Orquídeas de Cundinamarca: Conservación y aprovechamiento sostenible

Propagación tradicional de orquídeas nativas CAP. 6Epidendrum decurviflorum (fotografía Nicolás Gutiérrez).

248 - 249 Orquídeas de Cundinamarca: conservación y aprovechamiento sostenible Anexo 1. Factores y tratamiento evaluados para la propagación vegetativa de cinco espe- cies de orquídeas nativas de Cundinamarca. NA: no aplica.Ensayo Especie Factor evaluado Tratamiento Dosis Unidades experimentales Regulador de crecimiento 1.1 Agua de coco* 55ml 51 Oncidium Regulador de 1.2 Superthrive 2 ml/galón 5 luteopurpureum crecimiento Método de siembra 1.3 Blanco (testigo) NA 52 Oncidium Regulador de 2.1Superthrive 2 ml/galón 7 alexandrae crecimiento 2.2 Blanco NA 5 Reguladores de3 crecimiento de tipo 3.1 Matera NA 3 natural 3.2 Tronco de Tabebuia sp. NA 2 Método de siembra 4.1 Agua de coco* 44 Reguladores de 4.2 Superthrive 2 ml/galón 5 Oncidium crecimiento de tipo 4.3 Blanco NA 5 ornithorhynchum comercial 5.1 Agua de coco 55ml 45 Reguladores de crecimiento de tipo 5.2 Germinado de fríjol 55ml 4 natural 5.3 Germinado de lenteja 55ml 4 5.4 Maíz 55ml 4 5.5 Blanco NA 46 6.1 Matera NA 67 6.2 Tronco NA 6 Cattleya trianae8 7.1 Superthrive 2 ml/galón 3 7.2 Hormoagro 1gr/L 6 7.3 Control Raíz 1gr/L 6 7.4 Blanco NA 6 8.1 Agua de Coco* 55 ml 4 8.2 Germinado de maíz  55ml 4 8.3 Blanco NA  4

Propagación tradicional de orquídeas nativas CAP. 6Ensayo Especie Factor evaluado Tratamiento Dosis Unidades experimentales Dosis de reguladores de 9.1 Superthrive 2 ml/galón 4 crecimiento de tipo 9 9.2 Superthrive 4 ml/galón 4 Comparettia comercial macroplectron 9.3 Superthrive 6 ml/galón 4 Reguladores de 10 crecimiento de tipo 9.4 Blanco NA 4TOTAL 5 especies natural 10.1 Agua de coco* 55ml 5 10.2 Germinado de lenteja 55ml 5 10.3 Blanco NA 5 31 NA 142Blanco: testigo.*Agua de coco se utilizó en forma pura sin dilución en agua.

Propagaciónin vitro deorquídeasnativasCamilo Andrés Cárdenas-Burgosy Mónica Andrea Flórez-Pulido

Resumen Colombia es uno de los países con mayor diversidad de orquídeas en el mundo, y la mayor parte estándistribuidas en regiones altoandinas.A pesar de esta situación privile- plantas. En este capítulo, se describen giada, muchas especies se en- los procedimientos y los resultados ob- cuentran actualmente en algún tenidos durante la propagación in vitroriesgo de amenaza, debido a caracterís- de Oncidium alexandrae, Oncidium lu-ticas intrínsecas de su biología reproduc- teopurpureum, Oncidium ornithorhyn-tiva en el entorno natural, a la extracción chum y Cattleya trianae var. semi-alba,excesiva de individuos y a la destruc- especies nativas de Cundinamarca queción de su hábitat asociada a cambios además cuentan con un gran potencialen el uso del suelo. En este contexto el para su uso comercial. Los procedimien-uso de técnicas de biotecnología vege- tos descritos podrán ser replicados ental puede contribuir a la generación de otras especies de orquídeas que tam-conocimiento científico y la conservación bién son de interés para su conservaciónde especies nativas de esta familia de y uso sostenible.

252 - 253 Orquídeas de Cundinamarca: conservación y aprovechamiento sostenibleIntroducciónCultivo in vitro como estrategia de conservaciónLas técnicas de cultivo de tejidos vegetales des- getal (Paunescu 2009). En el caso de las orquí-empeñan un papel importante en los programas deas, la germinación asimbiótica (in vitro) ha sidode conservación, preservación y mejoramien- reportada como una alternativa eficiente para suto genético de las especies, principalmente de producción y se ha convertido en una herramientaaquellas que se encuentran en alguna categoría importante para la conservación y reintroducciónde amenaza (Benson 2008, Bapat et al. 2008), de especies amenazadas o en peligro de extincióncon poblaciones extremadamente pequeñas (Saavedra-Bruna y Vogel 2013).o con capacidades limitadas de reproducción(Bramwell 1990). De las cuatro estrategias com- Olmos et al. (2004) definen la propagación inplementarias para conservar la biodiversidad: vitro como la multiplicación de un genotipo a granreducción de las presiones antropogénicas, re- escala, a través del empleo de técnicas de cultivocuperación de las especies en peligro de extin- de tejidos. Los cultivos in vitro son una herramien-ción, y conservación in situ y ex situ (Singh et al. ta fundamental en los programas de propagación2006), esta última se ha convertido en un tema y mejora de especies vegetales, por su potencialde gran interés, pues genera una aplicabilidad para producir plantas de alta calidad a escala co-inmediata (Wang et al. 1993, Engelmann 2011). mercial, a partir de genotipos selectos y con am- plias tasas de multiplicación (Levitus et al. 2010). Frente a las técnicas tradicionales de propaga- El gran potencial de estos cultivos se basa en lación, la micropropagación (o propagación in vitro), totipotencialidad de las células vegetales, es de-además de proveer una reproducción ilimitada, cir, la capacidad que posee una célula para rege-no depende de los ciclos estacionales, permite un nerar plantas completas cuando son sometidas aahorro considerable de tiempo, de recursos huma- los estímulos adecuados (Cruz-Cruz et al. 2013).nos y físicos, y proporciona nuevos sistemas para Así, las células somáticas de cualquier tejido po-la evaluación y conservación de germoplasma ve- drían formar tallos, raíces o embriones somáticos

Propagación in vitro de orquídeas nativas CAP. 7El gran potencial de estos Masdevallia cf. xanthina (fotografía Francisco Nietocultivos se basa en la / Banco de imágenes Instituto Humboldt).totipotencialidad de las célulasvegetales, es decir, la capacidadque posee una célula pararegenerar plantas completascuando son sometidas a losestímulos adecuados (Cruz-Cruz et al. 2013).de acuerdo con la competencia que posean y elestímulo que reciban (Olmos et al. 2004). Para lograr una micropropagación exitosa, sedistinguen actualmente cinco etapas: 0. Prepara-ción del material vegetal; 1. Establecimiento (incluyeasepsia y germinación); 2. Multiplicación; 3. Enrai-zamiento (esta puede ser simultánea con la multipli-cación) y 4. Aclimatación y endurecimiento ex vitro.Los requerimientos para el desarrollo de cada eta-pa dependen del material vegetal y de los métodosespecíficos utilizados (Levitus et al. 2010), que serealizan bajo condiciones de esterilidad y en un me-dio sintético nutritivo, y se controlan la temperatura,luz y el fotoperiodo (Sharry et al. 2015). No obstante, propagar plantas in vitro, comocualquier otra técnica, presenta algunas limitacio-nes generales. Estas son la necesidad de contarcon la capacidad y experiencia en el desarrollode los procedimientos, las particularidades paracada especie y los requerimientos de las plántu-las durante la fase de endurecimiento, en la cualsiendo heterótrofas deben convertirse nuevamen-te en autótrofas.

254 - 255 Orquídeas de Cundinamarca: conservación y aprovechamiento sostenibleAntecedentes del cultivo in vitro de orquídeasEn Colombia, muchas de las orquídeas nativas se mer método asimbiótico práctico para la germina-encuentran amenazadas debido a su extracción ción de semillas de orquídeas, las cuales fueronexcesiva del medio natural y a la destrucción de observadas, dibujadas e ilustradas por primerasus hábitats (Ministerio de Ambiente y Desarro- vez durante el siglo XVI. La asociación entre estasllo Sostenible y Universidad Nacional de Colombia plantas y los hongos fue observada en 1824 y el2015). Asimismo, su reproducción natural presenta requisito de las micorrizas para su germinaciónalgunas limitaciones relacionadas con el lento cre- se estableció en 1899. En 1921 se formularon loscimiento y la tardanza en la floración y maduración medios nutritivos Knudson B y C, con los que lade las cápsulas, el tamaño reducido de sus semi- propagación in vitro de orquídeas aumentó y sellas (unos cuantos milímetros), el desarrollo de un generalizó en todo el mundo.embrión inmaduro sin presencia de endospermo(Arditti 2008) y la simbiosis obligada con un hon- En cuanto a las orquídeas nativas de Cundina-go micorriza. Esta relación restringe su germina- marca, el conocimiento es aun escaso, aunque so-ción, ya que este hongo la abastece con azúcares bresale el arduo trabajo que ha venido realizandoy nutrientes hasta que se desarrollen plántulas lo el Jardín Botánico de Bogotá “José Celestino Mu-suficientemente grandes para fabricar su propio tis” a través del establecimiento de un banco dealimento (Ospina y Bayman 2009). germoplasma in vitro de orquídeas colombianas, principalmente del Distrito Capital y sus alrededo- La propagación bajo condiciones in vitro, en es- res (Ministerio de Ambiente y Desarrollo Sosteni-pecies de la familia Orchidaceae, se ha llevado a ble y Universidad Nacional de Colombia 2015). Encabo desde comienzos del siglo XX. Por lo tanto, el algunos de estos trabajos se han llevado a caboconocimiento que se dispone actualmente sobre la procedimientos de propagación in vitro con An-composición nutricional de los medios de cultivo guloa clowesii, Cattleya trianae, Cyrtochilum re-que favorecen la germinación y el crecimiento de volutum, Epidendrum chioneum, Epidendrumestas especies, simplifica su replicación. No obstan- nocturnum, Epidendrum oxysepalum, Epidendrumte, la gran diversidad de especies y la capacidad de aff. portakalium, Masdevallia ignea, Lycaste fulves-hibridación de esta familia determina la pormeno- cens, Oncidium pyramidale Odontoglossum linde-rización de los procedimientos para cada especie. nii y Prosthechea fragrans, entre otras (Pérez-M. 2005, 2006, 2007a y b; Pérez-Martínez y Casta- De acuerdo con Yam y Arditti (2009), hace ñeda-Garzón 2016).aproximadamente 400 años se desarrolló el pri-De acuerdo con Yam y Arditti (2009), hace aproximadamente400 años se desarrolló el primer método asimbiótico prácticopara la germinación de semillas de orquídeas.

Propagación in vitro de orquídeas nativas CAP. 7Cómo propagar orquídeas in vitroA través de la historia se han determinado dife- te que se asocia en condiciones naturales, lo cualrentes procedimientos para automatizar la pro- se obtiene cultivando las semillas en un medio depagación de orquídeas y aumentar el número de cultivo nutritivo que contiene los azúcares y mine-plantas por explante, con el fin de disminuir los rales necesarios para que las semillas germinencostos de producción (Salgado 2013). Esto se ha y crezcan (Mckendrick 2000). Aunque es posiblelogrado con la formulación de protocolos de pro- sembrar las semillas en agua agar y una pequeñapagación in vitro y ex vitro, en los cuales se han porción de hongo micorrízico apropiado (germina-desarrollado metodologías exitosas para la pro- ción in vitro simbiótica), el cultivo sobre un medioducción de plantas que se utilicen en programas suplementado con nutrientes orgánicos e inorgá-de conservación y restauración. nicos y azúcares (germinación in vitro asimbiótica), garantiza la obtención de un mayor porcentaje de Para germinar semillas de orquídeas in vitro, germinación (Ruiz et al.2016).es necesario simular el efecto del hongo simbion-Cyrtochilum weirii, especie endémica de Colombia (fotografía Germán Torres).

256 - 257 Orquídeas de Cundinamarca: conservación y aprovechamiento sostenibleEtapa de establecimientoGeneralmente, el establecimiento in vitro de orquí- garantizar el aumento en el volumen del embrión,deas (germinación) se realiza en una cámara de la formación de masas protocórmicas, rizoidesflujo laminar, a partir de la siembra de semillas en (raíces en forma de vellosidades) y posteriormen-medios de cultivo, particularmente con las formu- te de un brote apical que dará origen a las ho-laciones propuestas por Knudson (1946), Vacin y jas verdaderas (Botero et al. 2008, Chugh et al.Went (1949), Murashige y Skoog (1962), Ichihashi 2009). Además, muchas veces las cápsulas vie-y Yamashita (1977) o Dalla-Rosa y Laneri (1977) y nen sin semillas o están contaminadas endóge-suplementados con extractos orgánicos como pul- namente por hongos, bacterias o virus, que sonpa de banano, agua de coco, jugo de piña o tomate. difíciles de eliminar (Blischak 2005).Antes de la siembra, se desinfectan las cápsulas odirectamente las semillas para retirar las impure- Antes de la siembra,zas del material vegetal, con jabón líquido seguido se desinfectande la inmersión en un agente desinfectante como las cápsulas ohipoclorito de sodio (NaOCl), bicloruro de mercurio directamente las(HgCl2), peróxido de hidrógeno (H2O2), nitrato de semillas para retirarplata (AgNO3), sulfato de cobre (Cu2SO4) o solucio- las impurezas delnes de yodo, a diferentes concentraciones y tiempos material vegetalde exposición (Ramírez et al. 2012). Un factor limitante durante esta etapa es elestado fisiológico de las semillas, ya que no to-das cuentan con la madurez óptima que puedaEtapa de multiplicaciónUna vez que se ha obtenido la germinación de ácido 3-indubutírico (AIB), ácido naftalenacé-las semillas, se realiza una transferencia de tico (ANA), bencilaminopurina (BAP), Tidiazuronlos protocormos o las masas protocórmicas a (TDZ), Kinetina (KIN), entre otros (Lo et al. 2004,un medio de cultivo renovado (Valencia y Ber- Arias et al. 2006, Mayo-Mosqueda et al. 2010).nal 2016). Este puede corresponder con el se- En esta etapa se busca la estimulación del cre-leccionado en la etapa de establecimiento in cimiento y la elongación de los protocormos, lavitro, adicionando también suplementos orgá- diferenciación de los vástagos individuales, lanicos (banano, coco, piña) y reguladores de formación de los brotes axilares y el desarrollocrecimiento como ácido 3-indolacético (AIA), del sistema radical (Arditti 2008).

Propagación in vitro de orquídeas nativas CAP. 7 Lepanthes efussa (fotografía Nicolás Gutiérrez).Etapa de aclimatación y endurecimientoEstandarizada la etapa de multiplicación, se garan- Periódicamente es necesaria la aplicación de bio-tiza la obtención masiva de plantas en crecimiento fertilizantes, biofungicidas y bioinsecticidas paraactivo y aptas para aclimatizar y endurecer bajo garantizar la sobrevivencia y el crecimiento de lascondiciones ex vitro. Para esto se utilizan diferen- plantas (Villegas et al. 2014).tes sustratos estériles en diferentes combinacio-nes y proporciones, como la fibra de coco, corteza La aclimatación es la etapa final del procesode pino, el carbón vegetal, la turba, perlita y vermi- de propagación en donde la manipulación debeculita, entre otros (Ruiz et al. 2016). La utilización ser muy cuidadosa, ya que en este punto pue-de los diferentes sustratos dependerá del hábito de manifestarse un alto porcentaje de mortandad,de cada especie, ya sea terrestre, epífita, semia- principalmente durante el proceso de trasplante.cuática o litófita. Para la siembra se debe retirar Al final de la aclimatización se verifica la eficienciael agar adherido a las raíces y disponer dos o tres del proceso y la calidad de las plantas producidasplantas en una matera, cubiertas con bandejas de in vitro (Ginderdeuren 2009). Aunque las plantasplástico trasparente; esto para que la transición de obtenidas bajo condiciones in vitro sí realizan fo-una condición heterótrofa (in vitro) a autótrofa (ex tosíntesis (en niveles reducidos), al transferirlasvitro) sea gradual y paulatina (Chugh et al. 2009). a condiciones ex vitro, el desarrollo y rendimien- to fotosintético se ven ampliamente disminuidos.La aclimatación es la etapa final del proceso de propagación endonde la manipulación debe ser muy cuidadosa, ya que en estepunto puede manifestarse un alto porcentaje de mortandad,principalmente durante el proceso de trasplante.

258 - 259 Orquídeas de Cundinamarca: conservación y aprovechamiento sostenibleMétodosSelección material vegetalEl trabajo se desarrolló en el Laboratorio de Pro- de algunos viveros de los municipios de Fusaga-pagación in vitro de la Subdirección Científica sugá y San Antonio del Tequendama, del depar-del Jardín Botánico de Bogotá “José Celesti- tamento de Cundinamarca. Una vez colectadas,no Mutis”. La colecta de cápsulas de Cattle- las cápsulas fueron llevadas a las instalacionesya trianae var. semi-alba, Oncidium alexandrae, del laboratorio, en donde se almacenaron bajoOncidium luteopurpureum y Oncidium ornithor- cuidados fitosanitarios en refrigerador a 4°Chynchum se realizó de poblaciones silvestres y hasta su uso.Establecimiento in vitroEl procedimiento para la asepsia superficial se lle- embolo y se coloca un filtro de algodón estérilvó a cabo a través de la inmersión de las cápsulas en la punta de la base. Luego se introduce unay semillas en hipoclorito de sodio (NaOCl), como pequeña cantidad de semillas y se inserta nue-agente desinfectante, en diferentes concentracio- vamente el embolo. Se absorbe y desecha con-nes y tiempos de exposición (Figura 1). Bajo una secutivamente 4 ml de agua microfiltrada estéril,cámara de flujo laminar, se lavaron las cápsulas ce- se agrega una gota de Tween 20 por 10 minu-rradas con agua microfiltrada y se les agregó una tos, NaOCl al 2% por cinco minutos y se llevangota de jabón enzimático Bonzyme por tres minutos, a cabo tres lavados con agua microfiltrada es-o Tween 20. Seguidamente se hizo una inmersión téril. Finalmente se vuelve a retirar el embolo yen hipoclorito de sodio (NaOCl) al 5%, durante 10 con ayuda de una miniespátula se dispersan lasminutos y se realizaron tres enjuagues consecuti- semillas sobre el medio de cultivo.vos con agua microfiltrada estéril. Posteriormente,en una caja Petri, se hizo un corte longitudinal para Para inducir la germinación in vitro de lasdividir en dos partes la cápsula. Inmediatamente semillas, se elaboraron diferentes medios dedespués se extendieron las semillas sobre el medio cultivo (Tabla 1). Su composición varió princi-de cultivo, con ayuda de una cuchilla. palmente en la reducción o no de las sales mi- nerales y vitaminas de Murashige y Skoog-MS Para la desinfección de las semillas, se utilizó (1962), del suplemento con vitaminas Gamborg,el método de jeringuilla propuesta por Vendrame de los extractos orgánicos (agua de coco, pulpaet al. (2007), el cual consiste en que a una jerin- de banano, jugo de piña) y de los reguladoresga de 5 ml previamente esterilizada, se le retira el de crecimiento.

Propagación in vitro de orquídeas nativas CAP. 7Figura 1. Diagrama con el procedimiento realizado para propagar, bajo condiciones in vitro, orquídeas nativasde Cundinamarca. Propagación in vitro de orquídeas Selección del material vegetal Colecta de cápsulas AsepsiaCàpsulas cerradas Cápsulas abiertasNaOCl 5% 10 min NaOCl 2% 5 min 1. Establecimiento in vitro Siembra en medioA B CDE Germinación Formación de protocomos 2 y 3. Multiplicación y enraizamiento SubcultivoA B CDE Elongación, brotes, raíces 4. Aclimatación Subcultivo Vitroplantas Siembra en sustrato Mantenimiento en invernadero Plántulas endurecidas

260 - 261 Orquídeas de Cundinamarca: conservación y aprovechamiento sostenible Tabla 1. Composición de medios de cultivo utilizados para la germinación de semillas de algunas orquídeas nativas de Cundinamarca.Medio Macro MS (%) Sacarosa Suplemento orgánico RCV de 100 50 25 Knud- Vit. Vit. 30 40 Pulpa de Jugo de Agua de AIAcultivo son MS B5 g/l g/l banano piña coco 0.5 mg/l (60 g/l) (20 ml/l) (40 ml/l)ACVG x x xx x xC1 x x x xC1V x x x xC1G x x xx xC1VG x xx xJ1 x x xx xJ1V x xx xJ1G x x x xxJ1VG x x xxJ1VG1 x x xx xMSAC x xxMSJP x xxK1 x xx xK1G x x xx xK1V xx xK1VG x x xx xMS x x xMS25 x xMS50 x xQ1 xQ1G xxQ1V xQ1VG xxTodos los medios de cultivo se suplementaron con 1,5 g/l de canela, 6 g/l de agar, 2 g/l de carbón activado (menoslos medios MS, MS25 y MS50) y con un pH de 5,8. Vit. =Vitaminas, B5= Vitaminas Gamborg, RCV=Reguladores decrecimiento vegetal, AIA: ácido indolacético.

Propagación in vitro de orquídeas nativas CAP. 7Multiplicación y enraizamientoUna vez se formaron los protocormos y se desarro- elongación, y el desarrollo de brotes axilares y delllaron en brotes con uno o dos pares de hojas verda- sistema radical (Tabla 2). En esta etapa se realiza-deras, estos fueron transferidos a medios de cultivo ron varias modificaciones en cuanto a la composi-suplementados con auxinas (ácido indolbutírico) y ción del medio de cultivo y su renovación a travéscitoquininas (bencilaminopurina), para estimular la de dos o tres subcultivos, cada uno de 30 a 45 días. Tabla 2. Composición de medios de cultivo utilizados durante la multiplicación y el enraizamiento de especies de proyecto orquídeas regalías. MEDIO Macronutrientes Pulpa de Agua de *AIB mg/l **BAP (mg/l) MS banano coco 0,5 2,0 M2-1 (60g/l) x 0,5 1,0 2,0 M2-2 100% 50% (40ml/l) x x M2-3 x x M3-1 x x x x M3-2 x x x x M3-3 x x x x J1V1-1 x x x J1V1-2 x x x x J1V1-3 x x xMSAC1-1 x x xMSAC1-2 x xMSAC1-3 x x x M2 x x M3 x x M4 x x M5 x x x L3*** x x x x x x x x x x x x x x* AIB: ácido indolbutírico.** BAP: bencilaminopurina*** Medio de cultivo suplementado con 30 g/l de banano y 15 g/l de sacarosa.Todos los medios de cultivo se suplementaron con 30 g/l de sacarosa, 1,5 g/l de canela, 6 g/l de agar, 2 g/l de carbónactivado, con un pH de 5,8.

262 - 263 Orquídeas de Cundinamarca: conservación y aprovechamiento sostenibleAclimatación de las plantasLas vitroplantas se extrajeron de los frascos de tas sembradas en bandejas con tapa de plásticovidrio y se lavó el agar adherido a las raíces con trasparente que hace un efecto tipo invernadero,agua microfiltrada. Enseguida se sumergieron en que inicialmente estuvieron cubiertas comple-una solución de yodo y agua microfiltrada al 0,1%. tamente y después de una semana se amplia-Posteriormente se sembraron en macetas de plás- ron los tiempos de exposición de dos a seis ytico con un sustrato estéril previamente humedeci- doce horas, hasta finalizar los 30 días; tiempodo, compuesto por fibra de coco, corteza de pino, en el que se descubrieron totalmente. Se reali-carbón vegetal y perlita en proporción 1:1:1:0,5. zaron saneamientos preventivos con un fungicida de contacto en concentraciones muy reducidas Para mantener las condiciones de humedad y cada dos semanas se fertilizó con Forza 0,5 g/lmuy parecidas a las obtenidas bajo condiciones y Kendal 1,0 ml/l.in vitro, se mantuvieron las macetas con las plan-Condiciones de cultivo y análisis de datosTodos los cultivos se realizaron en recipientes de con más de 0,5 cm de longitud) y 10 repeticio-vidrio de 100 ml a los que se les adicionó alícuo- nes en cada uno de los tratamientos evaluados,tas de 20 ml de medio de cultivo, con un pH de 5,7 mientras que para C. trianae var. semi-alba, fueajustado con ácido clorhídrico (HCl) e hidróxido de un frasco con cuatro explantes y cinco repeti-sodio (NaOH), y esterilizados en autoclave a 15 psi ciones. En la etapa de aclimatación se utilizarony 121°C, durante 20 minutos. Las condiciones de 30 plantas por especie. Los tratamientos usadosincubación para la etapa de establecimiento fue- en cada una de las fases para cada especie seron 27+2°C con iluminación natural de 12 horas definieron a partir de una revisión de literatura yluz y 12 de oscuridad, mientras que, para la eta- experiencias previas.pa de multiplicación y enraizamiento, se mantuvola misma temperatura con iluminación constante, Los datos registrados se procesaron en el pro-suministrada por lámparas fluorescentes. grama IBM SPSS Statistics (IBM Corp. 2013). Para hallar diferencias significativas entre los trata- Para todas las especies, la unidad experimen- mientos utilizados en la germinación se aplicó latal en la etapa de germinación correspondió a un prueba de bondad de ajuste Chi cuadrado y en lafrasco con la siembra homogénea de semillas y multiplicación y el enraizamiento, se usó la prueba10 repeticiones por tratamiento. Para la etapa de H de Kruskal-Wallis para muestras independien-multiplicación en O. alexandrae y O. luteopurpu- tes, con un nivel de confianza del 95%. Los demásreum, la unidad experimental por tratamiento fue datos (contaminación y aclimatación) se describenun frasco con cinco explantes (explante = brote como promedios o porcentajes

Propagación in vitro de orquídeas nativas CAP. 7Resultados y discusión1. Fase de establecimientoAsepsia superficial de semillasLos porcentajes de contaminación fueron inferio- semi-alba con hipoclorito de sodio (NaOCl)res a 35%, lo cual mostró que los procedimien- al 2% durante cinco minutos, se evidenció altos de asepsia superficial utilizados tanto en las obtener 86,9% de los cultivos sembrados li-semillas como en cápsulas de las especies de bres de algún microrganismo patógeno (Figu-estudio fueron efectivos. De esta forma, el hipo- ra 2). Resultados similares son reportados paraclorito de sodio (NaOCl) al 5% durante 10 minutos otras especies de orquídeas (Ávila y Salgadode exposición, empleado durante la desinfección 2006, Salazar-Mercado 2012, Aguilar-Moralesde cápsulas de O. luteopurpureum, O. alexandrae y López-Escamilla 2013) en donde, además dey O. ornithorhynchum, garantizó la obtención de ser generalizado el uso de este compuesto quí-cultivos asépticos, con 88,2%, 68,2% y 65,9% mico, se ratifica, al igual que en este estudio,de éxito, respectivamente. su efecto positivo en la etapa de estableci- miento in vitro (Roca y Mroginski 1991, Olmos Asimismo, el éxito del método de la jerin- et al. 2004).guilla utilizado en semillas de C. trianae var.Figura 2. Porcentajes de contaminación obtenidos durante el establecimiento in vitrode orquídea nativas de Cundinamarca.O. ornithorhynchumO. luteopurpureumO. alexandraeC. trianae var. semi alba 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Contaminación (%)

264 - 265 Orquídeas de Cundinamarca: conservación y aprovechamiento sostenibleLos hongos fueron los únicos agentes de conta- ción de la humedad que se genera en el interior deminación que se presentaron durante el estable- las mismas. Los hongos y las bacterias que se de-cimiento in vitro de semillas de las especies de sarrollan retrasan generalmente el crecimiento deorquídeas priorizadas: C. trianae var. semi -alba, los explantes, compiten con estos y generan modi-O. alexandrae, O. luteopurpureum y O. ornithorhy- ficaciones en el medio (Sánchez-Cueva y Salaverríanchum. Esta respuesta está determinada no solo 2004), lo que produce alteraciones perjudiciales enpor el origen del material vegetal (poblaciones sil- la sobrevivencia y el desarrollo de estos explantes.vestres) y por errores involuntarios realizados du-rante la siembra o la exposición de las semillas al La obtención de cultivos libres de contamina-ambiente previo a la desinfección, sino también ción no solo está determinada por el tipo de des-por el entorno favorable para la proliferación de infectante, sino también es importante controlarhongos y bacterias que genera la asociación direc- su concentración y tiempo de exposición (Sán-ta entre el explante, el medio de cultivo y las con- chez-Cueva y Salaverría 2004). Además, la adicióndiciones de incubación (Roca y Mroginski 1991). de unas gotas de un compuesto tensoactivo o sur- factante, como Tween 20 y Bonzyme a la solución En los cultivos realizados, los hongos crecieron esterilizante o el enjuague del tejido durante 30 se-en la superficie del medio de cultivo. Por lo tanto, gundos en alcohol antes de la esterilización, posi-es probable que fueran introducidos del ambiente bilita el rompimiento de la tensión superficial y pordurante el proceso de siembra. Sin embargo, unos ende el agente desinfectante tiene mayor contactopocos frascos se contaminaron dos o tres sema- con el explante (Bhojwani y Dantu 2013). En nuestronas posteriores al cultivo. De acuerdo con Seaton y caso, el cumplimiento de estos procedimientos me-Ramsay (2005), esto se debe a la posibilidad de in- joró la eficacia del tratamiento de asepsia, y facilitógreso de los microrganismos a través de las tapas, la viabilidad y reactivación del crecimiento y desa-que pueden llegar a degradarse por la condensa- rrollo del explante (Rache y Pacheco 2012). Cattleya trianae (fotografía Juan Camilo Ordóñez).

Propagación in vitro de orquídeas nativas CAP. 7Germinación asimbióticaCattleya trianae var. semi-albaLa primera señal de germinación para esta especie, de la testa (Figura 3c) y la posterior formación deldeterminada como el aumento en el volumen del protocormo (considerado en este estudio como ger-embrión o el cambio en su coloración blanquecina minación) se dio a los 90 días (Figura 3d). Se regis-por verde intenso (Figura 3a, 3b), se registró a los 30 traron porcentajes de germinación hasta de 100%días después de la siembra. No obstante, la ruptura en nueve de los veinte medios ensayados (Figura 4).Figura 3. Seguimiento del proceso de germinación de semillas de C. trianae var. se-mi-alba. a) semilla; b) hinchamiento del embrión; c) rompimiento de la testa; d) formacióndel protocormo. Las flechas indican la ruptura de la testa (fotografías Camilo Cárdenas). a. b. c. d.Para esta especie no se pudo establecer una re- Skoog 1962) contiene las sales inorgánicas, loslación entre la composición del medio de cultivo y carbohidratos, las vitaminas y los aminoácidosla respuesta germinativa, ya que las semillas ger- necesarios para la nutrición de una gran va-minaron con altos porcentajes tanto en el medio riedad de especies vegetales (Salazar-MercadoMS como en el Knudson, o suplementados con 2012). No son escasos los trabajos con resul-compuesto orgánico o sin este. Sin embargo, es tados similares a los obtenidos para esta es-posible determinar el efecto positivo de las modifi- pecie. Por ejemplo, Cadavid y Salazar (2008)caciones del medio MS (C1, C1V, C1G, C1VG) sobre indujeron la germinación de semillas de Ca-el desarrollo de las masas protocórmicas, ya que ttleya quadricolor en el medio MS. Lo mis-en estos medios la germinación alcanzó el 100%. mo ocurrió con C. forbesii (Schneiders et al. 2012) y C. skinneri (García et al. 2016), entre La obtención de estos óptimos resultados otros estudios.se relaciona con que el medio MS (Murashige y

266 - 267 Orquídeas de Cundinamarca: conservación y aprovechamiento sostenible Figura 4. Porcentajes de germinación registrados para cuatro especies de orquídeas nativas de Cundinamarca, después de 90 días de cultivo. Barras con letras iguales no difieren en forma significativa (P ≤ 0,05), prueba Chi cuadrado. C. trianae var. semi alba 120Germinación (%) 100 ddd dd dddd 80 60 cb 40 cb 20 b a aa aaa a a 0 ACVG C1 C1G C1V C1VG J1 J1G J1V J1VG K1 K1G K1V K1VG MSAC Q1 Q1G Q1V Q1VG MS MSJP O. alexandrae Medio 100 c 80Germinación (%) 60 b 40 20 ab aaaa aaaa aaaaaaa 0 ACVG C1 C1G C1V C1VG J1 J1G J1V J1VG K1 K1G K1V K1VG MSAC Q1 Q1G Q1V Q1VG O.luteopurpureum Medio 120Germinación (%) 100 c cccc 80 b b bb bb b 60 b 40 20 aaa a 0 ACVG C1 C1G C1V C1VG J1 J1G J1V J1VG K1 K1G K1V K1VG MSAC Q1 Q1G Q1V Medio

Propagación in vitro de orquídeas nativas CAP. 7 O. ornithorhynchum 120 100 cc c cc cGerminación (%) 80 60 b 40 b b 20 a a aaaa aaaa a 0 ACVG C1 C1G C1V C1VG J1 J1G J1V J1VG K1 K1G K1V K1VG MSAC Q1 Q1G Q1V Q1VG MS MSJP MedioOncidium alexandraeLa germinación de esta especie se obtuvo en solo 0,05) permitió determinar la existencia de diferen-cuatro de los 18 medios de cultivo ensayados; el cias significativas en los porcentajes de germina-rompimiento de la testa y la posterior formación ción, de tal forma que la respuesta germinativadel protocormo se dio después de 60 días de cul- más alta se registró en los medios J1VG y MSAC,tivo (Figura 5 a-d). La prueba Chi cuadrado (P ≤ con 95% y 65% respectivamente (Figura 4). Figura 5. Seguimiento del proceso de germinación de semillas de Oncidium alexandrae. a) semilla; b) cambio en la coloración del embrión; c) hinchamiento del embrión y rompimiento de la cubierta seminal (ver flecha); d) formación del protocormo (ver flecha). a. b. c. d.

268 - 269 Orquídeas de Cundinamarca: conservación y aprovechamiento sostenibleLa característica más importante de estos medios la respuesta de mayor predominancia fue la hi-es la presencia del extracto orgánico obtenido del dratación paralizada del embrión, que pasadosbanano (60 g/l) y agua de coco (40 ml/l), com- unos meses terminó en la oxidación de las se-ponentes de amplio uso en la germinación in vi- millas y supresión total de toda respuesta detro de semillas de varias orquídeas (Kitsaki et al. crecimiento. Este comportamiento se debe posi-2004, Nongrum et al. 2007, Muñoz 2011, Abbas et blemente al estado de madurez de las cápsulasal. 2011, Salazar-Mercado 2012, Pérez-Martínez fuente de semillas, o quizás a la incapacidad dey Castañeda-Garzón 2016). Este extracto contie- estas para absorber el agua necesaria que per-ne iones y ácidos inorgánicos, aminoácidos, vita- mite romper la testa y posteriormente formar elminas, reguladores de crecimiento, que permiten protocormo (Lauzer et al. 2007). La morfologíael adecuado desarrollo de las plántulas obtenidas de las semillas de las orquídeas y la existenciaa partir de las semillas de orquídeas (Yong et al. en algunas especies de una testa impermeable,2009, Abbas et al. 2011, Salazar-Mercado 2012). impide que algunas de estas germinen utilizan- do métodos simbióticos o asimbióticos (Arditti En aquellos medios en los que no se obser- y Ghani 2000).vó germinación (C1, J1, K1G, Q1VG, entre otros), Oncidium luteopurpureum (fotografía Juan Camilo Ordóñez).

Propagación in vitro de orquídeas nativas CAP. 7Oncidium luteopurpureumEn contraste con los resultados obtenidos en O. Los cambios morfofisiológicos de esta especie sealexandrae, los porcentajes de germinación en O. observaron a los 30 días de cultivo, con el au-luteopurpureum fueron en general altos, ya que mento del tamaño del embrión y el cambio de co-oscilaron entre 60% y 100% (Figura 4). No obs- loración de blanco hueso a verde claro (Figura 6atante, sí se encontraron diferencias significativas y 6b). Después se registró el rompimiento de laentre los medios de germinación utilizados (prue- testa (Figura 6c) y la formación del protocormo yba Chi cuadrado; P ≤ 0,05). La mayor cuantifica- los rizoides a los 45 días (Figura 6d), momento ención de estructuras tipo protocormos se dio en los el que se obtuvieron los porcentajes más altos demedios suplementados con pulpa de banano (J1, germinación. La presencia de azúcares complejosJ1V, J1G, J1VG) y agua de coco (ACVG, MSAC), lo tanto en la pulpa de banano como en el agua deque corrobora el éxito de estos extractos sobre la coco permite que se disocien con otros más sim-germinación de semillas de orquídeas del género ples, facilitando su asimilación por las semillas.Oncidium (Sardi y Guzmán 2007, Flores-Escobar Esto se expresa a través de una rápida y elevadaet al. 2008, Paredes 2012). tasa de germinación (García et al. 2016).Figura 6. Seguimiento del proceso de germinación de semillas de Oncidium luteopurpureum. a) semilla; b)hinchamiento del embrión y cambio de coloración; c) rompimiento de la testa (ver flecha); d) formación delprotocormo. La flecha superior señala protocormo y la inferior los rizoides (fotografías: Camilo Cárdenas). a. b. c. d.

270 - 271 Orquídeas de Cundinamarca: conservación y aprovechamiento sostenibleOncidium ornithorhynchumLa valoración de la germinación para O. orni- estructuras se necrosaron y aumentaron en vo-thorhynchum también contrastó estadísticamen- lumen (figuras 7d y 7e), pero no se diferenciaronte, entre los tratamientos evaluados (prueba Chi en hojas y raíces verdaderas (Figura 7f). Esta res-cuadrado; P ≤ 0,05); la inexistencia de señales de puesta puede ser explicada por la condición re-germinación en el medio Knudson (medios K y Q), calcitrante y dormante que experimentan algunospermite determinar que los medios pobres en sa- tejidos y que los incapacita para responder a lasles minerales no favorecen la germinación de se- manipulaciones durante el cultivo in vitro (Ben-millas para esta especie. En contraste, en medios son 2008). Además, evocando que el protocormode cultivo como el MS acompañado de algún ex- es una masa de células indiferenciadas (Ardit-tracto orgánico, como el jugo de piña, el agua de ti y Ernet 1993, Batty et al. 2001, Valencia-Díazcoco o la pulpa de banano, es posible obtener una et al. 2007), su potencial para originar plantastasa de germinación entre 50% y 100% (Figura 4). completas puede verse limitado por el balance hormonal adecuado de auxinas-citoquininas y la Si bien a partir de los 45 días de cultivo se influencia del genotipo sobre el comportamien-evidenciaron señales de germinación (Figura 7b), to in vitro de cada especie en particular (Roca yla formación del protocormo y sus respectivos Mroginski 1991, Olmos et al. 2004).rizoides se vio bloqueada (Figura 7c) y algunasFigura 7. Seguimiento del proceso de germinación de semillas de O. ornithorhynchum. a) semilla; b) hincha-miento del embrión; c) rompimiento de la testa; d) formación del protocormo; e) necrosamiento del protocormo;f) bloqueo del crecimiento del protocormo. La flecha roja señala estructura no diferenciada y hojas verdaderas(fotografías: Camilo Cárdenas).a. b. c.d. e. f.

Propagación in vitro de orquídeas nativas CAP. 7Cabe señalar que la variación de los resultados ob- sar de la similitud en su taxonomía y hábito de creci-tenidos para las especies de este estudio se debe miento (Vogel y Macedo 2011). Este resultado impidióa que las especies requieren balances nutricionales dar continuidad con la etapa de multiplicación, en-diferentes durante el proceso de germinación, a pe- raizamiento y aclimatación en O. ornithorhynchum. Oncidium ornithorrhynchum (fotografía Cristian Castro).

272 - 273 Orquídeas de Cundinamarca: conservación y aprovechamiento sostenible2. Fase de multiplicación y enraizamientoCattleya trianae var. semi-albaDe acuerdo con los resultados de la prueba H de O. luteopurpureum y O. alexandrae. De los proto-Kruskal-Wallis (P ≤ 0,05), la composición de los cormos fue posible individualizar pequeños brotesmedios de cultivo mostró diferencias significati- de aproximadamente 3 a 5 mm de longitud, quevas para las variables de longitud y número de pasados 60 días de cultivo en el medio M2-3, al-brotes (P ≤ 0,05), mientras que el desarrollo de canzaron en promedio 2,05 cm, y algunos de ellosraíces fue exitoso en todos los medios ensayados. hasta 3,5 cm (Tabla 3).Aunque se logró estimular el desarrollo de proto-cormos generados durante la etapa de estableci- Con el objetivo de acelerar el crecimiento demiento, el crecimiento fue menor con respecto a las plántulas, se optó por realizar varias trasfe- rencias al medio M2-3, cada 20-30 días. EstoTabla 3. Respuestas obtenidas durante la multiplicación y el enraizamiento de C.trianae var. semi-alba. Valores en una misma columna seguidos de letras iguales nodifieren en forma significativa (P ≤ 0,05. N = 5 repeticiones).Tratamiento Longitud total (cm) () Nº brotes () Enraizamiento (%) M2-1 1,71±0,66 a 0,16±0,63 a 100±0 M2-2 1,89±0,54 a 100±0 M2-3 2,05±0,26 b 0±0 a 100±0 M3-1 1,91±0,74 a 0±0 a 100±0 M3-2 1,84±0,53 a 0,49±1,37 a 100±0 M3-3 1,86±0,52 a 0±0 a 100±0 1,56±0,60 a 0,16±0,63 a 100±0 MSAC-1 1,53±0,40 a 0±0 a 100±0 MSAC-2 1,63±0,77 a 0±0 a 100±0 MSAC-3 1,68±0,63 a 0±0 a 100±0 J1VG-1 1,84±0,46 a 0,33±1,26 a 100±0 J1VG-2 1,83±0,6 a 1,79±1,45 b 100±0 J1VG-3 0,54±1,08 a

Propagación in vitro de orquídeas nativas CAP. 7permitió el aumento en el tamaño de las plantas, tema radical con cada subcultivo estaba másy se logró obtener algunas con 4 cm de longitud, vigoroso con raíces gruesas y de color verdedespués de cuatro subcultivos (Figura 8). El re- intenso. Estos resultados se deben al efecto si-novar el medio de cultivo permite activar la ab- nérgico que se da entre auxinas, citoquininas ysorción rápida de nutrientes que se encuentran componentes nutricionales, que permite el ade-el medio, lo que se traduce en un mayor creci- cuado crecimiento de las células vegetales bajomiento de los explante cultivados (Arditti 2008). condiciones in vitro (George et al. 2008). Para elAunque el aumento en el tamaño de las plantas caso de C. trianae var. semi-alba se vio favore-no fue tan significativo, se observó que el sis- cido el sistema radical. Figura 8. Crecimiento de vitroplantas de C. trianae var. semi-alba durante cuatro subcultivos en medio M2-3. Las cajas indican el valor de los cuartiles superior e inferior y la mediana para 5 repeticiones a través del tiem- po. Los círculos y asteriscos son los valores extremos que no están en el rango. 4 3Longitud (cm) 2 1 0 60 80 110 30 Días

274 - 275 Orquídeas de Cundinamarca: conservación y aprovechamiento sostenibleOncidium alexandraeLos protocormos obtenidos a través de la germi- plementados con agua de coco, específicamentenación de semillas fueron trasferidos a medios de en MSAC1 y MSAC1-1, en donde la longitud su-cultivo en los que, después de 30 días de siembra, peró 3,5 cm (Tabla 4).se diferenciaron en brotes con uno o dos pares dehojas verdaderas. De acuerdo con la prueba H de A diferencia de la longitud, el desarrollo deKruskal-Wallis (P ≤ 0,05) y pasados 90 días de brotes fue escaso en los medios de cultivo eva-siembra, se registraron diferencias significativas luados. Solo se cuantificaron aproximadamenteen las variables de crecimiento evaluadas (longitud dos brotes por explante en el medio MSJP, mien-total, número de brotes neoformados y porcentaje tras que en los demás, las plántulas desarrolla-de enraizamiento). ron un brote como máximo o simplemente este tipo de propagación vegetativa no se expresó. De esta forma, en el medio M3 se obtuvieron Esta respuesta se debió posiblemente porque loslas plantas con mayor longitud (=4,8 cm). No medios de cultivo no contaban con los balancesobstante, es posible articular estos resultados con nutricionales y hormonales adecuados, que propi-los obtenidos en los medios M3-1, J1VG y J1V1-3, ciarán el crecimiento de brotes axilares, o porquetodos suplementados con pulpa de banano o regu- las hormonas vegetales, así como promueven laladores de crecimiento como el ácido indolbutíri- expresión de un carácter de crecimiento tambiénco (AIB) y la bencilaminopurina (BAP), y en los que pueden inhibir otro (Arditti 2008).el crecimiento de los brotes también fue alto. Sinembargo, los elementos nutricionales del banano Por otra parte, el desarrollo de raíces se viono garantizan exclusivamente el mejor desarrollo influenciado por la presencia del extracto orgá-de los brotes, ya que, de manera semejante a lo nico y no por el de auxinas o citoquininas quereportado por Dalzotto (2013) en O. bifolium y en frecuentemente regulan su expresión. Los úni-este estudio con O. alexandrae, el crecimiento de cos porcentajes se registraron en ACVG, J1VGlos brotes también se ve favorecido en medios su- y MSAC, y correspondieron a 20,6%, 16,9% y 3,6%, respectivamente. Masdevallia picturata (fotografía Juan Camilo Ordóñez).

Propagación in vitro de orquídeas nativas CAP. 7Tabla 4. Respuestas obtenidas durante la multiplicación y el enraizamiento de O. alexandrae. Valores en unamisma columna seguidos de letras iguales no difieren en forma significativa (P ≤ 0,05. N = 10 repeticiones).Tratamiento Longitud total cm () Nº brotes () Enraizamiento (%) Clorosis MSJP 1,18±0,66 a 1,10±1,62 a 0±0 b - MSAC 1,22±0,77 a 0,39±0,97 a 3,6±0,46 a - ACVG 1,65±1,09 a 0,28±0,66 a 20,6±0,41 a - J1VG 3,60±1,61 bc 16,9±0,38 a + J1V1 1,94±1,04 a 0±0 b - MSAC2 3,08±0,82 b 0±0 b 0±0 b - 2,88±,75 b 0±0 b 0±0 b - M2 4,28±1,02 c 0±0 b 0±0 b +++ M3 1,77±0,98 a 0±0 b 0±0 b - J1V1-1 2,63±1,07 b 0±0 b 0±0 b - J1V1-2 3,31±1,39 bc 0±0 b 0±0 b ++ J1V1-3 2,51±0,84 ab 0±0 b 0±0 b - M2-1 1,78±1,00 a 0±0 b 0±0 b - M2-2 2,83±0,82 b 0±0 b 0±0 b - M2-3 3,69±1,01bc 0,44±0,88 a 0±0 b - MSAC1-1 2,79±1,02 b 0±0 b 0±0 b - MSAC1-2 2,67±1,14 b 0±0 b 0±0 b + MSAC1-3 3,33±1,00 bc 0,11±0,33 a 0±0 b ++ M3-1 2,99±0,91 b 0±0 b 0±0 b - M3-2 2,26±0,77 ab 0±0 b 0±0 b + M3-3 0±0 b 0±0 bInfortunadamente, pasados 45 días, se obser- zados, se adicionó en la concentración estándarvó que los brotes cultivados en los medios en del medio MS (Murashige y Skoog 1962). Por lolos que se registró la mayor longitud promedio tanto, no se puede atribuir como el promotorpresentaron una clorosis ascendente, es decir de dicha respuesta. Por el contrario, es posibleun amarillamiento de las hojas, cuyo progreso asumir que la reducción de macroelementos,podría reducir el crecimiento de estas y causar como el nitrato de amonio ((NH4)NO3) puede serla muerte de la planta (George et al. 2008). Aun- la causa de la aparición de este fenómeno, talque la causa principal del amarillamiento de las como lo reporta Fernández (2016) en las orquí-hojas es la ausencia de hierro (Fe) en el medio deas; la reducción de nitrógeno, además de clo-de cultivo (George et al. 2008), la fuente de este rosis, produce la caída de las hojas y reduce laelemento (quelato Fe-EDTA) en los medios utili- tasa de crecimiento.

276 - 277 Orquídeas de Cundinamarca: conservación y aprovechamiento sostenibleEstos resultados demandaron la selección de en todos los medios. Así, por ejemplo, aunque enaquellos medios en los que los explantes mos- J1V1-2 el incremento fue en promedio 1,15 cm,traron un crecimiento adecuado, sin señales de en el tercer mes, 75% de las plántulas cultivadasclorosis (MSAC1-3, MSAC2, J1V1-2, M2-3 y M3- superó los 7 cm de longitud. Este aumento tam-2) y el ajuste de otro, el M5. Con estos medios bién fue registrado en el medio MSAC2 (Figura 9).se evaluó el crecimiento de las plantas durante El desarrollo y fortalecimiento del sistema radicalaproximadamente tres meses a través de subcul- se vio favorecido con cada subcultivo, y al final deltivos, cada uno de 35 días. Durante el seguimiento tercer mes se observaron plantas con raíces vigo-realizado, se observó un aumento en la longitud rosas en todos los medios. Figura 9. Crecimiento de vitroplantas de O. alexandrae durante tres subcultivos en diferentes medios de crecimiento. Las cajas indican el valor de los cuartiles superior (75%) e inferior (25%) y la mediana para 10 repeticiones a través del tiempo. Los círculos son los valores extremos que no están en el rango. 30 días 65 días 100 días 12 10Longitud (cm) 8 6 4 2 0 MSAC1-3 MSAC2 J1V1-2 M5 M2-3 M3-2 Medio

Propagación in vitro de orquídeas nativas CAP. 7Oncidium luteopurpureumPara esta especie, los datos registrados durante no (30 g/l) y sacarosa (15 g/l), en comparaciónla etapa de multiplicación presentaron diferencias con los demás medios de cultivo, 60 g/l y 30 g/l,significativas entre los medios de cultivo ensaya- respectivamente. Estos resultados permiten de-dos (prueba H de Kruskal-Wallis; P ≤ 0,05). Es im- ducir que, para completar su desarrollo y formarportante mencionar que en el periodo de tiempo plántulas completas, los brotes obtenidos de laevaluado (60 días), se observó el desarrollo de bro- germinación de semillas de O. luteopurpureum,tes axilares, pero estos no fueron lo suficiente- no requieren de medios íntegros o suplementa-mente grandes para individualizarlos. Por lo tanto, dos con reguladores de crecimiento o extrac-esta variable no se tuvo en cuenta en el análisis. tos orgánicos (Billard et al. 2014). No obstante,Tanto para la variable de longitud total como el esto puede deberse también a la inducción queporcentaje de enraizamiento, se registraron algu- reciben los explantes desde la etapa de germi-nas diferencias estadísticamente significativas. Sin nación. En este estudio, esto se produjo me-embargo, el medio L3 mostró un comportamiento diante medios con dosis considerables de aguasuperior a los demás medios de cultivo, alcanza- de coco y pulpa de banano, que al ser trasferi-do brotes con un promedio de 6,1 cm y 100% de dos a un medio base reducido (L3), se compor-enraizamiento (Tabla 5). tan como el ambiente de expresión del estímulo recibido en la etapa anterior (Roca y Mroginski Una característica diferencial de este medio 1991, Olmos et al. 2004).(L3) es la cantidad reducida de pulpa de bana-Tabla 5. Respuestas obtenidas durante la multiplicación y el enraizamiento de O. luteopurpureum. Valores enuna misma columna seguidos de letras iguales no difieren en forma significativa (P ≤ 0,05).Tratamiento Longitud total (cm) () Enraizamiento (%) Clorosis MSJP 2,38±1,17 a 0±0 b - MSAC 1,98±1,26 a 0±0 b - ACVG 2,53±1,69 a 0±0 b - J1VG 2,69±1,54 a 0±0 b - J1V1 1,40±1,27 a 0±0 b + MSAC2 1,24±1,07 a 5,9±0,24 a - 1,39±1,01 a 0±0 b - M2 1,58±2,58 a 11,9±0,33 a + M3 6,10±2,10 b 100±0 a +++ L3

278 - 279 Orquídeas de Cundinamarca: conservación y aprovechamiento sostenibleAl igual que O. alexandrae, las plántulas de O. varon diferencias en la longitud entre el segun-luteopurpureum con mejor comportamiento en do y tercer subcultivo en los medios M5, J1V1-2,cuanto a sus crecimiento y desarrollo de raíces, se MSJP-1 y MSAC2 (Figura 10). En estos, el avancetornaron cloróticas (medio L3). Por lo tanto, se optó en 75% de los explantes cultivados fue de 0,74por realizar nuevos ensayos con medios de culti- cm, 0,51 cm, 0,25 cm y 0,27 cm, respectivamen-vo probados en O. alexandrae y C. trianae var. se- te. En cuanto a diferencias entre los medios, enmi-alba. Estos se evaluaron durante 110 días con M5 y MSJP-1, el aumento fue de más de 1 cm contres subcultivos. Aunque el aumento de la longitud relación a los demás medios, y el crecimiento detotal de las plántulas no fue muy alto, se obser- raíces vigorosas fue evidente. Figura 10. Crecimiento de vitroplantas de O. luteopurpureum durante tres subcultivos, en diferentes medios de crecimiento. Las cajas indican el valor de los cuartiles superior (75%) e inferior (25%) y la mediana para 10 repeticiones a través del tiempo. Los círculos son los valores extremos que no están en el rango. 30 días 65 días 100 días 6 5 4Longitud (cm) 3 2 1 0 M5 J1V1-2 MSJP-1 M2-3 MSAC1-2 MSAC2 Medio

Propagación in vitro de orquídeas nativas CAP. 7 Masdevallia peristeria (fotografía Juan Camilo Ordóñez).3. Fase de aclimatación y endurecimientoEl crecimiento (longitud de la hoja más larga) fue Durante el establecimiento de protocolos de pro-evaluado cada 15 días, y se registró un aumento pagación in vitro, la etapa de aclimatación y endu-de 1,5-2,0 cm en cada una de las especies (Fi- recimiento es una de las más críticas, ya que noguras 11 y 12). La obtención de este crecimien- muchas plantas logran alcanzar un estado de cre-to está determinada por el grado de desarrollo cimiento autotrófico (Preece y Sutter 1991), y másdel sistema radical durante la etapa de multi- aún, cuando los procedimientos se llevan a cabo enplicación y enraizamiento, ya que, si las plantas ambientes de menor humedad relativa y con sus-extraídas de los frascos cuentan con un sistema tratos sépticos (Teixeira da Silva et al. 2005). Pararadical bien definido y vigoroso, la absorción de las orquídeas nativas de Cundinamarca objeto denutrientes presentes en el sustrato estará faci- este estudio, los procedimientos realizados, comolitada. Aunque las plantas obtenidas bajo condi- la limpieza del agar adherido a las raíces con papelciones in vitro sí realizan fotosíntesis (en niveles absorbente (T1) o el lavado de la planta completareducidos), al transferirlas a condiciones ex vitro con agua corriente (T2), la inmersión en solución depara su aclimatación, el desarrollo y rendimiento yodo y agua microfiltrada, el uso de fibra de coco,fotosintéticos se ven ampliamente disminuidos. corteza de pino, carbón vegetal y perlita, previamen-Esto se debe al estrés producido por la transición te esterilizados y la exposición gradual al ambien-de condiciones in vitro, como humedad relativa te natural, permitieron cuantificar altos porcentajesalta, baja intensidad lumínica y baja concentra- de sobrevivencia. Tal es el caso para O. alexandraeción de dióxido de carbono (CO2) (Kadleček et al. con 87,9%, O luteopurpureum con 75,0% y C. tria-2001), a un ambiente en condiciones naturales nae var. semi-alba con 97,5% de plántulas viables,completamente diferentes después de 45 días de aclimatación.

280 - 281 Orquídeas de Cundinamarca: conservación y aprovechamiento sostenible Figura 11. Crecimiento de plantas de Oncidium alexandrae, Oncidium luteopurpureum y Cattleya trianae var. semi-alba durante 45 días de aclimatación y endurecimiento, en un sustrato compuesto por fibra de coco, corteza de pino, carbón vegetal y perlita (T1: limpieza del agar adherido a las raíces con papel absorbente; T2: lavado de la planta completa con agua corriente). Inicial 15 días 30 días 45 días 14 12 10Longitud (cm) 8 6 4 2 0 T2 T1 T2 T1 T2 T1 O. luteopurpureum C. trianae var. semi alba O. alexandraeLa evaluación realizada sobre el procedimiento de ten la obtención de los porcentajes más altos deaclimatación permitió identificar que la eliminación sobrevivencia de vitroplántulas de orquídeas acli-completa del agar adherido a las raíces mediante matizadas (Preece y Sutter 1991, Arciniegas 1996,la inmersión en agua corriente (T2), proporciona De Faria et al. 2006, Franco et al. 2007).una viabilidad y un crecimiento mayor de las plán-tulas obtenidas del cultivo in vitro. A esto se suma Finalmente, para garantizar el endurecimien-la selección de un sustrato con baja fecundidad to y la reactivación de orquídeas producidas in vi-(estéril), alta aireación, permeabilidad (porosidad) y tro es recomendable, tal como se llevó a cabo engrado de acidez correctos, que garantiza la activa- este estudio, mantener las plantas recién sembra-ción del crecimiento autotrófico (Díaz et al. 2010). das en una bandeja tipo invernadero. Progresiva- mente debe ser descubierta a partir de la segunda Adicionalmente, el suministro de fertilizantes, semana de siembra durante dos horas de la ma-fungicidas e insecticidas preventivos garantiza aún ñana, en la tercera toda la mañana, en la cuartamás la sobrevivencia y el crecimiento de las plan- solo las horas de día y finalmente en la quinta se-tas. De esta forma, para O. alexandrae, O luteopur- mana completamente descubierta. De esta forma,pureum y C. trianae var. semi-alba se aplicaron se disminuirán paulatinamente las condiciones depulsos de cinco segundos de manera alternada y alta humedad que requieren las orquídeas reciénrotativa, cada 15 o 20 días de agua de coco, Forza son extraídas de los frascos de cultivo (Seaton y1 mg/l, Kendal, Wuxal y Daconil 1 ml/l. Estos pro- Ramsay 2005). La ejecución puntual de estos pro-ductos y la combinación de fibra de coco, corte- cedimientos permitirá verificar la eficiencia de losza de pino y carbón vegetal, han sido reportados protocolos y la calidad de las plantas producidascomo los procedimientos apropiados, que permi- bajo condiciones in vitro.

Propagación in vitro de orquídeas nativas CAP. 7 Figura 12. Fotografías de la transición de condiciones in vitro a ex vitro de las especies de orquídeas nativas de Cundi- namarca; de arriba hacia abajo: Oncidium alexandrae, Oncidium luteopurpureum y Cattleya trianae var. semi-alba.Oncidium alexandree Fotografías Carlos Forero y Oficina de Comunicaciones-JBBOncidium luteopurpureumCattleya trianae var. semi-alba Fotografías Camilo Cárdenas

282 - 283 Orquídeas de Cundinamarca: conservación y aprovechamiento sostenibleConclusionesPara las especies trabajadas en este estudio, el diferenciación de las hojas sino también la forma-establecimiento in vitro a partir de semillas de ción y el fortalecimiento de las raíces verdaderas.cápsulas abiertas o cerradas, utilizando hipoclori- La renovación del medio (subcultivo) estimula elto de sodio como agente desinfectante, facilita la crecimiento de las plántulas y garantiza la obten-obtención de 70% a 80% de cultivos asépticos. ción de vitroplantas aptas para aclimatizar, bajoLa siembra de semillas en medios suplementa- condiciones ex vitro.dos con pulpa de banano, agua de coco y jugo depiña (J1VG, MSAC, MSJP), permiten cuantificar en- Durante la multiplicación de O. alexandraetre 65% y 95% de germinación. En estos medios, y O. luteopurpureum, se debe utilizar un medioel aumento en el volumen del embrión, el cambio de cultivo con la concentración completa de ma-en su coloración blanquecina por verde intenso, croelementos, ya que la reducción, por ejemplo,la ruptura de la testa y posterior formación del de nitrógeno, puede generar el amarillamiento deprotocormo son observados en todas las especies las hojas (clorosis) y la reducción del crecimientotrabajadas, después de 45 o 60 días de siembra. de las plantas. El lavado de la planta completa con agua corriente, la inmersión en solución de yodo y El crecimiento de los protocormos se vio faci- agua microfiltrada, el uso de fibra de coco, corte-litado por la adición tanto de extractos orgánicos, za de pino, carbón vegetal y perlita, la exposicióncomo de fitohormonas (AIB y BAP), debido princi- gradual al ambiente natural, y la fumigación y fer-palmente a la acción estimulante de las citoquini- tilización alternada rotativa, permiten aclimatizar ynas sobre la elongación y la formación de brotes endurecer las vitroplantas de orquídeas nativas deque, acompañadas con auxinas, promueven los Cundinamarca objeto de estudio, con una sobrevi-procesos de división celular, y facilitan no solo la vencia hasta de 87,9%, a los 45 días de siembra.

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Lineamientospara laconservaciónex situ e in situy el aprovechamientosostenible de las especiesde orquídeas nativas deCundinamarcaCarolina Castellanos-Castro, MarthaIsabel Vallejo y Néstor García

Resumen El contexto ambiental, social y económico de una región determina las oportunidades y limitantes para la planeación e implementación de acciones parala conservación de la biodiversidad.A partir de un diagnóstico so- buscan orientar las acciones futuras bre los aspectos biológicos, en el departamento para la conser- socioeconómicos y normati- vación y el aprovechamiento soste-vos sobre el aprovechamiento de las nible de este grupo de plantas. Estasorquídeas nativas en Cundinamarca, acciones se enmarcan en instrumen-y un diálogo con los diferentes sec- tos de planeación ya existentes, contores asociados, este capítulo pre- el fin de aportar a su cumplimientosenta una serie de lineamientos que a nivel local y regional.

292 - 293 Orquídeas de Cundinamarca: conservación y aprovechamiento sostenibleIntroducciónLas orquídeas son un grupo de plantascarismático en nuestro país, ya quecuentan con un amplio reconocimientoen la sociedad.L a riqueza y belleza de sus especies son establece la conservación de la biodiversidad de un motivo de orgullo nacional. Sin embar- manera amplia como una interacción entre siste- go, 207 especies de orquídeas nativas de mas de preservación, restauración, uso sostenibleColombia se encuentran amenazadas de extin- y construcción de conocimiento (Ministerio de Am-ción por la pérdida de su hábitat y la extracción biente y Desarrollo Sostenible et al. 2012). Esta vi-de plantas del medio silvestre para el uso orna- sión es la que hemos adoptado en este documentomental (Calderón-Sáenz 2006). Se infiere que un para enmarcar los lineamientos y las acciones ne-número mayor de especies se pueden encontrar cesarias para que las orquídeas nativas sean po-en esta situación puesto que solo contamos con sicionadas en el departamento de Cundinamarcauna evaluación del estado de conservación para como un bien de valor público.el 9% de las especies. Este contexto brinda unaoportunidad para que el interés por estas plantas, Considerando la importancia de las plantas aa nivel nacional, se traduzca en acciones concre- nivel biológico y por el sinnúmero de beneficiostas para su conservación, al igual que para otras que brinda a la humanidad, el país también cuen-especies de plantas y animales. ta con una “Estrategia nacional para la conserva- ción de plantas” (ENCP; Samper y García 2001) Para este fin, el país cuenta con un marco legal y un Plan de acción para su cumplimiento (Cas-y unos instrumentos nacionales que reglamentan tellanos et al. 2017). Este plan establece cincoy contribuyen a la gestión de la biodiversidad en objetivos y 16 metas que el país busca cumplirel país. Dentro de estos se destaca la “Política na- para el año 2035.cional para la gestión integral de la biodiversidady sus servicios ecosistemas (PNGIBSE)”, la cual

Lineamientos para la conservación ex situ e in situ CAP. 8 Elleanthus maculatus (fotografía Nicolás Gutiérrez).En el marco de la ENCP se han seleccionado algu-nos grupos de plantas debido a su alta riqueza deespecies y su importancia socioeconómica, paralos cuales se han desarrollado planes específicos.Las orquídeas conforman uno de estos grupos yen 2015, el Ministerio de Ambiente y DesarrolloSostenible y la Universidad Nacional de Colombia,publicaron el “Plan para el estudio y conservaciónde las orquídeas de Colombia”, el cual presen-ta un diagnóstico sobre el conocimiento existentesobre la diversidad de orquídeas en el país. Esteplan establece unas líneas estratégicas, junto conunas acciones y resultados asociados a cada unapara su cumplimiento en el año 2035, las cualesse desarrollaron mediante un trabajo colaborativocon representantes de diferentes sectores relacio-nados con este grupo de plantas. El cumplimiento de estos instrumentos de pla-neación requiere esfuerzos para que se concreten,a nivel local y regional, las acciones propuestas,considerando el contexto ambiental, social y nor-mativo. Como un aporte a este ejercicio, los linea-mientos que aquí se proponen para Cundinamarcaestán enmarcados en las líneas estratégicas y lasmetas del “Plan para el estudio y conservación delas orquídeas de Colombia” (en adelante Plan) yestán dirigidas al nivel biológico de especie y decomunidad, como uno de los componentes de labiodiversidad. Sin embargo, su cumplimiento ten-drá beneficios para la conservación de otros com-ponentes como los ecosistemas y los genes, y deotras especies que se encuentran directa o indi-rectamente relacionadas con las orquídeas.

294 - 295 Orquídeas de Cundinamarca: conservación y aprovechamiento sostenibleLa construcción de los lineamientos contó con la neamientos para la conservación ex situ e in situparticipación de representantes de los tres sectores y el aprovechamiento sostenible de las especiesasociados al aprovechamiento de orquídeas en Cun- de orquídeas nativas de Cundinamarca. Al eventodinamarca que se identificaron en este estudio (Fi- asistieron 65 participantes (Anexo 1): 22 de Sangura 1): el productivo, el político-institucional y el de Antonio del Tequendama, 20 de Fusagasugá, 19conservación. Para este fin, se realizó un taller el 19 de Bogotá y 4 de Guasca. Entre los asistentes sede abril de 2017 en el Parque Natural Chicaque con encontraban viveristas y representantes de 20 en-el objetivo de socializar los aportes del proyecto en el tidades, entre ellas autoridades ambientales nacio-cual se enmarca este trabajo y otras iniciativas al Plan. nales y locales, autoridades locales, organizaciones no gubernamentales (ONG) y las entidades socias En este espacio se generaron, de forma con- del proyecto.junta, insumos para la construcción de unos li-Kefersteinia tolimensis (fotografía Francisco Nieto / Banco de imágenes Instituto Humboldt).

Lineamientos para la conservación ex situ e in situ CAP. 8Figura 1. Mapa de actores asociados al aprovechamiento de orquídeas en los municipios de San Antonio delTequendama y Fusagasugá (Cundinamarca). Corporaciones autónomas regionales y de desarrollo sostenible(CAR), Secretarías de Agricultura y Medio Ambiente (SAMA), Instituto Colombiano de Agricultura (ICA), Ministeriode Ambiente y Desarrollo Sostenible (Minambiente), Secretaría Distrital de Ambiente (SDA), Asociación RedColombiana de Reservas Naturales de la Sociedad Civil (Resnatur) CONSERVACIÓNFundación Jardín Botánico Fundación Ma-Los Tunos de Bogotá “José riano Ospina Celestino Mutis“ Universidad de PRODUCTIVO Fundación Cundinamarca Zoológico Santa CruzParque temático Laboratorio Asociaciones de Comercializadores Orquídeas del Orquídeas del orquideología Tequendama Productores Trópico (comerciales y Resnatur coleccionistas)Jardín Botánico SDA CAR Uniminuto ICA Minambiente SAMA Alcaldías Gobernación POLÍTICO-INSTITUCIONAL

296 - 297 Orquídeas de Cundinamarca: conservación y aprovechamiento sostenibleLineamientosPara la conservación y el aprovechamientosostenible de orquídeas nativas de cundinamarcaLÍNEA 1. GENERAR Y AMPLIAR EL CONOCIMIENTOSOBRE LAS ORQUÍDEAS DE COLOMBIAEl conocimiento de las orquídeas en Cundina- chas áreas del país. Sin embargo, existen vacíosmarca cuenta con aportes muy importantes de conocimiento en términos de las áreas delpor figuras como el Padre Pedro Ortiz-Val- departamento que no han sido exploradas ydivieso (1995), quien visitó extensamente el también sobre diferentes aspectos de especiesdepartamento y dejó un legado entre los vi- de importancia biológica, como son las endé-veristas de San Antonio del Tequedama y mu- micas o de interés para el sector productivo.Meta 1. Ampliar el conocimiento sobre la historia natural delas orquídeas (taxonomía, morfología, biogeografía, relacionesfilogenéticas, ecología, genética, fisiología, entre otros aspectos)• Realizar estudios taxonómicos. La clasi- de las colecciones más importantes para elficación de las especies de orquídeas es un departamento, las cuales se encuentran enreto, si se considera el número elevado de es- Bogotá, y realizar estudios taxonómicos depecies y la gran variabilidad que se encuentra grupos no resueltos. Este trabajo con seguri-entre y dentro de las especies, lo que conlleva dad promoverá el descubrimiento de nuevasa que un número alto de especímenes en las especies en el departamento.colecciones botánicas no esté identificado. Es • Generar información sobre la fisiología ynecesario continuar con la labor de curaduría ecología de especies de interés comercial y