวลาเดียวกัน และสามารถตรวจหาความผิดปรกติของ โครโมโซมขนาดเล็กๆ ท่ีมองไม่เห็นด้วยกล้องจุลทรรศน์ ดังนั้นเทคนิคไมโครอะเรย์จึงเป็นเทคนิคท่ีมีประสิทธิภาพ ในการวินิจฉัยโรคทางพันธุกรรมได้ดีมากกว่าวิธีดั้งเดิมหลายเท่า โดยพบว่าในกลุ่มผู้ป่วยที่มีพัฒนาการช้า ผู้ป่วยที่มี ความบกพร่องด้านสติปัญญาท่ีไม่ทราบสาเหตุ ผู้ป่วยออทิสติกสเปคตรัม และผู้ป่วยที่มีความพิการแต่กําเนิดหลาย เทคนิคและการใชเ้ ครอ่ื งมือทางจลุ ชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 250

อย่างร่วมกัน เมื่อตรวจด้วยเทคนิค G-banding จะพบความผิดปรกติของโครโมโซมประมาณ 3-4% เมื่อตรวจด้วย เทคนิค G-bandingร่วมกับเทคนิค FISH ท่ีจําเพาะกับ subtelomereของแต่ละโครโมโซม จะพบความผิดปรกติ ของโครโมโซมเพิ่มขึ้นเป็นประมาณ 7-9% ในขณะท่ีตรวจด้วยไมโครอะเรย์อย่างเดียว จะพบความผิดปรกติของ โครโมโซมเพิ่มขึ้นเป็นประมาณ 15-20% ข้ึนอยู่กับชนิดและความละเอียดของเทคนิคไมโครอะเรย์ท่ีใช้ นอกจากนี้ เม่ือเร่ิมมีการตรวจโครโมโซมด้วยเทคนิคไมโครอะเรย์เพิ่มขน้ึ มีรายงานการค้นพบโรคและกลุ่มอาการใหม่ๆ ที่เกิด จากความผิดปรกติของโครโมโซมเพ่ิมข้ึนตามมา เช่น microdeletion syndrome,microdeletion syndrome ซ่ึงความผิดปรกติเหล่าน้ีมักมีขนาดเล็กมาก ด้วยความสามารถของเทคนิคน้ียังช่วยให้นักวิจัยทราบข้อมูลเพ่ิมเติม เกี่ยวกบั ยีนหรอื คน้ พบยีนท่เี กี่ยวข้องกับโรคหลายโรค เชน่ การขาดหายไปของยนี CHD7 ใน CHARGE syndrome และโรคในกลุ่ม complex disorder เช่น ออทิสติกสเปคตรัม ลมชัก อัลไซเมอร์ ช่วยในการระบุบ่งช้ี ข้อมูล เพิ่มเติมเกี่ยวกับ genotype-phenotype correlation แม้กระท่ังการตรวจวินิจฉัยโรคมะเร็งมีลักษณะความ ผิดปรกติท่ีหลากหลาย (heterogeneity) และมักพบเซลล์ที่มีการกลายพันธ์ุต่างชนิดกันปนอยู่ด้วยกันหรือปนอยู่ กบั เซลล์ท่ปี รกติ ประโยชน์ในการใช้งาน 1. ใช้เครื่องมือน้ีตรวจวิเคราะห์การแสดงออกของยีนท้ังหมดในส่ิงมีชีวิตหน่ึงคร้ังเดียว ทําให้ทราบการ ทาํ งานของยีนทุกตาํ แหน่งเมื่อได้รบั สภาวะกระตุน้ ใดสภาวะกระตุ้นหนึง่ 2. ใชต้ รวจสอบความผดิ ปกติของเซลลภ์ ายในรา่ งกายมนุษย์ เช่น เซลล์มะเร็ง 3. ใช้ตรวจสอบความผิดปกติของยีนที่มีผลจากพันธุกรรมสําหรับเด็กในครรภ์มารดา เช่น เด็กท่ีเป็นออทิ สตกิ สเปกตรมั 4. ใช้ตรวจสอบกลไกการด้ือยาปฏิชีวนะของเชื้อจุลินทรีย์ก่อโรคเม่ือได้รับสภาวะกระตุ้นใดสภาวะกระตุ้น หน่ึง เปน็ ตน้ 5.2.3 เคร่อื งมือวเิ คราะห์การแสดงออกของยนี ท้ังจโี นม (ChIP on Chip microarray) ด้วยวิวัฒนาการทางวิทยาศาสตร์ นักวิทยาศาสตร์ได้ให้ความสนใจในการศึกษาบทบาทหน้าที่ของยีน ต่างๆ ภายในเซลล์ทั้งจีโนม เน่ืองจากมีการหาลําดับเบสบนจีโนมท้ังหมดเป็นท่ีเรียบร้อยและออกเผยแพร่แล้ว ไม่ ว่าจะเป็นจีโนมของแบคทีเรีย ยีสต์ หนูทดลอง และ มนุษย์ จึงเป็นที่มาของการพัฒนาเทคนิค ChIP-on-chip microarray เป็นเทคนิคท่ีถูกพัฒนาข้ึนมาเพ่ือศึกษากลไกการควบคุมยีนท้ังจีโนมในกระบวนการเมแทบอลิซึม ต่างๆ ภายในสิ่งมีชีวิต ChIPมาจาก Chromatin Immunoprecipitation และ chip มาจาก DNA microarray chip เทคนิคนี้จึงเป็นเทคนิคที่รวมระหว่างการใช้คุณสมบัติของ antigen-antibobyซ่ึงเป็นโปรตีนประเภทหนึ่ง รว่ มกบั การ hybridization บน แผ่น microarray ChIP-on chip นีจ้ ะใช้ศกึ ษากลไกการทาํ งานของตวั ควบคุมการ เทคนคิ และการใช้เครือ่ งมือทางจุลชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 251

แสดงออกของยีนในสภาวะถูกกระตุ้นด้วยส่ิงใดสิ่งหน่ึง ตัวควบคุมการแสดงออกของยีนน้ันเรียกว่า transcription factor หรือ transcriptional regulator ด้วยความก้าวหน้าทางพันธุศาสตร์ของจุลินทรีย์และชีววิทยา ทําให้ ผู้ปฏิบัติงานทราบกลไกการทํางานของยีนต่างๆ จํานวนมากท่ีอยู่ภายในนิวเคลียส หรือ ไมโทรคอนเดรียของ จุลินทรีย์ที่ผู้ปฏิบัติงานต้องการศึกษา เม่ือสภาวะแวดล้อมมีการเปลี่ยนแปลง จุลินทรีย์จะถูกกระตุ้นให้การทํางาน ของกลุ่มยีนมีการเปลี่ยนแปลงไปด้วย ตัวควบคุมการแสดงออกของยีนก็จะเข้ามามีบทบาทหน้าท่ีในการกระตุ้น หรือยับย้ังการทํางานของกลุ่มยีนน้ันๆ (Buck et al., 2004) เป็นกระบวนการควบคุมการแสดงออกของยีน มี โปรตีนท่ีทําหน้าทีเ่ ป็น transcriptionfactor ให้มีการแสดงออก และยับย้ังการแสดงออกของกลุ่มยีนทั่วไปอีกกลุ่ม หน่งึ ในสภาวะกระตุ้นใดสภาวะหนึง่ (ภาพท่ี 5.10) ภาพท่ี 5.10 กระบวนการควบคุมการแสดงออกของยนี (ท่มี า: http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL3530/DEVO_10/ch10f04.jpg) เทคนิคนี้มีข้อดี คือ ผู้ปฏิบัติงานสามารถศึกษาการทํางานของตัวควบคุมการแสดงออกของยีนในสภาวะ กระตนุ้ ใดสภาวะหน่งึ แลว้ ผลที่แสดงออกมาจะเหน็ การเปลี่ยนแปลงของยีนทั่วไปทง้ั จโี นม ซึ่งกล่มุ ยนี ทัง้ จโี นมมีการ จัดกลุ่มตามกระบวนการเมแทบอลิซึมต่างๆ ภายในเซลล์ ผู้ปฏิบัติงานจึงวิเคราะห์ผลได้อย่างมีประสิทธิภาพ มี ความผิดพลาดน้อย ปจั จุบนั นกั วิทยาศาสตร์ด้านการแพทย์ใชเ้ ทคนติ นเ้ี พ่ือตรวจสอบการควบคุมการแสดงออกของ ยีนในมนุษย์ หนูทดลอง ยีสต์ เป็นต้น (Panda et al., 2003) ข้อจํากัดของเทคนิคนี้คือ เครื่องมือที่ใช้อ่านผลลัพธ์ เทคนคิ และการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 252

บนแผ่น chip มีราคาแพงมาก ดังนั้นค่าใช้จ่ายในการลงทุนนับว่าสูง ผู้ปฏิบัติงานต้องมีความเชี่ยวชาญและชํานาญ ในการถ่ายโอนโปรตนี (tag) แทรกเขา้ ไปในยนี ทแี่ ปลรหัสให้ transcriptional regulator เพือ่ ให้เกิดการจับกันของ transcriptional regulator กับกลุ่มยีนท้ังจีโนม ผลลัพธ์ที่ได้ แสดงผลการใช้เทคนิค ChIP-on-chip microarray วเิ คราะห์โปรตนี ทคี่ วบคุมการแสดงออกของกลุ่มยนี ทีส่ มองในผู้ปว่ ยรายหนึ่ง (ภาพที่ 5.11) ภาพที่ 5.11 ผลลพั ธ์การใชเ้ ทคนิค ChIP-on-chip microarray (ทีม่ า:http://help.brain-map.org/display/humanbrain/ Microarray+Data) ภาพท่ี 5.12 เครอ่ื งตรวจวิเคราะห์การแสดงออกของยนี (ท่มี า: Turcotte laboratory, Canada) ประโยชนใ์ นการใชง้ าน เทคนิคและการใช้เครือ่ งมือทางจลุ ชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 253

เทคนิค ChIP-on-chip microarray น้ีปัจจุบันนิยมนํามาใช้ในการศึกษาบทบาทหน้าที่ในการทํางานของ ตัวควบคุมการแสดงออกของยีนทั้งจีโนมในสภาวะต่างๆ อาทิเช่น การแสดงออกของยีนในส่ิงมีชีวิตหนึ่ง เปรียบเทียบกับส่ิงมีชีวิตชนิดอ่ืนในสภาวะกระตุ้นเดียวกัน การแสดงออกของยีนที่เก่ียวข้องกับการเกิดมะเร็ง การ แสดงออกของยีนท่ีเก่ียวข้องกับการวินิจฉัยโรคทางพันธุกรรม ซ่ึงนําไปสู่การสร้างผลิตภัณฑ์ยา (drug discovery) รักษาโรคได้อย่างทันถ่วงที ใช้ระยะเวลาส้ันกว่าในอดีต หรือแม้กระท่ังการศึกษาความเป็นพิษของจุลินทรีย์ต่อ สิ่งมีชีวิต ทางด้านการเกษตร ทางด้านส่ิงแวดล้อมหรือจุลินทรีย์ในอุตสาหกรรม รวมไปถึงงานต่างๆ ทางด้าน การแพทย์ ท่ีเก่ียวข้องกับจุลินทรีย์ท้ังท่ีมีประโยชน์และจุลินทรีย์ก่อโรคผลการวิเคราะห์การควบคุมการแสดงออก ของยีนด้วยเคร่ืองมือ ChIP-on-chip microarray(ภาพท่ี 5.12) ดังน้ันผลการวิเคราะห์ ท่ีเกี่ยวข้องกับการศึกษา การแสดงออกของ zinc cluster transcriptional regulator ทค่ี วบคุมการแสดงออกของยีนในสภาวะ oxidative stress ซึ่งเกี่ยวข้องกับการดื้อยาของเชื้อยีสต์ก่อโรค จะแสดงผลผ่านระบบประมวลผลจากโปรแกรมคอมพิวเตอร์ แยกเป็นเฉดสีเพอ่ื แสดงผลการวิเคราะห์ระดบั การแสดงออกของยนี ที่แตกต่างกัน (ภาพท่ี 5.13) ภาพท่ี 5.13 ระดับการแสดงออกของยีนที่ควบคุมด้วย zinc cluster regulator (ทีม่ า: Larochelle et al., 2006) เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจลุ ชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 254

บทสรุปทา้ ยหนว่ ยที่ 5 เครื่องมือทางอณูโมเลกุลสําหรับงานด้านจุลชีววิทยา เป็นเครื่องมือท่ีถูกประดิษฐ์ข้ึนสําหรับนักวิจัยหรือ ผู้ปฏิบัติงานเทางด้านจุลชีพใช้สร้างสรรค์งานทดลองเกี่ยวกับสารพันธุกรรม (DNA, RNA หรือโปรตีน) สารชีว โมเลกุลเหล่านี้ จะสามารถอธิบายปฏิสัมพันธ์ของกระบวนการเมแทบอลิซึมกับระบบต่างๆ ภายในเซลล์ของ จุลินทรีย์ ผู้ท่ีมีความจําเป็นต้องใช้เคร่ืองมือในกลุ่มน้ี ต้องมีความรู้พันธุศาสตร์ ชีวเคมี ชีววิทยาเชิงฟิสิกส์ หรือ คอมพิวเตอร์เทคโนโลยีสารสนเทศ เครื่องมือทางอณูโลเลกุล ได้แก่ เคร่ืองเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ (PCR machine/Real-time PCR) เคร่ืองมือน้ีใช้หลักการทฤษฎีเลียนแบบการจําลองดีเอ็นเอ จากดีเอ็นเอสายแม่แบบ สายคู่ ถูกแยกเป็นดีเอ็นเอสายเด่ียวด้วยความร้อน จากน้ันเริ่มเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอตรงบริเวณตําแหน่งท่ี ผู้ปฏิบัติงานต้องการ วนรอบไปตั้งแต่ 30-40 รอบของการเพ่ิมปริมาณดีเอ็นเอ (รอบทํา PCR) เม่ือครบกําหนด จํานวนรอบ ดีเอ็นเอที่เพ่ิมจํานวนเสร็จแล้วจะถูกนํามาตรวจสอบผลด้วยเคร่ืองแยกสารพันธุกรรมดีเอ็นเอ (electrophoresis) เป็นเครื่องมือท่ีใช้หลักการทฤษฎีของการเคลื่อนท่ีของประจุไฟฟ้า ดีเอ็นเอติดสารเรืองแสงอยู่ บน agarosegel ซ่ึงดีเอ็นเอมีประจุเป็นลบจากหมู่ฟอสเฟต จะเคลื่อนที่จากข้ัวลบไปหาขั้วบวก จากน้ันนํา gel ไป สอ่ งดูภายใตแ้ สงยวู ีดว้ ยเคร่ืองทเี่ รียกว่า gel doc ทุกขนั้ ตอนทีก่ ลา่ วมาเปน็ ขนั้ ตอนการทาํ PCR แบบท่ัวไป แต่ด้วย เทคโนโลยีทางคอมพิวเตอร์ท่ีเข้ามามีบทบาทสําคัญต่อการสร้างเครื่องมือท่ีทันสมัย ดังนั้นการเพ่ิมจํานวนดีเอ็นเอ ในปัจจุบันสามารถอ่านผลได้จากโปรแกรมที่กําหนดในเครื่องคอมพิวเตอร์ ทําให้ผู้ปฏิบัติงานสามารถพิจารณาการ เพ่ิมจํานวนดีเอ็นเอได้จากการแสดงผลการทดลองบนจอคอมพิวเตอร์ เครื่องมือนี้เรียกว่า Real-time PCR ข้อ แตกต่างระหว่างการทํา PCR แบบท่ัวไป กับ การทํา PCR แบบ Real-time ข้อหน่ึงท่ีต้องพึงระวังก็คือ สาร พันธุกรรมเริ่มต้นแตกต่างกัน PCRแบบทั่วไปใช้สารพันธุกรรมเร่ิมต้นคือ ดีเอ็นเอ (DNA) เป็นการอ่านผลดีเอ็นเอที่ ต้องการเพ่ิมจํานวน หรือพิจารณาความแตกต่างของดีเอ็นเอในสิ่งมีชีวิตท่ีแตกต่างกันส่วน PCR แบบ Real-time ใช้สารพันธุกรรมเริ่มต้นคือ อาร์เอ็นเอ (RNA)แล้วต้องเปลี่ยนจาก RNA ไปเป็น cDNA เสียก่อน ก่อนนําลงเคร่ือง Real-time PCR การอ่านผลจะพิจารณาผลการแสดงออกของยีนใดๆ ดังนั้น ถือเป็นความท้าทายสําหรับ ผู้ปฏิบัติงานในการเลือกใช้เคร่ืองมือให้เหมาะสมกับการทํา PCR เพราะผลลัพธ์ที่ได้จากการทดลองจะอธิบายการ ทํางานของสารพันธุกรรมท่ีไม่เหมือนกันการพัฒนาอย่างต่อเนื่อง ทําให้นักวิจัยได้ทราบถึงจํานวนยีนท้ังหมดของ ส่ิงมีชีวิต ด้วยเคร่ืองมือที่เรียกว่าเครื่องอ่านลําดับเบส (DNA sequencing) ต่อมาจากความรู้เก่ียวกับยีนทั้งจีโนม นํามาต่อยอดการศึกษาการทํางานหรือบทบาทหน้าท่ีของยีนแต่ละลําดับในกระบวนการเมแทบอลิซึมต่างๆ ของ จีโนมท้ังหมด โดยผ่านเคร่ืองมือท่ีเรียกว่า เคร่ืองอ่านค่ายีนท้ังจีโนม (DNA microarray) ในขณะที่เครื่องวัดค่าการ แสดงออกของยีนท้ังจีโนม (ChIP on Chip microarray) ถูกประดิษฐ์ขึ้นมาเพื่อใช้ตรวจสอบการแสดงออกของตัว ควบคุม (transcriptional regulator) การแสดงออกของยีนทง้ั จีโนมของจลุ นิ ทรียใ์ นสภาวะใดสภาวะหนงึ่ เทคนิคที่ ใช้เคร่ืองมือน้ี ศึกษาการแสดงออกของยีนในกลุ่มที่แตกต่างกันกับ เทคนิคและเคร่ืองมือท่ีใช้ในการศึกษา DNA microarray ดังน้ันผู้ปฏิบัติงานต้องมีความรู้ความเข้าใจ และความเชี่ยวชาญในการเลือกใช้เคร่ืองมือต่างๆ ให้ เทคนคิ และการใชเ้ ครือ่ งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 255

เหมาะสมกับช้ินงาน เพื่อเพิ่มประสิทธิผลของงานทดลองให้แม่นยํา และน่าเช่ือถือ สามารถทําซํ้าแล้วได้ผล เหมอื นเดมิ เทคนคิ และการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 256

วธิ ีการสอนและกิจกรรม 1. ใชว้ ิธกี ารสอนบรรยายผ่านส่ือการสอนทเ่ี หมาะสม ร่วมกับการถาม-ตอบ 2. สอดแทรกและฝึกกระบวนการคดิ อย่างมหี ลักการและเหตุผล 3. ยกตัวอย่างในเนือ้ หา พร้อมภาพประกอบให้นกั ศึกษาได้เห็นภาพชดั เจน 4. มอบหมายใหน้ ักศึกษาทาํ กิจกรรมกลุ่ม โดยให้นกั ศึกษาคัดเลอื กงานวิจัยทสี่ นใจและนํามา ประยุกต์ใช้กับองค์ความรูท้ ี่ไดร้ บั จากการเรียนรู้ในรายวิชาน้ี เพอื่ สรปุ เทคนคิ และเคร่ืองมอื ทใี่ ช้ ทง้ั หมดในงานวจิ ัยทีเ่ ลอื กมา สมาชิกในกลุม่ ร่วมกนั อภปิ รายพรอ้ มท้ังนําเสนอหน้าชนั้ เรียน ส่ือการสอน เอกสารอ้างอิง หมายเลข ตามบรรณานุกรมทา้ ยเล่ม (11 และ 16-19) เอกสารประกอบการสอน เอกสารประกอบการสอนเทคนิคและการใชเ้ ครือ่ งมือทาง จลุ ชีววทิ ยา โสตทัศนวสั ดุ สอื่ การสอนนําเสนอด้วยโปรแกรม Powerpoint ประกอบ การบรรยายสัปดาห์ที่ 14 Multimedia LCD projector งานทีม่ อบหมาย 1. ใหศ้ ึกษาคน้ คว้าจาก หนงั สือ หรอื งานวิจัยทางจุลชวี วทิ ยา เพิ่มเติม 2. ใหศ้ ึกษาค้นคว้าจาก ส่ือการสอนออนไลน์ จากเว็ปไซต์ต่างๆ 3. ให้ทํากิจกรรมท่ี 5.1 กิจกรรมกลุ่ม นําเสนองานวิจัยท่สี นใจหน้าชน้ั เรียนเกี่ยวกบั เทคนคิ และการใช้ เครือ่ งมอื ทางจุลชีววทิ ยา การวัดผล - วิธีการสังเกต - ใบบันทึกเวลาเรียน - กิจกรรมท้ายช่ัวโมง บนั ทึกการสอนและข้อสงั เกต - สังเกตจากพฤติกรรมท่ีแสดงออกของนักศึกษา เช่น การมวี ินัย การแตง่ กาย การตรง-ต่อเวลา รวมทงั้ การมีส่วนรว่ มของนักศึกษาในชัน้ เรียน - เช็คการมาเขา้ เรียนของนกั ศึกษาทุกครงั้ ในชั่วโมงตามตารางสอน - วัดผลจากการทาํ ข้อสอบปลายภาค - สงั เกตจากพฤติกรรมการมีส่วนร่วม ความกระตอื รือรน้ ในการทาํ กิจกรรมของนักศึกษา ความถูกตอ้ งของ ชิ้นงานจากงานทม่ี อบหมาย เทคนคิ และการใชเ้ คร่อื งมือทางจลุ ชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 257

ส่อื การสอนสัปดาห์ท่ี 14 เทคนคิ และการใชเ้ คร่อื งมือทางจลุ ชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 258

เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 259

เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 260

เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 261

เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 262

กิจกรรมที่ 5.1 ให้ผู้เรียนจัดกลุ่ม กลุ่มละเท่าๆ กันจากนั้นคัดเลือกงานวิจัยทางจุลชีววิทยาที่สนใจมากลุ่มละ 1 เร่ือง สมาชิกทุกคนในกลุ่มร่วมกันอภิปราย สรุปเครื่องมือท่ีใช้ทั้งหมดจากงานวิจัยท่ีคัดเลือกมา เทคนิคการใช้งานของ เคร่ืองมือ วิธีการใช้เครื่องมือท่ีถูกต้อง และอธิบายการดูแลรักษาเครื่องมือ ทําเป็น flow chart หรือ สื่อ อิเล็กทรอนิกส์ที่เหมาะสมบอกวิธีการทําการทดลองและเทคนิค การใช้เคร่ืองมือทั้งหมด โดยนําเสนอหน้าช้ันเรียน ให้คะแนนการนําเสนองานหน้าชนั้ เรียน คิดเปน็ 10 เปอรเ์ ซ็นต์ เทคนิคและการใชเ้ ครอ่ื งมือทางจลุ ชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 263

หน่วยท่ี 6 ความปลอดภยั ในห้องปฏบิ ัติการทางจุลชวี วทิ ยา (Biosafety in Microbiological laboratory) เทคนคิ และการใช้เครอ่ื งมือทางจลุ ชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 264

ใบเตรียมการสอน แผนการสอนสปั ดาห์ท่ี 15 รหสั วชิ า 403 – 25 – 16 บทเรียนที่ 6.1 หนว่ ยท่ี 6 ความปลอดภัยในห้องปฏิบตั ิการทางจลุ ชวี วิทยา เวลาเรียน 2 ชว่ั โมง บทเรยี นท่ี 6.1 การใช้ห้องปฏิบตั กิ ารทางจุลชวี วิทยา จุดประสงคก์ ารสอน 2 ช่วั โมง 6.1 เข้าใจการใช้หอ้ งปฏบิ ัติการทางจุลชีววิทยาท่ีดี 6.1.1 สรปุ การทาํ งานทางจลุ ชีววทิ ยาอย่างปลอดภยั 6.1.2 อธิบายการหลีกเล่ียงการติดเชอื้ ต่อตวั บุคคล 6.1.3 ยกตัวอย่างการป้องกันการปนเป้ือนของเช้อื กบั เคร่ืองมือ เทคนคิ และการใช้เครื่องมือทางจลุ ชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 265

หน่วยที่ 6 ความปลอดภัยในหอ้ งปฏบิ ตั กิ ารทางจลุ ชีววิทยา (Biosafety in Microbiological laboratory) บทเรียนที่ 6.1 การใช้ห้องปฏิบัติการทางจุลชีววิทยาท่ีดี บทนํา ในบทนี้จะกล่าวถึงความปลอดภัยของผู้ปฏิบัติงานในการทํางานกับเชื้อจุลินทรีย์ และการใช้เคร่ืองมือทาง จุลชีววิทยาในห้องปฏิบัติการ ผู้ปฏิบัติงานจะต้องทํางานกับเช้ือจุลินทรีย์ด้วยความระมัดระวัง เพื่อความปลอดภัย ต่อตนเอง ต่อบุคคลอ่ืน และต่อสภาพแวดล้อม รวมถึงการใช้เคร่ืองมือในงานทางจุลชีววิทยาเช่นกัน เคร่ืองมือท่ี เกี่ยวข้องจะมีโอกาสสัมผัสกับจุลินทรีย์ ดังนั้นผู้ปฏิบัติงานต้องช่วยลดความเส่ียงต่อการปนเปื้อนของเชื้อจุลินทรีย์ ขณะใช้เครื่องมือต่างๆ จุลินทรีย์นั้นมีท้ังท่ีเป็นประโยชน์และก่อให้เกิดโทษ ซ่ึงจุลินทรีย์ท่ีก่อให้เกิดโทษน้ันก็มี ระดับความเส่ียงต่อการเกิดโรคกับมนุษย์และสัตว์ ดังนี้ จุลินทรีย์ที่ก่อให้เกิดโรคในระดับต่ํา ระดับกลาง และ ระดับสูง ผู้ปฏิบัติงานจึงต้องมีความรู้และหลักปฏิบัติท่ีดีขณะทํางานกับเชื้อจุลินทรีย์ และใช้เครื่องมือใน ห้องปฏิบัติการ รวมทั้งการจัดวางตําแหน่งเคร่ืองมือให้เหมาะสมกับการทํางานของผู้ปฏิบัติงาน โดยการจัดวาง เคร่ืองมือนั้นต้องคํานึงถึงความปลอดภัยของผู้ปฏิบัติงานเป็นหลัก ถ้าผู้ปฏิบัติงานยึดหลักการทํางานที่เหมาะสม และระมัดระวัง ก็จะลดการปนเปื้อนของเชื้อจุลินทรีย์ที่อาจก่อโรคลงได้อย่างมาก ดังนั้นการใช้เครื่องมือที่ถูกต้อง เป็นไปตามระบบความปลอดภัยทางชีวภาพ จึงอยู่ภายใต้การควบคุมดูแลของคณะกรรมการกลางด้านความ ปลอดภัยทางชีวภาพ ศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ สํานักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และ เทคโนโลยแี ห่งชาติ ได้มกี ารแบง่ ระดับความปลอดภัยทางขีวภาพ (biosafety level) ไว้ 4 ระดับ การใช้ห้องปฏบิ ตั ิการทางจลุ ชวี วิทยาที่ดี ผู้ปฏิบัติงานท่ีต้องทํางานในห้องปฏิบัติการทางจุลชีววิทยาต้องมีแนวทางปฏิบัติ เพ่ือคํานึงถึงความ ปลอดภัยของการใช้เชื้อจุลินทรีย์ต่อตนเอง ต่อผู้อ่ืน ต่อสภาพแวดล้อม ต่อพื้นที่โดยรอบข้าง และต่อชุมชน การ ทดลองกับเชื้อจุลินทรีย์ทุกชนิดควรระมัดระวังเร่ืองการปนเป้ือนต่อส่ิงแวดล้อม มีวิธีการปฏิบัติงาน 2 แบบคือ เทคนิคปลอดเชื้อ (aseptic technique) ด้วยการใช้ตะเกียงแอลกอฮอล์จุดไฟ และเข่ียเช้ือจุลินทรีย์ใกล้เปลวไฟ หรือ ปฏิบัติงานภายใต้ตู้ปลอดเชื้อ (larminar flow cabinet) เป็นการป้องกันการปนเป้ือนต่อสิ่งแวดล้อม ขณะ ปฏิบัติงานผู้ปฏิบัติงานต้องใส่เส้ือกาวน์ทุกคร้ัง รวมท้ังสวมถุงมือแพทย์ป้องกันการสัมผัสของเช้ือจุลินทรีย์โดยตรง เทคนคิ และการใชเ้ ครอื่ งมือทางจุลชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 266

ต่อผิวหนัง หากมีการเปรอะเปื้อนบนพ้ืนที่การทํางาน ผู้ปฏิบัติงานต้องใช้แอลกอฮอล์ 70% เช็คทําความสะอาด บริเวณดังกล่าวและรัศมีโดยรอบ ห้องปฏิบัติการต้องอยู่เป็นสัดส่วนที่แน่นอน ไม่ปะปนกับการทํางานทางด้านอื่นๆ มีการจัดวางของอุปกรณ์ เคร่ืองมือ แยกแต่ละอย่างด้วยความเป็นระเบียบ เม่ือต้องใช้งานอุปกรณ์ เครื่องมือ ต้อง ตรวจเชค็ ความพร้อมก่อนใชง้ านทุกครั้ง ไมค่ วรนาํ อาหารและเครอื่ งดม่ื เข้าไปรับประทานในห้องห้องปฏิบัติการทาง จุลชวี วิทยา ระหว่างปฏิบตั งิ าน หากตอ้ งออกไปปฏิบัตงิ าน ณ ห้องอืน่ ๆ ตอ้ งถอดถุงมือแพทย์และเสื้อกาวน์ วางไว้ ภายในพ้ืนท่ีห้องปฏิบัติการก่อนออกไปปฏิบัติงานห้องอื่น ลดการปนเปื้อนของเชื้อจุลินทรีย์ออกสู่สภาพแวดล้อม หากเกิดเหตุที่ไม่สามารถควบคุมได้ เช่นไฟฟ้าดับ ควรหยุดการปฏิบัติงานทุกอย่างทางจุลินทรีย์ เก็บเชื้อจุลินทรีย์ ให้เรียบรอ้ ยก่อน แล้วจงึ นํามาทํางานต่อ การทาํ งานในห้องปฏิบตั ิการทางจุลชีววิทยาที่ดี ผู้ปฏบิ ตั งิ านจะต้องทราบ ลักษณะงาน และรู้จักลักษณะห้องปฏิบัติการก่อนว่าเหมาะสมกับการทํางานประเภทใด ซ่ึงประเภทของการวิจัย และทดลอง ตามระดับความปลอดภัย จัดแบ่งได้ 4 ประเภทงานได้แก่ (คณะอนุกรรมการความปลอดภัยทาง ชวี ภาพ, 2555) -งานประเภทท่ี 1 เป็นการวจิ ัยและทดลองท่ีไม่มอี ันตรายและไม่ตอ้ งขออนญุ าตจากคณะกรรมการกลางฯ -งานประเภทท่ี 2 เปน็ การวิจัยและทดลองท่ีอาจเป็นอนั ตรายในระดบั ตํ่าต่อพนักงานในห้องทดลอง ชุมชน และส่งิ แวดลอ้ ม -งานประเภทที่ 3 เป็นการวิจัยและทดลองที่อาจมีอันตรายต่อนักวิจัยชุมชนและสิ่งแวดล้อมหรือเกี่ยวกับ การรักษาผู้ปว่ ยโดยการดัดแปลงพนั ธุกรรม และงานท่อี าจมีอนั ตรายในระดบั ท่ียงั ไมเ่ ปน็ ท่ที ราบแนช่ ัด -งานประเภทที่ 4 เปน็ การวิจัยและทดลองทีอ่ าจมีอันตรายร้ายแรง และขดั ตอ่ ศีลธรรม 6.1.1 การทาํ งานทางจุลชวี วิทยาอย่างปลอดภัย การสร้างระบบความปลอดภยั ในหอ้ งปฏิบัติการ 1. เขตปลอดภัย (safety zone) ได้แก่ ประตูทางเข้า-ออก ห้องพักผู้ปฏิบัติงาน ห้องเก็บอุปกรณ์ ต้อง สามารถเขา้ -ออกได้สะดวก ไมม่ สี ่งิ กีดขวาง ไมว่ างเครือ่ งมือหรืออปุ กรณอ์ ันตราย 2. เขตอันตรายน้อย (low-hazard zone) ได้แก่ กิจกรรมเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อ ช่ังสาร เตรียมตัวอย่าง เตรียมสารเคมีท่ีไม่ระเหย และเป็นโซนสาํ หรับล้างเครอ่ื งแก้วและอปุ กรณ์ทดลอง 3. เขตอันตรายมาก (high-hazard zone) เปน็ พื้นท่ีที่อยู่ด้านในสุดของห้องปฏิบัติการ ผู้ไม่เก่ียวข้องห้าม ผ่านเข้า-ออก ได้แก่ การทํางานกับจุลชีพ ปฏิบัติงานในตู้ปลอดเชื้อ การเตรียมสารเคมีไวไฟและเป็นอันตราย ปฏบิ ตั งิ านในตูด้ ูดไอสารเคมี ควรมอี ปุ กรณ์ปอ้ งกันอันตราย เช่น ตชู้ ีวนริ ภัย เทคนคิ และการใช้เครื่องมือทางจลุ ชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 267

ภาพท่ี 6.1 การจดั การหอ้ งปฏบิ ัติการทางจุลชวี วิทยาและเทคโนโลยชี ีวภาพให้ปลอดภยั (ทม่ี า: คณะอนุกรรมการความปลอดภัยทางชีวภาพ, 2555) 6.1.2 การหลกี เลี่ยงการติดเชอื้ ต่อตวั บุคคล -หา้ มนาํ อาหารและเคร่อื งดืม่ เขา้ หอ้ งปฏิบตั กิ าร -ตอ้ งปฏบิ ัตงิ านตามข้อกาํ หนดของห้องปฏิบตั ิการนน้ั ๆ อย่างเคร่งครัด -กอ่ นลงมือปฏิบัติงาน ต้องทําความสะอาดมือด้วย แอลกอฮอล์ 70% -หา้ มใช้ปากดูดสารละลายเช้ือจลุ ินทรีย์จากไปเปตโดยตรงเดด็ ขาด -ทาํ ความสะอาดโต๊ะทดลองทุกครัง้ ก่อนและหลงั ทํางานดว้ ย แอลกอฮอล์ 70% -ทํางานดว้ ยความระมดั ระวังอยา่ งให้เกิดอบุ ัตเิ หตุใดๆ กบั ตัวเองและผอู้ ่นื -เขี่ยเชื้อจุลินทรียอ์ ยา่ งเหมาะสม ป้องกันการปนเปื้อนไปส่สู ิ่งแวดล้อม -เช้ือจุลินทรยี ท์ ี่ใช้งานแล้วตอ้ งนําไปน่งึ ฆา่ เชื้อด้วยหม้อน่ึงความดนั ไอนาํ้ เป็นเวลา 30 นาที 121องศา เซลเซียสก่อนท้ิงส่ภู ายนอก 6.1.3 การปอ้ งกนั การปนเปอื้ นของเชอ้ื จุลินทรยี ์กบั เคร่ืองมอื การป้องกันการปนเปื้อนและลดระดับของเช้ือจุลินทรีย์ที่มีโอกาสจะปนเปื้อนไปกับเครื่องมือให้อยู่ใน ระดับที่ไม่ก่อโรค มีวิธีการทําความสะอาดเคร่ืองมือที่นิยมใช้กัน 2 แบบ คือ disinfection หรือ sterilization ซึ่ง วิธีการ disinfection คือการใช้สารเคมีที่มีหน้าท่ีเป็น disinfectant การเลือกใช้งานต้องคํานึงถึงลักษณะและ พ้ืนผิวของวัสดุท่ีประกอบบนเคร่ืองมือ เน่ืองจากนํ้ายาแต่ละชนิดมีคุณสมบัติท่ีแตกต่างกัน ต้องพิจารณาส่ิงต่อไปนี้ ลกั ษณะพ้นื ผิววสั ดทุ ่ีประกอบเป็นเครื่องมือ จาํ นวนซํ้าทท่ี าํ ความสะอาดในรอบปีมีผลต่อจํานวนเช้ือที่ปนเปื้อน หาก เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจลุ ชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 268

มีการปนเปื้อนมากต้องใช้เวลาในการกําจัดเชื้อท่ีนานขึ้น อุณหภูมิมีผลต่อประสิทธิภาพของการทํางานของสาร disinfectant ตัวอย่างเช่น 70% alcohol, 5% formalin, 5% phenol ammonium และ Halogens การ ป้องกันการปนเปื้อนของเครื่องมือวิธีน้ี จะยังคงมีจุลินทรีย์หลงเหลืออยู่บ้าง แต่เป็นวิธีที่เหมาะกับการทําความ สะอาดผิดด้านนอกและดา้ นในของเครื่องมือในห้องปฏบิ ัติการ ส่วนวิธี sterilization การใช้ความร้อนทั้งความร้อน แห้งและความร้อนชื้น ผ่านเคร่ืองมือท่ีเรียกว่า หม้อน่ึงความดันไอนํ้า (autoclave) ใช้ได้เฉพาะฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ สําหรับอุปกรณ์ท่ีมีขนาดไม่ใหญ่มาก เป็นการทําลายเช้ืออย่างสมบูรณ์ เคร่ืองมือที่ผู้ปฏิบัติงานใช้งานทั้งใช้งานเป็น ประจําหรือใช้งานไม่บ่อยก็ควรต้องหม่ันดูแลทําความสะอาดอยู่สมํ่าเสมอ เพ่ือลดความเส่ียงของการปนเป้ือนของ เชอ้ื จุลินทรยี ต์ ่อเครอื่ งมือและผ้ปู ฏิบตั ิงาน ตารางท่ี 6.1 การจัดกลุม่ ของเชอื้ จุลนิ ทรีย์ตามความเส่ียง กลมุ่ ลกั ษณะความเส่ียง 1 ไม่กอ่ โรคทั้งมนุษยแ์ ละสตั ว์ 2 กอ่ โรคปานกลางต่อมนุษย์ แตส่ ามารถปอ้ งกันโรคได้ ไม่แพรร่ ะบาดในชุมชน 3 ก่อโรครุนแรงตอ่ มนษุ ยแ์ ละสตั ว์ แต่สามารถปอ้ งกัน ไม่ระบาดจากคนตดิ เชอ้ื ไปสู่คนอ่นื ใน ชมุ ชน 4 ก่อโรครนุ แรงตอ่ มนุษย์และสตั ว์ และเกดิ การระบาดจากคนตดิ เชอื้ ไปสู่คนอื่นในชมุ ชน ทง้ั ทางตรงและทางออ้ ม สรปุ ท้ายบท การทํางานในหอ้ งปฏบิ ัติการที่มีการนําเชื้อจุลนิ ทรีย์มาใช้ในการศึกษาวิจัย ผปู้ ฏบิ ัติงานจาํ เป็นต้องคํานึงถึง ความปลอดภัยต่อตนเอง ต่อบุคคลอื่น รวมท้ังสภาพแวดล้อม ในบทแรกได้กล่าวถึง จุลินทรีย์ไว้ว่าเป็นสิ่งมีชีวิตที่มี ขนาดเล็กส่วนใหญ่ไม่สามารถมองเห็นได้ด้วยตาเปล่า จุลินทรีย์มีความเก่ียวข้องสัมพันธ์กันกับการดํารงชีวิตของ สิ่งมีชีวิตบนโลกใบน้ี จุลชีพมีท้ังประโยชน์และให้โทษ ก่อให้เกิดโรคในระดับตํ่าจนถึงระดับร้ายแรง ดังน้ันผู้ท่ี ปฏบิ ตั ิงานทีเ่ กยี่ วขอ้ งกับจุลินทรียต์ ้องมีความรอบคอบ ระมัดระวงั ใส่ใจและไม่มักง่าย ความปลอดภัยเปน็ ส่ิงสําคัญ สําหรับการทํางานในห้องปฏิบัติการทางจุลชีววิทยา การทํางานภายใต้ระบบความปลอดภัยที่ดีย่อมส่งผลถึง ประสิทธิภาพการทํางานของผู้ปฏิบัติงาน สุขภาพแข็งแรง สามารถทํางานได้เต็มกําลัง ลดค่าใช้จ่ายในการ รักษาพยาบาลเมื่อเกิดการบาดเจ็บหรือการติดเชื้อขณะปฏิบัติงาน ลดความเส่ียงท่ีจะเกิดการปนเปื้อนจาก หอ้ งปฏิบัติการส่สู ่ิงแวดลอ้ ม เทคนคิ และการใชเ้ ครอ่ื งมือทางจลุ ชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 269

วิธีการสอนและกิจกรรม 1. ใชว้ ิธีการสอนบรรยายผ่านสื่อการสอนที่เหมาะสม รว่ มกับการถาม-ตอบ 2. สอดแทรกและฝึกกระบวนการคดิ อยา่ งมีหลักการและเหตุผล 3. ยกตัวอย่างในเน้อื หา พรอ้ มภาพประกอบให้นักศึกษาได้เห็นภาพชัดเจน 4. มอบหมายใหน้ ักศึกษาทาํ แบบฝึกหัดท้ายหน่วยเรียน ส่อื การสอน เอกสารอา้ งอิง หมายเลข ตามบรรณานุกรมท้ายเลม่ (1 2 และ 8) เอกสารประกอบการสอน เอกสารประกอบการสอนเทคนิคและการใชเ้ ครือ่ งมือทาง จลุ ชีววทิ ยา โสตทัศนวัสดุ สอ่ื การสอนนําเสนอด้วยโปรแกรม Powerpoint ประกอบ การบรรยายสัปดาหท์ ี่ 15 Multimedia LCD projector งานท่มี อบหมาย 1. ให้ศึกษาคน้ คว้าจาก หนงั สือ หรือ งานวิจัยทางจุลชีววิทยา เพ่ิมเติม 2. ใหศ้ ึกษาค้นคว้าจาก สื่อการสอนออนไลน์ จากเว็ปไซต์ตา่ งๆ 3. ใหท้ ําแบบฝึกหัดทา้ ยหน่วยเรียน การวัดผล - วิธีการสังเกต - ใบบนั ทึกเวลาเรียน - แบบฝึกหัดทา้ ยหนว่ ยเรียน บันทึกการสอนและข้อสงั เกต - สงั เกตพฤติกรรมที่แสดงออกของนักศึกษา เชน่ การมวี นิ ัย การแตง่ กาย การตรง-ตอ่ เวลา รวมท้ังการมี ส่วนร่วมของนักศึกษาในชัน้ เรยี น - เชค็ การมาเข้าเรียนของนักศึกษาทุกครัง้ ในช่วั โมงตามตารางสอน - วัดจากการตอบคําถามแบบฝึกหดั ทา้ ยบทเรียน เม่ือจบเนือ้ หาหน่วยท่ี 6 อยา่ งถูกตอ้ งและส่งตามกาํ หนดท่ี อาจารย์ผู้สอนนดั หมาย ในระยะเวลาไม่เกิน 5 วันหลังจากเรียนหน่วยท่ี 6 เสร็จสิ้นแล้ว - วัดผลจากการทําขอ้ สอบปลายภาค เทคนิคและการใช้เครอื่ งมือทางจลุ ชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 270

ส่อื การสอนสัปดาห์ท่ี 15 เทคนคิ และการใชเ้ คร่อื งมือทางจลุ ชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 271

เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 272

แบบฝึกหัดสัปดาหท์ ่ี 15 1. การทํางานในห้องปฏิบัตกิ ารทางจุลชวี วทิ ยา ผู้ปฏิบัตงิ านต้องคํานงึ ถึงสิ่งใดบ้าง ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ 2. จงบอกแนวทางปฏิบตั ใิ นการใช้งานของห้องปฏบิ ัติการทางจุลชีววิทยาที่ดีต่อการทํางานกับเชอื้ จุลนิ ทรีย์ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ 3. ห้องปฏิบตั กิ ารควบคมุ เชอ้ื จุลนิ ทรยี ์มีกีป่ ระเภท อะไรบ้าง ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ เทคนคิ และการใช้เคร่ืองมือทางจุลชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 273

เฉลย แบบฝึกหัดสัปดาหท์ ี่ 15 1. การทํางานในหอ้ งปฏิบตั ิการทางจุลชวี วิทยา ผู้ปฏิบัติงานต้องคาํ นึงถึงส่ิงใดบา้ ง การทํางานในห้องปฏบิ ัติการท่ีมีการนําเชื้อจุลินทรีย์มาใช้ในการศึกษาวิจัย ผู้ปฏบิ ตั งิ านจําเป็นต้องคํานึงถึง ความปลอดภัยต่อตนเอง ต่อบุคคลอ่ืน รวมทั้งสภาพแวดล้อม ในบทแรกได้กล่าวถึง จุลินทรีย์ไว้ว่าเป็นส่ิงมีชีวิตที่มี ขนาดเล็กส่วนใหญ่ไม่สามารถมองเห็นได้ด้วยตาเปล่า จุลินทรีย์มีความเกี่ยวข้องสัมพันธ์กันกับการดํารงชีวิตของ สิ่งมีชีวิตบนโลกใบนี้ จุลชีพมีทั้งประโยชน์และให้โทษ ก่อให้เกิดโรคในระดับตํ่าจนถึงระดับร้ายแรง ดังน้ันผู้ท่ี ปฏิบัตงิ านทเ่ี กยี่ วข้องกบั จุลินทรีย์ต้องมีความรอบคอบ ระมดั ระวงั ใสใ่ จและไม่มักงา่ ย ความปลอดภัยเป็นส่ิงสําคัญ สําหรับการทํางานในห้องปฏิบัติการทางจุลชีววิทยา การทํางานภายใต้ระบบความปลอดภัยท่ีดีย่อมส่งผลถึง ประสิทธิภาพการทํางานของผู้ปฏิบัติงาน สุขภาพแข็งแรง สามารถทํางานได้เต็มกําลัง ลดค่าใช้จ่ายในการ รักษาพยาบาลเม่ือเกิดการบาดเจ็บหรือการติดเชื้อขณะปฏิบัติงาน ลดความเสี่ยงท่ีจะเกิดการปนเปื้อนจาก ห้องปฏบิ ัติการส่สู ง่ิ แวดล้อม 2. จงบอกแนวทางปฏิบัติในการใช้งานของหอ้ งปฏบิ ัติการทางจุลชวี วิทยาทดี่ ีตอ่ การทาํ งานกับเชอื้ จุลนิ ทรยี ์ ผู้ปฏิบัติงานท่ีต้องทํางานในห้องปฏิบัติการทางจุลชีววิทยาต้องมีแนวทางปฏิบัติ เพื่อคํานึงถึงความ ปลอดภัยของการใช้เชื้อจุลินทรีย์ต่อตนเอง ต่อผู้อื่น ต่อสภาพแวดล้อม ต่อพื้นท่ีโดยรอบข้าง และต่อชุมชน การ ทดลองกับเชื้อจุลินทรีย์ทุกชนิดควรระมัดระวังเร่ืองการปนเป้ือนต่อส่ิงแวดล้อม มีวิธีการปฏิบัติงาน 2 แบบคือ เทคนิคปลอดเชื้อ (aseptic technique) ด้วยการใช้ตะเกียงแอลกอฮอล์จุดไฟ และเข่ียเช้ือจุลินทรีย์ใกล้เปลวไฟ หรือ ปฏิบัติงานภายใต้ตู้ปลอดเช้ือ (larminar flow cabinet) เป็นการป้องกันการปนเป้ือนต่อส่ิงแวดล้อม ขณะ ปฏิบัติงานผู้ปฏิบัติงานต้องใส่เสื้อกาวน์ทุกคร้ัง รวมท้ังสวมถุงมือแพทย์ป้องกันการสัมผัสของเช้ือจุลินทรีย์โดยตรง ต่อผิวหนัง หากมีการเปรอะเปื้อนบนพื้นท่ีการทํางาน ผู้ปฏิบัติงานต้องใช้ แอลกอฮอล์ 70% เช็คทําความสะอาด บริเวณดังกล่าวและรัศมีโดยรอบ ห้องปฏิบัติการต้องอยู่เป็นสัดส่วนท่ีแน่นอน ไม่ปะปนกับการทํางานทางด้านอื่นๆ มีการจัดวางของอุปกรณ์ เครื่องมือ แยกแต่ละอย่างด้วยความเป็นระเบียบ เม่ือต้องใช้งานอุปกรณ์ เครื่องมือ ต้อง ตรวจเชค็ ความพร้อมก่อนใชง้ านทุกครั้ง ไม่ควรนาํ อาหารและเครอ่ื งดม่ื เขา้ ไปรบั ประทานในหอ้ งห้องปฏิบัติการทาง จลุ ชวี วิทยา ระหวา่ งปฏิบตั งิ าน หากต้องออกไปปฏบิ ัตงิ าน ณ ห้องอื่นๆ ตอ้ งถอดถุงมอื แพทย์และเส้ือกาวน์ วางไว้ ภายในพ้นื ที่หอ้ งปฏิบตั กิ ารกอ่ นออกไปปฏิบัติงานหอ้ งอืน่ เทคนคิ และการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 274

3. ห้องปฏิบตั กิ ารควบคมุ เช้ือจุลนิ ทรยี ์มีกีป่ ระเภท อะไรบ้าง 4 ประเภท คอื 1 ห้องปฏิบัตกิ ารความปลอดภัยทางชวี ภาพระดับ 1 (biosafety level 1; BL1) 2 หอ้ งปฏิบัติการความปลอดภัยทางชวี ภาพระดบั 2 (biosafety level 2; BL2) 3 ห้องปฏบิ ัติการความปลอดภัยทางชวี ภาพระดบั 3 (biosafety level 3; BL3) 4 ห้องปฏบิ ัติการความปลอดภัยทางชีวภาพระดบั 4 (biosafety level 4; BL4) เทคนคิ และการใช้เครือ่ งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 275

ใบเตรียมการสอน แผนการสอนสัปดาห์ที่ 16 รหัสวชิ า 403 – 25 – 16 บทเรยี นท่ี 6.2 หน่วยท่ี 6 ความปลอดภัยในห้องปฏิบัติการทางจุลชวี วิทยา เวลาเรียน 2 ชั่วโมง บทเรยี นท่ี 6.2 ระดบั ห้องปฏิบตั ิการควบคุมเช้ือจุลนิ ทรีย์ จุดประสงคก์ ารสอน 6.2 รรู้ ะดับห้องปฏิบตั ิการควบคุมเช้ือจุลนิ ทรยี ์ 2 ช่ัวโมง 6.2.1 ให้รายละเอียดหอ้ งปฏิบตั กิ ารความปลอดภยั ทางชวี ภาพระดับ 1 6.2.2 ใหร้ ายละเอียดหอ้ งปฏิบัตกิ ารความปลอดภยั ทางชีวภาพระดับ 2 6.2.3 ใหร้ ายละเอียดหอ้ งปฏิบัติการความปลอดภัยทางชวี ภาพระดับ 3 และ 4 เทคนคิ และการใชเ้ ครอื่ งมือทางจลุ ชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 276

หน่วยท่ี 6 ความปลอดภัยในหอ้ งปฏบิ ัตกิ ารทางจุลชีววิทยา (Biosafety in Microbiological laboratory) บทเรียนท่ี 6.2 ห้องปฏิบัติการควบคุมเชื้อจุลินทรีย์ บทนํา ในบทนี้จะกล่าวถึงแผนผังการวางเครื่องมือ และการทํางานทางจุลชีววิทยาในห้องปฏิบัติการต่อ ผ้ปู ฏบิ ตั งิ านจะตอ้ งวางแผนผังของเครือ่ งมือใหอ้ ยู่ในตําแหน่งทีเ่ หมาะสม ไม่เกะกะทางเดนิ สําหรับผู้ปฏบิ ัตงิ าน การ ใช้เครื่องมือในงานทางจุลชีววิทยาเช่นกัน ผู้ปฏิบัติงานจึงต้องมีความรู้และหลักปฏิบัติที่ดีขณะทํางานกับ เชอื้ จุลินทรยี ์ และใช้เคร่อื งมอื ในหอ้ งปฏิบัติการ รวมทั้งการจัดวางตาํ แหน่งเครื่องมือใหเ้ หมาะสมกบั การทํางานของ ผู้ปฏิบัติงาน โดยการจัดวางเคร่ืองมือนั้นต้องคํานึงถึงความปลอดภัยของผู้ปฏิบัติงานเป็นหลัก ถ้าผู้ปฏิบัติงานยึด หลักการทํางานท่ีเหมาะสมและระมัดระวัง ก็จะลดการปนเปื้อนของเช้ือจุลินทรีย์ท่ีอาจก่อโรคลงได้อย่างมาก ดังนั้นการใช้เคร่ืองมือท่ีถูกต้องเป็นไปตามระบบความปลอดภัยทางชีวภาพ จึงอยู่ภายใต้การควบคุมดูแลของ คณะกรรมการกลางด้านความปลอดภัยทางชีวภาพ ศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ สํานักงาน พัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ ได้มีการแบ่งระดับความปลอดภัยทางขีวภาพ (biosafety level) ไว้ 4 ระดบั การควบคมุ เช้อื จลุ นิ ทรีย์ การปฏิบัติงานกับเช้ือจุลินทรีย์ส่ิงที่ผู้ปฏิบัติงานต้องพึงระวังไว้เสมอคือ การทํางานทุกข้ันตอนจะต้องไม่มี ผลกระทบต่อผู้ปฏิบัติงาน ต่อเคร่ืองมือท่ีใช้ และออกสู่สภาพแวดล้อม เพื่อความปลอดภัยของผู้ปฏิบัติงาน ผู้ทําวิจัยและทดลอง ลดความเส่ียงของการปนเป้ือนจากเช้ือจุลินทรีย์ท่ีอาจจะหลุดลอดออกสู่ส่ิงแวดล้อม แสดงดัง ตารางท่ี 6.1 จึงจําเป็นต้องทําระบบการป้องกันอันตรายทางชีวภาพ โดยระบุข้อควรปฏิบัติในขณะปฏิบัติการ การ ป้องกันภัย และการใช้เครื่องมือที่ถูกต้องกับระบบความปลอดภัยทางชีวภาพ อยู่ภายใต้การควบคุมดูแลของ คณะกรรมการกลางด้านความปลอดภัยทางชีวภาพ ศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ สํานักงาน พัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ ได้มีการแบ่งระดับความปลอดภัยทางขีวภาพ (biosafety level) ไว้ 4 ระดบั ดังนี้ เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจลุ ชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 277

6.2.1 ความปลอดภัยทางชีวภาพระดบั 1 (Biosafety level 1; BL1) ระบบความปลอดภัยระดบั ท่ี 1 ใชค้ วบคุมการทํางานของห้องปฏบิ ัติการท่ีใช้สงิ่ มีชีวิตหรือจุลนิ ทรีย์ท่ีไม่ ก่อโรคต่อมนุษย์ สัตว์ และส่ิงแวดล้อม ต้องมีผลกระทบต่อทุกด้านน้อยท่ีสุด ส่ิงท่ีห้องปฏิบัติการควรมี ได้แก่ โต๊ะ ปฏิบัติการมาตรฐาน อ่างล้างมือ อุปกรณ์วิจัยและเทคนิคทางจุลชีววิทยาท่ัวไป การปฏิบัติงานทํางานบน โต๊ะทดลองทั่วไป ผู้ปฏิบัติงานต้องรักษาความสะอาด ต้องปฏิบัติงานตามหลักการเทคนิคทางจุลชีววิทยาที่ดี (GMT) ห้องปฏิบัติการระดับ 1 (ภาพที่ 6.2) นี้ไม่มีอุปกรณ์นิรภัยมีไว้เพื่อการเรียนการสอนและการวิจัยขั้นพื้นฐาน ท่ีเป็นงานวิจัยและทดลองกับเช้ือจุลินทรีย์ท่ีไม่ก่อโรค เช่น Bacillussubtilis,Saccharomycescerevisiae ที่ไม่ เปน็ อันตรายและไม่ต้องขออนญุ าตจากคณะกรรมการกลางด้านความปลอดภัยทางชีวภาพ ภาพที่ 6.2 ห้องปฏิบตั ิการควบคุมความปลอดภัยทางชีวภาพระดบั 1 (ทีม่ า: คณะอนกุ รรมการความปลอดภัยทางชีวภาพ, 2555) 6.2.2 ความปลอดภัยทางชีวภาพระดับ 2(Biosafety level 2; BL2) ระบบความปลอดภัยระดบั ท่ี 2 ใชค้ วบคุมการทํางานของห้องปฏบิ ัติการที่ใช้สง่ิ มีชีวิตหรือจุลินทรีย์ที่ไม่ ก่อโรคร้ายแรงต่อมนุษย์ สัตว์ และสิ่งแวดล้อม ต้องมีผลกระทบต่อทุกด้านปานกลาง แต่เชื้อจุลินทีย์จะไม่สามารถ แพร่กระจายผ่านทางละอองได้ หรือ spore ไม่ฟุ้งกระจาย สิ่งท่ีห้องปฏิบัติการควรมี ได้แก่ โต๊ะปฏิบัติการ มาตรฐาน อา่ งลา้ งมือ อปุ กรณ์วิจัยและเทคนิคทางจุลชีววิทยา การปฏิบตั ิงานทํางานบนโต๊ะทดลอง เพ่ิมเติม ต้องมี ตู้ชีวนิรภัย (larminar flow cabinet) และหม้อนึ่งฆ่าเช้ือความดันไอน้ํา (autoclave) ผู้ปฏิบัติงานต้องรักษาความ สะอาด ตอ้ งปฏบิ ตั งิ านตามหลักการเทคนิคทางจุลชีววิทยาทด่ี ี (GMT) และตอ้ งผา่ นการฝึกอบรมเปน็ พิเศษก่อนเร่ิม เทคนคิ และการใชเ้ ครอ่ื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 278

ปฏิบัติงานจริง ห้องปฏิบัติการระดับ 2 (ภาพที่ 6.3) ต้องมีการกําหนดผู้รับผิดชอบดูแลห้องปฏิบัติการ ติดป้าย Biohazard ไว้หน้าห้อง จํากัดบุคคลผ่านเข้า-ออก ผู้ปฏิบัติงานต้องฉีดวัคซีนหากต้องทํางานกับของมีคมท่ีอาจ ปนเป้ือนเช้ือจุลินทรีย์ ขณะปฏิบัติงานผู้ปฏิบัติงานต้องสวมเส้ือกาวน์ ถุงมือแพทย์ และหน้ากากป้องกันการ กระเด็นของจุลินทรีย์เข้าใบหน้า ห้องปฏิบัติการระดับนี้ใช้เพ่ือการวิจัยที่เป็นงานวิจัยและทดลองกับเชื้อจุลินทรีย์ท่ี ไม่ก่อโรค หรือก่อโรคที่ไม่เป็นอันตรายต่อผู้ปฏิบัติงาน บุคคลอื่นและสิ่งแวดล้อมต้องแจ้งและขออนุญาตจาก คณะกรรมการด้านความปลอดภัยทางชีวภาพระดับสถาบนั ภาพท่ี 6.3 ห้องปฏบิ ตั ิการควบคุมความปลอดภัยทางชีวภาพระดบั 2 (ท่ีมา: คณะอนุกรรมการความปลอดภัยทางชีวภาพ, 2555) 6.2.3 ความปลอดภัยทางชีวภาพระดับ 3 และ 4 Biosafety level 3-4; BL3-4) ระบบความปลอดภัยระดับที่ 3-4 ใช้ควบคุมการทํางานของห้องปฏิบัติการท่ีใช้สิ่งมีชีวิตหรือจุลินทรียท์ ี่ ก่อโรคร้ายแรงต่อมนุษย์ สัตว์ และส่ิงแวดล้อม และมีโอกาสแพร่กระจายผ่านทางระบบทางเดินหายใจ ซึ่งจัดว่ามี ความเสี่ยงสูง ดังน้ัน ส่ิงท่ีห้องปฏิบัติการควรมี ได้แก่ โต๊ะปฏบิ ัติการมาตรฐาน อ่างล้างมือ อุปกรณ์วิจัยและเทคนิค ทางจุลชีววิทยา การปฏิบัติงานทํางานบนโต๊ะทดลอง ตู้ชีวนิรภัย (larminar flow cabinet) และหม้อน่ึงฆ่าเช้ือ ความดันไอนํ้า (autoclave) เพ่ิมเติม ต้องมีระบบหมุนเวียนอากาศก่อนการปล่อยออกด้านนอกด้วยแผ่นกรอง HEPA filter ก่อน ต้องเปลี่ยนเสื้อผ้าก่อนเข้าปฏิบัติงาน และอาบน้ําทุกคร้ังหลังปฏิบัติงานเสร็จเรียบร้อยและจะ ออกจากห้องปฏิบัติการ ผู้ปฏิบัติงานต้องรักษาความสะอาด ต้องปฏิบัติงานตามหลักการเทคนิคทางจุลชีววิทยาที่ดี เทคนคิ และการใชเ้ ครอื่ งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 279

(GMT) และต้องผ่านการฝึกอบรมเป็นพิเศษก่อนเริ่มปฏิบัติงานจริง ห้องปฏิบัติการระดับ 3-4 (ภาพท่ี 6.4) ต้องมี การกาํ หนดผรู้ บั ผิดชอบดแู ลห้องปฏิบตั ิการ ติดปา้ ย biohazard ไวห้ น้าห้อง จํากัดบุคคลผ่านเข้า-ออก ผูป้ ฏบิ ตั งิ าน ต้องฉีดวัคซีนหากต้องทํางานกับของมีคมท่ีอาจปนเป้ือนเช้ือจุลินทรีย์ ขณะปฏิบัติงานผู้ปฏิบัติงานต้องสวมเสื้อ กาวน์ ถุงมือแพทย์ และหน้ากากป้องกันการกระเด็นของจุลินทรีย์เข้าใบหน้า ห้องปฏิบัติการระดับน้ีมีระบบการ ป้องกันความปลอดภัยและการปนเป้ือนของเชื้อจุลินทรีย์อย่างมาก เหมาะสําหรับห้องปฏิบัติการด้านคลินิก โรงพยาบาล การตรวจวินิจฉัย และการวิจัยที่เกี่ยวกับจุลินทรีย์ที่อันตราย ต้องแจ้งและขออนุญาตจาก คณะกรรมการด้านความปลอดภัยทางชีวภาพในระดับสถาบัน ส่งไปยังคณะกรรมการกลางด้านความปลอดภัยทาง ชวี ภาพ และต้องรอข้อเสนอแนะ ความเห็นชอบกอ่ นปฏบิ ตั งิ านทุกครั้ง ภาพที่ 6.4 ห้องปฏบิ ัติการควบคุมความปลอดภัยทางชีวภาพระดับ 3 และ 4 (ท่ีมา: คณะอนุกรรมการความปลอดภยั ทางชีวภาพ, 2555) เทคนคิ และการใช้เครือ่ งมือทางจลุ ชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 280

บทสรุปท้ายหน่วยที่ 6 การทํางานในห้องปฏิบัติการที่มีการนําเช้ือจุลินทรีย์มาใช้ในการศึกษาวิจัยน้ัน ผู้ปฏิบัติงานจะต้องคํานึงถึง ความปลอดภัยต่อตนเอง ต่อบุคคลอ่ืน และต่อสภาพแวดล้อมด้วยขณะปฏิบัติงาน ผู้ปฏิบัติงานต้องยึดหลักเกณฑ์ ในการหลีกเล่ียงการติดเชื้อต่อตัวผู้ปฏิบัติงานเองและต่อบุคคลอ่ืน ผู้ปฏิบัติงานต้องทํางานด้วยความระมัดระวัง รอบคอบป้องกันการปนเปื้อนของเชื้อจุลินทรีย์ไปกับเคร่ืองมือทางจุลชีววิทยาที่ใช้ขณะปฏิบัติงาน ซ่ึงจุลินทรีย์ สามารถแบ่งตามความเส่ียงต่อการติดเช้ือและก่อให้เกิดโรคตามความรุนแรง ดังน้ี กลุ่มที่ 1 เชื้อจุลินทรีย์ที่ไม่ก่อ โรคท้ังมนุษย์และสัตว์ กลุ่มท่ี 2 เช้ือจุลินทรีย์ท่ีก่อโรคปานกลางต่อมนุษย์ แต่สามารถป้องกันโรคได้ ไม่แพร่ระบาด ในชุมชนกลุ่มทื่3 เช้ือจุลินทรีย์ท่ีก่อโรครุนแรงต่อมนุษย์และสัตว์ แต่สามารถป้องกัน ไม่ระบาดจากคนติดเชื้อไปสู่ คนอื่นในชุมชนกลุ่มท่ี 4 เช้ือจุลินทรีย์ท่ีก่อโรครุนแรงต่อมนุษย์และสัตว์ และเกิดการระบาดจากคนติดเชื้อไปสู่คน อื่นในชุมชน ท้ังทางตรงและทางอ้อม ดังน้ันการป้องกันการปนเป้ือนของเช้ือจุลินทรีย์ต่อส่ิงแวดล้อม รวมทั้ง ป้องกันผู้ปฏิบัติงานเองและผู้อ่ืน จึงต้องมีการจัดการวางแผนออกแบบห้องปฏิบัติการให้เหมาะสมและถูก สุขลักษณะต่อการทํางาน เพ่ือความปลอดภัยของผู้ปฏิบัติงาน การลดความเส่ียงของการปนเปื้อนจากเช้ือจุลินทรีย์ ที่อาจจะหลุดลอดออกสู่สิ่งแวดล้อม จําเป็นต้องมีระบบการป้องกันอันตรายทางชีวภาพ โดยมีข้อปฏิบัติในขณะ ปฏิบัติการ การป้องกันภัย และการใช้เครื่องมือท่ีถูกต้องกับระบบความปลอดภัยทางชีวภาพ ดังน้ี ระบบการ ปอ้ งกนั อนั ตรายทางชีวภาพอยู่ภายใต้การควบคุมดูแลของคณะกรรมการกลางด้านความปลอดภัยทางชีวภาพ ศนู ย์ พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ สํานักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ ได้มีการแบ่ง ระดับความปลอดภัยทางขีวภาพ (biosafety level) ไว้ 4 ระดับ ได้แก่ ความปลอดภัยทางชีวภาพระดับ 1 (biosafety level 1-BL1)ระบบความปลอดภัยระดับท่ี 1 ใช้ควบคุมการทํางานของห้องปฏิบัติการท่ีใช้สิ่งมีชีวิต หรือจุลินทรีย์ที่ไม่ก่อโรคต่อมนุษย์ สัตว์ และสิ่งแวดล้อม ต้องมีผลกระทบต่อทุกด้านน้อยที่สุด มีไว้เพ่ือการเรียน การสอนและการวิจัยข้ันพ้ืนฐาน ท่ีเป็นงานวิจัยและทดลองกับเช้ือจุลินทรีย์ที่ไม่ก่อโรค เช่น Bacillussubtilisหรือ Saccharomycescerevisiae ท่ีไมเ่ ป็นอันตรายและไม่ต้องขออนุญาตจากคณะกรรมการกลางด้านความปลอดภัย ทางชีวภาพ ถัดมาความปลอดภัยทางชีวภาพระดับ 2(biosafety level 2; BL2)ระบบความปลอดภัยระดับที่ 2 ใช้ ควบคุมการทํางานของห้องปฏิบัตกิ ารทีใ่ ช้ส่ิงมีชีวิตหรือจุลินทรยี ์ที่ไม่ก่อโรคร้ายแรงต่อมนุษย์ สัตว์ และส่ิงแวดล้อม ต้องมีผลกระทบต่อทุกด้านปานกลาง แต่เชื้อจุลินทีย์จะไม่สามารถแพร่กระจายผ่านทางละอองได้ หรือ spore ไม่ ฟ้งุ กระจาย หอ้ งปฏิบตั ิการระดับนี้ใช้เพ่ือการวิจัยท่ีเป็นงานวิจัยและทดลองกับเชือ้ จุลนิ ทรีย์ท่ีไม่ก่อโรค หรอื ก่อโรค ท่ีไม่เป็นอันตรายต่อผู้ปฏิบัติงาน บุคคลอื่นและส่ิงแวดล้อมต้องแจ้งและขออนุญาตจากคณะกรรมการด้านความ ปลอดภัยทางชีวภาพระดับสถาบัน หรือ ความปลอดภัยทางชีวภาพระดับ 3 และ 4 biosafety level 3-4; BL3-4) ระบบความปลอดภัยระดับที่ 3 และ 4 ใช้ควบคุมการทํางานของห้องปฏิบัติการที่ใช้ส่ิงมีชีวิตหรือจุลินทรีย์ท่ีก่อโรค ร้ายแรงต่อมนุษย์ สัตว์ และส่ิงแวดล้อม และมีโอกาสแพร่กระจายผ่านทางระบบทางเดินหายใจ ซ่ึงจัดว่ามีความ เสี่ยงสูง เหมาะสําหรับห้องปฏิบัติการด้านคลินิก โรงพยาบาล การตรวจวินิจฉัย และการวิจัยท่ีเก่ียวกับจุลินทรีย์ท่ี เทคนคิ และการใช้เคร่ืองมือทางจุลชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 281

อันตราย ต้องแจ้งและขออนุญาตจากคณะกรรมการด้านความปลอดภัยทางชีวภาพในระดับสถาบัน ส่งไปยัง คณะกรรมการกลางดา้ นความปลอดภัยทางชวี ภาพ และต้องรอขอ้ เสนอแนะ ความเห็นชอบก่อนปฏิบตั งิ านทกุ คร้งั เทคนคิ และการใช้เครอ่ื งมือทางจุลชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 282

วธิ กี ารสอนและกิจกรรม 1. ใชว้ ิธกี ารสอนบรรยายผา่ นสื่อการสอนทีเ่ หมาะสม รว่ มกับการถาม-ตอบ 2. สอดแทรกและฝึกกระบวนการคิดอย่างมีหลักการและเหตุผล 3. ยกตัวอย่างในเน้ือหา พรอ้ มภาพประกอบให้นักศึกษาไดเ้ ห็นภาพชัดเจน 4. มอบหมายให้นักศึกษาทาํ แบบฝึกหดั ท้ายหนว่ ยเรียน 5. มอบหมายใหน้ ักศึกษาทํากจิ กรรมค้นคว้านอกเวลา โดยให้ผูเ้ รียนสวมบทบาทเป็นผู้ตรวจสอบความ เหมาะสมห้องปฏบิ ตั ิการควบคุมเช้อื จุลินทรยี ์ ของห้องปฏิบตั ิการทางจุลชีววทิ ยา ณ คณะ วทิ ยาศาสตร์และเทคโนโลยี สอื่ การสอน เอกสารอ้างอิง หมายเลข ตามบรรณานุกรมท้ายเล่ม (1 2 และ 8) เอกสารประกอบการสอน เอกสารประกอบการสอนเทคนิคและการใช้เครอื่ งมือทาง จุลชวี วิทยา โสตทัศนวสั ดุ สอ่ื การสอนนําเสนอด้วยโปรแกรม Powerpoint ประกอบ การบรรยายสัปดาห์ที่ 16 Multimedia LCD projector งานท่ีมอบหมาย 1. ให้ศึกษาคน้ คว้าจาก หนังสอื หรือ งานวิจัยทางจุลชีววทิ ยา เพ่ิมเติม 2. ใหศ้ ึกษาคน้ คว้าจาก สื่อการสอนออนไลน์ จากเว็ปไซต์ตา่ งๆ 3. ให้ทําแบบฝึกหดั ทา้ ยหนว่ ยเรียน 4. ทาํ กิจกรรมท่ี 6.1 ให้ผูเ้ รียนใชอ้ งค์ความรูท้ ่ีได้รับ ตรวจสอบความเหมาะสมหอ้ งปฏบิ ัติการควบคุม เช้ือจลุ นิ ทรีย์ ของหอ้ งปฏิบัตกิ ารทางจุลชีววิทยา ณ คณะวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี สรปุ การวาง แผนผังหอ้ งตาม zone การจัดวางอุปกรณ์ และเคร่ืองมือ พิจารณาความเหมาะสมในการจดั วาง เคร่ืองมือ ความปลอดภัยของผู้ปฏิบัติงานและผู้อ่ืน การวัดผล - วิธีการสังเกต - ใบบันทึกเวลาเรียน - แบบฝกึ หัดทา้ ยหน่วยเรียน - กิจกรรมคน้ คว้านอกเวลา เทคนคิ และการใช้เครอื่ งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 283

บนั ทกึ การสอนและข้อสงั เกต - สงั เกตพฤติกรรมที่แสดงออกของนักศึกษา เชน่ การมวี ินัย การแต่งกาย การตรง-ตอ่ เวลา รวมทง้ั การมี สว่ นรว่ มของนักศึกษาในชน้ั เรียน - เชค็ การมาเขา้ เรียนของนกั ศึกษาทุกครงั้ ในช่วั โมงตามตารางสอน - วัดจากการตอบคําถามแบบฝึกหดั ท้ายบทเรียน เม่ือจบเน้ือหาหน่วยท่ี 6 อยา่ งถูกตอ้ งและสง่ ตามกาํ หนดที่ อาจารย์ผู้สอนนัดหมาย ในระยะเวลาไม่เกิน 5 วันหลังจากเรยี นหน่วยท่ี 6 เสรจ็ สิ้นแล้ว - วัดผลจากการทําขอ้ สอบปลายภาค - วัดจากความตง้ั ใจในการทํากิจกรรมตามวัตถุประสงค์ของหน่วยท่ี 6 ต้องใชเ้ วลาทาํ ในระยะเวลาท่ีกําหนด คิดเป็น 10 เปอร์เซ็นต์ตอ่ การทํากิจกรรมในชนั้ เรยี นตอ่ ครงั้ - สังเกตจากพฤติกรรมการมสี ่วนรว่ ม ความกระตือรือรน้ ในการทํากิจกรรมของนกั ศึกษา และความถูกต้อง ของงานทมี่ อบหมาย เทคนิคและการใช้เคร่ืองมือทางจลุ ชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 284

ส่อื การสอนสัปดาห์ท่ี 16 เทคนคิ และการใชเ้ คร่อื งมือทางจลุ ชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 285

เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 286

เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 287

เทคนิคและการใชเ้ คร่อื งมือทางจุลชวี วิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 288

แบบฝึกหัดสปั ดาห์ที่ 16 1. จงระบุเขตความปลอดภัยในหอ้ งปฏิบตั ิการ มีกร่ี ะดับ อะไรบา้ งอธิบาย ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ 2. จงระบุการจดั กลุ่มของเชือ้ จุลินทรยี ์กับความเสี่ยงในการทํางานดา้ นจุลชีววิทยา ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ 3. จงอธบิ ายวิธกี ารป้องกนั การปนเปื้อนของเช้ือจุลินทรีย์กับเครอ่ื งมือท่ีใช้ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ 4. จงอธิบายหลักการหลีกเล่ียงการติดเชอ้ื ต่อตัวผู้ปฏบิ ัติงานทางจุลชวี วิทยา ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ เทคนคิ และการใช้เคร่อื งมือทางจุลชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 289

5. ห้องปฏิบัติการความปลอดภัยทางชีวภาพทเ่ี หมาะสมในสถานศึกษาควรอยู่ในระดับใด อธบิ าย ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ เทคนิคและการใช้เครอื่ งมือทางจุลชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 290

เฉลย แบบฝกึ หัดสปั ดาห์ที่ 16 1. จงระบเุ ขตความปลอดภัยในหอ้ งปฏิบัติการ มีกร่ี ะดับ อะไรบา้ งอธิบาย 3 ระดบั ได้แก่ 1. เขตปลอดภัย (safety zone) ได้แก่ ประตูทางเข้า-ออก ห้องพักผู้ปฏิบัติงาน ห้องเก็บอุปกรณ์ ต้อง สามารถเข้า-ออกไดส้ ะดวก ไมม่ สี ิง่ กดี ขวาง ไม่วางเคร่ืองมือหรอื อปุ กรณ์อนั ตราย 2. เขตอันตรายน้อย (low-hazard zone) ได้แก่ กิจกรรมเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อ ช่ังสาร เตรียมตัวอย่าง เตรียมสารเคมีทไี่ ม่ระเหย และเปน็ โซนสําหรับล้างเครอื่ งแก้วและอุปกรณ์ทดลอง 3. เขตอันตรายมาก (high-hazard zone) เป็นพ้ืนที่ที่อยู่ด้านในสุดของห้องปฏิบัติการ ผู้ไม่เก่ียวข้องห้าม ผ่านเข้า-ออก ได้แก่ การทํางานกับจุลชีพ ปฏิบัติงานในตู้ปลอดเชื้อ การเตรียมสารเคมีไวไฟและเป็นอันตราย ปฏบิ ัตงิ านในตู้ดูดไอสารเคมี ควรมีอปุ กรณป์ อ้ งกันอนั ตราย เชน่ ตชู้ วี นริ ภัย 2. จงระบกุ ารจดั กลุ่มของเชอื้ จุลินทรีย์กบั ความเส่ียงในการทํางานดา้ นจุลชวี วิทยา กลุม่ ลกั ษณะความเส่ียง 1 ไม่ก่อโรคทง้ั มนษุ ย์และสตั ว์ 2 กอ่ โรคปานกลางต่อมนุษย์ แต่สามารถปอ้ งกนั โรคได้ ไมแ่ พรร่ ะบาดในชุมชน 3 ก่อโรครุนแรงต่อมนุษย์และสัตว์ แต่สามารถป้องกัน ไม่ระบาดจากคนติดเชื้อไปสู่คนอื่นใน ชมุ ชน 4 ก่อโรครุนแรงต่อมนุษย์และสัตว์ และเกิดการระบาดจากคนติดเชื้อไปสู่คนอ่ืนในชุมชน ทั้ง ทางตรงและทางอ้อม 3. จงอธบิ ายวธิ ีการป้องกันการปนเป้ือนของเชื้อจุลนิ ทรีย์กบั เครอ่ื งมอื ท่ีใช้ การป้องกนั การปนเป้ือนและลดระดับของเช้อื จุลนิ ทรีย์ทม่ี ีโอกาสจะปนเป้ือนไปกบั เคร่ืองมือให้อยู่ในระดับ ที่ไม่ก่อโรค มีวิธีการทําความสะอาดเคร่ืองมือที่นิยมใช้กัน 2 แบบ คือ disinfection หรือ sterilization ซ่ึง วิธีการ disinfection คือการใช้สารเคมีที่มีหน้าที่เป็น disinfectant การเลือกใช้งานต้องคํานึงถึงลักษณะและพื้นผิวของ วัสดุที่ประกอบบนเคร่ืองมือ เน่ืองจากน้ํายาแต่ละชนิดมีคุณสมบัติที่แตกต่างกัน ต้องพิจารณาสิ่งต่อไปนี้ ลักษณะ พื้นผิววัสดุที่ประกอบเป็นเครื่องมือ จํานวนซ้ําที่ทําความสะอาดในรอบปีมีผลต่อจํานวนเช้ือท่ีปนเป้ือน หากมีการ ปนเปื้อนมากต้องใช้เวลาในการกําจัดเช้ือท่ีนานขึ้น อุณหภูมิมีผลต่อประสิทธิภาพของการทํางานของสาร เทคนคิ และการใช้เครอ่ื งมือทางจุลชีววิทยา | Current Techniques and Instrument Usage in Microbiology 291