anafylatoxínov, opsonínov a chemotaktických faktorov. Jedná sa o vrodenú, nešpecifickú humorálnu zložku imunity. V zdravom neinfikovanom organizme je komplement v neaktívnej forme. Môže sa aktivovať tromi rozličnými mechanizmami; klasickou, alternatívnou a lektínovou cestou. Komplement tvorí viac ako 30 rôznych proteínov. Niektoré sa nachádzajú voľne v sére alebo na povrchu buniek ako receptory. Jednotlivé zložky tvoria približne 15 % globulínovej frakcie séra. Jednotlivé zložky sú syntetizované na rôznych miestach celého organizmu. Faktor H (FH = Factor H), C3, C6, C8 a B zložky sa tvoria v pečeni, kým C2, C3, C4, C5, B, D, P a I produkujú makrofágy. V neutrofiloch sa môžu uskladniť veľké množstvá C6 a C7. Tieto zložky sú dostupné na všetkých miestach, kde sa akumulujú makrofágy a neutrofily121. Alternatívna cesta aktivácie komplementu Alternatívna cesta aktivácie komplementu (AC = Alternative Complement pathway) sa spúšťa kontaktom zložiek komplementu s mikróbmi. Aktivuje sa okamžite po tom, ako sa invadujúci organizmus dostane do kontaktu s krvou. Táto cesta tvorí kľúčovú zložku vrodenej imunity122. Kľúčovým proteínom alternatívnej cesty je C3. Jedná sa o heterodimér, ktorý má α a β reťazce spojené disulfidovými väzbami. C3 syntetizujú pečeňové bunky a makrofágy. Zo všetkých zložiek komplementu sa v sére vyskytuje v najvyššej koncentrácii C3 zložka121. V zdravom organizme sa C3 spontánne štiepi na C3a a C3b. C3b zložka sa naviaže na povrch buniek. Táto povrchovo naviazaná C3b viaže faktor H, ktorý slúži ako kofaktor pre faktor I, ktorý sa aktivuje a tým dôjde k zničeniu C3b zložky (Obr. 4.6). V zdravom organizme faktor H a I inaktivujú C3b hneď ako sa vytvorí121. Naviazaná C3b zložka viaže ďalší komplementový kontrolný proteín – faktor B a vytvorí sa C3bB komplex123. Faktor B sa následne štiepi proteázou, ktorá sa označuje ako faktor D, čím vznikne Ba a C3bBb naviazaný na bakteriálny povrch. C3bBb sa označuje aj ako C3 konvertáza alternatívnej cesty. Faktor D môže pôsobiť na faktor B až po jeho naviazaní sa na C3b zložku. Jedná sa o substrátovú moduláciu a dochádza k nej na viacerých miestach ciest aktivácie komplementu. Jej význam spočíva v tom, aby sa zaručilo to, že enzýmy budú pôsobiť len na cieľové molekuly. C3 konvertáza môže štiepiť C3 a tým sa tvorí viac C3b124. C3b sa viaže na proteín C5, ktorý je štiepený pomocou C3bBbC3b (C5 konvertáza). Vzniká malý peptid C5a a veľký fragment C5b. Pri tomto štiepení sa odkryje miesto na C5b, na ktoré sa môžu naviazať ďalšie dva proteíny C6 a C7 a vytvoriť multimolekulárny komplex C5b67. Ten sa sám zakomponuje do bunkovej membrány mikróbov. Následne sa naviažu molekuly C8 a C9, čím sa vytvorí tubulárny komplex C5bC6C7C8C9 atakujúci membránu mikroorganizmu (MAC = Membrane Attack 101
Complex). MAC sa včlení do mikrobiálnej bunkovej membrány a vytvorí otvor, čím dôjde k osmotickej lýze a k zničeniu mikroorganizmu121. Klasická cesta aktivácie komplementu Klasická cesta komplementu (CC = Classical Complement pathway) sa spúšťa naviazaním špecifických protilátok na antigény (Ag) na povrchu cudzorodých organizmov. Táto cesta môže byť spustená, až keď sú vytvorené špecifické protilátky, čo môže trvať 7 až 10 dní po infekcii. Napriek tomu sa jedná o veľmi efektívnu cestu aktivácie komplementu121. Keď sa protilátky naviažu na antigén, zmení sa ich molekulová štruktúra a dôjde k odhaleniu aktívnych miest na ich Fc regióne. Prvou zložkou klasickej cesty je multimolekulárny proteínový komplex C1, ktorý pozostáva z troch proteínov (C1q, C1r, C1s) viazaných spolu vápnikom (Obr. 4.6). C1q sa aktivuje naviazaním na Fc koniec imunoglobulínu, čo spôsobí zmenu konformácie C1q a C1r. Zmena konformácie C1r vedie k odhaleniu aktívneho proteolytického miesta, čím sa oddelí peptid naviazaný na C1s a tým sa konvertuje molekula na enzymaticky aktívnu formu. Na aktiváciu C1 je potrebné naviazanie protilátok IgM alebo IgG121. Aktivovaná C1s štiepi C4 zložku na C4a a C4b. Ďalšia zložka komplementu C2 sa viaže s C4b a vytvára C4b2. Aktivovaná C1s potom rozštiepi naviazanú C2 na malú C2a a C4b2b. C2 sa musí najprv naviazať na C4b a až potom môže byť štiepená pomocou C1s. Komplex C4b2b slúži ako proteáza, ktorá štiepi C3 zložku komplementu a vznikne C3a a C3b. Vzniknutá C3b sa viaže na C5, ktorý je štiepený pomocou C4bC2aC3b (C5 konvertáza). Vzniká malý peptid C5a a veľký fragment C5b (Obr. 4.6). Nasledujúce reakcie sú rovnaké ako pri AC a vedú k vytvoreniu MAC a zničeniu mikroorganizmu121. Lektínová cesta (LC = Lectin Complement pathway) aktivácie komplementu Tretí spôsob aktivácie komplementového systému zahŕňa rozpoznanie mikrobiálnych karbohydrátov sérovými proteínmi. Sérový proteín lektín viažuci manózu (MBL = Mannose- Binding Lectin) sa vie naviazať na manózu alebo N-acetylglukozamín na mikrobiálnom povrchu. MBL sa vie naviazať na povrch baktérií, húb, vírusov a parazitických protozoí. Po naviazaní sa na mikrobiálny povrch dochádza k aktivácii serínovej proteázy MASP-2 (Mannose-binding protein-Associated Serine Protease 2; MBL asociovaná serínová proteáza). Väzba MBL s cukrovými skupinami na mikrobiálnom povrchu má za následok zmeny konformácie a ich výsledkom je aktivácia MASP-2121. Aktivovaná MASP-2 pôsobí na proteín C4, ktorý štiepi na C4a a C4b zložku, ktorá je viazaná na mikrobiálny povrch126 (Obr. 4.6). 102
Obr. 4.6 Cesty aktivácie komplementu (Davles a kol. 2017; upravené)125 C2 je glykoproteín, ktorý sa viaže s C4b, čím vznikne komplex C4b2. C2 je následne štiepený MASP-2 za vzniku C4b2b komplexu, ktorý je C3 konvertázou. Povrchovo viazaný C4b2b (pôsobí na α-reťazec C3 a vzniká C3a a C3b. Aktivácia C3 prostredníctvom C4b2b je hlavným krokom tejto cesty, pretože každý komplex C4b2b môže aktivovať viac ako 200 C3 molekúl, ktoré sú potom ireverzibilne spojené s povrchom. Vzniknutá C3b sa viaže na C5, ktorý je štiepený pomocou C4bC2aC3b (C5 konvertáza) na C5a a C5b. Komplementová cesta pokračuje vznikom MAC a zničením mikroorganizmu ako už bolo uvedené vyššie121. Regulácia komplementu Aktivácia jednotlivých ciest komplementu musí byť regulovaná. Túto kontrolu zabezpečujú komplementové regulačné proteíny (CRPs = Complement Rregulatory Proteins) (Obr. 4.7). 103
Najdôležitejším regulátorom klasickej cesty je C1 inhibítor (C1-inh). C1-inh kontroluje tvorbu C4b2b blokovaním aktivity aktívnych zložiek C1r a C1s127. Ďalšie regulačné proteíny kontrolujú aktivitu C3 a C5 konvertáz. Napríklad CD55 (označovaný tiež ako DAF = Decay Accelerating Factor) je glykoproteín, ktorý je exprimovaný na povrchu erytrocytov, neutrofilov, lymfocytov, monocytov, trombocytov a endotelových buniek. CD55 sa viaže na konvertázy a akceleruje ich rozklad. Jeho úlohou je chrániť vlastné bunky organizmu pred komplementovým atakom128. Ďalšími proteínmi, ktoré podporujú degradáciu konvertáz vrátane faktora H a C4-viažuceho proteínu (C4BP = C4 Binding Protein) sú CD35 (CR1 = Complement receptor type 1) a CD46 (MCP = Membrane Cofactor Protein) prítomné na bunkových membránach129. Kontrolu C5bC6C7C8C9 komplexu zabezpečujú glykoproteíny – vitronektín, klusterín a najdôležitejším je CD59 (protektín). Tieto proteíny bránia vsunutiu C5bC6C7C8C9 do bunkovej membrány a polymerizácii C9 v membráne buniek128. Regulačné proteíny sú prítomné v rozličných koncentráciách v rôznych častiach tela. Delia sa na solubilné a membránové (Obr. 4.7). Obr. 4.7 Regulačné proteíny komplementu (Merle a kol. 2015; upravené)130 V sére sú solubilné regulačné faktory vo vysokej koncentrácii131. Takisto boli nájdené, hoci v menšom zastúpení, v CNS v temporálnom kortexe a v plexus choroideus132. Membránový proteín protektín označovaný aj CD59, bol nájdený tiež v salivárnom systéme, bronchoch, epiteli ductus pancreaticus, ductus choledochus a ductus renalis133. Vo všeobecnosti sa pod vplyvom zápalu zvyšuje koncentrácia komplementových proteínov a takisto aj regulačných faktorov. Pri poraneniach sa proteíny komplementových kaskád dostávajú z porušených ciev krvou do rany a vytvárajú ochranu pred patogénmi. Takisto aj pri exsudatívnom seróznom 104
zápale sa komplementové zložky dostávajú zo séra prestupom na povrch slizníc a zabezpečujú ochrannú funkciu proti patogénom. Pri prestupe prechádzajú na povrch slizníc aj regulačné faktory, ktoré chránia vlastné bunky organizmu pred deštrukciou komplementom. Na druhej strane, patogén rezistentný voči komplementu je schopný využívať funkciu CRPs tým, že ich viaže na svoj povrch, alebo exprimuje proteíny s funkčnými vlastnosťami CRPs a tým inhibuje komplementové kaskády, vďaka čomu uniká pred komplementom sprostredkovanou lýzou. Pre lepšie pochopenie, ako tento inhibičný proces prebieha, je nutné oboznámiť sa z charakteristikami CRPs, ich rozdelením, označením, štruktúrou, vlastnosťami a najmä inhibičným mechanizmom, ktorý spôsobuje pozastavenie alebo zablokovanie tvorby membránu atakujúceho komplexu. Solubilné CRPs: faktor H (FH), faktor I (FI = Factor I), C1 inhibítor (C1-inh), proteín viažuci C4 (C4BP), vitronektín. FH: Faktor H je jedným z najdôležitejších kontrolných proteínov. Väčšina patogénov primárne využíva FH na blokovanie aktivácie komplementového systému, a preto je tento proteín podrobne opísaný v ďalšej časti tejto kapitoly. C1-inh: Je solubilný inhibítor serínových proteáz regulujúci aktiváciu komplementu cez disociáciu C1r2s2 komplexu od C1q molekuly. C1-inh kontroluje aj aktiváciu koagulácie134. Deficiencia C1-inh sa prejavuje náhodnými opuchmi, bolesťou brucha a epizódami obštrukcií horných dýchacích ciest. Takáto skupina symptómov sa nazýva hereditárny angioedém135. C4BP: Je taktiež glykoproteín s molekulovou hmotnosťou 500 kDa136. C4BP je prepojený disulfidickými mostíkmi a má multidoménovú architektúru. Skladá sa zo 7 podjednotiek α- reťazcov s molekulovou hmotnosťou 70 kDa, každá má 8 SCR (Short Consensus Repeats) domén. Ďalšou súčasťou C4BP je podjednotka nazývaná -reťazec, s veľkosťou 45 kDa obsahujúca tri SCR domény. Je hlavným regulátorom klasickej cesty aktivácie komplementu, ale má kapacitu regulovať aj alternatívnu cestu137. C4BP blokuje pripojenie C2 na C4b proteín a môže znižovať usadzovanie C3b a C4b na bakteriálnom povrchu138. C4BP-C3b komplex je unikátny, pretože C4BP sprostredkuje štiepenie C3b na inaktívnu formu iC3b za pomoci FI139. Vitronektín: Ako jeden z ďalších solubilných CRPs je multifunkčný adhezívny proteín nachádzajúci sa v plazme a zohráva významnú úlohu v bunkových adhéziách, migrácii, hemostáze a imunitnej odpovedi140. V cirkulácii sa nachádza vo voľnej forme alebo viazaný spolu s C4BP, tiež má aj významnú úlohu pri koagulácii. Vitronektín viaže C5b67 komplex a inhibuje inzerciu C8 komplementového komponentu125. 105
FI: Je solubilná proteáza regulujúca aktiváciu komplementu prostredníctvom štiepenia C3b a C4b141. Ma reštrikčnú špecificitu pre C3b a C4b. Za pomoci C4BP napomáha inaktivovať C4b fragment. Membránové CRPs: CR1 (CD35), CR2 (CD21), CR3 (CD11a/CD18), CR4 (CD11c/CD18), CD46, CD55, CD59 CD35 alebo tiež aj komplementový receptor CR1: Je trans-membránový regulačný glykoproteín regulujúci klasickú, ako aj alternatívnu cestu142. CD35 viaže C3b, C4b a iC3b (inaktivovaná C3b). CR1 receptory sa nachádzajú na erytrocytoch, neutrofiloch, eozinofiloch, monocytoch a makrofágoch, B bunkách a niektorých T bunkách. Erytrocyty obsahujú 90 % zo všetkých CR1 receptorov prítomných v krvi. Erytrocyty odstraňujú solubilné imunitné komplexy z cirkulácie, vďaka ich väzbe na CR1. Erytrocyty transportujú tieto komplexy do pečene a sleziny, kde sú z nich odstránené rezidentnými makrofágmi. Pri deficienciách komplementových zložiek alebo ich receptorov sa môžu cirkulujúce imunokomplexy ukladať v orgánoch ako sú obličky a spôsobovať ich poškodenie (hypersenzitívna reakcia typu III). Napríklad pacienti s autoimunitným ochorením – systémový lupus erythematosus, majú deficienciu CR1, a preto nie sú schopní efektívne odstrániť tieto komplexy. Takisto boli popísané obličkové lézie u psov, ktoré vznikli z rovnakého dôvodu. CR2: Sú prítomné na B-lymfocytoch. Viažu odštiepený fragment C3d. CR2 tvorí komplex s CD19, ktorý pôsobí ako stimulátor B-lymfocytoh. B-bunky využívajú C3d stimuláciu cez CR2 na to, aby sa zabezpečila ich optimálna odpoveď na antigény. CR3: Je integrín, ktorý viaže iC3b. Tento receptor sa nachádza na makrofágoch, neutrofiloch a NK bunkách. Genetická deficiencia CR3 (LAD = Leukocyte Adherence Deficiency) bola popísaná u ľudí, hovädzieho dobytka a psov a v jej dôsledku dochádza k vzniku opakujúcich sa infekcií. CR4: Je ďalším integrínom prítomným na neutrofiloch, T-lymfocytoch, NK bunkách, trombocytoch a makrofágoch. Je zodpovedný za väzbu rozštiepených fragmentov C3121. CD46: Tiež nazývaný aj ako Membrane Cofactor Protein (MCP), je exprimovaný na všetkých cirkulujúcich bunkách vrátane trombocytov, granulocytov, na T-bunkách, B-bunkách, NK bunkách a monocytoch, ale nie je na povrchu ľudských erytrocytov143. Jeho komplement inhibičná aktivita je podobná s CD35125. CD55: Nazývaný tiež ako rozklad urýchľujúci fakror (DAF = Decay-Accelerating Factor), je glykofosfatidylinozitol –ukotvený 70 kDa membránový glykoproteín regulujúci aktivitu C3 a C5 konvertáz144. Expresia CD55 na neurónoch a jej zvyšovanie počas zápalu môže zohrávať 106
kľúčovú úlohu pri ochrane pred komplementovým systémom145. Množstvo patogénov mimikuje expresiu CD55146. CD59 alebo aj homológny reštrikčný faktor (HRF = Homologous Restriction Factor), poprípade protektín: Je membránový glykoproteín, pôsobiaci najmä v terminálnej fáze proti vytváraniu MAC147. CD59 obmedzujú inkorporáciu C9 do membránového C5b-8 komplexu125. Obr. 4.8 Bakteriálne únikové stratégie pred komplementovým systémom (Hoving a kol. 2016; upravené)149. Bakteriálne únikové stratégie pred komplementovým systémom sa delia do piatich rôznych skupín. (A) Expresia proteínov, ktoré napodobňujú hostiteľské štruktúry, ako je proteín podobný CD59 B. burgdorferi inhibujúci tvorbu MAC. (B) Sekrécia bakteriálnych proteáz ako PaE a PaAP exprimovaných P. aeruginosa, ktoré štiepia C3. SpeB S. pyogenes štiepi C3, properdín a IgG. (C) Inhibícia TLR2 F. tularensis. Táto baktéria využíva svoju opsonizáciu zabezpečovanú C3b na obsadenie CR3 receptorov na povrchu makrofágov, aby sa uľahčil jej vstup do tela hostiteľa a vyvolali „inside-out“ ako aj „outside-in“ signalizačné dráhy CR3, čo vedie k zníženiu aktivity TLR2. (D) Sekrécia malých bakteriálnych proteínov inhibujúcich komplementový systém, ako je uvedené u S. aureus. Tento patogén vylučuje proteíny Ecb (Extracellular complement binding protein) a Efb (Extracellular fibrinogen binding protein), ktoré sa viažu na C3b, a tým inhibujú tvorbu C5 konvertázy, ako aj inhibujú tvorbu C3 konvertázy stabilizáciou väzby fB na C3b, čím bránia štiepeniu fB do Bb. Navyše vylučuju SSL7 (Staphylococcal Superantigen-Like protein 7), ktorý viaže C5 a IgA, čím inhibuje tvorbu C5a a tým následnú infiltráciu neutrofilmi. (E) Väzba regulačných proteínov komplementového systému tekutej fázy C1-inh, C4BP, FH a Vn na bakteriálnu membránu. 107
4.2.2.2 Bakteriálne únikové stratégie pred komplementovým systémom Mikroorganizmy si vyvinuli niekoľko mechanizmov zasahovania do komplementového systému, aby dokázali prežiť v hostiteľovi. Prvým opísaným mechanizmom je napodobňovanie komplementových regulačných proteínov (Obr. 4.8 A). Jediná známa baktéria využívajúca tento mechanizmus je Borrelia burgdorferi. Borrelia exprimuje na svojej membráne 80 kDa proteín „podobný CD59“ (CD59-like proteín), ktorý sa viaže do komplexu s C8b a C9 a inhibuje tvorbu membrány atakujúceho komplexu – MAC148. Napriek tomu, že CD59-like proteín B. burgdorferi je jediným príkladom mimikry regulátora komplementového systému baktériami, medzi vírusmi je tento mechanizmus rozšírený150. Druhým mechanizmom, ktorý využívajú baktérie na únik pred komplementovým systémom, je expresia proteáz schopných štiepiť zložky komplementu (Obr. 4.8 B). Pseudomonas aeruginosa, ktorý spôsobuje infekcie najmä u pacientov trpiacich cystickou fibrózou, vylučuje dve proteázy, elastázu (PaE) a alkalickú proteázu (PaAP), ktoré degradujú C1q a C3, čím zabraňujú aktivácii komplementu na bakteriálnom povrchu130. Ďalším patogénom, o ktorom je známe, že štiepi zložky komplementu pomocou proteáz, je Streptococcus pyogenes. S. pyogenes exprimuje pyrogénny exotoxín B (SpeB), čo je endoproteáza schopná štiepiť široké spektrum proteínov vrátane C3, imunoglobulínov (Ig) a properdínu151. SpeB štiepi IgG v pántovej oblasti, čo vedie k vzniku dvoch Fab a jedného Fc fragmentu, vďaka čomu blokuje fagocytózu sprostredkovanú IgG. Štiepenie properdínu, ako pozitívneho regulátora aktivácie komplementového systému, a C3 pomocou SpeB zasahuje do tvorby C3 konvertáz a zabraňuje opsonizácii baktérií151. Expresia proteáz štiepiacich proteíny komplementového systému nie je obmedzená iba na P. aeruginosa a S. pyogenes, je to veľmi rozšírený mechanizmus. Ďalším patogénom, ktorý exprimuje proteázy schopné štiepiť proteíny komplementu, je Porphyromonas gingivalis. Namiesto degradácie komponentov komplementu jej proteázy nazývané „gingipainy“ štiepia C5 na C5a a C5b podobne ako hostiteľská C5 konvertáza152. Štúdie uvádzajú, že tento patogén využíva zvýšenú produkciu C5a na stimuláciu C5a receptora a TLR2 (tzv. „cross-talk“) na povrchu makrofágov, výsledkom čoho je zoslabenie TLR2 odpovede a potlačenie imunity153. Inhibícia signálnej transdukcie prostredníctvom TLR2 v dôsledku manipulácie s komplementovým systémom bola tiež dokázaná u zoonotického patogénu Francisella tularensis . Táto baktéria využíva svoju opsonizáciu zabezpečovanú C3 zložkou na obsadenie CR3 receptora na povrchu makrofágov, na uľahčenie jej vstupu do týchto buniek ako aj na vyvolanie „inside-out“ a „outside-in“ signalizačných dráh tohto receptora, čo vedie k zníženiu aktivity TLR2 (Obr. 4.8 C). 108
Okrem štiepenia zložiek komplementu môžu baktérie tiež exprimovať malé únikové molekuly, ktoré inhibujú komplementový systém (Obr. 4.8 D). Niekoľko z týchto molekúl sa špecificky zameriava na centrálnu molekulu C3. S. aureus je majstrom sekrécie malých únikových molekúl a exprimuje extracelulárny fibrinogén viažuci proteín (Efb) a extracelulárny komplement viažuci proteín (Ecb), ktoré sa oba viažu na C3d doménu C3b, čím inhibujú C3b obsahujúce konvertázy154. Okrem toho, Ecb dokáže tvoriť tripartitný komplex s FH a C3b na povrchu S. aureus (podrobnejšie opísané nižšie). Inhibícia konvertáz pomocou Efb a Ecb spôsobuje utlmenie C3b sprostredkovanej opsonizácie bakteriálneho povrchu, ako aj zníženú tvorbu C5a. C3b a C5a sú chemoatraktnty neutrofilov, a preto nasleduje migrácia neutrofilov do miesta prepuknutia infekcie154. Ďalšie malé molekuly vylučované S. aureus so zameraním na C3 sú stafylokokový inhibítor komplementu (SCIN = Staphylococcal Complement Inhibitor) a povrchový proteín viažuci imunoglobulíny (Sbi = Staphylococcal binder of immunoglobulin)155,156. Okrem toho, S. aureus tiež exprimuje molekuly ako stafylokokový proteín podobný superantigénu 7 (SSL7), ktorý viaže C5, a preto bráni tvorbe C5a a následne znižuje migráciu neutrofilov do miesta infekcie157. Tento proteín sa navyše viaže aj na IgA. Štúdie uvádzajú, že SSL7 viaže C5 spolu s IgA, čo predstavuje účinnú inhibíciu tvorby C5a, ktorá si vyžaduje vyviazanie C5 a zároveň aj IgA158. Napokon sú mikroorganizmy schopné viazať na svojom povrchu aj solubilné regulátory komplementu, aby obmedzili jeho aktiváciu na svojej membráne (Obr. 4.8 E). Nižšie sú popísané bakteriálne proteíny, ktoré sa viažu na regulačné proteíny komplementu. 4.2.2.2.1 Cielené zneškodnenie komplementu v klasickej (CC) a lektínovej ceste (LC): naviazanie C1-inh C1-inh inhibuje C1r, C1s, MASP1 a MASP-2, čím bráni aktivácii komplementu prostredníctvom CC a LC159. Výsledkom vyviazania C1-inh na bakteriálnu membránu je znížená aktivácia komplementu. E. coli O157:H7 má 92 kb plazmid pO157 kódujúci viaceré predpokladané faktory virulencie. Jedným z týchto faktorov je StcE proteáza C1 inhibítora. StcE štiepi C1-inh na NH2-konci a uvoľňuje serpín/serín proteázový komplex160. Bordetella pertussis je ďalšou baktériou, u ktorej sa preukázalo, že na svoj povrch viaže C1- inh. Aj keď je B. pertussis relatívne odolná voči komplementom sprostredkovanému usmrcovaniu, výskum jej únikových stratégií je limitovaný. B. pertussis je schopná viazať C1- inh na svoj povrch pomocou autotransportérového proteínu Vag8. Väzba C1-inh na povrch baktérie zvyšuje prežitie B. pertussis v ľudskom sére. 109
Spirochéta Borrelia recurrentis je ďalším patogénom, o ktorom je známe, že viaže C1-inh. B. recurrentis exprimuje na vonkajšej membráne CihC lipoproteínom, ktorý môže viazať C1-inh. Ukázalo sa, že za túto väzbu sú zodpovedné aminokyseliny na 145 – 185 pozícii v sekvencii CihC. Údaje naznačujú, že C1-inh viazaný na CihC si zachováva svoju funkčnú aktivitu, čo vedie k inaktivácii komplementu161. 4.2.2.2.2 Cielené zneškodnenie komplementu v C3 konvertáze klasickej (CC) a lektínovej cesty (LC): naviazanie C4BP Ako už bolo uvedené, C4BP je proteínový komplex tvarom pripomínajúci pavúka, ktorý pôsobí ako kofaktor pre faktor I pri inaktivácii C4b, čím inhibuje tvorbu C3 konvertázy v CC a LC. Navyše spôsobuje disociáciu C2a z už vytvorených C3 konvertáz162. Cielené vyviazanie C4BP na povrch baktérie inhibuje nielen ukladanie C3b na jej povrchu a následne fagocytózu, ale napokon zabraňuje aj lýze Gram-negatívnych baktérií zníženou tvorbou MAC163. Naviazanie C4BP na baktériu obyčajne zahŕňa interakciu medzi bakteriálnym receptorom a C- alebo N- terminálnymi krátkymi konsenzuálnymi opakovaniami (SCR) v sekvencii C4BP164. Haemophilus influenzae je jedným z patogénov, o ktorých je známe, že viažu C4BP165. Naviazanie C4BP na povrch tejto baktérie súviselo so zníženým ukladaním C3b a zvýšenou rezistenciou voči pôsobeniu komplementu, ktorá sa označuje aj ako sérorezistencia, zatiaľ čo zodpovedný(é) proteín(y) doteraz nebol(i) presne identifikovaný(é). Aj Streptococcus pneumoniae viaže C4BP. C4BP sa môže naviazať na pneumokokový glykolytický enzým enolázu exponovanú na povrchu baktérií166. Enoláza sa viaže na SCR 1-2 a SCR 8 a obmedzuje ukladanie C3b166. Ďalším enzýmom S. pneumoniae schopným väzby s C4BP je autolytický enzým LytA. Pneumokokové kmene, ktorým chýba expresia LytA, viazali menej C4BP a boli citlivejšie na komplement. Zaujímavé je, že LytA preukázal svoju dôležitú úlohu v patogenéze sepsy a pneumónie v myších modeloch167. Okrem toho sa ukázalo, že klinické izoláty viažu rôzne koncentrácie C4BP. S. pneumoniae sérotyp 14 spojený s invazívnym ochorením ľudí, vykazoval najvyššiu schopnosť viazať C4BP. Tento rozdiel bol pripísaný expresii alelického variantu pneumokokového povrchového proteínu C (Psp C = Pneumococcal surface protein), označovaného PspC4.4, u ktorého bolo potvrdené, že viaže aj C4BP. S. pneumoniae sa viaže s C4BP interakciou s elektropozitívnym klastrom na SCR 1-2 (Obr. 4.9 A). 110
Obr. 4.9 Naviazanie C4BP bakteriálnymi patogénmi (Hoving a kol. 2016; upravené)149 (A) PspC4.4 S. pneumoniae viaže C4BP na bakteriálny povrch, čo vedie k rozpadu C3 konvertázy v AC a LC a proteolytickému štiepeniu C4b. To následne inhibuje tvorbu MAC, ako aj znižuje odstaránenie baktérií fágocytmi v dôsledku inhibície ukladania C3b a tvorby C5a. (B) Viaceré baktérie sa môžu viazať na rôznych miestach ⍺- reťazca C4BP, ako je to znázornené sivými obdĺžnikmi. SCR 1-3 ⍺-reťazca sprostredkúvajú interakciu s C4b. Okrem toho, SCR 8 sa podieľa na špecifickej väzbe s C4BP u ľudí167. Väzba C4BP na B. pertussis je závislá od expresie génov, ktoré sú pod kontrolou hlavného regulačného lokusu virulencie (BvgAS). Tento dvojzložkový senzorický transdukčný systém reguluje expresiu bvg-aktivovaných génov, ktoré zahŕňajú mnohé známe faktory virulencie, ako je pertaktín, pertusis toxín, fimbrie, Vag8 a filamentózny hemaglutinín (FHA = Filamentous Hemagglutinin)168. FHA bol označený ako proteín viažuci C4BP v B. pertussis, aj keď FHA mutanty viazali na svoj povrch menej C4BP v porovnaní s divokým typom. Väzba s 111
C4BP nebola zrušená, a preto FHA mutanty vykazovali podobnú sérorezistenciu ako kmene divokého typu, čo naznačuje, že väzba C4BP na FHA nesprostredkuje únik baktérie pred komplementom. FHA by mohol uľahčiť väzbu iného proteínu na C4BP a tým nepriamo prispieť k sérorezistencii169. Pri použití C4BP mutantov boli SCR 1-2 s významnou úlohou aminokyselín Arg64 a Arg66 identifikované ako miesto zodpovedné za väzbu na B. pertussis168. Lymská borelióza je multisystémové ochorenie spôsobené baktériami patriacimi do komplexu B. burgdorferi senus lato, ktorý zahŕňa najmenej desať druhov. Infikované druhy kliešťov rodu Ixodes majú borélie vo svojom čreve a infikujú ľudí počas nasávania krvi. Keďže prenos z vektora na hostiteľa prebieha krvou, borélie sa musia účinne vyhýbať komplementovému systému. Na tento účel patogénne borélie viažu C4BP170. Pomocou hmotnostnej spektrometrie bolo identifikovaných niekoľko potenciálnych mediátorov naviazania C4BP na B. burgdorferi a B. garinii, a to konkrétne variabilný veľký proteín, variabilný hlavný proteín a vonkajší povrchový proteín A170,171. Pridanie heparínu aj C4b narušilo väzbu C4BP na B. burgdorferi a B. garinii, čo naznačuje, že pre túto interakciu sú dôležité SCR 1-3 s osobitným dôrazom na SCR 2, ktorý je najdôležitejší pre väzbu s heparínom170. Preto je pravdepodobné, že kladne nabité aminokyseliny na rozhraní medzi SCR 1-2 sú zodpovedné za väzbu s C4BP. Okrem toho, B. recurrentis exprimuje CihC, ktorý je tiež schopný sa viazať s C4BP. Ukázalo sa, že centrálna časť CihC obsahujúca aminokyseliny 145-185 sa viaže na neidentifikovanú časť C4BP pomocou hydrofóbnych interakcií161. Ďalšou Gram-negatívnou baktériou, ktorá navodzuje septikémiu, je pôvodca moru Yersinia pestis. Lokus invazívneho prichytenia (Ail) je pre Y. pestis významný kvôli adhézii a invázii makrofágov a dendritových buniek172. Okrem tejto úlohy Ail viaže C4BP, vďaka čomu sa podieľa aj na rezistencii Y. pestis voči komplementu. Táto silná interakcia medzi Ail a C4BP sa týka SCR 6 a 8. Príbuzné druhy Y. enterocolitica a Y. pseudotuberculosis tiež exprimujú Ail, ktorý sa môže viazať na C4BP. Ail Y. pseudotuberculosis viaže C4BP prostredníctvom SCR 6- 8, avšak Ail Y. enterocolitica interaguje s SCR 1-3173. U Y. enterocolitica je z veľkej časti zodpovedný za väzbu s C4BP iný povrchový proteín, označovaný ako YadA. YadA interaguje s C4BP podobným spôsobom ako s C4b na väzobnom mieste, ktoré sa pravdepodobne prekrýva s SCR 1-2173. Fakt, že rôzne druhy rodu Yersinia viažu C4BP, zdôrazňuje význam jeho využitia pre prežitie týchto patogénov. Prehľad rôznych bakteriálnych druhov a ich väzbových miest na C4BP je znázornený na Obr. 4.9 B. 112
4.2.2.2.3 Inhibícia alternatívnej cesty (AC): Faktor H a Faktor H-like proteín Hostiteľský faktor H (FH) je hlavným regulátorom AC a je využívaný rôznymi patogénmi ako stratégia vyhýbania sa komplementu. FH sa nachádza v sére a je inhibítorom C3 konvertázy alternatívnej cesty aktivácie komplementu. Faktor H prvýkrát popísal Nilsson a Müeller- Eberhard v roku 1965 ako β1H globulín. Jedná sa o plazmový glykoproteín s jednoduchým polypeptidovým reťazcom (155kDa), ktorý je prítomný v plazme v koncentrácii 110 – 615 µg/ml. Sekretovaná forma proteínu je tvorená 20 opakujúcimi sa jednotkami zo 60 aminokyselín, nazývaných ako SCR alebo Complement Control Protein (CCP). SCR majú typickú štruktúru, ktorú tvoria 4 cysteínové, 2 prolínové, jeden tryptofánový a mnohé ďalšie glycínové a hydrofóbne rezíduá. Trojrozmernú štruktúru SCR tvorí globulárna štruktúra zo 6 stočených antiparalelných ß-skladaných listov pospájaných slučkami174. Okrem faktora H kontroluje aktiváciu alternatívnej cesty komplementu aj faktor H-like proteín (FHL-1 = Factor H-Like 1). Kým faktor H pozostáva z 20 SCR, FHL-1 je tvorený prvými siedmimi repetíciami faktora H a C-terminálnym koncom tvoreným zo štyroch aminokyselinových zvyškov175. SCR FHL-1 je identická s N-terminálnou doménou faktora H, kým C-terminálny koniec je unikátny. Veľkosť FHL-1 je 42 kDa176. Obidva proteíny FH aj FHL-1 štruktúrne spolu súvisia a sú kódované rovnakým génom a ich transkripty sú odvodené od alternatívneho spracovania jadrového RNA transkriptu. Hlavná regulačná doména komplementových regulátorov je lokalizovaná na N-konci SCR 1-4. Faktor H sa viaže na C3b, urýchľuje rozklad C3-konvertázy (C3bBb) alternatívnej cesty a slúži ako kofaktor pre faktor I- sprostredkujúcu proteolytickú inaktiváciu C3b. V prítomnosti faktora H a faktora I, proteolýza C3b vedie k rozštiepeniu α-reťazca C3b. V prípade inaktivácie na povrch naviazaného C3b, inaktivovaná C3b molekula označovaná ako iC3b, zostáva kovalentne spojená k aktivujúcemu povrchu. Aby sa baktérie vyhli aktivácii alternatívnej cesty , bežne viažu FH na svoj povrch väzbou na SCR 6 – 7 alebo SCR 19 – 20, pričom dôležité aktívne miesto FH (SCR 1 – 4) zostáva funkčné175. Bakteriálne proteíny, ktoré viažu FH prostredníctvom SCR 6 – 7, môžu vďaka konzervovaným doménam SCR tiež viazať FHL-1 176 (Obr. 4.10 A). 113
Obr. 4.10 Väzba FH patogénmi (Hoving a kol. 2016; upravené)149 (A) Jedným príkladom bakteriálneho proteínu viažuceho FH je povrchový proteín CspZ u B. burgdorferi. CspZ interaguje s SCR 20 FH, čo vedie k rozpadu C3 konvertázy AC a proteolytickej degradácii C3b na iC3b a C3d. To následne inhibuje tvorbu MAC, ako aj znižuje fagocytárny príjem baktérií v dôsledku inhibície ukladania C3b a tvorby C5a. (B) Viaceré baktérie môžu viazať FH na rôznych miestach, ako je znázornené šedými obdĺžnikmi. SCR 1 – 4, ktoré sprostredkúvajú interakciu s C3b a SCR 19 – 20 sa podieľajú na rozpoznávaní baktérií od seba samých. Bakteriálne proteíny, ktoré využívajú SCR 19 – 20, sa viažu na takzvané „bežné (obvyklé) mikrobiálne väzbové miesto“, ktoré na SCR 20 pozostáva z aminokyselín Arg1182, Arg1203 a Arg1206175. Kmene Haemophilus influenzae sú schopné viazať FH na svoj povrch. Ukázalo sa, že väzba FH sa medzi rôznymi kmeňmi líši, a preto ich sérorezistencia koreluje s množstvom naviazaného FH165. Typické kmene H. influenzae, najmä H. influenzae typu b (Hib) a H. influenzae typu f (Hif), v porovnaní s kmeňmi NTHi (Nontypable Haemophilus influenzae stains) lepšie viažu FH. Okrem toho štyri z desiatich testovaných kmeňov Hib tiež 114
vykazovali adherenciu k FHL-1. Ukázalo sa, že SCR 6 – 7 a SCR 18 – 20 sa podieľajú na väzbe FH na Hib165. Delécia proteínu H (PH) u H. Influenzae viedla k zníženiu väzby FH na tieto baktérie177. Za túto interakciu sú zodpovedné SCR 7 a SCR 18 – 20 vo FH177. Väzba proteínu H na FHL-1 bola sprostredkovaná prostredníctvom jeho SCR 7177. Niektoré kmene H. influenzae neexprimujú proteín H, ale môžu viazať FH prostredníctvom proteínu vonkajšej membrány P5 (OmpP5 = Outer membrane protein P5)178. OmpP5, člen rodiny proteínov OmpA, je exprimovaný ako v kmeňoch NTHi, tak aj v typických kmeňoch. S. pneumoniae exprimuje niekoľko proteínov, ktoré sprostredkovávajú pripojenie FH na bakteriálny povrch a väzba tohto AC regulátora koreluje s invazívnosťou kmeňa179. Inhibítor komplementu viažuci faktor H (Hic = H-binding inhibitor of complement), získava FH prostredníctvom interakcií medzi SCR 8 – 11 a SCR 12 – 14 z FH a AA 38 – 92 z Hic180. Druhým proteínom u S. pneumoniae viažucim FH je PspC, ktorý špecificky interaguje prostredníctvom AA 1 – 225 svojej N-terminálnej hypervariabilnej α-helikálnej domény v SCR 8 – 10 ľudského FH181. Ukázalo sa, že povrchový proteín SdrE u S. aureus, predtým opísaný ako C4BP viažuci proteín, sa spája s FH, a teda SdrE môže inhibovať všetky tri dráhy komplementu. Po naviazaní tohto proteínu zostáva FH funkčne aktívny a je schopný poskytnúť kofaktorovú aktivitu pre FI na sprostredkovanie následného štiepenia C3b na iC3b182. Okrem toho, vyššie uvedený homológ SdrE, stafylokokový proteín tiež vykazuje schopnosť viazať FH183. S. aureus taktiež exprimuje secernované proteíny, ktoré zvyšujú zachytenie FH na povrch184. Ukázalo sa, že Ecb tvorí tripartitný komplex s C3b a FH prostredníctvom SCR 19 – 20184. Tvorba takéhoto komplexu má zosilňujúci účinok na funkciu Ecb aj FH. Najviac študovaným proteínom s ohľadom na väzbu FH je špecifický lipoproteín viažuci faktor H (fHbp = factor H binding protein) u Neisseria meningitidis, ktorý je súčasťou licencovanej vakcíny proti typu B185. N. meningitidis je hlavným pôvodcom invazívneho meningokokového ochorenia a septikémie na celom svete. Väzba FH a fHbp je interakcia s vysokou afinitou s KD približne 5 nM zahŕňajúca N- a C-koncový β barel fHbp a SCR 6 – 7 vo FH186. fHbp bol kategorizovaný do troch rôznych variantných skupín, V1, V2 a V3. Expresia fHbp je u klinických izolátov variabilná186. Okrem náboru FH je fHbp navyše schopný viazať sa na FHL- 1 a FHR-3 (Factor H-related protein 3). Ukázalo sa, že FHR-3 je kompetitívny antagonista FH187. Kmene V1 majú nižšiu afinitu k FHR-3 v porovnaní s kmeňmi V3. Druhým FH viažucim proteínom baktérie N. meningitidis je neisseriový povrchový proteín A (NspA = Neisserial surface protein A), ktorý spôsobuje sérorezistenciu aj v neprítomnosti fHbp188. NspA má osemvláknovú antiparalelnú β-barelovú štruktúru so štyrmi zdanlivými slučkami odkrytými 115
na povrchu. Slučka 3 je dôležitá pre väzbu na FH SCR 6 – 7188. N. meningitidis taktiež využíva lipooligosacharidy (LOS = Lipooligosaccharides), ktoré zvyšujú väzbu FH na NspA. Doposiaľ nie je vysvetlený presný mechanizmus tejto zvýšenej väzby. Ukázalo sa, že LOS, kyselina sialová, fHbp, PorinB2 a NspA spoločne znižujú umiestnenie C3b prostredníctvom AC na bakteriálnom povrchu188. Okrem toho sa predpokladá, že PorB3 môže byť ďalším proteínom N. meningitidis, ktorý viaže FH188. Obr.10 B sumarizuje rôzne patogény a ich väzbové miesta k FH. Borrelia a faktor H Dlhodobé prežívanie indikuje, že borélie sú schopné vyhnúť sa obranným imunitným mechanizmom hostiteľa. Počas rôznych životných štádií borélií dochádza k výraznej zmene expresie jej povrchových proteínov. Povrchové proteíny vonkajšej membrány patria medzi najlepšie preštudované antigény. Sú zodpovedné za hostiteľskú imunitnú odpoveď. Povrchové antigény zahŕňajú OspA, OspB, OspC o molekulovej hmotnosti 31, 34 a 21 až 25 kDa. OspC sa vyskytuje ako dimér a je hlavným imunogénom v skorej protilátkovej odpovedi. Medzi ďalšie povrchové antigény patrí lipoproteín OspD s molekulovou hmotnosťou 28 kDa, OspE s molekulovou hmotnosťou 19 kDa, OspF s molekulovou hmotnosťou 26 kDa, CRASPs (Complement Regulatory Acquiring Surface Proteins), 19 kDa FH viažuci proteín, a pod.189,190. Jedná sa štruktúrne zložky vonkajšej membrány borélií, ktoré boli identifikované s rôznym stupňom expresie u jednotlivých izolátov a v závislosti na fáze životného cyklu borélií. Borrelia má komplexný životný cyklus ako hostiteľ-asociované spirochéty, ktoré cirkulujú medzi hematofágnymi artropódami a stavovcami. Keď sa spirochéty dostanú z článkonožcov do stavovcov, zmenia prostredie bez protilátok za prostredie, kde je imunologický tlak vysoký, preto biológia týchto organizmov vyžaduje vysoký stupeň prispôsobivosti. Na zvýšenie pravdepodobnosti prenosu pomocou nepravidelne cicajúcich článkonožcov z jedného hostiteľa do druhého, borélie musia perzistovať v hostiteľovi tak dlho, ako je to možné. Dobrou cestou, ako uniknúť imunitnej reakcii, je zmeniť molekuly na povrchu baktérií. Borélie sa v kliešťoch vyskytujú v strednej časti čreva (mezenteron). Črevo je prvé miesto, kde dochádza k vzájomnému pôsobeniu medzi kliešťom a B. burgdorferi. K infikovaniu hostiteľa baktéria musí opustiť črevo a migrovať do slinných žliaz. Spirochéty sa množia počas kŕmenia sa kliešťa, migrujú cez stenu čreva do rôznych tkanív, vrátane slinných žliaz odkiaľ sú prenesené do hostiteľa pomocou slín191. Borélie sú počas tohoto cyklu vystavené značným zmenám teploty, pH, osmotického tlaku a takisto aj imunitnému systému. K vyrovnaniu sa s týmito zmenami sú nevyhnutné efektívne regulačné mechanizmy. Expresia povrchových 116
proteínov OspA a OspC je kľúčová pre tento adaptačný proces. Spirochéty vo vnútri čreva nenakŕmeného kliešťa exprimujú OspA proteín, pričom k expresii OspC nedochádza, resp. len vo veľmi malom množstve, a je obmedzená hlavne na povrch črevných buniek. Mnohé štúdie demonštrovali pokles expresie OspA proteínu a nárast OspC v počiatočných štádiách kŕmenia sa kliešťa192-194. Expresia FH viažucich proteínov je taktiež variabilná počas životného cyklu Borrelia. Borélie exprimujú množstvo proteínov, ktoré viažu FH alebo FHL-1. Nižšie sú stručne uvedené niektoré z týchto proteínov. OspE a Erp proteíny OspE proteín a skupina Erp proteínov ( E related proteins) borélií viažu faktor H. Erp gény boli identifikované v každom izoláte spirochét Lymskej choroby, čo naznačuje významnú úlohu Erp proteínov u B. burgdorferi195. Posledné dôkazy ukazujú, že FH viažuca doména OspE je konformacionálna alebo diskontinuálna a rozptýlené lyzínové rezíduá sú spojené s charge based založenou interakciou. Štúdie demonštrovali potrebu intaktnej C-terminálnej domény OspE pre väzbu faktora H196. Väzba FH závisí od formácie množstva coiled coil štruktúrnych motívov a odchýlka/rozrušenie ďalších aspektov OspE štruktúry vedie k strate väzby faktora H. Do skupiny Erp proteínov patrí 11 proteínov: erpA, erpB, erpC, erpD, erpE, erpF erpG, erpK, erpL, erpM, erpX. Regulácia expresie Erp prebieha na úrovni mRNA197, hoci niektoré erp operóny sú pravdepodobne regulované aj prídavnými mechanizmami197. Funkciou týchto proteínov je viazať komplementový inhibičný FH mnohých stavovcov198. Uvažuje sa, že baktéria potrebuje exprimovať široký repertoár Erp proteínov, aby mohla viazať molekuly FH rôznych hostiteľov, čo jej umožňuje založiť infekciu u mnohých rozdielnych hostiteľov198. Je známe, že B. burgdorferi rozdielne exprimuje Erp proteíny v závislosti od teploty a chemických signálov199. Rovnako regulácia naznačuje, že expresia týchto proteínov je tiež kontrolovaná počas infekčného cyklu B. burgdorferi. Baktéria kultivovaná pri 23˚ C produkovala veľmi malé množstvo Erp proteínov, kým pri teplote od 23 do 34 ºC došlo k výrazne vyššej expresii Erp proteínov197. Jedná sa o teploty, ktoré napodobňujú teploty, pri ktorých sa B. burgdorferi nachádza v čreve nenacicaného kliešťa (teplota okolia) a v kliešťoch počas cicania na teplokrvných zvieratách (ohrievanie na teplotu krvi)198. Pri kmeni B. burgdorferi B31, erp mRNA a Erp proteíny boli simultánne exprimované baktériou počas kultivácie a vo vnútri čreva kŕmiaceho sa kliešťa200. Všetky spirochéty exprimovali Erp proteíny počas kŕmenia sa larvy na infikovanom hostiteľovi. Pár dní po ukončení kŕmenia, percento Erp-pozitívnych baktérií významne pokleslo. Počas premeny larvy na nymfu, takmer žiadna baktéria v čreve 117
nenakŕmenej nymfy neexprimovala detekovateľné hladiny Erp proteínov. Keď infikovaná nymfa začala prijímať krv na hostiteľovi, percento Erp-pozitívnych baktérií vzrástlo, hoci ich počet nepresiahol 50 % populácie. Podiel Erp-exprimujúcich baktérií poklesol po ukončení kŕmenia. Takmer 100 % spirochét prenesených do hostiteľa, produkovalo vysoké hladiny Erp proteínov. Baktérie, ktoré iniciovali expresiu Erp proteínov počas kŕmenia sa kliešťa, boli úspešne prenesené do hostiteľa201. B. burgdorferi zvyšuje expresiu aj nesúvisiaceho OspC proteínu pri teplotách od 23 do 34º C a tiež reguluje produkciu OspC počas kŕmenia sa kliešťa na hostiteľovi194. Podobnosť zákonitostí Erp a OspC expresie in vitro vedie k návrhu, že hladiny Erp proteínov tiež vzrastajú počas prenosu z kliešťov na teplokrvných hostiteľov. Kým mnohé imunologické štúdie demonštrovali, že Erp proteíny sú produkované počas infekcie, avšak čas expresie zatiaľ ešte nebol popísaný200. CRASP proteíny Okrem OspE a Erp proteínov, aj CRASPs (Complement Regulator-Acquiring Surface Proteins) viažu FH. Patria sem CRASP-1 až -5 , ktoré sa delia do troch skupín. Skupina I zahŕňa proteíny, ktoré viažu FHL-1 ako aj faktor H (napr. CRASP-1Bb, CRASP-1Ba, CRASP-2Bb, CRASP-2Ba). Skupina II a III zahŕňa proteíny, ktoré selektívne viažu FHL-1 alebo FH (napr. CRASP- 3Ba, CRASP-3Bb, CRASP-5Bb, CRASP-4Ba, CRASP-5Ba)202. CRASP-1 je hlavným proteínom B. burgdorferi zodpovedným za väzbu FH a FHL-1 in vitro kultivovaných spirochét. Štúdie ukázali, že inaktivácia CRASP-1 génu u B. burgdorferi má za následok sérosenzitívny fenotyp a že komplementácia mutantného kmeňa s CRASP-1 vektorom vedie k obnoveniu rezistencie ku komplementom sprostredkovanému usmrteniu203. Tieto údaje naznačujú, že CRASP-1 má podiel na úniku a/alebo prežití spirochét u človeka, avšak stále sa skúma či spirochéty exprimujú CRASP-1 počas infekcie u ľudí. Faktom je, že predchádzajúce štúdie ukázali, že séra pacientov s Lymskou boreliózou neobsahovali protilátky špecifické pre denaturovanú rekombinantnú CRASP-1, keď boli testované pomocou metódy Western blotting204. CRASP-1 je homodimér. Výsledky ukazujú, že B. burgdorferi exprimuje CRASP- 1 počas infekcie u ľudí a naznačujú, že vytvorené protilátky sú obmedzené na nedenaturované štruktúrne zložky funkčne aktívnych proteínov. Výsledky tiež naznačujú, že vytvorené protilátky neinterferujú s väzbou humánneho FH a CRASP-1, čo môže byť významné pre perzistenciu spirochét u infikovaného človeka. Sú potrebné ďalšie štúdie k zisteniu významu imunogénneho epitopu CRASP-1 pre väzbu faktora H. BbCRASP-3, 4, a 5 sa označujú aj ako ErpP, ErpC a ErpA205. 118
Rezistencia borélií voči komplementu Jednotlivé druhy borélií majú rôznu citlivosť k sérovému komplementu jednotlivých zvierat, a preto existujú rôzne rezervoárové druhy pre Borreliu burgdorferi sensu lato206. Štúdie indikujú, že B. garinii a B. valaisiana sú prenášané na kliešťov hlavne vtákmi, kým B. afzelii je prenášaná hlodavcami. Rezistencia na komplement hlodavcov u B. afzelii zodpovedá tomu, že jej hlavnými prenášačmi sú myši , potkany a takisto aj veveričky. Následne komplementom sprostredkovaná lýza B. garinii vysvetľuje, prečo európske hlodavce neslúžia ako rezervoár pre kmene B. garinii, zatiaľ čo jej rezistencia ku komplementu bažantov jej umožňuje využívať bažanty ako rezervoárové zvieratá. Taktiež deštrukcia borélií bez ohľadu na jej druh koreluje s neschopnosťou sŕn a jeleňov slúžiť ako ich prirodzený rezervoár206. Sérum hlodavcov a ľudí má baktericídne účinky pre B. garinii a B. valaisianu, ale tento účinok nemá pre B. afzelii a B. japonica, zatiaľ čo bažantie sérum zabíja B. afzelii a B. japonica, ale nie B. garinii a B. valaisiana. Sérum bažanta je čiastočne boreliacídne pre B. burgdorferi sensu stricto. Sérum koní, ošípaných a hovädzieho dobytka je baktericídne pre B. garinii, B. afzelii, B. valaisiana, B. japonica s výnimkou B. burgdorferi sensu stricto206. Získanie hostiteľových regulátorov priamo súvisí s rezistenciou voči komplementu v sére, ako napr. sérorezistentné kmene ľudských patogénov B. afzelii a B. burgdorferi exprimujú CRASP-1, 2, 3, 4 a 5 , kým sérosenzitívne kmene B. garinii ich neexprimujú207. Kmene B. burgdorferi s. s. a B. afzelii, ktoré sú rezistentné voči komplementu, podporujú faktorom I- sprostredkovanú inaktiváciu C3b zložky, kým sérosenzitívna B. garinii nie. Komplementová rezistencia súvisí so schopnosťou viazať solubilný komplementový regulačný faktor H a FHL- 1. Neutralizácia tejto rezistencie môže byť významná pri prevencii a/alebo pri liečbe boreliózy123. Analýzy väzby FH k spirochétam Lymskej boréliozy ukazujú, že 100 % B. burgdorferi, 83 % B. afzelii a 25 % B. garinii viažu faktor H204. B. garinii je viac citlivá na komplement ako iné kmene, a preto spôsobuje boreliózu centrálneho nervového systému, kde je koncentrácia komplementu oveľa nižšia ako v ostatných častiach ľudského organizmu123. Vzhľadom k charakteristickým črtám infekcie B. burgdorferi je jasné, že spirochéty musia nejakým spôsobom uniknúť komplementovému ataku. V čreve kliešťov môžu byť chránené pomocou komplement inhibujúcich faktorov v slinách kliešťa, ktoré bránia ukladaniu C3b na komplementom aktivovaných povrchoch. Avšak pri invázii subkutánneho tkaniva a pri diseminovanej infekcii borélie musia mať ďalšie spôsoby úniku pred komplementovým systémom. Bolo zistené, že komplement rezistentné kmene B. burgdorferi s. s. a B. afzelii môžu zvýšiť C3b inaktiváciu a tým uniknúť komplementovému ataku, pričom B. garinii nemá túto 119
schopnosť. Táto vlastnosť podporovať štiepenie C3b zložky u B. burgdorferi a B. afzelii sa dáva do súvisu so schopnosťou týchto kmeňov viazať komplementový inhibičný faktor H a FHL-1. Pri Lymskej borelióze sa pozoruje tvorba protilátok, avšak imunitný systém v mnohých prípadoch nedokáže baktérie eliminovať. So zníženou alebo neefektívnou tvorbou MAC komplexu dochádza k zníženiu protilátkami sprostredkovaného zabitia spirochét123. Rezervoárové druhy stavovcov môžu byť súčasne infikované rôznymi druhmi B. burgdorferi sensu lato, dokonca takými, pre ktoré nie sú vhodní ako prenášač208. Možné vysvetlenie tohto zrejmého paradoxu môže súvisieť s faktom, že borélie rôzne exprimujú gény počas životného cyklu. Kým expresia génov spirochét nachádzajúcich sa v čreve kliešťa sa podobá pozorovanej expresii v kultúre, hlavné vonkajšie membránové proteíny borélií vrátane možných komplementových receptorov sú zrejme regulované v slinných žľazách kliešťov a v hostiteľov209. Je možné, že počas kŕmenia sa kliešťa komplement selektívne zabije spirochéty v čreve kliešťa (ako bolo pozorované in vitro), zatiaľ čo spirochéty injektované do hostiteľa kliešťami, ktorého slinné žľazy boli infikované pred prijatím krvi, môžu uniknúť zabitiu210. Takmer 100 % spirochét prenesených do hostiteľa produkovalo vysoké hladiny Erp proteínov. Tieto údaje naznačujú, že Erp proteíny hrajú dôležitú úlohy počas prenosov medzi hostiteľmi a vektormi (kliešte). Bolo zistené, že zvieratá chronicky infikované B. burgdorferi kontinuálne produkovali vysoký titer IgG protilátok voči Erp proteínom. Nie je však jasné či protilátková odpoveď je výsledkom expresie Erp proteínov počas infekcie, alebo či baktéria potlačila syntézu Erp proteínov po vzniku infekcie211. 4.2.2.2.4 Inhibícia cesty tvorby terminálneho komplexu: naviazanie vitronektínu (Vn) a klusterínu Vitronektín (Vn) bráni inzercii MAC tým, že sa spája s membránovým väzbovým miestom C5b-9. V nedávnej štúdii sa analyzovali väzbové schopnosti Vn trinástich rôznych mikrobiálnych patogénov. Zaujímavosťou je, že všetky bakteriálne patogény interagovali s rovnakou C-terminálnou heparín viažucou doménou 3 (HBD3 = Heparin Binding Domain 3) (AA 352 – 374) Vn, čo naznačuje, že väzba baktérií na Vn je medzi rôznymi bakteriálnymi druhmi vysoko konzervovaná212. H. influenzae je jedným z patogénov, o ktorom je známe, že viaže vitronektín (Vn). Povrchové fibrily hemofilov (Hsf = Haemophilus surface fibrils), ktoré sú vysoko konzervované v typizovaných kmeňoch, boli u H. influenzae prvými identifikovanými proteínmi viažucimi Vn213. Väzba Hsf na HBD3 z Vn bola sprostredkovaná prostredníctvom AA 429 – 652 z Hsf214 (Obr. 4.11 A). 120
Obr. 4.11 Väzba Vn bakteriálnymi patogénmi (Hoving a kol. 2016; upravené)149 (A) Hsf z H. influenzae sa viažu na heparín viažucu doménu 3 (HBD3 = Heparin Binding Domain 3) z Vn. Naviazaním Vn na bakteriálny povrch inhibuje H. influenzae tvorbu MAC. (B) Viaceré baktérie môžu viazať na rôznych miestach Vn, ako je znázornené šedými obdĺžnikmi. Bakteriálne patogény interagujú buď so spojovacou oblasťou Vn alebo s C-koncovou HBD3. Proteín H je ďalší proteín exprimovaný H. influenzae, ktorý sa podieľa na sprostredkovaní sérorezistencie prostredníctvom väzby Vn215. Kmene NTHi H. influenzae sa vyvinuli tak, aby exprimovali odlišné proteíny viažuce Vn, konkrétne proteín E a proteín F216. Oba proteíny sa viažu na HBD3 z Vn, ale proteín E vykazuje silnejšiu väzbu ako proteín F. Centrálne umiestnené AA 84 – 108 zvyšky (aminokyselinové zvyšky 84 – 108) proteínu E interagujú s Vn217, zatiaľ čo N-koncové AA 23 – 48 zvyšky proteínu F tvoria miesto interakcie Vn (zatiaľ čo v proteíne F tvoria miesto interakcie pre Vn N-koncové aminokyselinové zvyšky 23 – 48. Okrem H. influenzae je tiež známe, že P. aeruginosa exprimuje dva proteíny, ktoré sú schopné 121
viazať Vn. Vn viažuce proteíny porín D a dihydrolipoamid dehydrogenáza (Lpd = Dihydrolipoamide dehydrogenase) u P. aeruginosa sa tiež viažu na HBD3 oblasť Vn218. Okrem väzby Vn môže Lpd tiež interagovať s ďalším inhibítorom terminálnej fázy aktivácie komplementu, klusterínom219. Vn sa viaže na AA 161 – 287, ako aj AA 264 – 478 Lpd, zatiaľ čo klusterín sa viaže na AA 1 – 160 a AA 328 – 478 tohto proteínu219. Ukázalo sa, že Vn a klusterín sa viažu súčasne219. Zaujímavosťou je, že kmene P. aeruginosa izolované z dýchacích ciest vykazujú silnejšiu väzbovú kapacitu k Vn v porovnaní s kmeňmi izolovanými z krvného obehu218. Naďalej zostáva nevysvetlené, či množstvo porínu D alebo Lpd exprimovaného týmito kmeňmi môže zodpovedať za rôzne väzbové sily a či sú tieto kmene odolnejšie voči séru. Vyššie spomenuté proteíny S. pneumoniae PspC a Hic, ako proteíny viažuce FH, boli navyše identifikované ako molekuly viažuce Vn, a preto inhibujú tvorbu MAC220. Väzba Vn na PspC je sprostredkovaná cez N-terminálnu oblasť PspC, ktorá sa viaže na HBD3 aktivovaného Vn221. Hic, tiež známy ako PspC11.4, sa viaže na aktivovaný Vn svojou centrálnou časťou (AA 151 – 200), čo naznačuje, že prijal odlišný väzbový mechanizmus v porovnaní s klasickým proteínom PspC. Väzbové oblasti na aktivovanom Vn sú však podobné ako PspC220. Vonkajší membránový proteín Opc a meningokokový povrchový proteín (Msf) boli identifikované ako Vn viažuce proteíny N. meningitidis, ktoré sú variabilne exprimované medzi izolátmi a sú spojené so zvyšujúcou sa sérorezistenciou222. Opc je transmembránový proteín N. meningitidis z rodiny β barel s piatimi povrchovo exponovanými slučkami. Spočiatku bola väzba Opc na Vn opísaná výlučne v kontexte zvýšenej adhézie k endotelovým bunkám ľudského mozgu. Následné štúdie spojili expresiu Opc so sérorezistenciou223. Opc sa môže viazať na dve odlišné miesta na Vn, a to na spojovaciu oblasť a oblasť HBD3. Táto väzba je sprostredkovaná sulfátovanými tyrozínmi na Vn alebo tvorbou mostíkov s heparínom. Aminokyselinové zvyšky na Opc zodpovedné za väzbu Vn ešte neboli identifikované. Podobne ako Opc, aj Msf viaže podobné miesta na aktivovanom Vn222. Molekulárne modelovanie identifikovalo AA 39 – 82 Msf ako dôležité pre väzbu Vn224. Obr. 11 B sumarizuje rôzne patogény a ich väzbové miesta k Vn. 4.2.3 Únikové stratégie využívané na prežitie vo fagocytoch Fagocytóza má kľúčovú úlohu pri obrane organizmov pred bakteriálnymi patogénmi. Bunky, ktoré sa špecializujú na túto úlohu, sú profesionálne fagocyty – makrofágy, neutrofily a monocyty225. Profesionálne fagocyty sú zodpovedné nielen za elimináciu mikroorganizmov, 122
ale aj za ich prezentáciu bunkám adaptívneho imunitného systému. K neprofesionálnym fagocytom patria epitelové bunky, fibroblasty a endotelové bunky226. Neutrofily sú relatívne krátko žijúce bunky, ktorých primárnou úlohou je fagocytózou odstrániť invadujúce patogény4. Neutrofily pomáhajú odstraňovať invazívne baktérie aj tým, že do vonkajšieho prostredia uvoľňujú svoju dekondenzovanú jadrovú DNA pokrytú antimikrobiálnymi proteínmi uvoľnenými z ich granúl, ktorá vytvára tzv. neutrofilové extracelulárne pasce (NET), ktoré majú silnú antimikrobiálnu aktivitu proti širokej škále bakteriálnych patogénov227,228. K aktivácii neutrofilov dochádza vďaka aktivácii tkanivových makrofágov, ktoré po rozpoznaní invadérov začnú produkovať cytokíny aktivujúce cievny endotel (TNF-, IL-1), čím podporujú prichytenie cirkulujúcich neutrofilov na endotel a chemokíny, ktoré ovplyvňujú následnú migráciu neutrofilov do tkanív. V mieste infekcie neutrofily fagocytujú komplementom a protilátkami opsonizované baktérie. Aj neutrofily tvorbou cytokínov a chemokínov priťahujú ďalšie leukocyty do miesta infekcie. Po odstránení baktérií neutrofily obvykle uhynú mechanizmom apoptózy; apoptotické neutrofily sú potom odstránené makrofágmi. Neutrofily sú preto na jednej strane nevyhnutné pre obranu proti extracelulárnym baktériám, avšak, ak je z nich po ich degranulácii do prostredia nekontrolovateľne uvoľnený obsah ich granúl, potom aj neutrofily prispievajú k vzniku poškodzujúceho zápalu229. Monocyty cirkulujú v krvi a odkiaľ ľahko migrujú do tkanív, kde sa môžu diferencovať na tkanivové makrofágy a dendritové bunky. Makrofágy majú zníženú pohyblivosť a zvýšenú fagocytárnu aktivitu, čo zdôrazňuje ich primárny cieľ chrániť tkanivá pred infekčnými agensami. Mononukleárne fagocyty sa zameriavajú na odstránenie intracelulárnych patogénov. Aktivované makrofágy sú zdrojom prozápalových cytokínov (TNF- a IL-1) a chemokínov (CC a CXC skupina chemokínov), ako aj cytokínov (napr. IL-12), potrebných k aktivácii adaptívnej imunity. Makrofágy majú dôležitú úlohu nielen pri eliminácii invadérov, ale aj pri ukončení zápalu a odstraňovaní odumretých alebo poškodených buniek. Proces fagocytózy pri zápale sa delí do niekoľkých krokov na (1) migráciu (extravazáciu, výstup fagocytov z krvného riečiska a migráciu v tkanive), následné (2) rozpoznanie invadérov a (3) vlastnú fagocytózu spojenú s deštrukciou pohltených baktérií, ktorá vedie k apoptóze fagocytov a ukončeniu zápalu spojeného s reparáciou poškodeného tkaniva alebo vznikom chronického zápalu. Únikové stratégie baktérií pred fagocytózou sa preto delia do skupín na tie, ktorými sa snažia (1) ovplyvniť extravazáciu a migráciu fagocytov do miesta zápalu, (2) uniknúť pred rozpoznaním fagocytmi alebo (3) uniknúť pred usmrtením vo vnútri fagocytov. 123
4.2.3.1 Extravazácia a migrácia fagocytov Extravazácia a migrácia fagocytov v tkanivách (Obr. 4.12) je regulovaná chemoatraktantmi, medzi ktoré patria hostiteľom tvorený leukotrién B4 (LTB4 = Leukotriene B4), trombocyty aktivujúci faktor (PAF = Platelet-Activating Factor), komplementové fragmenty C3a a C5a a chemokíny. Obr. 4.12 Jednotlivé kroky v reakcii cirkulujúcich neutrofilov na infekciu (Bogaert a Hayrec 2021; upravené)232 Zápalové mediátory (IL-1, LPS a TNF-α) stimulujú expresiu adhezínu E-selektínu na endotelových bunkách. E- selektín interaguje so sialyl Lewis antigénom na povrchu neutrofilov, čo vedie k rolovaniu neutrofilov po endotelových bunkách. Chemoatraktanty, ako je IL-8, spôsobujú zvýšenie expresie integrínov v membráne neutrofilov, ktoré sú následne zodpovedné za tesnú adhéziu na ICAM-1, 2 a PECAM-1 molekúl na endotelových bunkách. Neutrofily potom prechádzajú cez endotel do okolitého tkaniva a sú nasmerované do miesta infekcie prostredníctvom snímania gradientov chemoatraktantov (chemokínov, produktov baktérií a komplementu). V infikovanom tkanive neutrofily fagocytujú baktérie, ktoré sú opsonizované protilátkami a komplementom. Na usmrtenie pohltených baktérií sa potom používajú oxidačné aj neoxidačné antimikrobiálne mechanizmy. ICAM- 1, 2: InterCellular Adhesion Molecule-1, 2; PECAM: Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1 Typickým chemokínom pre neutrofily je CXCL8 (IL-8). Aj bakteriálne bunky môžu byť zdrojom veľmi účinných chemoatraktantov, a to konkrétne ich N-formylované peptidy obsahujúce N-formylovaný metionín (napr. fMLP) tieto peptidy sa uvoľňujú aj z mitochondrií po poškodení eukaryotických buniek230. Chemoatraktanty sú rozpoznávané receptormi 124
viazanými na G proteíny (GPCR = G Protein-Coupled Receptors) v membránach leukocytov231. Aktivácia prostredníctvom GPCR riadi nielen chemotaxiu fagocytov, ale taktiež pripravuje a aktivuje bunky na efektorové funkcie, ako je napr. fagocytóza. Chemoatraktanty a GPCR preto zohrávajú dôležitú úlohu v riadení vrodenej imunitnej obrany proti invazívnym patogénom. 4.2.3.1.1 Ovplyvnenie migrácie fagocytov Patogény využívajú rôzne stratégie, pomocou ktorých sa snažia utlmiť extravazáciu a aktiváciu fagocytov pomocou chemoatraktantov233. N-formylované peptidy sa viažu na FPR (Formyl Peptide Receptor) receptory (FPR1, FPR2/ FPRL-1 a FPR3/FPRL-2) patriace do rodiny GPCR234. Väzba formylovaných peptidov na tieto receptory indukuje a potencuje chemotaxiu, fagocytózu a oxidačné vzplanutie v neutrofiloch a monocytoch. Tieto receptory môžu byť inaktivované väzbou bakteriálnych inhibičných molekúl, ako sú chemotaxiu inhibujúceho proteínu S. aureus (CHIPS = Chemotaxis Inhibitory Protein of S. aureus) a proteínu inhibujúceho FPRL-1 receptor (FLIPr, FPRL-1 Inhibitory Protein). Tieto proteíny po väzbe na FPR1 alebo FPR2 inhibujú chemotaxiu fagocytov vyvolanú bakteriálnymi N-formylovanými peptidmi. CHIPS navyše inhibuje aj komplementový receptor C5aR235,236. Príkladom ďalších molekúl, ktoré ovplyvňujú extravazáciu a chemotaxiu neutrofilov sú stafylokokové superantigénom podobné molekuly (SSL = Staphylococcal Superantigen- Like)237, z ktorých napr. SSL5, SSL11 ako aj stafylokokový enterotoxínu podobný toxín X (SElX = Staphylococcal Enterotoxin-like X) inhibujú extravazáciu neutrofilov blokovaním interakcie PSGL-1 (P-Selectin Glycoprotein Ligand-1) neutrofilov s P-selektínmi na endotelových bunkách238. SSL5 tiež inhibuje odpoveď leukocytov na C3a a C5a fragmenty komplementu239. SSL1 a SSL5 inhibujú neutrofilové metaloproteinázy (MMP8 a MMP9), vďaka čomu prispievajú k inhibícii migrácie neutrofilov v tkanivách240. Podobný mechanizmus využíva aj S. pneumoniae, ktorý produkuje zinkovú metaloproteinázu C (ZmpC), ktorá štiepením PSGL-1 blokuje rolovanie neutrofilov241. Na ovplyvnení chemotaxie sa podieľajú aj bakteriálne enzýmy, ktoré tieto chemoatraktanty degradujú. Napríklad Pseudomonas aeruginosa vylučuje elastázu, ktorá inhibuje chemotaxiu neutrofilov vďaka štiepeniu fMLP ako aj inaktivácii FPR receptorov242. Na povrchu streptokokov sa zase nachádzajú rôzne proteázy z rodiny CEP (Cell Envelope Protease), ku ktorým patrí aj streptokoková chemokínová proteáza (SpyCEP alebo SpcC) nachádzajúca sa 125
v bunkovej stene S. pyogenes. Táto proteáza degraduje rôzne humánne a myšacie chemokíny vrátane CXCL8243. Zoonotický patogén Streptococcus iniae má funkčný homológ SpcC, označovaný ako CepI, ktorý taktiež štiepi CXCL8244, podobne aj streptokoky skupiny B majú povrchovú proteázu CspA, ktorá štiepi CXC chemokíny245. Podobné účinky na degradáciu chemokínov boli opísané aj v prípade P. aeroginosa246 a Porphyromonas gingivalis247. Avšak patogény môžu využiť chemokínom podobné molekuly aj na pritiahnutie fagocytov do miesta infekcie. To bolo pozorované u Mycobacterium avium, ktorý má CCL-2 (MCP-1 = Monocyte Chemoattractant Protein-1) podobnú molekulu s chemotaktickým účinkom na monocyty a makrofágy. Nahromadenie týchto buniek do miesta infekcie sa môže podieľať na vytváraní lokálnej imunitnej odpovede, avšak, môže byť aj stratégiou, ktorá týmto baktériám zabezpečí prežitie v hostiteľovi prostredníctvom pritiahnutia makrofágov, v ktorých sa môžu replikovať248. Bakteriálne patogény môžu ovplyvniť migráciu neutrofilov aj prostredníctvom modulácie zápalovej odpovede. Gram-negatívne patogény na to využívajú tzv. sekrečný systém typu III (T3SS = Type III Secretory System), ktorý im umožňuje vstrieknuť efektorové molekuly – efektory (faktory virulencie) do cytoplazmy hostiteľových buniek249 s cieľom vytvoriť prostredie umožňujúce prežitie patogénov, a to napríklad narušením signalizácie prozápalového transkripčného faktora NF-κB (Nuclear Factor-κB), ktoré vedie k zmene produkcie interleukínov. Príkladom môže byť Shigella flexneri, ktorá využíva rôzne T3SS efektory na moduláciu imunitnej odpovede hostiteľa. Medzi jej efektory, ktoré bránia aktivácii NF-B, patria OspG250, OspF251, IpaH9.8252, OspZ253 a OspI molekuly254. Ďalší efektor S. flexneri IpgD indukuje produkciu fosfatidylinozitol-5-fosfátu (PI5P). Vysoké hladiny PI5P spúšťajú internalizáciu a degradáciu ICAM- molekúl v infikovaných epitelových bunkách, a preto významne ovplyvňujú pohyb neutrofilov počas infekcie255. 4.2.3.2 Rozpoznanie mikrobiálnych patogénov Fagocytóza sa začína rozpoznaním a pohltením mikrobiálnych patogénov väčších ako 0,5 µm do vezikuly vytvorenej z plazmatickej membrány, známej ako fagozóm. Toto rozpoznanie sa dosahuje prostredníctvom receptorov, ktoré po naviazaní ligandov následne spúšťajú signálne kaskády vyvolávajúce fagocytózu. Receptory na fagocytoch možno rozdeliť do dvoch skupín a to na receptory pre neopsonizované (neoznačené) častice, tiež pomenované ako vzory rozpoznávajúce receptory (PRR = Pattern Recognition Receptor), a receptory pre opsonizované častice3. 126
Vzory rozpoznávajúce receptory (PRR) môžu priamo identifikovať molekulárne vzory asociované s mikróbmi (MAMPs = Microbe-Associated Molecular Patterns). Medzi tieto receptory patria receptory pre lektíny typu C, ako napríklad Dectin-1, Mincle alebo DC- SIGN256. Na fagocytóze neopsonizovaných častíc sa podieľajú aj upratovacie (scavenger) receptory makrofágov CD14, scavengerové receptory (SR-A, SR-B a CD36) a MARCO (Macrophage Receptor with Collagenous Structure)257,258. CD14 je receptor pre proteín viažuci LPS (LBP = LPS Biding Protein)259. SR-A rozpoznáva LPS na Gram-negatívnych baktériách260. CD36 je ko-receptorom, ktorý sa podieľa na rozpoznávaní LTA a niektorých diacylglycerolov, čo vedie k aktivácii TLR2/6261, avšak LPS a Gram-negatívne baktérie môžu indukovať aj priamu signalizáciu CD36 nezávisle od aktivity TLR262. MARCO sa podieľa na rozpoznávaní viacerých baktérií263. Väzba ligandov na tieto PRR iniciuje zložitú kaskádu intracelulárnych signálov, ktoré modulujú efektorové funkcie fagocytov. K PRR receptorom patria aj Toll-like (TLR) receptory, tie však nefungujú ako receptory aktivujúce pohlcovanie, ale môžu spolupracovať s inými receptormi pre neopsonizované častice pri stimulácii fagocytózy264. Receptory pre opsonizované častice rozpoznávajú mikroorganizmy opsonizované hostiteľom produkovanými solubilnými molekulami nazývanými opsonínmi. Medzi opsoníny patria komplementové fragmenty C3b/iC3b, ktoré rozpoznávajú komplementové receptory (CR1, CR3 a CR4)265 a protilátky (IgG a IgA), ktoré rozpoznávajú FcR receptory (FcγR a FcR) v membránach fagocytov266. Opsonínmi sú aj fibronektín, manózu viažuci lektín (MBL) či laktadherín (MFG-E8 = Milk Fat Globule-EGF factor 8 protein)267. Intracelulárne patogény často využívajú tieto receptory na povrchu fagocytov na vstup do buniek. Extracelulárne patogény, naopak, využívajú rôzne stratégie na únik pred rozpoznaním fagocytmi. 4.2.3.2.1 Únik pred rozpoznaním Fagocytóza je obvykle veľmi účinná a vedie k zničeniu prehltnutého mikroorganizmu, preto sa baktérie snažia uniknúť pred rozpoznaním fagocytmi. Patogénne baktérie na to využívajú rôzne stratégie. Modulácia PRR signalizácie Jedným z mechanizmov prelomenia obrany hostiteľa patogénmi je vyhýbanie sa signalizácii PRR. Medzi bakteriálnymi patogénmi je len niekoľko takých, ktoré priamo inhibujú 127
signalizáciu PRR. Typickým príkladom je Yersinia pestis, ktorej antigén virulencie, LcrV, špecificky zasahuje do dráhy TLR2/6 a stimuluje produkciu IL-10, čo blokuje ochranné zápalové reakcie hostiteľa268. Niektoré bakteriálne patogény sa zameriavajú na intracelulárne dráhy prenosu signálu, ako sú signálne dráhy mitogén-aktivovanej proteínovej kinázy (MAPK = Mitogen-Activated Protein Kinase), TGF-β-aktivovanej kinázy 1 (TAK1 = TGF-β Activated Kinase 1) a dráhy NF-κB. Efektorový proteín YopJ Y. pestis sa zameriava na viaceré MAPK a TAK269. Podobne salmonelový efektorový proteín AvrA sprostredkúva intracelulárne prežívanie baktérií počas infekcie inhibíciou MAPK4 a MAPK7270. Baktérie tiež potláčajú imunitné reakcie hostiteľa priamou interakciou s inhibičnými receptormi, ako sú napríklad receptory obsahujúce inhibičné ITIM (Immunoreceptor Tyrosine- based Inhibitory Motif) motívy alebo prostredníctvom faktorov virulencie, ktoré napodobňujú medziprodukty inhibičnej signalizácie hostiteľa271 (Obr. 4.13). S. aureus takto väzbou na inhibičný receptor PIR-B (Paired Ig-like Receptor B) s ITIM motívom na povrchu makrofágov potláča TLR indukovanú tvorbu prozápalových cytokínov272. Podobne aj povrchové proteíny Moraxella catarrhalis a Neisseria meningitidis potláčajú, po interakcii s adhezívnou molekulou CEACAM-1 nesúcou ITIM-motív, TLR2-sprostredkované zápalové reakcie v epitelových bunkách273. V membráne leukocytov sa nachádzajú lektínove Siglec (Sia-recognizing Ig superfamily lectins) receptory rozpoznávajúce kyselinu sialovú (Sia = Sialic acid), v ktorých je taktiež ITIM-motív. Niektoré patogénne baktérie, ako napr. streptokoky skupiny B (GBS = Group B Streptococci), Campylobacter jejuni, P. aeruginosa a neiserie využívajú sialoglykány zakončené Sia identickou s tou, ktorú produkujú cicavčie bunky ako „molekulové mimikry“274 na interakciu so Siglec receptormi na fagocytoch, čo vedie k potlačeniu imunity a vzniku infekcie275-278. Aj enteropatogénne E.coli (EPEC = Enteropathogenic Escherichia coli) a H. pylori uvoľňujú v cieľových bunkách efektory obsahujúce motívy podobné ITIM motívom na potlačenie imunitných reakcií. EPEC takto využívajú Tir (Translocated intimin receptor) efektor sekrečného systému typu III (T3SS). Tento efektor následne potláča EPEC indukovanú expresiu zápalových cytokínov279. H. pylori zase využívajú CagA (Cytotoxin-associated gene A) efektor sekrečného systému typu IV (T43SS) na potláčenie imunitnej odpovede280. Na druhej strane yersinie a salmonely oslabujú zápalovú signalizáciu prostredníctvom sekrécie efektorov YopH a SptP, ktoré sa podobajú proteínovým tyrozínfosfatázam hostiteľa281,282. 128
Obr. 4.13 Negatívna modulácia zápalových reakcií proti patogénom prostredníctvom inhibičných receptorov nesúcich ITIM (Van Avondt a kol. 2015; upravené)271 Invázia baktérií do hostiteľa sa prejaví prítomnosťou MAMP. Tieto nebezpečné signály sú rozpoznávané PRR receptormi vrátane TLR na povrchu imunitných buniek. Baktérie opsonizované protilátkami sú rozpoznávané FcR receptormi, ktoré majú ITAM motív. FcR prenášajú aktivačné signály prostredníctvom aktivácie proteínovej tyrozínkinázy SYK, zatiaľ čo aktivácia cez PRR aktivuje rôzne signálne kaskády (ako napríklad aktivácia MAPK, NF-κB a PI3K). Aktivácia cez FcR ako aj cez PRR vedie k zápalovej odpovedi nevyhnutnej k eliminácii invadérov. Na druhej strane zápalová odpoveď musí byť kontrolovaná, aby nedošlo k neprimeranému poškodeniu tkaniva. Inhibičné receptory majú často vo svojich vnútrobunkových častiach inhibičné ITIM motívy. Po aktivácii takéhoto receptora sú tyrozínové zvyšky v ITIM motíve fosforylované, a preto môžu viazať cytosólové proteínové tyrozínfosfatázy, ako sú SHP-1 a SHP-2. Tieto negatívne regulačné proteíny ukončujú aktivačné signály sprostredkované PRR a/alebo ITAM-spojenými FcR a prispievajú k tlmeniu zápalovej reakcie. ITAM: Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif; MAPK: Mitogen-Activated Protein Kinase; NF-κB: Nuclear Factor-κB; PI3K: Phosphoinositide 3-Kinase; ITIM: Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibitory Motifs; SYK: Spleen tYrosine Kinase S e k r e t o v a n é p r o t e í ny Bakteriálne patogény sa bránia pred fagocytózou tvorbou rôznych toxínov, ktoré priamo usmrcujú fagocyty. S. aureus takto využíva leukocidíny a -hemolyzín283,284. Dvojzložkové leukocidíny sú vo všeobecnosti vylučované ako neaktívne monomérne podjednotky, ktoré po naviazaní na špecifické receptory (napr. receptory pre chemokíny, komplementový receptor CR3) v membráne cieľovej eukaryotickej bunky polymerizujú, čo vedie k vytvoreniu pórov, ktoré prechádzajú cez fosfolipidovú dvojvrstvu a navodia lýzu bunky285. -hemolyzín sa viaže na metaloproteázu ADAM10 v membráne makrofágov a následne v nej vytvára póry286. 129
Baktérie produkujú aj proteázy, ktoré môžu degradovať opsoníny. Príkladom je stafylokináza (Sak = Staphylokinase), bakteriálny aktivátor plazminogénu, ktorý premieňa plazminogén na aktívnu serínovú proteázu plazmín. Aktivovaný plazmín potom môže degradovať IgG alebo C3b naviazané na povrch baktérií287. S. aureus vylučuje extracelulárny fibrinogén viažuci proteín (Efb), ktorý následne prekrýva opsoníny naviazané na povrch stafylokokov vďaka čomu ich chráni pred fagocytózou288. Streptokoky skupiny A unikajú pred rozpoznaním vylučovaním 2 proteínov (Mac a IdeS). Mac proteín je bakteriálnym homológom CD11b subjednotky integrínového receptora CR3 (CD11b/CD18). Mac sa viaže na CD16 (FcRIII) na povrchu neutrofilov, vďaka čomu blokuje väzbu IgG na CD16289. IdeS (Immunoglobulin G-degrading enzyme S. pyogenes) je cysteínová proteáza, ktorá degraduje ľudské IgG290. Kapsula Baktérie si vytvárajú kapsulu ako obranný mechanizmus a ochrannú vrstvu, aby odolali zmenám prostredia. Prítomnosť kapsuly preto podmieňuje virulenciu baktérií, keďže im počas infekcie umožňuje únik pred fagocytózou a usmrtením sprostredkovaným komplementom. Kapsulu zvyčajne tvoria kapsulárne polysacharidy (CPS = Capsular polysaccharides) pevne pripojené k povrchu buniek. Bakteriálna kapsula však môže mať aj iné zloženie, napr. kapsulu B. anthracis tvorí kyselina poly-D-glutámová291. Niektoré patogény sú chránené kapsulou, ktorá sa podobá hostiteľským polysacharidom, ako napr. kapsula S. pyogenes, ktorú tvorí kyselina hyalurónová (polysacharid extracelulárnej hmoty)292. Z tohto dôvodu tieto kapsuly nie sú imunogénne, a preto hostiteľ netvorí protilátky, ktoré by mohli opsonizovať povrch týchto kapsúl. Navyše regulácia expresie kapsuly umožňuje baktériám prispôsobiť sa rôznym štádiám infekcie, napr. expresia kapsuly u niektorých kmeňov N. meningitidis je znížená počas kolonizácie, ale prítomná počas invázie293, obdobne je to aj u S. pneumoniae294. Polysacharidová kapsula niektorých kmeňov N. meningitidis obsahujúca kyselinu sialovú identickú s tou, ktorú produkujú cicavčie bunky295, rovnako aj streptokokov skupiny B má kapsulárny polysacharid, ktorý taktiež obsahuje terminálne zvyšky kyseliny sialovej. Prítomnosť kyseliny sialovej blokuje ukladanie a aktiváciu komplementu na povrchu baktérie296. Kapsulárne polysacharidy sú tvorené z opakujúcich sa jednotiek, ktoré sa medzi jednotlivými druhmi, ako aj v rámci bakteriálnych druhov, líšia, vďaka čomu vznikajú odlišné sérotypy. Takáto štruktúrna rozmanitosť umožňuje únik pred adaptívnymi imunitnými reakciami 130
(rozpoznaním špecifickými protilátkami). Napríklad na základe variácií v kapsulárnych polysacharidoch sa kmene S. agalactiae delia do 10 séroskupín297, kmene N. meningitidis a S. aureus do 13 séroskupín298,299 a v prípade E. coli bolo zaznamenaných najmenej 80300 a S. pneumoniae 93 kapsulárnych sérotypov301. Biofilm Niektoré extracelulárne baktérie, ako napr. S. aureus alebo P. aeruginosa žijú nielen ako jednobunkové \"planktonické\" organizmy, ale majú aj schopnosť vytvárať komplexné spoločenstvá – biofilmy, ktoré spôsobujú chronické infekcie tým, že unikajú obranným mechanizmom hostiteľa a odolávajú štandardnej antibiotickej liečbe302. Mechanizmy, ktoré umožňujú baktériám v biofilmoch odolávať obrane hostiteľa, zahŕňajú v prvom rade obmedzený prienik leukocytov a ich baktericídnych produktov do biofilmu ako aj zníženú schopnosť leukocytov pohlcovať baktérie tvoriace biofilm303. Keď sa takéto \"frustrované\" neutrofily a makrofágy stretnú s baktériami v biofilmoch, avšak nedokážu ich pohltiť, aktivujú sa a vylučujú toxické látky (enzýmy, ROS), ktoré poškodzujú okolité zdravé tkanivo hostiteľa, čoho výsledkom je chronický zápal. Baktérie v biofilme môžu potlačiť aj aktivitu leukocytov, napr. S. aureus v biofilme podporuje diferenciáciu makrofágov smerom k M2 fenotypu (znížená expresia iNOS a zvýšená expresie arginázy), vďaka čomu sa znižuje ich baktericídna schopnosť304. Povrchové proteíny Proteíny prítomné na povrchu baktérií taktiež môžu ovplyvniť ich rozpoznanie fagocytmi. Tieto proteíny majú v prvom rade ochrániť baktérie pred opsonizáciou komplementom. Patogény k tomu využívajú mechanizmy, ktoré sú podrobne opísané v predchádzajúcej podkapitole 4.2.2. Aj na ochranu pred opsonizáciou protilátkami majú patogénne baktérie vytvorené účinné mechanizmy. Typickým príkladom sú povrchové proteíny S. aureus a to proteín A (SpA = Staphylococcal protein A)305 a proteín Sbi, ktorý má aj sekrétovanú formu306. SpA a Sbi proteíny viažu Fc koniec IgG, vďaka čomu blokujú fagocytózu (takto „nesprávne“ naviazané IgG na povrch baktérií nie sú preto rozpoznávané FcR receptormi fagocytov) a blokujú aktiváciu klasickej dráhy komplementu (naviazaniu C1q zložky na Fc koniec IgG)307. Proteín A má však aj ďalšie účinky: je superantigénom B-lymfocytov, pretože môže prepájať ich BCR (B Cell Receptor) receptory vďaka väzbe na ich Fab koniec podtriedy VH3308,309. SpA aktivuje aj zrážanie vďaka väzbe von Willebrandovho faktora (vWF), čo je veľmi dôležité pri 131
endokarditíde spôsobenej S. aureus, pretože to umožňuje adherenciu patogénu k trombocytom hostiteľa310. SpA sa viaže aj na TNFR1 (Tumor Necrosis Factor Receptor 1) receptor pre TNF- na epitelových bunkách, a preto môže iniciovať stafylokokovú pneumóniu311. Väzba proteínu A na TNFR1 síce napodobňuje väzbu TNF-, ktorá následne vedie k stimulácii zápalu, avšak môže viesť aj k uvoľňovaniu TNFR1 receptora z bunkovej membrány, za ktoré je zodpovedná metaloproteáza TACE (TNF-Alpha-Converting Enzyme). Aktiváciu TACE navodí interakcia medzi proteínom A a EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor). Uvoľnený TNFR1 neutralizuje dostupný TNF-α, ako aj proteín A. Aktivácia dráhy TNFR1 teda nielen stimuluje mobilizáciu neutrofilov, ale je aj mechanizmom, ktorým sa reguluje nábor neutrofilov vyvolaný stafylokokovou infekciou312. Sbi proteín má dôležitú úlohu aj pri sekvestrácii C3 zložky komplementu156. 4.2.3.3 Pohltenie a tvorba fagolyzozómu Po naviazaní sa častice na receptory fagocytov sú aktivované signálne dráhy vedúce k prestavbe aktínového cytoskeletu a lipidov v membráne fagocytu, čo vedie k vytvoreniu pseudopódií okolo pohlcovanej častice a po spojení sa membránových výbežkov na distálnom konci dôjde k vytvoreniu skorého fagozómu, v ktorom je internalizovaná častica313. Fagocyty využívajú aktínový cytoskelet aj počas maturácie fagozómu na reguláciu pohybu vezikúl a na ich spájanie. Presné signálne kaskády spájajúce aktivované receptory s polymerizáciou aktínu nie sú úplne objasnené, avšak je známe, že Rho-GTPázy (RhoA, Rac1 a Cdc42) majú rozhodujúcu úlohu pri riadení prestavby cytoskeletu314. Takto vytvorená vakuola, skorý fagozóm, potom splynie s endozómami a zároveň sa od nej oddelia sekrečné vezikuly, čím sa skorý fagozóm zmení na neskorý fagozóm. Tento neskorý fagozóm sa po fúzii s lyzozómami zmení na mikrobicídnu vakuolu, fagolyzozóm. Výsledkom týchto procesov (maturácie fagozómov) je prestavba membrán, postupná acidifikácia fagozómu (skorý fagozóm má pH 6,1 – 6,5 zatiaľ čo fagolyzozóm má pH 4,5 – 5,0) a vytvorenie prostredia, ktoré zabezpečí usmrtenie a degradáciu pohltených baktérií (Obr. 4.14)315,316. Základnou vlastnosťou fagolyzozómov je ich nízke pH (pH 4,5 – 5,0), ktoré zabezpečuje v membráne umiestnená vakuolárna V-ATPáza premiestňujúca protóny (H+) do lúmenu fagozómu318. Kyslý obsah fagolyzozómu vytvára nepriaznivé prostredie pre väčšinu mikroorganizmov. Nízke pH narúša normálny metabolizmus mnohých baktérií a bráni využívaniu viacerých základných mikrobiálnych živín. Nízke pH je potrebné aj na aktiváciu mnohých hydrolytických enzýmov, ktoré rozložia pohltené mikroorganizmy. 132
Obr. 4.14 Pohltenie a tvorba fagolyzozómu (Lee a kol. 2020; upravené)317 Vznikajúci fagozóm sa postupnými interakciami s cytosólovými vezikulami mení na mikrobicídnu vakuolu, fagolyzozóm. Tento proces možno opísať v troch štádiách dozrievania: skoré, neskoré a fagolyzozóm. Pri tejto maturácii sa v membráne fagozómu objavujú molekuly, ktoré riadia fúziu membrán, ako sú GTPázy Rab5 a Rab7. Fagolyzozóm sa pôsobením protónovej pumpy V-ATPázy stáva čoraz kyslejším a získava rôzne degradačné enzýmy, ako sú katepsíny, proteázy, lyzozýmy a lipázy. EEA1: Early Endosome Antigen 1; LAMP: Lysosome-Associated Membrane Protein 4.2.3.3.1 Ovplyvnenie tvorby fagolyzozómu Patogénne baktérie sa v snahe uniknúť pred usmrtením vo fagocytoch snažia (1) inhibovať fagocytózu, alebo (2) inaktivovať mechanizmy vedúce k tvorbe fagolyzozómu, napr. zabránením fúzie fagozómu s lyzozómami alebo jednoducho (3) uniknú z fagozómov do cytosólu. Patogény sa v prvom rade snažia inhibovať fagocytózu. Príkladom môžu byť toxíny C. difficile, ktoré glykozylujú Rho GTPázy s cieľom dezorganizovať aktín, čím sa zníži migrácia fagocytov a fagocytóza319. Iným príkladom sú toxíny regulujúce funkciu rôznych Rho GTPáz tým, že pôsobia ako proteíny aktivujúce GTPázy (GAP = GTPase Activating Proteins). Tieto toxíny sú efektorovými molekulami transportovanými T3SS systémom do cytosólu eukaryotických buniek. Yersinie majú T3SS efektor YopE, ktorý po vstreknutí do cytosólu interaguje s RhoA320 a YopO, ktorý bráni aktivácii Rac proteínov (Rho GTPázy), a preto aktívne inhibujú fagocytózu321. S. enterica má taktiež efektorovú molekulu T3SS systému – proteínovú tyrozínfosfatázu (SptP = Salmonella protein tyrosine Phosphatase ), ktorá pôsobí ako GAP aktivujúca proteíny Cdc42 a Rac1, vďaka čomu dochádza k zmenám v aktínovom cytoskelete 133
hostiteľských buniek322. SptP taktiež potláča produkciu IL-8, čím podporuje inváziu salmonel a vnútrobunkovú replikáciu323. Obr. 4.15 Regulácia Rho GTPáz (Jank a kol. 2007; upravené )319 Rho GTPázy sú regulované cyklom GTPáz. Rho proteíny sú neaktívne, ak sú naviazané na guanozíndifosfát (GDP) a aktívne, ak sú naviazané na guanozíntrifosfát (GTP). Aktivitu Rho GTPáz regulujú tri rodiny proteínov. GEF faktory (Guanine nucleotide Exchange Factors) spôsobujú aktiváciu Rho GTPáz. GAP (GTPase Activating Proteins) uľahčujú inaktiváciu proteínov Rho stimuláciou ich GTP hydrolyzačnej aktivity. GDI (Guanine nucleotide Dissociation Inhibitors) udržiavajú neaktívnu formu Rho proteínov v cytosóle. Aktívna forma Rho interaguje s viacerými efektormi vrátane proteínových a lipidových kináz, fosfolipáz a rôznych adaptorových proteínov na kontrolu rôznych imunitných a obranných funkcií cieľových buniek vrátane funkcie epitelovej bariéry, signalizácie imunitných buniek, fagocytózy, produkcie O2-, hojenia rán, signalizácie imunitných buniek. GTP: Guanozíntrifosfát; GDP: Guanozíndifosfát; GEF: Guanine nucleotide Exchange Factor; GAP: GTPase Activating Proteins; GDI: Guanine nucleotide Dissociation Inhibitor Aj P. aeruginosa produkuje cytotoxín ExoS, ktorý taktiež pôsobí ako GAP pre RhoA, Rac1 a Cdc42, vďaka čomu dochádza k zmenám v aktínovom cytoskelete hostiteľských buniek324. Niektoré patogény ako napr. salmonely a M. tuberculosis zasahujú do tvorby fagolyzozómu, vďaka čomu si uľahčujú prežitie. Salmonely využívajú svoj T3SS, pomenovaný ako Spi/Ssa, ktorý exportuje proteín SPI-2, kódovaný ostrovom patogenity SpiC, do cytoplazmy hostiteľskej bunky a účinne blokuje fúziu fagozómu a lyzozómu325. M. tuberculosis bráni maturácii fagozómu vďaka zníženiu akumulácie fosfatidylinozitol-3-fosfátu (PI3P = Phosphatidylinositol-3-phosphate) na membráne fagozómu a z toho vyplývajúcej zníženej prítomnosti proteínov viažucich PI3P-EEA1 a Hrs (Hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate), ktoré sú potrebné na fúziu fagozómov s lyzozómami326. Presné mechanizmy sa stále študujú, ale napr. niektoré mykobakteriálne lipidy a glykolipidy ako napr. lipoarabinomanan (LAM) a trehalóza dimykolát (TDM), znemožňujú fúziu fagozómu s lyzozómami. Okrem toho aj ďalšie molekuly mykobaktérií, ako sú lipidová fosfatáza SapM, tyrozínfosfatáza PtpA a proteínkináza G (PknG), bránia dozrievaniu fagozómov327. Okrem toho 134
mykobaktérie využívajú ESX (ESAT6 Secretion) sekrečný systém (známy aj ako sekrečný systém typu VII) na manipuláciu tvorby fagolyzozómov. ESX-3 exportuje dva proteíny, ktoré interagujú s Hrs a zhoršujú dozrievanie fagozómov prostredníctvom narušenia endozomálneho triediaceho komplexu potrebného na transport (ESCRT = Endosomal Sorting Complex Required for Transport)328. Efektorové molekuly ESX-1 sú zodpovedné za prasknutie fagozómu, v ktorom sú pohltené mykobaktérie, vďaka čomu tieto uniknú do cytosólu, kde dochádza k tvorbe autofagozómov329. Ďalšou únikovou stratégiou, ktorú využívajú niektoré intracelulárne patogény s cieľom zabezpečiť prežitie vo fagocytoch, je únik z fagozómov do cytoplazmy. L. monocytogenes na tento únik využíva listeriolyzín O (LLO) a fosfolipázy (PLC a PLD = Phospholipase C, D), ktoré spôsobia rozpad fagozómu a únik baktérií do cytoplazmy330,331. Následne v cytosóle lokalizované listérie využívajú ActA (Actin-Assembly inducing) proteín332, na vytvorenie aktínových „kométových chvostov“ , ktoré ich posúvajú naprieč bunkou a uľahčujú ich šírenie medzi bunkami333. Podobne aj S. flexneri môže narušiť membránu fagozómu a uniknúť do cytosólu334, kde následne jej IscA proteín iniciuje polymerizáciu aktínu335. Aktínové \"kométové chvosty\" potom poháňajú aj tieto baktérie cez cytosól do susedných buniek. Baktérie z rodu Rickettsia sú obligátne intracelulárne patogény, ktoré taktiež môžu uniknúť z fagozómu. Rickettsia využíva na narušenie fagozómovej membrány fosfolipázu A2336. Po vstupe do cytozómu ich RickA proteín aktivuje komplex Arp2/3, aby sa iniciovala polymerizácia aktínu337. Aj rickettsie vytvárajú aktínové chvosty, ktoré im umožňujú priamy prenos z bunky na bunku. 4.2.3.4 Deštrukcia Fagocyty majú tri hlavné antimikrobiálne mechanizmy na odstraňovanie patogénov. Neutrofily a v menšej miere aj makrofágy využívajú komplex NADPH-oxidázy (NOX) na premenu molekulárneho kyslíka (O2) na reaktívne formy kyslíka (ROS), ako je superoxidový aniónový radikál (O2•-), peroxid vodíka (H2O2) a iné. Tento proces sa nazýva respiračné vzplanutie338 (Obr. 4.16). Superoxiddismutáza (SOD) katalyzuje dismutáciu superoxidového aniónového radikálu na H2O2, ktorý môže reagovať s ďalším superoxidovým aniónovým radikálom (O2•-) za vzniku hydroxylového radikálu. Ak je vo fagolyzozóme prítomné redukované železo Fe2+, reaguje s H2O2 za vzniku hydroxylového radikálu (OH•); tento proces je známy ako Fentonova reakcia339. Nakoniec myeloperoxidáza katalyzuje reakciu H2O2 s iónmi Cl- za vzniku kyseliny chlórnej340. K toxickému účinku HClO prispievajú všetky voľné 135
radikály, ktoré pri tomto procese (respiračnom vzplanutí) vznikajú (superoxid, peroxid vodíka, peroxynitrit), pretože sa podieľajú na peroxidácii proteínov a lipidov, nitrozylácii proteínov a iných oxidačných zmenách341. ROS produkujú aj mitochondrie. Mitochondriálne ROS (mROS) sú vo väčšine prípadov vedľajším produktom oxidačnej fosforylácie. Novšie štúdie však preukázali, že mROS pôsobia ako mikrobiálny obranný mechanizmus v makrofágoch342. Aktivované makrofágy vytvárajú oxid dusnatý (NO) pôsobením induktívnej NO syntázy (iNOS)343. Tento enzým katalyzuje reakciu, v ktorej sa z L-arginínu tvorí oxid dusnatý (NO•) a L-citrulín. Aj keď NO• sám nie je veľmi toxický, po reakcii s O2•- a H2O2 vznikajú vysoko toxické reaktívne formy dusíka (RNS), ako je peroxynitrit (ONOO-) (Obr. 4.16). Obr. 4.16 Usmrcovanie pohltených mikroorganizmov vo fagolyzozóme (Uribe-Quero a Rosales 2017; upravené)348 Pohltené baktérie sú usmrcované vo fagolyzozómoch, ktoré vznikajú fúziou fagozómov s lyzozómami (Obr. 4.16). Vo fagolyzozómoch sa nachádzajú molekuly, ktoré priamo poškodzujú integritu pohltených baktérií. K týmto molekulám patria antimikrobiálne peptidy ako defenzíny344 a katelicidíny345. Defenzíny sa nachádzajú v primárnych granulách neutrofilov. Viažu sa na záporne nabité molekuly na mikrobiálnom povrchu a následne permeabilizujú bakteriálnu membránu vytváraním kanálov prepúšťajúcich ióny346. Katelicidíny sú uložené v sekundárnych granulách neutrofilov ako neaktívne prekurzory, ktoré sa účinkom elastázy (prítomnej v primárnych granulách) menia v lúmene fagolyzozómu na aktívne 136
antimikrobiálne peptidy, ktoré permeabilizujú bunkovú stenu a vnútornú membránu Gram- pozitívnych baktérií347. Charakteristickou vlastnosťou fagolyzozómov je ich nízke pH. V-ATPáza premiestňuje protóny (H+) do lúmenu fagozómu. NADPH-oxidáza je enzymatický komplex tvorený transmembránovými proteínmi CYBB a CYBA a cytosólovými zložkami: NCF-4, NCF-1 a NCF-2. Na účinnú aktiváciu tohto enzýmového komplexu sú potrebné aj Rac proteíny patriace medzi Rho GTPázy (Obr. 4.15). Myeloperoxidáza (MPO) katalyzuje reakciu H2O2 s iónmi Cl- za vzniku kyseliny chlórnej . Induktívna syntáza oxidu dusnatého (iNOS) katalyzuje reakciu, v ktorej sa z L-arginínu tvorí radikal oxidu dusného (NO•) a L-citrulín. NO• po reakcii so superoxidovým aniónovým radikálom (O2•-) tvorí vysoko toxické reaktanty, ako sú peroxynitrit (ONOO-) a radikál oxidu dusnatého (NO•). Fe2+, ktorý je nevyhnutný pre rast baktérií, viaže laktoferín alebo ho NRAMP-1 (Natural Resistance-Associated Macrophage Protein 1) transportuje von z fagozómu. Defenzíny sú antimikrobiálne peptidy, ktoré na baktériách vytvárajú multimerné póry priepustné pre ióny. Katepsíny sú lyzozomálne proteázy. Lyzozým rozkladá peptidoglykán v bunkovej stene baktérií, a vylučovaná fosfolipáza A2 typu IIA (sPLA2-IIA) rozkladá aniónové fosfolipidy, ako je fosfatidylglycerol, hlavná fosfolipidová zložka bakteriálnych membrán. Vo fagolyzozómoch sú aj proteázy, z ktorých katepsíny (cysteínové proteázy) poškodzujú bakteriálne membrány a hydrolázy, napr. lyzozým, štiepiaci peptidoglykán ako aj ďalšie enzýmy, ktoré dokončia lýzu bakteriálnych buniek. Jedným z týchto enzýmov je fosfolipáza A2 typu IIA (sPLA2-IIA), ktorá prednostne štiepi fosfatidylglycerol bakteriálnych bunkových membrán340, a preto má silnú antimikrobiálnu aktivitu hlavne proti Gram-pozitívnym baktériám349. Prežívanie mikroorganizmov vo fagocytoch môže byť obmedzené aj sekvestráciou (vychytávaním) živín dôležitých pre rast mikroorganizmov. Aktívna sekvestrácia živín hostiteľom označovaná ako \"nutričná imunita\", je dôležitá obranná stratégia hostiteľa. Príkladom je sekvestrácia Fe2+ a Mn2+, ktoré môžu byť z fagozómu odstránené pomocou špeciálnych záchytných molekúl, ktoré sa do fagozómu dostali po fúzii s granulami, alebo pomocou transportérov prítomných v membráne fagozómu. Príkladom záchytnej molekuly transportovanej do fagolyzozómu z granúl neutrofilov je laktoferín, glykoproteín viažuci Fe2+ nevyhnutné pre rast baktérií350 (Obr. 4.16). V membráne fagolyzozómov je transportér NRAMP-1 , ktorý transportuje katióny Fe2+ a Mn2+ z fagolyzozómu von, čo tiež prispieva k obmedzeniu rastu pohltených baktérií351 (Obr. 4.16). Tento transportér vyžaduje H+ ióny, 137
preto je NRAMP-1 účinnejší v kyslom prostredí fagolyzozómu352. Fe2+ sú potom exportované z bunky von membránovým proteínom feroportínom (Fpn = Ferroportin)353. Počas bakteriálnej infekcie IL-6 indukuje v pečeni produkciu proteínu akútnej fázy hepcidínu, ktorý sa viaže na feroportín, čo vedie k jeho internalizácii a degradácii, čím blokuje únik železa z makrofágov354. Retencia železa v makrofágoch prostredníctvom pôsobenia hepcidínu je dobrou stratégiou na obmedzenie dostupnosti tohto kovu pre cirkulujúce extracelulárne patogény, zatiaľ čo v prípade infekcie intracelulárnym mikróbom, ako napr. M. tuberculosis, môže byť škodlivá355. Okrem toho sa neutrofily bránia proti mikróbom uvoľňovaním zápalových mediátorov v extracelulárnom priestore a tvorbou neutrofilových extracelulárnych pascí (NET)227. NET sú veľké siete vlákien zložené z dekondenzovaného chromatínu a cytosólových a granulových proteínov apoptotických neutrofilov. NET zachytávajú extracelulárne patogény, čím uľahčujú ich neutralizáciu356. Napokon fagocyty posilňujú a usmerňujú následné vrodené a adaptívne imunitné reakcie prostredníctvom priameho kontaktu s inými imunitnými bunkami a sekréciou cytokínov a chemokínov. 4.2.3.4.1 Únik pred deštrukciou Po ingescii sú mikroorganizmy vystavené veľmi drsnému prostrediu fagolyzozómu, preto sa mnohé patogény zameriavajú aj na únik pred deštrukciou vo vnútri fagozómu. Ako už bolo spomenuté vyššie, jedným z prvých znakov dozrievania fagozómu je rýchla a progresívna acidifikácia fagozómu vďaka zvyšujúcemu sa množstvu molekúl vakuolárnej V- ATPázy v membráne fagozómu. Nízke pH priamo ovplyvňuje mnohé patogény a je tiež potrebné na aktiváciu mnohých hydrolytických enzýmov. Niektoré patogény preto využívajú inhibíciu acidifikácie fagozómov na únik pred deštrukciou, napr. M. tuberculosis bráni akumulácii V-ATPázy na membráne fagozómu357, S. pyogenes blokuje aktivitu V-ATPázy prostredníctvom expresie povrchových proteínov regulovaných faktorom virulencie Mga (transkripčný faktor)358 a Rhodococcus equi a Y.pestis majú schopnosť odstrániť V- ATPázy359,360. Niektoré patogény tvoria ureázu, enzým, ktorý katalyzuje hydrolýzu močoviny za vzniku amoniaku, čo vedie k zvýšeniu pH fagozómu. Príkladmi patogénov, ktoré využívajú túto stratégiu na prežitie vo fagozóme, sú S. aureus361 a H. pylori362. Baktérie si však vyvinuli mechanizmy na vychytávanie ROS a RNS. S. aureus vylučuje stafylokokový inhibítor peroxidázy (SPIN = Staphylococcal Peroxidase Inhibitor), ktorý 138
inaktivuje ľudskú MPO363. S. aureus má aj dve superoxiddismutázy, ktoré zneškodňujú superoxidové radikály364 a na elimináciu peroxidov a H2O2 využíva alkylhydroperoxidreduktázu (AhpC) a katalázu (KatA)365. Niektoré patogény, napr. S. Typhimurium alebo enteropatogénne E.coli využívajú flavohemoglobín (Hmp = Flavohemoglobin) ako denitrozylázu, ktorá odstraňuje NO•366,367. Avšak tento mechanizmus musí byť kontrolovaný, pretože expresia Hmp v neprítomnosti NO• vedie k zvýšenému oxidačnému stresu368. Represor citlivý na dusitany (NsrR) je transkripčný regulátor Hmp citlivý na NO•, ktorý používajú mnohé baktérie na identifikáciu a zneškodnenie NO•369. Patogény majú aj ďalšie mechanizmy, ktoré im umožňujú odolávať mikrobicídnym zložkám nachádzajúcim sa vo fagolyzozómoch. Napríklad S. aureus dokáže odolávať lytickému účinku lyzozýmu vďaka tvorbe O-acetyltransferázy A (OatA), ktorá spôsobuje O-acetyláciu peptidoglykánu, ktorý je vďaka tomu odolný voči pôsobeniu lyzozýmu370,371. Baktérie môžu odolávať pôsobeniu antimikrobiálnych peptidov (α-defenzínov) vďaka modifikácii svojich bunkových membrán zmenou náboja alebo tvorbou enzýmov, ktoré AMP degradujú. Napríklad S. aureus tvorí stafylokinázu89 alebo metaloproteázu aureolyzín, ktoré môžu degradovať tieto defenzíny78. Baktérie využívajú ióny kovov (Fe2+, Mn2+, Cu2+, Zn2+) pre svoju metabolickú aktivitu, replikáciu a obranu pred oxidačným stresom. Ióny kovov sa však podieľajú aj na produkcii ROS a RNS372. Fagocyty obmedzujú dostupnosť iónov kovov a tým inhibujú rast baktérií373, čo sa označuje ako \"nutričná imunita\"374. Zatiaľ čo Fe2+, Mn2+ sú z fagozómu odstraňované, Cu2+, Zn2+ sa vo fagocytoch hromadia, vďaka čomu môžu pôsobiť toxicky na pohltené mikróby. Baktérie získavajú železo vďaka tvorbe siderofórov – bakteriálnych chelátorov Fe3+ 375. Keď sa siderofóry dostanú do cytoplazmy baktérií, Fe3+ sa redukuje na Fe2+ alebo sa uvoľní enzymatickou degradáciou siderofóru. Siderofóry môžu viazať aj iné dôležité prvky, ako sú Mo, Mn, Co a Ni tak, aby boli dostupné pre mikróby376. Avšak makrofágy produkujú lipokalín- 2 (Lcn2), ktorý selektívne viaže siderofóry (enterobaktín produkovaný S.Typhimurium377 alebo karboxymykobaktín M. tuberculosis378), vďaka čomu je železo naviazané na siderofóry stále neprístupné pre tieto baktérie. Baktérie získavajú železo aj vďaka vychytávaniu hému, hemoglobínu alebo komplexov hemoglobínu s haptoglobínom na ich povrchové receptory a ich následnému transportu do cytoplazmy baktérií, kde je hém enzymaticky degradovaný. Niektoré baktérie, ako napr. Neisseria spp., Morexella catarrhalis a Haemophilus influenzae, majú receptor, ktorým vychytávajú železo viazané na transferín379. Hoci sa železo prevažne prenáša 139
v chelátovej forme, niektoré baktérie prenášajú aj voľné Fe2+ za pomoci membránových transportérov z rodiny FeoB380. Mangán (Mn) a zinok (Zn) majú tiež dôležitú úlohu u baktérií, pretože sú kofaktormi mnohých enzýmov381. Mnohé patogény využívajú superoxiddismutázy závislé od Mn na obranu proti superoxidovému aniónovému radikálu382,383. V niektorých baktériách môže Mn2+ nahradiť reaktívnejšie Fe2+ v proteínoch obsahujúcich železo, čo znižuje oxidačné poškodenie týchto proteínov384. Zinok plní katalytickú ako aj štruktúrnu úlohu v proteínoch385. Import Mn2+ a Zn2+ cez cytoplazmatickú membránu baktérií je primárne umožnený transportérmi rodiny ABC alebo NRAMP386. Na obranu pred intoxikáciou Mn2+ a Zn2+ využívajú baktérie ATPázy typu P. Tieto ATP poháňané pumpy sú substrátovo špecifické, čo je dané membránovým rozpoznávacím miestom pre kovy387. 4.2.3.5 Autofágia Nesprávne zložené proteíny môžu vytvárať cytoplazmatické agregáty, ako sú agrezómy a štruktúry podobné agrezómom (ALIS = Aggresome-Like Induced Structures)388, ktoré sú po označení ubikvitínom (ubikvitinizácii) odstránené v proteazómoch alebo v autofagozómoch. Autofágia je proces, ktorý pohlcuje a odstraňuje cytoplazmatické zložky ako sú poškodené organely, proteínové agregáty či mikroorganizmy. Existujú tri definované typy autofágie: makroautofágia, mikroautofágia a autofágia sprostredkovaná chaperónmi, ktoré podporujú proteolytickú degradáciu cytosólových zložiek v lyzozóme389. Intracelulárne patogény môžu byť cielené na degradáciu prostredníctvom selektívnej autofágie390. Baktérie, ktoré uniknú do cytosólu bunky, sú na povrchu ubikvitinované. Ubikvitín je vysoko konzervovaný 76-aminokyselinový polypeptid, ktorý môže byť kovalentne pripojený k iným proteínom prostredníctvom trojstupňovej reakcie, pri ktorej sa voľný ubikvitín najprv kovalentne naviaže na ubikvitín-aktivujúci enzým (E1), následne sa prenesie na ubikvitín-konjugujúci enzým (E2) a nakoniec sa pomocou ubikvitínligázy (E3) pripojí na substrát391,392. Autofágové adaptérové proteíny – NDP52, p62 alebo optineurín (OPTN) – sa teraz môžu viazať na ubikvitinované proteíny na povrchu baktérií a zároveň na LC3-PE pripojený k fagofórom. Autofágia zahŕňa tvorbu dvojmembránovej štruktúry, známej ako autofagozóm, ktorá pohltí časť cytosólových zložiek. Na membránu autofagozómov je naviazaný ubikvitínu podobný proteín LC3. Autofagozómy sa potom spájajú s lyzozómami a rozkladajú ich obsah (Obr. 4.17). Autofágia je preto dôležitá nielen pre udržanie bunkovej homeostázy, ale je aj nenahraditeľným 140
obranným mechanizmom pred intracelulárnymi patogénmi , keďže obmedzuje replikáciu baktérií v cytosóle393. Obr. 4.17 Eliminácia intracelulárnych patogénov autofágiou (Jiang a Chen 2021; upravené)394 Ubikvitín označuje invázne bakteriálne patogény tým, že sa zameriava na bakteriálne proteíny alebo pridružené hostiteľské zložky. Adaptorové proteíny, ako sú p62, NDP52 a optineurín (OPTN), sa viažu na ubikvitín naviazaný na povrch baktérií ako aj na proteín LC3, vďaka čomu spájajú tieto ubikvitinované baktérie s povrchom špecializovanej dvojmembránovej organely nazývanej autofagozóm, ktorý sa po spojení s lyzozómami mení na autolyzozóm, v ktorom je pohltená baktéria degradovaná. Prekurzory antibakteriálnych peptidov sú podobným spôsobom označené p62 proteínom a transportované do autofagolyzozómu. Hoci je autofágia účinným mechanizmom na odstraňovanie baktérií, niektoré intracelulárne patogény využívajú sofistikované stratégie na potlačenie autofágie, alebo dokonca na zabránenie rozpoznaniu a následnému zachyteniu autofágom. L. monocytogenes sa vyhýba autofágii pomocou proteínov ActA a internalínu K395,396, zatiaľ čo efektorový proteín RavZ Legionella pneumophila inhibuje autofágiu prostredníctvom ireverzibilnej dekonjugácie proteínu Atg8 pripojeného na membránach autofagozómov397. Aj S. Typhimurium vďaka tvorbe SPI-2 T3SS efektorov sekrečného systému typu 3 môže uniknúť z fagozómu do cytosólu hostiteľskej bunky, kde indukujú tvorbu ubikvitinovaných agregátov ALIS. Avšak S. Typhimurium môže tvorbou SseL (Salmonella secreted factor L) 141
proteínu s deubikvitinázovou (DUB = DeUBiquitylation) aktivitou maskovať prítomnosť týchto agregátov a uniknúť pred autofágiou398,399. S. flexneri bráni autofágii tým, že jej proteín IcsB blokuje interakciu iného bakteriálneho proteínu VirG s hostiteľskou zložkou autofágie proteínom Atg5400. Ďalším príkladom toho, ako patogény využívajú inovatívne stratégie na manipuláciu s hostiteľskými bunkami, sú efektorové proteíny CHBP (Cif homolog in Burkholderia pseudomallei) z Burkholderia pseudomallei a Cif (Cycle inhibiting factor) z enteropatogénnych E.coli. CHBP priamo modifikuje ubikvitín a ubikvitínu podobný proteín NEDD8 deamidáciou špecifického glutamínového zvyšku na kyselinu glutámovú401. Deamidovaný ubikvitín je nefunkčný pri tvorbe ubikvitínových reťazcov a deamidovaný NEDD8 po konjugácii s RING ligázami potláča ich aktivitu pri spájaní ubikvitínov. Aj u mykobaktérií bolo identifikovaných viacero molekúl inhibujúcich ich autofágiu. Medzi tieto molekuly patrí proteín EIS (Enhanced Intracellular Survival)402,403 a niekoľko proteínov rodín PE, PGRS a PPE asociovaných s virulenciou M. tuberculosis404. Mechanizmy, ktorými môžu tieto mykobakteriálne efektory inhibovať autofágiu, nie sú dobre známe. 4.2.3.6 Extracelulárne pasce Extracelulárne pasce (ET = Extracellular Traps) sú výbežky chromatínu, histónových proteínov, DNA, proteáz a AMP, ktoré zachytávajú baktérie a tvoria dôležitú súčasť imunitnej odpovede na infekciu405, prvýkrát opísané v súvislosti s neutrofilmi227. Extracelulárne pasce neutrofilov (NET = Neutrophil Extracellular Traps) sa líšia svojou tvorbou (rýchle alebo pomalé) a zložením (chromatín alebo mitochondriálna DNA)406. Pôvodné opisy vzniku NET poukázali na ich vznik v priebehu 3 hodín deštrukciou jadrovej membrány, čo vedie k smrti neutrofilu. Avšak NET sa môžu tvoriť aj z mitochondriálnej DNA a to mechanizmom, ktorý je nezávislý od usmrtenia neutrofilov406, čo im umožňuje naďalej sa podieľať na imunitnej odpovedi. Tvorba NET je indukovaná ako odpoveď na množstvo rôznych podnetov, ako napríklad LPS, IL-8, komplementový faktor C5a a baktérie407. Tvorba ET na kontrolu baktérií môže byť indukovaná aj u eozinofilov408, mastocytov409 a makrofágov409. Makrofágové ET (MET = Macrophage Extracellular Traps) zohrávajú úlohu v obrane hostiteľa aj tým, že umožňujú susedným makrofágom fagocytovať zachytené baktérie vďaka čomu spomaľujú šírenie sa infekcie410. Tvorba MET bola napr. pozorovaná v bovinných makrofágoch získaných z monocytov v reakcii na Mannheimia haemolytica a na jej leukotoxín (LKT)409. 142
Avšak baktérie môžu využiť rôzne stratégie na únik pred zachytávaním a usmrcovaním v NET, a tým zvýšiť svoju virulenciu. V prvom rade baktérie sa spoliehajú na použitie nukleáz, ktoré napádajú DNA kostru sieťovú štruktúru NET. S. pyogenes takto vďaka tvorbe DNázy Sda1 uniká pred zabíjaním v NET411. S. pneumoniae a S. aureus vďaka tvorbe endonukleáz môžu zabrániť zachyteniu sieťami NET412,413. S. aureus môže aj vďaka tvorbe koagulázy degradovať NET414. P. aeruginosa zasa využíva mechanizmus „molekulových mimikrov“ tým, že absorbuje na svoj povrch kyselinu sialovú (Sia). Takto obalený P. aeruginosa väzbou na siglec-9 receptory neutrofilov stimuluje v neutrofiloch produkciu silných imunomodulačných cytokínov IL-10 a TGF-β. Navyše táto interakcia oslabuje tvorbu ROS a uvoľňovanie neutrofilovej elastázy v takto aktivovaných neutrofiloch. Keďže tvorba ROS je nevyhnutná na aktiváciu NETózy, P. aeruginosa obalený Sia nedostatočne aktivuje tvorbu NET415. Aj bunková stena S. pneumoniae a Leischmania donovani modifikovaná D-alanyláciou LTA a prítomnosťou povrchového lipofosfoglykánu chráni tieto patogény pred antimikrobiálnou aktivitou NET416,417. Podobne aj prítomnosť lipidov v bunkovej stene M.tuberculosis chráni tieto patogény pred usmrtením v NET vytvorených infikovanými neutrofilmi418. Neutrofily spolupracujú s makrofágmi pri obrane pred mykobaktériami. Mykobaktérie vyvolávajú zhlukovanie alebo agregáciu leukocytov a následne NETózu, ktorá však nevedie k usmrteniu týchto patogénov. Následne makrofágy pohlcujú uvoľnené proteíny azurofilných granúl neutrofilov a využívajú ich na usmrtenie mykobaktérií419,420. Aj mykobaktériami infikované makrofágy vytvárajú extracelulárne pasce (MET), ich tvorba závisí od prítomnosti IFN-γ a efektorových molekúl ESX-1, sekrečného systému mykobaktérií, ktoré sú zodpovedné za ruptúru fagozómu a následný únik baktérií421. 4.3 ÚNIKOVÉ STRATÉGIE BAKTÉRIÍ PRED ADAPTÍVNOU IMUNITNOU ODPOVEĎOU Vrodený imunitný systém je prvou líniou obrany proti invazívnym patogénom a v boji proti infekcii pôsobí rýchlo a nešpecificky. Naproti tomu adaptívny imunitný systém reaguje oveľa pomalšie, ale je schopný rozpoznať jedinečné antigény a využiť imunologickú pamäť na posilnenie imunitnej odpovede po následnom vystavení rovnakým antigénom. Adaptívny imunitný systém sa pri svojej činnosti spolieha na T- a B-lymfocyty. B-lymfocyty sú dôležité ako producenti protilátok (plazmatické bunky), zatiaľ čo jednotlivé subpopulácie T-lymfocytov ako sú CD4+ Th, CD8+ Tc, gama delta (γδ) a regulačné T bunky (Tregs) majú jedinečné funkcie 143
(Obr. 4.1). Keďže adaptívna imunitná odpoveď má dôležitú úlohu pri eliminácii mikrobiálnych invadérov, perzistentné patogény využívajú rôzne mechanizmy, ktorými na rôznych úrovniach potláčajú vznik adaptívnej imunitnej odpovede. Infekcie navodené intracelulárnymi patogénmi aktivujú vrodenú aj adaptívnu imunitnú odpoveď a vytvárajú prozápalové prostredie, ktoré podporuje diferenciáciu CD4+ T-buniek smerom k Th1 fenotypu. Tieto Th1 bunky vylučujú IFN-γ, ktorý nielen zvyšuje mikrobicídny potenciál makrofágov, ale v makrofágoch indukuje aj expresiu molekúl ako sú molekuly MHC triedy I a triedy II, či kostimulačné molekuly. Všetky tieto účinky v konečnom dôsledku vedú k usmrteniu baktérií žijúcich v makrofágoch a k odstráneniu infekcie422. M a n i p u l á c i a s p r e z e n t á c i o u a n t i g é n o v v MHC m o l e k u l á ch Jedným z mechanizmov, ktorý umožňuje baktériám manipulovať s adaptívnou imunitnou odpoveďou, je potlačenie prezentácie ich antigénov MHC molekulami. V MHC molekulách sa nachádzajú väzbové miesta pre antigénne peptidy, ktoré vznikli zo spracovaných endogénnych (MHC I) alebo exogénnych (MHC II) antigénov. T-lymfocyty môžu rozpoznať iba antigénne peptidy naviazané na vlastné MHC molekuly. K tomu, aby vznikla špecifická imunitná odpoveď je preto potrebné, aby tieto antigénne peptidy prezentované v komplexoch s MHC molekulami rozpoznali TCR receptory na T-lymfocytoch. MHC molekuly triedy Ia (ďalej len MHC I) sú exprimované na povrchu jadrových buniek a ich úlohou je prezentácia spracovaných endogénnych antigénov (napr. vírusových antigénov) CD8+ cytotoxickým Tc-lymfocytom. MHC molekuly triedy II (ďalej len MHC II) sú exprimované na povrchu profesionálnych antigén prezentujúcich buniek (APC) (dendritové bunky, makrofágy a B-lymfocyty) a ich úlohou je prezentácia spracovaných exogénnych antigénov (napr. bakteriálnych antigénov) CD4+ pomocným Th-lymfocytom423. Expresiu MHC II na iných typoch buniek indukuje napr. IFN-424. Z tohto dôvodu sú únikové stratégie bakteriálnych patogénov pred rozpoznaním zložkami adaptívnej imunity zamerané na ovplyvnenie prezentácie antigénov v MHC II molekulách. Novo syntetizované a reťazce MHC II molekúl sa v endoplazmatickom retikule spájajú s invariantným reťazcom Ii, ktorého úlohou je blokovanie antigén viažuceho miesta v MHC II425. Na transkripčnej úrovni je expresia MHC II ako aj Ii reťazca riadená komplexom proteínov viažucich DNA, označovaným aj ako MHCII enhanceozóm, pričom aktivácia tohto komplexu vyžaduje spojenie s MHCII transaktivátorom (CIITA = Class II Transactivator)426. CIITA je transkripčný koaktivátor, ktorý reguluje transkripciu génov MHC I. a II. triedy aktivovanú IFN-γ426,427. 144
Takto vzniknutý nezrelý MHC II komplex (MHCII-Ii) opúšťa endoplazmatické retikulum, migruje cez Golgiho sieť na povrch bunky, odkiaľ je endocytózou pohltený do neskorého endozómu, alebo je priamo transportovaný do neskorého endozómu428, kde po proteolytickom štiepení katepsínom429,430, alebo (v závislosti od typu buniek) zostane z Ii reťazca iba krátky CLIP (Class II-associated Ii Peptide) reťazec, ktorý je stále naviazaný do antigén viažuceho žliabku MHC II molekuly431. Po fúzii MIIC vakuoly s endozómom alebo fagozómom, v ktorom sú pohltené bakteriálne antigény proteolyticky naštiepené, je CLIP reťazec uvoľnený (u ľudí po naviazaní sa neklasických MHC molekúl HLA-DM a HLA-DO432 a do prázdneho antigén- viažuceho žliabku MHC molekuly sa teraz môže naviazať antigénny peptid. Takto vzniknuté komplexy MHC II molekúl s naviazaným peptidom (pMHCII) sú transportované na povrch APC bunky, kde ich svojím TCR môžu rozpoznať CD4+ Th-lymfocyty. V neaktivovaných bunkách sú MHC II komplexy ubikvitinované za pomoci MARCH1 (Membrane-Associated RING-CH-type finger 1) ligázy, ktorá patrí do rodiny MARCH E3 ligáz433. Ubikvitinované MHC II sú rozpoznané ESCRT komplexom, čo vedie k ich transportu do neskorých endozómov a lyzozómov, kde sú degradované428. Kľúčovú úlohu MARCH1 pri regulácii prezentácie antigénov sprostredkovanej MHC II ilustruje zistenie, že protizápalový cytokín IL-10 zvyšuje expresiu MARCH434, čím podporuje degradáciu MHC II. Narušenie prezentácie antigénov MHC II molekulami, ktoré je nevyhnutné pre aktiváciu CD4+ pomocných Th-buniek, je jednou zo stratégií, ktoré využívajú niektoré fakultatívne intracelulárne patogény ako sú Francisella tularensis435, Streptococcus suis436 a Salmonella Typhimurium437. Tieto patogény znižujú množstvo maturovaných MHC II molekúl na povrchu infikovaných APC a to zvýšením ich ubikvitinácie, hoci príslušné mechanizmy sú odlišné. Zatiaľ čo Francisella tularensis indukuje expresiu MARCH1 sprostredkovanú IL-10 prostredníctvom stimulácie produkcie prostaglandínu E2 v infikovaných bunkách438, Streptococcus suis indukuje transkripciu mRNA MARCH1 bez ovplyvnenia IL-10436. Naproti tomu salmonely nemodulujú expresiu ligázy MARCH, ale vylučujú efektorový proteín SteD, o ktorom sa predpokladá, že priamo viaže MARCH8, aby podporil ubikvitináciu MHC II sprostredkovanú MARCH8439. Aj M. tuberculosis či Brucella abortus inhibujú vznik efektívnej adaptívnej imunitnej odpovede, ktorá by ich mohla eradikovať vďaka modulácii prezentácie ich antigénov v MHC II. APC síce pohlcujú M. tuberculosis, avšak tieto mykobaktérie vďaka expresii PE_PGRS47 a EsxG-EsxH inhibujú tvorbu fagolyzozómov, vďaka čomu bránia degradácii mykobakteriálnych antigénov. M. tuberculosis navyše inhibuje expresiu MHC II 145
v infikovaných bunkách blokovaním IFN-γ sprostredkovanej indukcie transaktivátora triedy II (CIITA)440,441, ktorý kontroluje expresiu MHC II. Jedným z mechanizmov, ktorý blokuje IFN- γ indukovanú expresiu MHC II, je mechanizmus, ktorý zahŕňa pôsobenie mykobakteriálnych lipoproteínov a lipoglykánov na TLR2442, hoci existujú aj dôkazy o na TLR2 nezávislom mechanizme443. Mykobaktérie ovplyvňujú MHC II dráhu aj tým, že zasahujú do zostavovania a presunu MHC II komplexu, v ktorom má byť invariantný reťazec (Ii) naviazaný do antigén viažuceho žliabku MHC II molekúl uvoľnený pôsobením katepsínu S430. M. tuberculosis blokuje uvoľnenie tohto reťazca z MHC II molekúl tým, že indukuje tvorbu IL-10, ktorý znižuje expresiu katepsínu S444, čo vedie k inhibícii ukladania antigénnych peptidov do MHC II molekúl a k zníženej prezentácii mykobakteriálnych peptidov CD4+ T-bunkám. Táto stratégia umožňuje mykobaktériám navodiť perzistentnú infekciu vďaka úniku pred rozpoznaním imunitným systémom. M. tuberculosis môže aj vezikulárnym transportom presmerovať mykobakteriálne antigény do extracelulárneho priestoru445, vďaka čomu nie sú prezentované v MHC II. Avšak tento export antigénov zvyšuje aktiváciu naivných CD4+ T-buniek tým, že umožňuje vychytávanie, spracovanie a prezentáciu exportovaných antigénov neinfikovanými bunkami v lymfatických uzlinách445. B. abortus je fakultatívne intracelulárny patogén, ktorý vyvoláva chronickú infekciu aj vďaka inhibícii transkripčného aktivátora CIITA, ktorý reguluje transkripciu génov MHC I a II aktivovanú IFN-γ446. Velásquez a kol. (2017)447 vo svojej štúdii charakterizovali možné mechanizmy, ktorými B. abortus prostredníctvom svojich lipoproteínov a prostredníctvom sekrécie IL-6 inhibuje IFN-γ indukovanú transkripciu génov CIITA a MHC-II, čo vedie k zníženej expresii zrelých, ako aj nezrelých molekúl MHC-II. Výsledkom je zníženie prezentácie antigénov CD4+ T-bunkám, ktoré umožňujú baktériám ukryť sa vo vnútri makrofágov a vyhnúť sa imunitnému dohľadu. M a n i p u l á c i a s Th1 b u n k a m i a Treg b u n k a m i Ďalším mechanizmom, ktorý umožňuje baktériám manipulovať s adaptívnou imunitnou odpoveďou je manipulácia s Th1 a Treg bunkami. Infekcia pohlavných orgánov baktériou N. gonorrhoeae zvyčajne vyvoláva intenzívnu zápalovú reakciu charakterizovanú prílevom neutrofilov, avšak prirodzená infekcia nevyvoláva stav účinnej, špecifickej, ochrannej adaptívnej imunity proti opakovanej infekcii448. Všeobecne sa predpokladá, že N. gonorrhoeae sa dokáže vyhnúť imunitnej obrane hostiteľa kombináciou viacerých stratégií, vrátane fázovej variability a hypervariability väčšiny svojich povrchových antigénov, rezistencie voči 146
bakteriolýze sprostredkovanej komplementom449 a pravdepodobne aj produkciou proteázy štiepiacej IgA450. Bolo zistené, že N. gonorrhoeae potláča aj vznik adaptívnej imunity inhibíciou proliferácie a tvorby cytokínov Th1 a Th2 buniek a súčasnou aktiváciou Th17 buniek vďaka stimulácii infikovaných buniek k tvorbe TGF-β451,452. Za stimuláciu Th17 odpoveď je zodpovedný gonokokový lipooligosacharid (LOS) pôsobiaci prostredníctvom TLR4. Na potlačení Th1/Th2 sa podieľajú aj gonokokové proteíny Opa (Opacity), ktoré interagujú s CEACAM 1 (CarcinoEmbryonic Antigen-related Cellular Adhesion) molekulou exprimovanou na aktivovaných CD4+ T-bunkách453. Ďalším príkladom patogénu, ktorý manipuluje s aktiváciou adaptívnej imunity, je H. pylori, ktorý účinne preprogramuje dendritové bunky na tolerogénny fenotyp a indukuje diferenciáciu Treg buniek s vysoko imunosupresívnou aktivitou454. Vakuolizujúci cytotoxín A (VacA – Vacuolating cytotoxin A), jeden z hlavných faktorov virulencie H. pylori, inhibuje proliferáciu T-buniek potlačením tvorby IL-2455,456 a v spojení s γ-glutamyltranspeptidázou (GGTP) podporuje perzistenciu a imunitnú toleranciu457. VacA potláča tvorbu IL-2 rôznymi spôsobmi. Jedným z nich je zásah do signálnej dráhy na úrovni Ca2+-kalmodulín-dependentnej fosfatázy kalcineurínu455, čím bráni translokácii transkripčného faktora NFAT (Nuclear Factor of Activated T cells) do jadra, čo vedie k zníženiu transkripcie génu pre IL-2458. 147
ZOZNAM SKRATIEK AA Amino Acids (Aminokyseliny) ABC ATP-Binding Cassette AC Alternative Complement pathway (Alternatívna cesta aktivácie komplementu) Act Actin-assembly inducing Ag Antigén ALIS Aggresome-Like Induced Structures AMP Antimicrobial Peptides (Antimikrobiálne peptidy) APC Antigen Presentig Cell (Antigén prezentujúca bunka) APD3 Antimicrobial Peptide Database 3 (Databáza antimikrobiálnych peptidov 3) ATP Adenozíntrifosfát BCR B Cell Receptor (B-bunkový receptor pre antigén) Breg Regulatory B-cells (Regulačné B lymfocyty) CagA Cytotoxin-associated gene A CAMP Cationic Antimicrobial Peptides (Antimikrobiálne peptidy s kladným nábojom) CC Classical Complement pathway (Klasická cesta aktivácie komplementu) CCL2 C-C Motif Chemokine Ligand 2 CCP Complement Control Protein modules CD Cluster of Differentiation (Diferenciačná skupina) CEACAM CarcinoEmbryonic Antigen-related Cellular Adhesion CEP Cell Envelope Protease CHDP Cationic Host Defence Peptides (Obranné peptidy s kladným nábojom) CIITA Class II Transactivator C1-inh C1 inhibítor CLRs C-type Lectin Receptors (Lektínové receptory typu C) CLIP Class II-associated Ii Peptide CPS Capsular polysaccharides (Kapsulárne polysacharidy) CR Complement Receptor (Komplementový receptor) CRASPs Complement Regulatory Acquiring Surface Proteins CRPs Complement Rregulatory Proteins (Komplementové regulačné proteíny) CS Complement System (Komplementový systém) C4BP C4 Binding Protein (C4-viažúci proteín) CYBA Cytochrome b-245 α chain CYBB Cytochrome b-245 β chain DAF Decay Accelerating Factor DC Dendritic Cells (Dendritové bunky) DPG Diphosphatidylglycerol (Difosfatidylglycerol) DUB DeUBiquitylation enzyme Ecb Extracellular complement binding protein (Extracelulárny komplement viažuci proteín) eDNA extracellular DNA (Extracelulárna DNA) EEA1: Early Endosome Antigen 1 (Skorý endozómový antigén 1) Efb Extracellular fibrinogen binding protein (Extracelulárny fibrinogén viažuci proteín) EGFR Epidermal Growth Factor Receptor EPEC Enteropathogenic Escherichia coli (Enteropatogénne E. coli) EPS Exopolysaccharides (Exopolysacharidy) Erp E related proteins ESAT-6 Early Secreted Antigenic Target of 6 kDa 148
ESCRT Endosomal Sorting Complex Required for Transport ESX ESAT6 Secretion ET Extracellular Traps (Extracelulárne pasce) FH Factor H (Komplementový faktor H) FHA Filamentous Hemagglutinin (Filamentózny hemaglutinín) fHbp factor H bnding protein (Proteín viažuci faktor H) FI Factor I (Komplementový faktor I) FHL-1 Factor H-Like 1 FHR-3 Factor H-related protein 3 FLIPr Formyl Peptide Receptor-Like-1 Inhibitory Protein fMLP N-Formylmethionyl-leucyl-phenylalanin Fpn Ferroportin (Feroportín) FPR Formyl Peptide Receptor FPRL-1 FPR-Like-1 receptor GAP GTPase Activating Proteins GAS Group A Streptococci (Streptokoky skupiny A) GBS Group B Streptococci (Streptokoky skupiny B) GDI Guanine nucleotide Dissociation Inhibitor GDP Guanozíndifosfát GEF Guanine nucleotide Exchange Factor GGT γ-glutamyltranferáza (v minulosti GGTP – γ-glutamyltranspeptidáza) GlcNAc N-acetylglukózamín GPCR G Protein-Coupled Receptors GRAB G-Related 2-macroglobulin-Binding GTP Guanozíntrifosfát HBD3 Heparin Binding Domain 3 (Heparín viažuca doména 3) Hmp Flavohemoglobin (Flavohemoglobín) HNP Human Neutrophil Peptide HRF Homologous Restriction Factor (Homológny reštrikčný faktor) Hsf Haemophilus surface fibrils (Povrchové fibrily hemofilov) HSP Heat Shock Proteins (Proteíny tepelného šoku) CHIPS Chemotaxis Inhibitory Protein of S. aureus Hic H-binding inhibitor of complement (Inhibítor komplementu viažuci faktor H) Hrs Hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate iC3b Inaktivovaná C3b molekula ICAM-1, 2 InterCellular Adhesion Molecule-1, 2 IdeS Immunoglobulin G-degrading enzyme S. pyogenes IFN Interferón Ig Imunoglobulíny IL Interleukín IM Inner Membrane (Vnútorná membrána) iNKT invariant Natural Killer T cell (Invariantné prirodzené zabíjačské T-lymfocyty) iNOS inducible NOS (Induktívna syntáza oxidu dusnatého) ITAM Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif ITIM Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibitory Motif LAD Leukocyte Adherence Deficiency (Genetická deficiencia CR3) LC Lectin Complement pathway (Lektínová cesta aktivácie komplementu) LAM Lipoarabinomanan LAMP Lysosome-Associated Membrane Protein (Membránový proteín asociovaný s lyzozómami) 149
LBP LPS Biding Protein (LPS viažuci proteín) LDL Low-Density Lipoprotein LIR LC3-Interacting Region LLO Listeriolyzín O LKT Leukotoxín LOS Lipooligosaccharides (Lipooligosacharidy) Lpd Dihydrolipoamide dehydrogenase (Dihydrolipoamiddehydrogenáza) LPS Lipopolysacharid LTA Lipoteichoic Acid (Kyselina lipoteichová) LTB4 Leukotriene B4 (Leukotrién B4) MAC Membrane Attack Complex (Tubulárny komplex atakujúci membránu MAIT mikroorganizmu) Mucosal-Associated Invariant T Cell (Invariantné T-lymfocyty spojené so sliznicou) MALT Mucosa-Associated Lymfoid Tissue (So sliznicami asociované lymfoidné tkanivo) MAMPs Microbe-Associated Molecular Patterns (Molekulové vzory spojené s mikroorganizmamy) MAPK Mitogen-Activated Protein Kinase MARCO Macrophage Receptor with Collagenous Structure MARCH1 Membrane-Associated RING-CH-type finger 1 MASP-1,2 Mannose-binding protein-Associated Serine Protease 1, 2 (MBL asociovaná serínová proteáza) MBL Mannose-Binding Lectin (Manózu viažuci lektín) MBP Mannose-Binding Protein (Manózu viažuci poteín) MCP Membrane Cofactor Protein MCP-1 Monocyte Chemoattractant Protein-1 MET Macrophage Extracellular Traps (Extracelulárne pasce makrofágov) MFP Membrane Fusion Protein MHC Major Histocompatibility Complex (Hlavný histokompatibilny komplex) MICA MHC I Chain-related protein A MICB MHC I Chain-related protein B MPO Myeloperoxidáza MprF Multipeptide resitance Factor MR1 Major histocompatibility complex class I-related gene protein mROS Mitochondriálne ROS MurNAc Kyselina N-acetylmuramová NADPH Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate NET Neutrophil Extracellular Traps (Extracelulárne pasce neutrofilov) NF-κB Nuclear Factor-κB NFAT Nuclear Factor of Activated T cells NK Natural Killers cells (Prirodzené zabíjačské bunky) NO Oxid dusný NOS Nitric Oxyde Synthases (Syntáza oxidu dusnatého) NOX NADPH-oxidáza NRAMP1 Natural Resistance-Associated Macrophage Protein 1 NspA Neisserial surface protein A (Neisseriový povrchový proteín A) NTHi Nontypable Haemophilus influenzae stains (Netypizovateľné kmene H. influenza) OM Outer Membrane (Vonkajšia membrána) OmpP5 Outer membrane protein P5 (Proteín vonkajšej membrány P5) Osp Outer surface protein (Vonkajší povrchový proteín) 150
Search
Read the Text Version
- 1
- 2
- 3
- 4
- 5
- 6
- 7
- 8
- 9
- 10
- 11
- 12
- 13
- 14
- 15
- 16
- 17
- 18
- 19
- 20
- 21
- 22
- 23
- 24
- 25
- 26
- 27
- 28
- 29
- 30
- 31
- 32
- 33
- 34
- 35
- 36
- 37
- 38
- 39
- 40
- 41
- 42
- 43
- 44
- 45
- 46
- 47
- 48
- 49
- 50
- 51
- 52
- 53
- 54
- 55
- 56
- 57
- 58
- 59
- 60
- 61
- 62
- 63
- 64
- 65
- 66
- 67
- 68
- 69
- 70
- 71
- 72
- 73
- 74
- 75
- 76
- 77
- 78
- 79
- 80
- 81
- 82
- 83
- 84
- 85
- 86
- 87
- 88
- 89
- 90
- 91
- 92
- 93
- 94
- 95
- 96
- 97
- 98
- 99
- 100
- 101
- 102
- 103
- 104
- 105
- 106
- 107
- 108
- 109
- 110
- 111
- 112
- 113
- 114
- 115
- 116
- 117
- 118
- 119
- 120
- 121
- 122
- 123
- 124
- 125
- 126
- 127
- 128
- 129
- 130
- 131
- 132
- 133
- 134
- 135
- 136
- 137
- 138
- 139
- 140
- 141
- 142
- 143
- 144
- 145
- 146
- 147
- 148
- 149
- 150
- 151
- 152
- 153
- 154
- 155
- 156
- 157
- 158
- 159
- 160
- 161
- 162
- 163
- 164
- 165
- 166
- 167
- 168
- 169
- 170
- 171
- 172
- 173
- 174
- 175
- 176
- 177
- 178
- 179
- 180
- 181
- 182
- 183
- 184
- 185
- 186
- 187
- 188
- 189
- 190
- 191
- 192
- 193
- 194
- 195
- 196
- 197
- 198
- 199
- 200
- 201
- 202
- 203
- 204
- 205
- 206
- 207
- 208
- 209
- 210
- 211
- 212
- 213
- 214
- 215
- 216
- 217
- 218
- 219
- 220
- 221
- 222
- 223
- 224
- 225
- 226
- 227
- 228
- 229
- 230
- 231
- 232
- 233
- 234
- 235
- 236
- 237
- 238
- 239
- 240
- 241
- 242
- 243
- 244
- 245
- 246
- 247
- 248
- 249
- 250
- 251
- 252
- 253
- 254
- 255
- 256
- 257
- 258
- 259
- 260
- 261
- 262
- 263
- 264
- 265
- 266
- 267
- 268
- 269
- 270
- 271
- 272
- 273
- 274
- 275
- 276
- 277
- 278
- 279
- 280
- 281
- 282
- 283
- 284
- 285
- 286
- 287
- 288
- 289
- 290
- 291
- 292
- 293
- 294
- 295
- 296
- 297
- 298
- 299
- 300
- 301
- 302
- 303
- 304
- 305
- 306
- 307
- 308
- 309
- 310
- 311
- 312
- 313
- 314
- 315
- 316
- 317
- 318
- 319
- 320
- 321
- 322
- 323
- 324
- 325
- 326
- 327
- 328
- 329
- 330
- 331
- 332
- 333
- 334
- 335
- 336
- 337
- 338
- 339
- 340
- 341
- 342
- 343
- 344
- 345
- 346
- 347
- 348
- 349
- 350
- 351
- 352
- 353
- 354
- 355
- 356
- 357
- 358
- 359
- 360
- 361
- 362
- 363
- 364
- 365
- 366
- 367
- 368
- 369
- 370
- 371
- 372
- 373
- 374
- 375
- 376
- 377
- 378
- 379
- 380
- 381
- 382
- 383
- 384
- 385
- 386
- 387
- 388
- 389
- 390
- 391
- 392
- 393
- 394
- 395
- 396
- 397
- 398
- 399
- 400
- 401
- 402
- 403
- 404
- 405
- 406
- 407
- 408
- 409
- 410
- 411
- 412
- 413
- 414
- 415
- 416
- 417
- 418
- 419
- 420
- 421
- 422
- 423
- 424
- 425
- 426
- 427
- 428
- 429
- 430
- 431
- 432
- 433
- 434
- 435
- 436
- 437
- 438
- 439
- 440
- 441
- 442
- 443
- 444
- 445
- 446
- 447
- 448
- 449
- 450
- 451
- 452
- 453
- 454
- 455
- 456
- 457
- 458
- 459
- 460
- 461
- 462
- 463
- 464
- 465
- 466
- 467
- 468
- 469
- 470
- 471
- 472
- 473
- 474
- 475
- 476
- 477
- 478
- 479
- 480
- 481
- 482
- 483
- 484
- 485
- 486
- 487
- 488
- 489
- 490
- 491
- 492
- 493
- 494
- 495
- 496
- 497
- 498
- 499
- 500
- 501
- 502
- 503
- 504
- 505
- 506
- 507
- 508
- 509
- 510
- 511
- 512
- 513
- 514
- 515
- 516
- 517
- 518
- 519
- 520
- 521
- 522
- 523
- 524
- 525
- 526
- 527
- 528
- 529
- 530
- 531
- 532
- 533
- 534
- 535
- 536
- 537
- 538
- 539
- 540
- 541
- 542
- 543
- 544
- 545
- 546
- 547
- 548
- 549
- 550
- 551
- 552
- 553
- 554
- 555
- 556
- 557
- 558
- 559
- 560
- 561
- 562
- 563
- 564
- 565
- 566
- 567
- 568
- 569
- 570
- 571
- 572
- 573
- 574
- 575
- 576
- 577
- 578
- 579
- 580
- 581
- 582
- 583
- 584
- 585
- 1 - 50
- 51 - 100
- 101 - 150
- 151 - 200
- 201 - 250
- 251 - 300
- 301 - 350
- 351 - 400
- 401 - 450
- 451 - 500
- 501 - 550
- 551 - 585
Pages:
