E. Pilipčinec a kol._KEGA monografia 2022_č.j. 07UVLVF-4-2021

PAF Platelet-Activating Factor PAMP Pathogen-Associated Molecular Patterns PC Fosfatidylcholín PEA Phosphoethanolamine (Fosfoetanolamín) PECAM-1 Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1 PI3K Phosphoinositide 3-Kinase (Fosfatidylinozitol-3-kináza) PI3P Phosphatidylinositol-3-phosphate (Fosfatidylinozitol-3-fosfát) PI5P Phosphatidylinositol-5-phosphate (Fosfatidylinozitol-5-fosfát) PIA Polysaccharide Intercellular Adhesin (Polysacharidový intercelulárny adhezín) PG Phosphatidylglycerol (Fosfatidylglycerol) PGA -Polyglutamic Acid (Kyselina poly--glutámová) PGN Peptidoglykán PLC Phospholipase C PLD Phospholipase D PRR Pattern Recognition Receptor (Vzory rozpoznávajúce receptory) PS Phosphatidylserine (Fosfatidylserín) PSGL-1 P-Selectin Glycoprotein Ligand-1 Psp Pneumococcal surface protei RLR Retinoic acid-inducible gene I (RIG-I)-like receptory RND Resistance/Ndulation/cell Division (Rodina transportérov) RNS Reactive Nitrogen Species (Reaktívne formy dusíka) ROS Reactive Oxygen Species (Reaktívne formy kyslíka) SAAP Surfactant-Associated Anionic Peptides Sak Staphylokinase (Stafylokináza) SALT Skin-Associated Lymfoid Tissue Sbi Staphylococcal binder of immunoglobulin SCIN Staphylococcal Complement Inhibitor (Stafylokokový inhibítor komplementu) SCR Short Consensus Repeats SElX Staphylococcal Enterotoxin-like X sensu lato (s. l.) v širšom zmysle sensu stricto (s. s.) v užšom zmysle Sia Sialic acid (Kyselina sialová) SIC Streptococcal inhibitor of complement (Streptokokový inhibítor komplementu) Siglec Sia-recognizing Ig superfamily lectins Ska Streptokinase (Streptokináza) SOD Superoxiddismutáza SpA Staphylococcal protein A (Stafylokokový proteín A) SpeB Streptococcal pyrogenic exotoxin B SPIN Staphylococcal Peroxidase Inhibitor SptP Salmonella protein tyrosine Phosphatase SseL Salmonella secreted factor L SSL7 Staphylococcal Superantigen-Like protein 7 (Stafylokokový proteín podobný superantigénu 7) SYK Spleen tYrosine Kinase TA Teichoic Acid (Kyselina teichová) TACE TNF-Alpha-Converting Enzyme TAK1 TGF-β Activated Kinase 1 TAP Trypsinogen Activation Peptides Tc T-cytotoxic cells (Cytotoxické T-lymfocyty) TCR T-Cell Receptor (T-bunkový receptor pre antigén) 151

TCS Two-Component regulatory Systems (Dvojzložkový bakteriálny senzor/regulátor) TDM Trehalóza dimykolát Tfh T follicular helper cell (Folikulárne Th lymfocyty) TGF Transforming Growth Factor (Transformujúci rastový faktor) TNFR1 Th Tumor Necrosis Factor Receptor 1 Tir T helper cells (Pomocné T-lymfocyty) TLR2 TNF Translocated intimin receptor Treg T3SS Toll-like Receptor 2 UBD UCL Tumour Necrosis Factor VCAM-1 Regulatory T-cells (Regulačné T-bunky) vWF Vn Type III Secretory System WTA Ubiquitin-Binding Domain Universal Classification System Vascular Adhesion Molecule-1 von Willebrandov faktor Vitronektín Wall Teichoic Acid (Kyselina teichová bunkovej steny) 152

LITERATÚRA 1. Dorin, J. R. Mammalian Antimicrobial Peptides;Defensins and Cathelicidins.) 2. Merle, N. S. et al. Front Immunol 6, 257, (2015) 3. Rosales, C. & Uribe-Querol, E. Biomed Res Int 2017, 9042851, (2017) 4. Nauseef, W. M. & Borregaard, N. Nat Immunol 15, 602-11, (2014) 5. Klebanoff, S. J. et al. J Leukoc Biol 93, 185-98, (2013) 6. Palm, N. W. & Medzhitov, R. Immunol Rev 227, 221-33, (2009) 7. Kawasaki, T. & Kawai, T. Front Immunol 5, 461, (2014) 8. De Nardo, D. Cytokine 74, 181-9, (2015) 9. Davis, B. K. et al. Annu Rev Immunol 29, 707-35, (2011) 10. Goubau, D. et al. Immunity 38, 855-69, (2013) 11. Mellman, I. Cancer Immunol Res 1, 145-9, (2013) 12. Mildner, A. & Jung, S. Immunity 40, 642-56, (2014) 13. Krystel-Whittemore, M. et al. Front Immunol 6, 620, (2015) 14. Vivier, E. et al. Nat Immunol 9, 503-10, (2008) 15. Van Den Berg, H. A. In Journal of Theoretical Biology 224, 249-67, (2003) 16. van Kasteren, S. I. et al. Curr Opin Immunol 26, 21-31, (2014) 17. Brady, J. et al. Intensive Care Med Exp 8, 20, (2020) 18. Blum, J. S. et al. Annu Rev Immunol 31, 443-73, (2013) 19. Mosmann, T. R. & Coffman, R. L. Annu Rev Immunol 7, 145-73, (1989) 20. Butler, N. S. & Kulu, D. I. Curr Opin Immunol 34, 68-74, (2015) 21. Isailovic, N. et al. J Autoimmun 60, 1-11, (2015) 22. Miossec, P. & Kolls, J. K. Nat Rev Drug Discov 11, 763-76, (2012) 23. Shevyrev, D. & Tereshchenko, V. Front Immunol 10, 3100, (2019) 24. Andersen, M. H. et al. J Invest Dermatol 126, 32-41, (2006) 25. Van Kaer, L. Curr Opin Immunol 19, 354-64, (2007) 26. Wong, E. B. et al. Immunology 150, 45-54, (2017) 27. Fahl, S. P. et al. J Immunol 193, 4289-94, (2014) 28. Allman, D. & Pillai, S. Curr Opin Immunol 20, 149-57, (2008) 29. Mizoguchi, A. & Bhan, A. K. J Immunol 176, 705-10, (2006) 30. Schroeder, H. W., Jr. & Cavacini, L. J Allergy Clin Immunol 125, S41-52, (2010) 31. Farber, D. L. et al. Nat Rev Immunol 14, 24-35, (2014) 32. McHeyzer-Williams, M. et al. Nat Rev Immunol 12, 24-34, (2011) 33. Moravej, H. et al. Microb Drug Resist 24, 747-67, (2018) 34. Huan, Y. et al. Front Microbiol 11, 582779, (2020) 35. Cardoso, P. et al. Biophys Rev 13, 35-69, (2021) 36. Patocka, J. et al. Curr Med Chem 26, 5924-46, (2019) 37. Masso-Silva, J. A. & Diamond, G. Pharmaceuticals (Basel) 7, 265-310, (2014) 38. Wu, Q. et al. Toxins (Basel) 10, (2018) 39. Tam, J. P. et al. Pharmaceuticals (Basel) 8, 711-57, (2015) 40. Gan, B. H. et al. Chem Soc Rev 50, 7820-80, (2021) 41. Mookherjee, N. et al. Nat Rev Drug Discov 19, 311-32, (2020) 42. Le, C. F. et al. Antimicrob Agents Chemother 61, (2017) 43. Brotz, H. et al. Antimicrob Agents Chemother 42, 154-60, (1998) 44. Breukink, E. & de Kruijff, B. Biochim Biophys Acta 1462, 223-34, (1999) 45. Cho, J. H. et al. Biochim Biophys Acta 1788, 1564-9, (2009) 46. Hilpert, K. et al. Antimicrob Agents Chemother 54, 4480-3, (2010) 47. Xia, X. et al. Antonie Van Leeuwenhoek 111, 5-26, (2018) 48. Joo, H. S. et al. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 371, (2016) 49. Silhavy, T. J. et al. Cold Spring Harb Perspect Biol 2, a000414, (2010) 50. Maria-Neto, S. et al. Biochim Biophys Acta 1848, 3078-88, (2015) 51. Peschel, A. et al. J Biol Chem 274, 8405-10, (1999) 52. Kovacs, M. et al. J Bacteriol 188, 5797-805, (2006) 53. Abi Khattar, Z. et al. J Bacteriol 191, 7063-73, (2009) 54. Carvalho, F. et al. PLoS Pathog 11, e1004919, (2015) 55. Meireles, D. et al. Pathogens 9, (2020) 56. Zhang, G. et al. Curr Opin Microbiol 16, 779-85, (2013) 57. Gunn, J. S. et al. Mol Microbiol 27, 1171-82, (1998) 58. Gunn, J. S. et al. Infect Immun 68, 6139-46, (2000) 153

59. Gunn, J. S. Trends Microbiol 16, 284-90, (2008) 60. Johnson, L. et al. BMC Microbiol 13, 115, (2013) 61. Moskowitz SM, E. R., Miller SI. . J. Bacteriol. 186, 575-79, (2004) 62. Pelletier, M. R. et al. Antimicrob Agents Chemother 57, 4831-40, (2013) 63. Kanistanon, D. et al. PLoS Pathog 4, e24, (2008) 64. Shah, N. R. et al. Antimicrob Agents Chemother 58, 4931-4, (2014) 65. Hankins, J. V. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 109, 8722-7, (2012) 66. Tzeng, Y. L. et al. J Bacteriol 187, 5387-96, (2005) 67. Bishop, R. E. et al. EMBO J 19, 5071-80, (2000) 68. Matson, J. S. et al. J Bacteriol 192, 2044-52, (2010) 69. Llobet, E. et al. Microbiology (Reading) 154, 3877-86, (2008) 70. Cole, J. N. et al. mBio 1, (2010) 71. Wilde, S. et al. Front Cell Infect Microbiol 11, 704099, (2021) 72. Jones, A. et al. J Bacteriol 191, 3861-8, (2009) 73. Ogunleye, A. et al. Microbiology (Reading) 161, 1-17, (2015) 74. Candela, T. & Fouet, A. Mol Microbiol 60, 1091-8, (2006) 75. Peschel, A. et al. J Exp Med 193, 1067-76, (2001) 76. Ernst, C. M. et al. PLoS Pathog 5, e1000660, (2009) 77. Ernst, C. M. & Peschel, A. Mol Microbiol 80, 290-9, (2011) 78. Sieprawska-Lupa, M. et al. Antimicrob Agents Chemother 48, 4673-9, (2004) 79. Nelson, D. C. et al. Biol Chem 392, 1077-88, (2011) 80. Rasmussen, M. et al. J Biol Chem 274, 15336-44, (1999) 81. Nyberg, P. et al. J Biol Chem 279, 52820-3, (2004) 82. Lauth, X. et al. J Innate Immun 1, 202-14, (2009) 83. LaRock, C. N. et al. Cell Host Microbe 18, 471-7, (2015) 84. Schmidtchen, A. et al. Mol Microbiol 39, 708-13, (2001) 85. Haiko, J. et al. Innate Immun 15, 67-80, (2009) 86. Belas, R. et al. Infect Immun 72, 5159-67, (2004) 87. Kooi, C. & Sokol, P. A. Microbiology (Reading) 155, 2818-25, (2009) 88. Shelton, C. L. et al. PLoS Pathog 7, e1002360, (2011) 89. Jin, T. et al. J Immunol 172, 1169-76, (2004) 90. Nguyen, L. T. & Vogel, H. J. Sci Rep 6, 31817, (2016) 91. Hollands, A. et al. J Biol Chem 287, 40891-7, (2012) 92. Frick, I. M. et al. J Biol Chem 278, 16561-6, (2003) 93. Frick, I. M. et al. J Biol Chem 286, 1331-40, (2011) 94. Flemming, H. C. & Wingender, J. Nat Rev Microbiol 8, 623-33, (2010) 95. Hoiby, N. et al. Int J Antimicrob Agents 35, 322-32, (2010) 96. Mulcahy, H. et al. PLoS Pathog 4, e1000213, (2008) 97. Foschiatti, M. et al. Mol Microbiol 72, 1137-46, (2009) 98. Heilmann, C. et al. Mol Microbiol 20, 1083-91, (1996) 99. Cramton, S. E. et al. Infect Immun 67, 5427-33, (1999) 100. Vuong, C. et al. J Biol Chem 279, 54881-6, (2004) 101. Otto, M. Curr Top Microbiol Immunol 306, 251-8, (2006) 102. Alvarez-Ortega, C. et al. Front Microbiol 4, 7, (2013) 103. Delmar, J. A. et al. Annu Rev Biophys 43, 93-117, (2014) 104. Shafer, W. M. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 1829-33, (1998) 105. Bina, X. R. et al. Infect Immun 76, 3595-605, (2008) 106. Padilla, E. et al. Antimicrob Agents Chemother 54, 177-83, (2010) 107. Gebhard, S. Molecular Microbiology 86, 1295-317, (2012) 108. Nawrocki, K. L. et al. Antibiotics (Basel) 3, 461-92, (2014) 109. Qiao, M. & Saris, P. E. FEMS Microbiol Lett 144, 89-93, (1996) 110. Rashid, R. et al. Front Cell Dev Biol 4, 55, (2016) 111. Kier, L. D. et al. J Bacteriol 138, 155-61, (1979) 112. Miller, S. I. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 86, 5054-8, (1989) 113. Gunn, J. S. & Miller, S. I. J Bacteriol 178, 6857-64, (1996) 114. Guo, L. et al. Cell 95, 189-98, (1998) 115. Lee, H. et al. J Bacteriol 186, 4124-33, (2004) 116. Bader, M. W. et al. Cell 122, 461-72, (2005) 117. Oyston, P. C. et al. Infect Immun 68, 3419-25, (2000) 118. Moss, J. E. et al. Cell Microbiol 2, 443-52, (2000) 154

119. Li, M. et al. Mol Microbiol 66, 1136-47, (2007) 120. Li, M. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 9469-74, (2007) 121. Tizard, R. I. Veterinary Immunology, 10th Ed., ISBN 9780323523486 (2016) 122. Roitt I. Immunology, 4th Ed., ISBN 978-0723421788, Mosby-Year Book (1996) 123. Alitalo, A. et al. Infect Immun 69, 3685-91, (2001) 124. Janeway, C. A., Jr. Microbes Infect 3, 1167-71, (2001) 125. Devles J. P. et al. Roitt´s Essential Immunology,13th Ed., ISBN 978-1-118-41577-1, Wiley-Blackwell (2017) 126. Morgan, B. P. Methods Mol Biol 150, 1-13, (2000) 127. Cai, S. & Davis, A. E., 3rd. J Immunol 171, 4786-91, (2003) 128. Meri, S. & Pangburn, M. K. Proc Natl Acad Sci U S A 87, 3982-6, (1990) 129. Dahlback, B. & Hildebrand, B. Biochem J 209, 857-63, (1983) 130. Merle, N. S. et al. Front Immunol 6, 262, (2015) 131. Kim, D. D. & Song, W. C. Clin Immunol 118, 127-36, (2006) 132. Singhrao, S. K. et al. Lab Invest 79, 1247-59, (1999) 133. Meri, S. et al. Lab Invest 65, 532-7, (1991) 134. Nettis, E. et al. Eur J Clin Invest 35, 781-4, (2005) 135. Longhurst, H. J. Int J Clin Pract 59, 594-9, (2005) 136. Aso, T. et al. Biochem Biophys Res Commun 174, 222-7, (1991) 137. Martinez-Barricarte, R. et al. Clin Exp Immunol 155, 59-64, (2009) 138. Accardo, P. et al. J Immunol 157, 4935-9, (1996) 139. Ziccardi, R. J. et al. J Biol Chem 259, 13674-9, (1984) 140. Zhang, H. et al. J Biomed Mater Res A 74, 59-68, (2005) 141. Tsiftsoglou, S. A. et al. Biochemistry 44, 6239-49, (2005) 142. Yazdanbakhsh, K. & Scaradavou, A. Drug News Perspect 17, 314-20, (2004) 143. Lindahl, G. et al. Curr Opin Immunol 12, 44-51, (2000) 144. White, J. et al. Protein Sci 13, 2406-15, (2004) 145. van Beek, J. et al. J Immunol 174, 2353-65, (2005) 146. Tambourgi, D. V. et al. Infect Immun 61, 3656-63, (1993) 147. Bohana-Kashtan, O. et al. Mol Immunol 41, 583-97, (2004) 148. Pausa, M. et al. J Immunol 170, 3214-22, (2003) 149. Hovingh, E. S. et al. Front Microbiol 7, 2004, (2016) 150. Bernet, J. et al. Vaccine 29, 7435-43, (2011) 151. Honda-Ogawa, M. et al. J Biol Chem 288, 15854-64, (2013) 152. Wingrove, J. A. et al. J Biol Chem 267, 18902-7, (1992) 153. Wang, M. et al. Sci Signal 3, ra11, (2010) 154. Jongerius, I. et al. J Exp Med 204, 2461-71, (2007) 155. Rooijakkers, S. H. et al. Nat Immunol 10, 721-7, (2009) 156. Haupt, K. et al. PLoS Pathog 4, e1000250, (2008) 157. Langley, R. et al. J Immunol 174, 2926-33, (2005) 158. Laursen, N. S. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 107, 3681-6, (2010) 159. Davis, K. S. et al. Otolaryngol Head Neck Surg 143, 152-8, (2010) 160. Lathem, W. W. et al. J Exp Med 199, 1077-87, (2004) 161. Grosskinsky, S. et al. PLoS Negl Trop Dis 4, e698, (2010) 162. Rawal, N. et al. Mol Immunol 46, 2902-10, (2009) 163. Ermert, D. & Blom, A. M. Immunol Lett 169, 82-92, (2016) 164. Kraiczy, P. & Wurzner, R. Mol Immunol 43, 31-44, (2006) 165. Hallstrom, T. et al. J Immunol 178, 6359-66, (2007) 166. Agarwal, V. et al. J Immunol 189, 3575-84, (2012) 167. Ramos-Sevillano, E. et al. Infect Immun 83, 591-603, (2015) 168. Berggard, K. et al. Eur J Immunol 31, 2771-80, (2001) 169. Berggard, K. et al. Mol Microbiol 42, 539-51, (2001) 170. Pietikainen, J. et al. Mol Immunol 47, 1299-305, (2010) 171. Madar, M. et al. Mol Biosyst 11, 1684-95, (2015) 172. Kolodziejek, A. M. et al. Front Cell Infect Microbiol 2, 103, (2012) 173. Kirjavainen, V. et al. PLoS Pathog 4, e1000140, (2008) 174. Horstmann, R. D. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 85, 1657-61, (1988) 175. Meri, T. et al. PLoS Pathog 9, e1003308, (2013) 176. Kuhn, S. et al. J Immunol 155, 5663-70, (1995) 177. Fleury, C. et al. J Immunol 192, 5913-23, (2014) 178. Langereis, J. D. & de Jonge, M. I. Emerg Infect Dis 21, 1711-8, (2015) 155

179. Hyams, C. et al. Infect Immun 81, 354-63, (2013) 180. Kohler, S. et al. Thromb Haemost 113, 125-42, (2015) 181. Herbert, A. P. et al. J Immunol 195, 4986-98, (2015) 182. Sharp, J. A. et al. PLoS One 7, e38407, (2012) 183. Hair, P. S. et al. Results Immunol 3, 114-21, (2013) 184. Amdahl, H. et al. J Immunol 191, 1775-84, (2013) 185. Seib, K. L. et al. Expert Rev Vaccines 14, 841-59, (2015) 186. Schneider, M. C. et al. Nature 458, 890-3, (2009) 187. Jozsi, M. et al. Trends Immunol 36, 374-84, (2015) 188. Lewis, L. A. et al. PLoS Pathog 6, e1001027, (2010) 189. Babb, K. et al. Infect Immun 69, 4146-53, (2001) 190. Bhide, M. et al. J Proteomics 75, 4520-8, (2012) 191. Schwan, T. G. & Piesman, J. J Clin Microbiol 38, 382-8, (2000) 192. Coleman, J. L. et al. Cell 89, 1111-9, (1997) 193. Roehrig, J. T. et al. J Immunol 149, 3648-53, (1992) 194. Schwan, T. G. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 2909-13, (1995) 195. Stevenson, B. & Miller, J. C. J Mol Evol 57, 309-24, (2003) 196. Metts, M. S. et al. Infect Immun 71, 3587-96, (2003) 197. Hefty, P. S. et al. Infect Immun 69, 3618-27, (2001) 198. Stevenson, B. et al. Infect Immun 70, 491-7, (2002) 199. Gilmore, R. D., Jr. et al. Microbes Infect 3, 799-808, (2001) 200. Miller, J. C. et al. Infect Immun 71, 6943-52, (2003) 201. Miller, J. C. & Stevenson, B. Microbiology (Reading) 149, 1113-25, (2003) 202. Wallich, R. et al. Infect Immun 73, 2351-9, (2005) 203. Brooks, C. S. et al. J Immunol 175, 3299-308, (2005) 204. McDowell, J. V. et al. Infect Immun 74, 3030-4, (2006) 205. Alitalo, A. et al. J Immunol 172, 6195-201, (2004) 206. Bhide, M. R. et al. FEMS Immunol Med Microbiol 43, 165-72, (2005) 207. Kraiczy, P. et al. Infect Immun 69, 7800-9, (2001) 208. Nakao, M. & Miyamoto, K. J Clin Microbiol 33, 490-2, (1995) 209. De Silva, A. M. & Fikrig, E. Parasitol Today 13, 267-70, (1997) 210. Kurtenbach, K. et al. Infect Immun 66, 1248-51, (1998) 211. Miller, J. C. et al. Microb Pathog 39, 27-33, (2005) 212. Hallstrom, T. et al. PLoS One 11, e0147709, (2016) 213. Hallstrom, T. et al. J Immunol 177, 430-6, (2006) 214. Singh, A. R. et al. Cancer Cell Int 14, 105, (2014) 215. Al-Jubair, T. et al. J Immunol 195, 5688-95, (2015) 216. Singh, B. et al. Infect Immun 81, 801-14, (2013) 217. Hallstrom, T. et al. J Immunol 183, 2593-601, (2009) 218. Paulsson, M. et al. J Cyst Fibros 14, 600-7, (2015) 219. Hallstrom, T. et al. PLoS One 10, e0137630, (2015) 220. Kohler, T. P. et al. J Biol Chem 289, 4070-82, (2014) 221. Voss, S. et al. J Biol Chem 288, 15614-27, (2013) 222. Griffiths, N. J. et al. Mol Microbiol 82, 1129-49, (2011) 223. Hubert, K. et al. PLoS One 7, e45132, (2012) 224. Hill, D. J. et al. PLoS One 10, e0124133, (2015) 225. Rabinovitch, M. Trends Cell Biol 5, 85-7, (1995) 226. Lim, J. J. et al. Front Cell Infect Microbiol 7, 191, (2017) 227. Brinkmann, V. et al. Science 303, 1532-5, (2004) 228. Brinkmann, V. & Zychlinsky, A. Nat Rev Microbiol 5, 577-82, (2007) 229. Kruger, P. et al. PLoS Pathog 11, e1004651, (2015) 230. Schiffmann, E. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 72, 1059-62, (1975) 231. Rosenbaum, D. M. et al. Nature 459, 356-63, (2009) 232. Bogaert, D. & Haerynck, F. Cellular Primary Immunodeficiencies. 518 (2021). 233. Bestebroer, J. et al. FEMS Microbiol Rev 34, 395-414, (2010) 234. Migeotte, I. et al. Cytokine Growth Factor Rev 17, 501-19, (2006) 235. de Haas, C. J. et al. J Exp Med 199, 687-95, (2004) 236. Postma, B. et al. J Immunol 172, 6994-7001, (2004) 237. Fraser, J. D. & Proft, T. Immunol Rev 225, 226-43, (2008) 238. Fevre, C. et al. Cell Microbiol 16, 1646-65, (2014) 156

239. Bestebroer, J. et al. Blood 113, 328-37, (2009) 240. Koymans, K. J. et al. Int J Mol Sci 17, (2016) 241. Surewaard, B. G. et al. Cell Microbiol 15, 1753-65, (2013) 242. Ijiri, Y. et al. Int J Exp Pathol 75, 441-51, (1994) 243. Edwards, R. J. et al. J Infect Dis 192, 783-90, (2005) 244. Zinkernagel, A. S. et al. Cell Host Microbe 4, 170-8, (2008) 245. Bryan, J. D. & Shelver, D. W. J Bacteriol 191, 1847-54, (2009) 246. Leidal, K. G. et al. Am J Respir Cell Mol Biol 25, 186-95, (2001) 247. Zhang, J. et al. Microb Pathog 26, 275-80, (1999) 248. Rao, S. P. et al. FEMS Immunol Med Microbiol 33, 115-24, (2002) 249. Finlay, B. B. & Cossart, P. Science 276, 718-25, (1997) 250. Kim, D. W. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 14046-51, (2005) 251. Arbibe, L. et al. Nat Immunol 8, 47-56, (2007) 252. Ashida, H. et al. Mol Microbiol 63, 680-93, (2007) 253. Newton, H. J. et al. PLoS Pathog 6, e1000898, (2010) 254. Sanada, T. et al. Nature 483, 623-6, (2012) 255. Boal, F. et al. Cell Rep 14, 750-59, (2016) 256. Li, K. & Underhill, D. M. Curr Top Microbiol Immunol 429, 1-18, (2020) 257. Palecanda, A. & Kobzik, L. Curr Mol Med 1, 589-95, (2001) 258. Taylor, P. R. et al. Annu Rev Immunol 23, 901-44, (2005) 259. Schiff, D. E. et al. J Leukoc Biol 62, 786-94, (1997) 260. Canton, J. et al. Nat Rev Immunol 13, 621-34, (2013) 261. Triantafilou, M. et al. J Biol Chem 281, 31002-11, (2006) 262. Baranova, I. N. et al. J Immunol 181, 7147-56, (2008) 263. van der Laan, L. J. et al. J Immunol 162, 939-47, (1999) 264. Kawai, T. & Akira, S. Immunity 34, 637-50, (2011) 265. van Lookeren Campagne, M. et al. Cell Microbiol 9, 2095-102, (2007) 266. Rosales C, U.-Q. E. Curr Immunol Rev 9, 44-55, (2013) 267. Flannagan, R. S. et al. Annu Rev Pathol 7, 61-98, (2012) 268. Depaolo, R. W. et al. Cell Host Microbe 4, 350-61, (2008) 269. Paquette, N. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 109, 12710-5, (2012) 270. Wu, H. et al. Cell Microbiol 14, 28-39, (2012) 271. Van Avondt, K. et al. PLoS Pathog 11, e1004644, (2015) 272. Nakayama, M. et al. J Immunol 189, 5903-11, (2012) 273. Slevogt, H. et al. Nat Immunol 9, 1270-8, (2008) 274. Carlin, A. F. et al. Blood 113, 3333-6, (2009) 275. Chang, Y. C. et al. PLoS Pathog 10, e1003846, (2014) 276. Bax, M. et al. Infect Immun 79, 2681-9, (2011) 277. Mukherjee, K. et al. Front Immunol 11, 332, (2020) 278. Jones, C. et al. Mol Microbiol 49, 1213-25, (2003) 279. Yan, D. et al. Cell Signal 25, 1887-94, (2013) 280. Wang, Y. C. et al. J Immunol 193, 4149-58, (2014) 281. Rolan, H. G. et al. Cell Host Microbe 14, 306-17, (2013) 282. Choi, H. W. et al. Immunity 39, 1108-20, (2013) 283. Alonzo, F., 3rd & Torres, V. J. Microbiol Mol Biol Rev 78, 199-230, (2014) 284. Berube, B. J. & Bubeck Wardenburg, J. Toxins (Basel) 5, 1140-66, (2013) 285. Spaan, A. N. et al. Nat Rev Microbiol 15, 435-47, (2017) 286. Wilke, G. A. & Bubeck Wardenburg, J. Proc Natl Acad Sci U S A 107, 13473-8, (2010) 287. Rooijakkers, S. H. et al. Microbes Infect 7, 476-84, (2005) 288. Kuipers, A. et al. Microbiology (Reading) 162, 1185-94, (2016) 289. Lei, B. et al. Nat Med 7, 1298-305, (2001) 290. von Pawel-Rammingen, U. et al. EMBO J 21, 1607-15, (2002) 291. Choudhury, B. et al. J Biol Chem 281, 27932-41, (2006) 292. Wessels, M. R. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 88, 8317-21, (1991) 293. Hammerschmidt, S. et al. Mol Microbiol 20, 1211-20, (1996) 294. Wyres, K. L. et al. J Infect Dis 207, 439-49, (2013) 295. Mubaiwa, T. D. et al. Pathog Dis 75, (2017) 296. Wessels, M. R. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 86, 8983-7, (1989) 297. Cieslewicz, M. J. et al. Infect Immun 73, 3096-103, (2005) 298. Rouphael, N. G. & Stephens, D. S. Methods Mol Biol 799, 1-20, (2012) 157

299. von Eiff, C. et al. Diagn Microbiol Infect Dis 58, 297-302, (2007) 300. Orskov, I. et al. Bacteriol Rev 41, 667-710, (1977) 301. Yother, J. Annu Rev Microbiol 65, 563-81, (2011) 302. Hänsch, G. M. ISRN Immunology, 853123, (2012) 303. Leid, J. G. Microbe. 4, 66-70, (2009,) 304. Thurlow, L. R. et al. J Immunol 186, 6585-96, (2011) 305. Uhlen, M. et al. J Biol Chem 259, 1695-702, (1984) 306. Smith, E. J. et al. Infect Immun 79, 3801-9, (2011) 307. Palmqvist, N. et al. Microb Pathog 33, 239-49, (2002) 308. Roben, P. W. et al. J Immunol 154, 6437-45, (1995) 309. Silverman, G. J. Semin Immunol 10, 43-55, (1998) 310. Hartleib, J. et al. Blood 96, 2149-56, (2000) 311. Gomez, M. I. et al. Nat Med 10, 842-8, (2004) 312. Gomez, M. I. et al. EMBO J 26, 701-9, (2007) 313. Freeman, S. A. & Grinstein, S. Immunol Rev 262, 193-215, (2014) 314. Niedergang, F. & Chavrier, P. Curr Top Microbiol Immunol 291, 43-60, (2005) 315. Fairn, G. D. & Grinstein, S. Trends Immunol 33, 397-405, (2012) 316. Levin, R. et al. Immunol Rev 273, 156-79, (2016) 317. Lee, H. J. et al. Microorganisms 8, (2020) 318. Lukacs, G. L. et al. J Biol Chem 265, 21099-107, (1990) 319. Jank, T. et al. Glycobiology 17, 15R-22R, (2007) 320. Black, D. S. & Bliska, J. B. Mol Microbiol 37, 515-27, (2000) 321. Groves, E. et al. J Biol Chem 285, 4087-98, (2010) 322. Fu, Y. & Galan, J. E. Nature 401, 293-7, (1999) 323. Haraga, A. & Miller, S. I. Infect Immun 71, 4052-8, (2003) 324. Krall, R. et al. Infect Immun 70, 360-7, (2002) 325. Uchiya, K. et al. EMBO J 18, 3924-33, (1999) 326. Philips, J. A. Cell Microbiol 10, 2408-15, (2008) 327. Lugo-Villarino, G. & Neyrolles, O. Cold Spring Harb Perspect Med 4, a018549, (2014) 328. Mehra, A. et al. PLoS Pathog 9, e1003734, (2013) 329. Groschel, M. I. et al. Nat Rev Microbiol 14, 677-91, (2016) 330. Schnupf, P. & Portnoy, D. A. Microbes Infect 9, 1176-87, (2007) 331. Goldfine, H. et al. Infect Immun 68, 5735-41, (2000) 332. Kocks, C. et al. Cell 68, 521-31, (1992) 333. Portnoy, D. A. et al. J Cell Biol 158, 409-14, (2002) 334. Marteyn, B. et al. Gut Microbes 3, 104-20, (2012) 335. Egile, C. et al. J Cell Biol 146, 1319-32, (1999) 336. Walker, D. H. et al. Am J Trop Med Hyg 65, 936-42, (2001) 337. Gouin, E. et al. Nature 427, 457-61, (2004) 338. Babior BM: NADPH oxidase. Curr Opin Immunol (2004)16:42-7 339. Kuhns DB. Assessment of neutrophil function. Clin Immunol (2008), 1461– 70. doi: 10.1016/B978-0 323-04404-2.10099-5 340. Flannagan, R. S. et al. Nat Rev Microbiol 7, 355-66, (2009) 341. Slauch, J. M. Mol Microbiol 80, 580-3, (2011) 342. Ariffin, J. K. et al. Antimicrob Agents Chemother 60, 1521-9, (2015) 343. Fang, F. C. Nat Rev Microbiol 2, 820-32, (2004) 344. Zhao, L. & Lu, W. Curr Opin Hematol 21, 37-42, (2014) 345. Kosciuczuk, E. M. et al. Mol Biol Rep 39, 10957-70, (2012) 346. Lehrer, R. I. et al. Annu Rev Immunol 11, 105-28, (1993) 347. Zanetti, M. Curr Issues Mol Biol 7, 179-96, (2005) 348. Uribe-Querol, E. & Rosales, C. Front Immunol 8, 1368, (2017) 349. Wu, Y. et al. Biochimie 92, 583-7, (2010) 350. Masson, P. L. et al. J Exp Med 130, 643-58, (1969) 351. Cellier, M. F. et al. Microbes Infect 9, 1662-70, (2007) 352. Hackam, D. J. et al. J Exp Med 188, 351-64, (1998) 353. Delaby, C. et al. Blood 106, 3979-84, (2005) 354. Ganz, T. & Nemeth, E. Annu Rev Med 62, 347-60, (2011) 355. Nairz M., H. D., et al. . Front Pharmacol 5, (2014) 356. Papayannopoulos, V. Nat Rev Immunol 18, 134-47, (2018) 357. Sturgill-Koszycki, S. et al. Science 263, 678-81, (1994) 158

358. Nordenfelt, P. et al. Microbes Infect 14, 1319-29, (2012) 359. Toyooka, K. et al. J Med Microbiol 54, 1007-15, (2005) 360. Pujol, C. et al. Infect Immun 77, 2251-61, (2009) 361. Bore, E. et al. Microbiology (Reading) 153, 2289-303, (2007) 362. Schwartz, J. T. & Allen, L. A. J Leukoc Biol 79, 1214-25, (2006) 363. de Jong, N. W. M. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 114, 9439-44, (2017) 364. Karavolos, M. H. et al. Microbiology (Reading) 149, 2749-58, (2003) 365. Cosgrove, K. et al. J Bacteriol 189, 1025-35, (2007) 366. Stevanin, T. M. et al. Infect Immun 70, 4399-405, (2002) 367. Stevanin, T. M. et al. Gene 398, 62-8, (2007) 368. Bang, I. S. et al. J Biol Chem 281, 28039-47, (2006) 369. Rodionov, D. A. et al. PLoS Comput Biol 1, e55, (2005) 370. Bera, A. et al. Mol Microbiol 55, 778-87, (2005) 371. Herbert, S. et al. PLoS Pathog 3, e102, (2007) 372. Weiss, G. & Schaible, U. E. Immunol Rev 264, 182-203, (2015) 373. Weinberg, E. D. Science 184, 952-6, (1974) 374. Hood, M. I. & Skaar, E. P. Nat Rev Microbiol 10, 525-37, (2012) 375. Schalk, I. J. J Inorg Biochem 102, 1159-69, (2008) 376. Ahmed, E. & Holmstrom, S. J. Microb Biotechnol 7, 196-208, (2014) 377. Nairz, M. et al. Blood 114, 3642-51, (2009) 378. Holmes, M. A. et al. Structure 13, 29-41, (2005) 379. Cornelissen, C. N. Front Biosci 8, d836-47, (2003) 380. Cartron, M. L. et al. Biometals 19, 143-57, (2006) 381. Kehl-Fie, T. E. & Skaar, E. P. Curr Opin Chem Biol 14, 218-24, (2010) 382. Kehl-Fie, T. E. et al. Cell Host Microbe 10, 158-64, (2011) 383. Anjem, A. et al. Mol Microbiol 72, 844-58, (2009) 384. Sobota, J. M. & Imlay, J. A. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 5402-7, (2011) 385. Hantke, K. Curr Opin Microbiol 8, 196-202, (2005) 386. Klein, J. S. & Lewinson, O. Metallomics 3, 1098-108, (2011) 387. Hou, Z. J. et al. J Biol Chem 276, 40858-63, (2001) 388. Szeto, J. et al. Autophagy 2, 189-99, (2006) 389. Glick, D. et al. J Pathol 221, 3-12, (2010) 390. Leyva-Paredes, K., Castrejón-Jiménez, N. S., et al. Choosing Lunch: The Role of Selective Autophagy Adaptor Proteins. (2016) 391. Komander, D. & Rape, M. Annu Rev Biochem 81, 203-29, (2012) 392. Pickart, C. M. Annu Rev Biochem 70, 503-33, (2001) 393. Lin, L. & Baehrecke, E. H. Mol Cell Oncol 2, e985913, (2015) 394. Jiang, X. & Chen, Z. J. Nat Rev Immunol 12, 35-48, (2011) 395. Yoshikawa, Y. et al. Nat Cell Biol 11, 1233-40, (2009) 396. Dortet, L. et al. PLoS Pathog 7, e1002168, (2011) 397. Choy, A. et al. Science 338, 1072-6, (2012) 398. Mesquita, F. S. et al. PLoS Pathog 8, e1002743, (2012) 399. Thomas, M. et al. Autophagy 8, 1824-6, (2012) 400. Ogawa, M. et al. Science 307, 727-31, (2005) 401. Cui, J. et al. Science 329, 1215-8, (2010) 402. Shin, D. M. et al. PLoS Pathog 6, e1001230, (2010) 403. Duan, L. et al. Biochem Biophys Res Commun 473, 1229-34, (2016) 404. Saini, N. K. et al. Nat Microbiol 1, 16133, (2016) 405. von Kockritz-Blickwede, M. & Nizet, V. J Mol Med (Berl) 87, 775-83, (2009) 406. Yousefi, S. et al. Cell Death Differ 16, 1438-44, (2009) 407. Hahn, S. et al. Semin Immunopathol 35, 439-53, (2013) 408. Yousefi, S. et al. Nat Med 14, 949-53, (2008) 409. von Kockritz-Blickwede, M. et al. Blood 111, 3070-80, (2008) 410. Liu, P. et al. PLoS One 9, e90042, (2014) 411. Buchanan, J. T. et al. Curr Biol 16, 396-400, (2006) 412. Beiter, K. et al. Curr Biol 16, 401-7, (2006) 413. Berends, E. T. et al. J Innate Immun 2, 576-86, (2010) 414. Cheng, A. G. et al. PLoS Pathog 6, e1001036, (2010) 415. Khatua, B. et al. J Leukoc Biol 91, 641-55, (2012) 416. Wartha, F. et al. Cell Microbiol 9, 1162-71, (2007) 159

417. Gabriel, C. et al. J Immunol 185, 4319-27, (2010) 418. Torrado, E. et al. Trends Immunol 32, 66-72, (2011) 419. Steinwede, K. et al. J Immunol 188, 4476-87, (2012) 420. Jena, P. et al. PLoS One 7, e50345, (2012) 421. Wong, K. W. & Jacobs, W. R., Jr. J Infect Dis 208, 109-19, (2013) 422. Mitchell, G. & Isberg, R. R. Cell Host Microbe 22, 166-75, (2017) 423. Trombetta, E. S. & Mellman, I. Annu Rev Immunol 23, 975-1028, (2005) 424. Geppert, T. D. & Lipsky, P. E. J Immunol 135, 3750-62, (1985) 425. Loss, G. E., Jr. & Sant, A. J. J Immunol 150, 3187-97, (1993) 426. Steimle, V. et al. Science 265, 106-9, (1994) 427. Devaiah, B. N. & Singer, D. S. Front Immunol 4, 476, (2013) 428. ten Broeke, T. et al. Cold Spring Harb Perspect Biol 5, a016873, (2013) 429. Nakagawa, T. et al. Science 280, 450-3, (1998) 430. Riese, R. J. et al. Immunity 4, 357-66, (1996) 431. Shi, G. P. et al. J Exp Med 191, 1177-86, (2000) 432. Schulze, M. S. & Wucherpfennig, K. W. Curr Opin Immunol 24, 105-11, (2012) 433. Nathan, J. A. & Lehner, P. J. Exp Cell Res 315, 1593-600, (2009) 434. Thibodeau, J. et al. Eur J Immunol 38, 1225-30, (2008) 435. Wilson, J. E. et al. Infect Immun 77, 4953-65, (2009) 436. Letendre, C. et al. Front Immunol 9, 1199, (2018) 437. Lapaque, N. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 14052-7, (2009) 438. Hunt, D. et al. PLoS One 7, e37330, (2012) 439. Bayer-Santos, E. et al. Cell Host Microbe 20, 584-95, (2016) 440. Kincaid, E. Z. & Ernst, J. D. J Immunol 171, 2042-9, (2003) 441. Pennini, M. E. et al. J Immunol 176, 4323-30, (2006) 442. Pai, R. K. et al. J Immunol 171, 175-84, (2003) 443. Fortune, S. M. et al. J Immunol 172, 6272-80, (2004) 444. Sendide, K. et al. J Immunol 175, 5324-32, (2005) 445. Srivastava, S. & Ernst, J. D. Cell Host Microbe 15, 741-52, (2014) 446. Barrionuevo, P. et al. Infect Immun 76, 250-62, (2008) 447. Velasquez, L. N. et al. J Leukoc Biol 101, 759-73, (2017) 448. Liu, Y. et al. Front Microbiol 2, 52, (2011) 449. Ram, S. et al. J Exp Med 193, 281-95, (2001) 450. Plaut, A. G. et al. Science 190, 1103-5, (1975) 451. Liu, Y. et al. Mucosal Immunol 5, 320-31, (2012) 452. Zhu, W. et al. PLoS One 7, e41260, (2012) 453. Boulton, I. C. & Gray-Owen, S. D. Nat Immunol 3, 229-36, (2002) 454. Robinson, K. et al. Gut 57, 1375-85, (2008) 455. Gebert, B. et al. Science 301, 1099-102, (2003) 456. Sundrud, M. S. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 7727-32, (2004) 457. Oertli, M. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 110, 3047-52, (2013) 458. Utsch, C. & Haas, R. Toxins (Basel) 8, (2016) 160

V. ÚČELOVÉ SPRÁVANIE BAKTERIÁLNEJ BUNKY Radomíra Nemcová, Marián Maďar, Ján Király 5.1 TVORBA BIOFILMU ....................................................................... 162 162 5.1.1 Biofilm ............................................................................................... 162 5.1.1.1 Výskyt biofilmov v prírode a na umelých materiáloch ..................... 163 164 5.1.1.2 Typy biofilmov .................................................................................. 165 166 5.1.2 Tvorba biofilmu ................................................................................. 166 5.1.2.1 Adhézia baktérií na povrch ................................................................ 167 5.1.2.2 Tvorba mikrokolónií .......................................................................... 168 168 5.1.2.3 Dozrievanie biofilmu ......................................................................... 168 169 5.1.2.4 Disperzia biofilmu ............................................................................. 169 5.1.2.5 Faktory ovplyvňujúce tvorbu biofilmu .............................................. 170 5.1.3 Ochorenia spojené s biofilmom ......................................................... 170 5.1.3.1 Zubný kaz a ochorenia paradontu ...................................................... 170 171 5.1.3.2 Rany ................................................................................................... 171 5.1.3.3 Periprotetické kĺbové infekcie ........................................................... 171 5.1.3.4 Urinárne infekcie ............................................................................... 172 5.1.3.5 Infekcie srdcových chlopní ................................................................ 175 5.1.4 Prevencia tvorby biofilmov a ich eliminácia ..................................... 5.1.4.1 Mechanické metódy regulácie tvorby biofilmu ................................. 176 5.1.4.2 Fyzikálne metódy regulácie tvorby biofilmu ..................................... 177 5.1.4.3 Chemické metódy regulácie tvorby biofilmu .................................... 5.1.4.4 Biologické metódy regulácie tvorby biofilmu ................................... 180 5.1.5 Využitie baktérií tvoriacich biofilm v priemysle ............................... 181 5.2 BIOFILM A QUORUM SENSING .................................................... 181 182 5.2.1 Quorum sensing .................................................................................. 183 5.2.1.1 Quorum sensing regulácia tvorby biofilmu 183 183 u Gram-negatívnych baktérií ............................................................. 184 5.2.1.2 Quorum sensing regulácia tvorby biofilmu 184 u Gram-pozitívnych baktérií .............................................................. 185 5.2.1.3 Medzidruhové quorum sensing signály ............................................. 185 5.2.2 Stratégie inhibície QS ........................................................................ 199 5.2.2.1 Syntéza derivátov QSI ....................................................................... 204 5.2.2.2 Modifikácia quorum zhášacích (QQ) enzýmov ................................. 206 5.2.2.3 Prírodné látky a lieky inhibujúce QS ................................................. 208 5.2.2.4 Využitie látok inhibujúcich QS pri kontrole tvorby biofilmu ............ 208 212 5.3 CHEMOTAXIA ................................................................................. 217 5.3.1 Typy aktívneho pohybu baktérií ........................................................ 5.3.1.1 Pohyb sprostredkovaný bičíkmi ......................................................... 5.3.1.2 Zášklbový pohyb (Twitching) ............................................................ 5.3.1.3 Kĺzavý pohyb (Gliding) ..................................................................... 5.3.1.4 Iné typy pohybu ................................................................................. 5.3.2 Mechanizmus bakteriálnej chemotaxie .............................................. 5.3.2.1 Reakcia baktérií s bičíkovým pohybom na chemické podnety .......... 5.3.2.2 Chemotaktická signálna dráha u Escherichia coli ............................. 5.3.2.3 Adaptačný proces ............................................................................... 161

5.3.2.4 Rozdiely v dráhach prenosu signálu u iných bakteriálnych druhov .. 220 5.3.3 Úloha pohybu a chemotaxie v kolektívnom správaní baktérií ........... 224 5.3.3.1 Expanzia populácie podmienená pohybom ........................................ 224 5.3.3.2 Autoagregácia chemotaktických baktérií ........................................... 225 5.3.3.3 Fyzikálne interakcie medzi pohyblivými bunkami ............................ 227 5.3.3.4 Úloha bičíka, pohybu a chemotaxie pri tvorbe biofilmu ................... 228 5.3.4 Úloha chemotaxie pri interakciách hostiteľ-mikroorganizmus .......... 229 5.1 TVORBA BIOFILMU 5.1.1 Biofilm Mikroorganizmy si počas evolúcie vytvárali rôzne stratégie prežívania. Jedným z účinných spôsobov prežitia bola aj tvorba biofilmu. Prostredníctvom biofilmov mikroorganizmy úspešne kolonizovali rôzne prostredie na celej našej planéte: vodu, pôdu, ako aj vnútorné a vonkajšie povrchy iných živých organizmov1. Mikroorganizmy sa viažu na biotické alebo abiotické povrchy a vytvárajú biofilm tvorbou extracelulárnych polymérnych substancií2. Biofilmy sú klasickým príkladom mikrobiálnych konzorcií, ktoré slúžia k ich adherencii, komunikácii a ochrane3. Biofilm je definovaný ako spoločenstvo mikroorganizmov, ktoré je naviazané na substrát, rozhranie alebo na seba navzájom. Mikroorganizmy v biofilme sú vložené do matrice zloženej z extracelulárnej polymérnej substancie a vykazujú zmenený fenotyp vzhľadom na rast, expresiu génov a produkciu proteínov2. Matrica extracelulárnej polymérnej substancie slúži ako skelet na zadržiavanie mikrobiálnych buniek, vody, polysacharidov, proteínov, DNA, RNA, iónov a rôznych iných biologicky aktívnych látok, vrátane signálnych molekúl bunkovej komunikácie4,5. 5.1.1.1 Výskyt biofilmov v prírode a na umelých materiáloch Biofilm je možné nájsť bežne na skalách v jazerách, na povrchoch rastlín a živočíchoch, ale aj na miestach ako sú toxické termálne jazerá sopečného pôvodu. Bakteriálny biofilm je ovplyvnený vonkajšími faktormi ako aj klimatickými podmienkami a poskytuje unikátnu stratégiu prežívania baktérií aj v tých najextrémnejších podmienkach. Synergické interakcie medzi mikrobiálnymi spoločenstvami biofilmu zvyšujú v extrémnych podmienkach ich odolnosť voči UV žiareniu, vysokej teplote, pH prostredia6,7, vysokej koncentrácii solí8, nedostatočnej výžive9 a rezistencii voči antibiotikám10. Biofilmy majú pre prírodu 162

nenahraditeľnú funkciu najmä pri rozklade odumretých častí organizmov. Biofilmy, ktorým hovoríme patologické, sa môžu vyskytovať pri chronických, ťažko hojacich sa ranách, na povrchoch umelých kĺbových náhrad alebo na umelých srdcových chlopniach. Negatívny, resp. nežiaduci efekt biofilmu sa prejaví aj v prípade jeho tvorby na povrchu chirurgického inštrumentária, najmä pri operačných zákrokoch. Biofilmy, tvorené patogénnymi baktériami odolnými voči dezinfekčným prostriedkom alebo antibiotikám, predstavujú veľkú hrozbu najmä v nemocničnom prostredí. Tieto biofilmy sú zodpovedné za mnohé nozokomiálne infekcie a post operačné komplikácie. Navyše, v potravinárskom priemysle môžu zmiešané druhy biofilmov znehodnotiť potraviny alebo mať za následok vzplanutie infekcie prenášanej potravinami11. 5.1.1.2 Typy biofilmov Biofilmy sa delia na monobakteriálne a polybakteriálne. Monobakteriálne biofilmy sú tvorené jedným druhom baktérií a polybakteriálne sa v prírode formujú ako komplexné bakteriálne spoločenstvá. Monobakteriálne biofilmy sa vyskytujú najmä na miestach, kde by sa iné bakteriálne druhy neuplatnili kvôli výraznému selekčnému tlaku prostredia. Pritom jednodruhové biofilmové spoločenstvá sa často skladajú z fenotypovo odlišných bakteriálnych subpopulácií12. Napríklad pri monobakteriálnom biofilme fakultatívne anaeróbnej baktérie sa predpokladá, že bunky umiestnené v horných vrstvách biofilmu spotrebúvajú dostupný kyslík a rastú aeróbne, zatiaľ čo pod aeróbnou vrstvou sa vytvára anaeróbne mikroprostredie pre anaeróbny rast bakteriálneho spoločenstva12. Vo väčšine prípadov sa biofilm skladá z viacerých bakteriálnych druhov, ktoré vedia spolu koexistovať. Tieto biofilmy nazývame polybakteriálne alebo polymikrobiálne. Medzi najznámejší polybakteriálny biofilm patrí dentálny biofilm. Na jeho tvorbe v mikroprostredí ústnej dutiny sa okrem rôznych baktérií podieľajú aj mikroskopické huby a kvasinky. Vzájomné molekulárne vzťahy, chemická komunikácia prostredníctvom signálov, energetická závislosť, nutričný potenciál a bioštrukturálna stabilita, ktorá sa vytvára v biofilmoch, je udržateľným prostredím pre druhy, ktoré ich tvoria1. Pri patogénnych, resp. potenciálne patogénnych bakteriálnych druhoch sa schopnosť tvoriť biofilm považuje za jeden z významných faktorov patogenity a virulencie. Bolo preukázané, že väčšina chronických infekcií je vyvolaná biofilm tvoriacimi baktériami13,14. Príkladom toho sú chronické infekcie vyvolané najmä kmeňmi Staphylococcus epidermidis a Pseudomonas aeruginosa u imunokompromitovaných jedincov15. Rast biofilmu sa vyskytuje na prirodzených povrchoch, 163

ako je napríklad spomínaný povrch zubov, pričom tu patologické biofilmy spôsobujú ochorenie zubov16, prípadne aj periodontitídy17. Biofilmy sú prítomné aj pri chronickej rinosinusitíde18, v strednom uchu u pacientov s chronickým a sekrečným zápalom stredného uch19, v pľúcach pacientov s cystickou fibrózou, čo vedie k chronickej bronchopneumónii20, pri infekciách močových ciest21, ale aj na už spomínanom povrchu srdcových chlopní pri endokarditídach22 a na povrchoch kĺbových náhrad. 5.1.2 Tvorba biofilmu Mechanizmus tvorby biofilmu je regulovaný proces, kedy sa zoskupujú jednobunkové planktonické mikroorganizmy a vytvárajú mnohobunkový útvar, až postupne vzniká usporiadané spoločenstvo baktérií23. Biofilm sa môže formovať troma mechanizmami: redistribúciou (premiestnením) už prichytených buniek24, ich postupným delením25 alebo ich postupným nahromadením, resp. ich autoagregáciou26. V závislosti od mikrobiálneho druhu tvoriaceho biofilm a podmienok vonkajšieho prostredia (vlastnosti povrchu, dostupnosť živín a kyslíka, pH, osmotický tlak a hydrodynamika prostredia) je štruktúra a tvar biofilmu relatívne premenlivý27. Hrúbka biofilmu sa môže pohybovať od jednej bunkovej vrstvy, až po významné spoločenstvo uzavreté viskóznym polymérnym prostredím. Štruktúrou biofilmu prebieha zložitá sieť kanálikov, ktorá poskytuje určitú dostupnosť základných živín aj do jeho najhlbších oblastí28. Obr. 5.1 Tvorba biofilmu na biotickom povrchu (povrch sliznice žalúdka) – vlastný obrázok. 164

Aj keď biofilm môže vzniknúť z jednej bunky, rozdielne environmentálne podmienky v celom spoločenstve biofilmu môžu iniciovať vznik a rozvoj odlišných bakteriálnych subpopulácií. Rôzne koncentrácie kyslíka, živín a akceptorov elektrónov môžu spôsobiť heterogénnu expresiu génov v celom biofilme. Tvorba biofilmu je dobre organizovaný proces riadený expresiou špecifických génov29 . Jeho tvorba pozostáva v princípe z počiatočnej adhézie baktérií k povrchu, tvorby mikrokolónií, dozrievania biofilmu a disperzie (Obr.5.1). Na jeho začiatku sa na bakteriálnom povrchu za priaznivých podmienok zvýši expresia adhezínov, pohyblivé druhy strácajú svoju pohyblivosť a začínajú produkovať extracelulárnu polymérnu substanciu. Táto je spolu s adhezínmi nevyhnutná k zahájeniu počiatočnej fázy vzniku biofilmu23. 5.1.2.1 Adhézia baktérií na povrch Pri tvorbe väčšiny biofilmov sa jednobunkové organizmy spájajú a vytvárajú komunitu, ktorá je pripojená k pevnému povrchu a pokrytá extracelulárnou polymérnou substanciou. Mikroorganizmy tvoria menej ako 10 % sušiny, zatiaľ čo matrica môže predstavovať viac ako 90 %. Existuje množstvo mechanizmov, pomocou ktorých sú rôzne mikrobiálne druhy schopné prísť do užšieho kontaktu s povrchom, pevne sa k nemu pripojiť, podporiť interakcie medzi bunkami a rásť ako komplexná štruktúra30. Planktonické bunky, za istých vhodných podmienok pH, teploty, koncentrácie živín a osmolarity, adherujú na abiotické aj biotické povrchy31,32. Na adhézií sa taktiež podieľa difúzia, pasívny transport vody, ale aj aktívny transport baktérií. Adhézia buniek závisí predovšetkým od fyzikálno-chemických vlastností kontaktného povrchu ako aj od samotných buniek. Adhézia prebieha ľahšie na drsnejších a hydrofóbnejších povrchoch. Prvotného spojenia sa zúčastňujú aj niektoré špeciálne bakteriálne povrchové štruktúry ako sú flagely a fimbrie a tiež aj povrchové molekuly polysacharidov a proteínov. Voľne plávajúce planktonické bunky sa prichytávajú na povrch pomocou adhezínov33. Neskôr baktérie vytvárajú pevné špecifické väzby v podobe chemických väzieb alebo väzieb medzi adhezínom a receptorom34. Prvé prichytenie je reverzibilné. Potom nastáva tzv. irreverzibilná adhézia33. Prechod z reverzibilného do ireverzibilného prichytenia buniek k substrátu prostredníctvom extracelulárnych polymérov popísal v roku 1990 Characklis35. Udržiavanie kontaktu baktérií s povrchom a ich rast vedú k vývoju a dozrievaniu biofilmu. Adherencia baktérií na povrch pomocou fimbrií, glykokalyxu a proteínov podmieňuje expresiu génov pre tvorbu extracelulárnej polymérnej substancie. U baktérií dochádza k zvýšeniu produkcie lepivej 165

extracelulárnej polymérnej substancie, tzv. matrice, ktorá má funkciu lešenia33. Extracelulárna polymérna substancia ako matrica biofilmov plní okrem úlohy lešenia aj úlohu tráviaceho systému. Akumuluje tráviace a degradačné enzýmy baktérií, ktoré môžu degradovať aj rôzne zložky samotnej matrice, degradujú ďalej komplexné živiny a iné látky. Degradácia pomáha presunu živín do tesnej blízkosti mikrobiálnych buniek, čo im uľahčuje príjem živín. 5.1.2.2 Tvorba mikrokolónií V biofilme pevne prichytené baktérie sa rýchlo delia, rastú a vznikajú mikrokolónie. Kľúčovým aspektom dozrievania biofilmu je tvorba mikrokolónií, ktoré poskytujú zväčšený povrch pre výmenu živín a odstraňovanie odpadu a podporujú šírenie buniek biofilmu do vzdialenejších miest36. Mikrokolónie sa obalia slizom a ďalej sa diferencujú. Dochádza k ich rozrastaniu delením i koagregáciou, teda väzbou ďalších baktérií k baktériám v biofilme34. Menia sa ich vlastnosti, najprv na úrovni regulácie génov, neskôr zvýšením produkcie polysacharidov a znížením produkcie polymérov alebo úplným zastavením tvorby flagel. Vďaka zvýšenej produkcii extracelulárnej polymérnej substancie, stabilizujúcej biofilmovú sieť a vzniku mikrokolónií dochádza neskôr k maturácii biofilmu27. 5.1.2.3 Dozrievanie biofilmu V tejto fáze dochádza k množeniu baktérií, ich agregácii a k ďalšej tvorbe mikrokolónií so súčasným zvyšovaním produkcie extracelulárnej polymérnej substancie. Táto fáza sa označuje ako fáza akumulácie a maturácie (dozrievania) biofilmu37. Vďaka biofilm špecifickým génom, bunky biofilmu začínajú komunikovať medzi sebou pomocou signálnych molekúl38. Signálne molekuly, ktoré sú uvoľňované z biofilmu, môžu byť atraktantom aj pre iné druhy baktérií, ktorý ich priťahuje k biofilmu39. Trojrozmerná štruktúra zrelého biofilmu vzniká počas niekoľkých hodín až dní. Zo zrelého biofilmu sa môžu uvoľniť voľné planktonické bunky a následne kolonizovať iné miesta. Signálom na takéto správanie buniek je dosiahnutie kritického množstva masy buniek v biofilme, v dôsledku čoho dochádza k prechodu buniek z fázy biofilmu do fázy disperzie40. 166

5.1.2.4 Disperzia biofilmu Jednotlivé bunky a ich celé zhluky obalené v extracelulárnej polymérnej substancii sa z biofilmu môžu uvoľňovať a ďalej šíriť, pričom dôležitú úlohu pri ich disperzii zohráva viacero faktorov, ako sú mechanické účinky prostredia, dostupnosť živín a kyslíka, koncentrácia metabolitov a regulačné systémy, predovšetkým systém quorum sensing41,42. Samotná disperzia (rozptyl) prebieha buď uvoľňovaním jednotlivých buniek z biofilmu, alebo uvoľňovaním agregátov, prípadne uvoľnením celého biofilmu, ktorý sa môže pohybovať po povrchu27,43. Aktívna disperzia je iniciovaná samotnými baktériami najčastejšie pomocou quorum sensing, zatiaľ čo pri pasívnej disperzii je proces sprostredkovaný vonkajšími silami, napríklad prúdom tekutiny a obrusovaním44. Quorum sensing je typ komunikácie, ktorý zohráva úlohu v synergických i antagonistických mikrobiálnych interakciách. Pochopenie mechanizmov quorum sensing môže poskytnúť dôležité informácie o fungovaní mikrobiálnych spoločenstiev v biofilme. Na základe pôsobenia určitého signálu sa bunky z tejto matrice odlučujú, opúšťajú biofilm a prechádzajú do planktonického stavu a môžu tak kolonizovať ďalšie časti povrchu33. Enzýmy, ktoré sa tvoria v rôznych fázach vývoja biofilmu, môžu tiež iniciovať degradáciu biofilmovej extracelulárnej polymérnej substancie, a tak prispieť k disperzii. Komunikácia baktérií v biofilme spočíva aj vo výmene genetických informácií medzi baktériami, čím môžu baktérie získať napríklad rezistenciu voči antibiotikám (jedným z mechanizmov horizontálneho prenosu genetickej informácie). Oddelenie buniek je posledným krokom životného cyklu biofilmu, čo umožňuje baktériám kolonizovať nové prostredie (niky). Zo zrelého biofilmu sa niektoré bakteriálne bunky prenesú na rast planktónu. Tieto rozptýlené bunky skúmajú ďalšie možné priestory pre vytvorenie novej niky a opätovne sa pripájajú k novému povrchu. Disperzia teda nie je len poslednou fázou životného cyklu biofilmu, ale je zároveň aj začiatkom ďalšieho životného cyklu nového biofilmu. Existuje „aktívna disperzia“, ktorá závisí od motility buniek alebo degradácie extracelulárnej polymérnej substancie, a „pasívna disperzia“, ktorá závisí od fyzikálnych faktorov, ako je šmyková sila v podmienkach prúdenia kvapaliny43. Aktívna disperzia je spustená zmenami podmienok prostredia, ako je zmena teploty, nedostatok živín, nedostatok kyslíka a akumulácia metabolitov29. Pri aktívnom rozptýlení je zvýšená expresia génov, ktoré sú zapojené do motility buniek, ako je syntéza bičíkov alebo chemotaxia, resp. sa podieľajú napr. na produkcii disperzínu, prípadne ďalších látok dôležitých pre degradáciu extracelulárnej polymérnej substancie. Na druhej strane gény zapojené do produkcie extracelulárnej polymérnej substancie, ako je syntéza polysacharidov, prichytenie a syntéza fimbrií, vykazujú zníženú 167

expresiu29. Do tejto génovej regulácie je úzko zapojený aj intracelulárny bis-(3'-5')-cyklický dimérny guanozínmonofosfát (c-di-GMP), ktorý ako druhý posol, riadi širokú škálu bunkových procesov, ktoré prispievajú k povrchovej adaptácii, tvorbe biofilmu, progresii bunkového cyklu a virulencii. Intracelulárne hladiny c-di-GMP sú dynamicky kontrolované podmienkami prostredia. Na rozdiel od štádia pripojenia, zníženie intracelulárnych hladín c-di-GMP podporuje konverziu z planktónového na biofilmový spôsob života reguláciou génov zapojených do disperzie. Naopak, zvýšenie intracelulárnych hladín c-di-GMP podporuje konverziu na biofilmový spôsob života. c-di-GMP teda hrá ústrednú úlohu ako prepínač medzi planktónovým a biofilmovým spôsobom života45. 5.1.2.5 Faktory ovplyvňujúce tvorbu biofilmu Je známe, že zmena fenotypu z planktonického na sesilnú (pevne usadenú, či prichytenú) formu biofilmu, sa vyskytuje v reakcii na zmeny podmienok prostredia. Medzi environmentálne faktory, ktoré ovplyvňujú tvorbu a vývoj biofilmu, patrí teplota, pH prostredia, hladina O2, hydrodynamika, osmolarita, prítomnosť špecifických iónov, prítomnosť živín a faktorov odvodených z biotického prostredia46. 5.1.3 Ochorenia spojené s biofilmom 5.1.3.1 Zubný kaz a ochorenia paradontu Prostredie ústnej dutiny podporuje rast rôznych spoločenstiev mikroorganizmov – vírusov, mykoplaziem, baktérií, mikroskopickych húb a prvokov47,48. Tieto spoločenstvá pretrvávajú na všetkých povrchoch v dutine ústnej ako viacdruhové biofilmy a tvoria rezidentný orálny mikrobióm, ktorý vo všeobecnosti existuje v harmónii s hostiteľom a prináša mu dôležité výhody, ktoré prispievajú k jeho celkovému zdraviu a pohode. Celkovo je orálny ako aj dentálny biofilm zložený z množstva bakteriálnych druhov. Skladba bakteriálnej mikrobioty varíruje nielen medzidruhovo, ale aj v rámci hostiteľov jedného druhu. Mikroorganizmy nachádzajúce sa v týchto biofilmoch žijú vzájomne v tesnej blízkosti, čo vedie k širokému rozsahu potenciálnych interakcií, ktoré môžu byť synergické alebo antagonistické. Zloženie mikrobiómu je ovplyvnené prostredím dutiny ústnej a zmeny tohto prostredia môžu ovplyvniť aj mikrobiálne interakcie a čiastočne určiť, či vzťah medzi orálnym mikrobiómom a hostiteľom je symbiotický alebo potenciálne dysbiotický, čím sa zvyšuje riziko ochorení, ako sú kazy alebo 168

periodontálne ochorenia47. Streptococcus mutans je jedným z najdôležitejších biofilm tvoriacich dentálnych patogénov, zodpovedným za tvorbu zubného kazu. Ďalšie patogény, ktoré sa podieľajú na vzniku patologického dentálneho biofilmu vedúceho k vzniku a rozvoju paradontitíd, sú najmä Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia a Treponema denticola49. Ich prítomnosť v biofilmoch je závislá na viacerých faktoroch, ako je tvar zubov, akumulácia plaku, ústna hygiena, systémové ochorenia ako je napr. diabetes mellitus, ale aj enviromentálne a behaviorálne faktory ako je fajčenie a iné50. Na odhalenie skladby dentálnych biofilmov sa najnovšie využívaju metodiky sekvenovania novej generácie (NGS = Next Generetion Sequencing ) ako napríklad sekvenovanie amplikónu. 5.1.3.2 Rany Rany predstavujú jednu zo vstupných brán infekcie hostiteľa. Rany môžu vzniknúť poranením o ostrý predmet, uhryznutím, uštipnutím, poškrabaním, prípadne aj iným spôsobom. Samostatnou kategóriou sú pooperačné rany, ktoré sa hoja per primam intentionem (primárne hojenie rany). V závislosti od rozsahu poškodenia tkaniva sa rany delia na povrchové a hlboké rany. Mikroorganizmy bežne kontaminujú, kolonizujú a často aj infikujú rany všetkých typov. Kontaminácia a infekcia rany mikroorganizmami predstavuje vážnu zdravotnú komplikáciu, nakoľko sa vtedy rany hoja per secundam intentionem (sekundárne hojenie rany). Pri analýze chronických rán bola identifikovaná prítomnosť biofilm tvoriacích baktérií, čím sa vysvetlilo, prečo tieto rany pretrvávajú51. Mikroorganizmy v biofilmoch, ktoré sa tvoria v ranách, lepšie odolávajú účinkom antimikrobiálnych látok a obranným mechanizmom hostiteľa52. Napríklad po uhryznutí psom sa veľmi často objavuje infekcia spôsobená Pasteurella canis53. Infekcia rany biofilm tvoriacim a meticilin rezistentným kmeňom Staphylococcus aureus, prípadne infekcia iným biofilm tvoriacim a polyrezistentným kmeňom Pseudomonas aeruginosa vyvolá vážnu komplikáciu pri hojení takto infikovanej rany. 5.1.3.3 Periprotetické kĺbové infekcie Veľmi častý problém, najmä u starších pacientov s umelými náhradami kĺbov, je tvorba biofilmu na povrchoch umelých kĺbových náhrad, čo si veľakrát vyžaduje nutnosť reoperácie. Pri periprotetickej infekcii sú známe dve hlavné cesty, resp. dve časové obdobia spojené so vstupom patogénnych baktérií do operačnej rany. Prvá cesta možnej infekcie je počas perioperačného obdobia, najčastejšie počas samotného chirurgického zákroku, pričom 169

prameňom infekcie je buď endogénna mikroflóra pacienta alebo mikroflóra personálu, prípadne je to bakteriálna kontaminácia z prostredia operačnej sály. Druhá cesta vstupu patogénnych baktérií do operačnej rany je cesta hematogénna, ktorá sa vyskytuje skôr v pooperačnom období54. Periprotetické infekcie sú navyše komplikované skutočnosťou, že sú často vyvolané dobre adaptovanými biofilm tvoriacimi patogénmi, ktoré sa niekedy ťažko diagnostikujú55. 5.1.3.4 Urinárne infekcie Urinárne infekcie sú najčastejšie spájané s Escherichia coli, ale môžu byť vyvolané aj inými patogénmi schopnými tvoriť biofilmy. Medzi takéto patria napríklad Proteus mirabilis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Morganella morganii, Providencia spp. a Klebsiella pneumoniae56,57. Okrem infekcií močových ciest tieto baktérie spôsobujú komplikácie aj tým, že sa zachytávajú na povrchu katétrov. Uretrálne katétre patria medzi najčastejšie používané zdravotnícke pomôcky a používajú sa na zvládanie širokého spektra stavov. Pri dlhodobej katetrizácii, viac ako 28 dní, vzniká riziko tvorby biofilmov na povrchoch katétrov56. Osobitné problémy vznikajú pri kolonizácii uretrálnych katétrov s bakteriálnymi druhmi produkujúcimi ureázu, ako je napr. Proteus mirabilis. 5.1.3.5 Infekcie srdcových chlopní Srdcové chlopne sú veľmi náchylné na kolonizáciu baktériami, ktoré sa dostanú do krvného obehu, najčastejšie po stomatologických chirurgických zákrokoch58. Z uvedeného dôvodu medzi najčastejšich pôvodcov infekcií srdcových chlopní, ktoré sú navyše spájané s tvorbou biofilmu, patria baktérie dentálneho biofilmu. A to aj v prípadoch ich umelých náhrad. Jedná sa najčastejšie, v 80 – 90 % prípadov endokarditíd, o zástupcov z rodu Staphylococcus, Streptococcus alebo Enterococcus59. Najčastejšie sú to kmene Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguis, Streptococcus sanguinis, Streptococcus mitis, Streptococcus salivarius a Streptococcus bovis60. 5.1.4 Prevencia tvorby biofilmov a ich eliminácia Biofilmy je možné eliminovať mechanickými, fyzikálnými a chemickými metódami13. Iná možnosť je biologická forma regulácie tvorby biofilmu. Nateraz je však najdôležitejšie preventívne predchádzať tvorbe biofilmu ako ho odstraňovať. 170

5.1.4.1 Mechanické metódy regulácie tvorby biofilmu Medzi mechanické metódy regulácie tvorby biofilmu patrí: zamedzenie prichytenia baktérií na povrchu, povrchový náboj a hydrofóbnosť, použitie zlúčenín, ktoré môžu narušiť tvorbu biofilmu, indukcia disperzie alebo degradácie vytvoreného biofilmu61. Drsnosť povrchu môže tiež ovplyvniť priľnavosť biofilmu. Drsné povrchy viac prispievajú k tvorbe a dozrievaniu biofilmu, zatiaľ čo hladké povrchy sú menej náchylné na priľnavosť biofilmu. Drsnosť povrchu môže ovplyvniť hydrofóbnosť alebo hydrofilnosť kontaktnej látky, čo následne ovplyvňuje jej schopnosť priľnúť62. Modifikácia povrchového náboja polymérov sa tiež ukázala ako účinný prostriedok prevencie biofilmu. Pozitívne nabité polykatiónové reťazce umožňujú molekule natiahnuť sa a vytvoriť baktericídnu aktivitu63. Hydrofóbnosť tiež zohráva významnú úlohu pri určovaní schopnosti baktérií vytvárať biofilmy. Niektoré druhy sa nedokážu prichytiť k povrchu a niekedy sa dokážu usadiť priamo na už prítomných zástupcoch tvoriaceho sa biofilmu63. 5.1.4.2 Fyzikálne metódy regulácie tvorby biofilmu Fyzikálne metódy používané na reguláciu tvorby biofilmov zahŕňajú supervysoké magnetické pole64, ultrazvuk65, vysoko pulzné elektrické pole a nízke elektrické pole66. Elektrický prúd o veľkosti 200 a 400 mA, prípadne použitý v kombinácii s antibiotikami, má baktericídny i mykocídny účinok na planktónové bunky Gram-pozitívnych a Gram-negatívnych baktérií, ako aj na kvasiniky Candida albicans66, 67. Na zabránenie tvorby biofilmov na povrchoch z nehrdzavejúcej ocele alebo na hydrofilných povrchoch tvorených Staphylococcus epidermis, sa používa nano-plazmový trimetylsilánový povlak68. Antiadhézne proti baktériám tvoriacim biofilm pôsobia aj hydrofóbne silán-xerogélové povlaky69. Na inhibíciu tvorby biofilmu v katétroch možno použiť techniku nazývanú antimikrobiálna zámková technika70. 5.1.4.3 Chemické metódy regulácie tvorby biofilmu Chemické metódy sú hlavnými metódami prevencie nežiaducej tvorby biofilmu. Patria medzi ne antibiotiká, biocídy a iónové povlaky. Polymér N-alkylpyridíniumbromidu a poly(4-vinyl- N-hexylpyridínu) inaktivuje viac ako 99 % baktérií Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli a Pseudomonas aeruginosa63. Zlúčeniny chelatujúce železo možno použiť na rozrušenie biofilmov Pseudomonas aeruginosa, ak sa použijú spolu s aminoglykozidmi71. Citrát sodný 171

inhibuje in vitro tvorbu biofilmu viacerých zástupcov rodu Staphylococcus72. Niektoré detergenty sú baktericídne a niektoré dezinfekčné prostriedky môžu dokonca depolymerizovať extracelulárnu polymérnu substanciu. Patrí k nim kyselina peroctová73, peroxid vodíka74, jód75 a chlór76. N-acetylcysteín (derivát aminokyseliny L-cysteínu) inhibuje tvorbu biofilmu Staphylococcus epidermis77. 5.1.4.4 Biologické metódy regulácie tvorby biofilmu Rastlinné extrakty Viacero rastlín a ich extraktov má preukázanú antibiofilmovú aktivitu13. Napríklad cibuľa alebo cesnak majú už oddávna popisované baktericídne a bakteriostatické vlastnosti. Nedávne štúdie potvrdili aj ich antibiofilmový potenciál najmä voči Listeria monocytogenes78. V súčasnosti rastlinné produkty našli široké uplatnenie v medicínskom a potravinárskom priemysle ako alternatívy ku konvenčnej terapii79. Rastlinné extrakty z rôznych druhov rastlín, vrátane bežných kulinárskych bylín, sú predmetom rozsiahleho štúdia v snahe izolovať a charakterizovať ich bioaktívne zlúčeniny. Možno tu spomenúť Eugenol, ktorý napríklad tiež inhibuje rast Listeria monocytogenes80. Tiež bolo preukázané, že metanolový extrakt z granátovníka púnskeho (Punica granatum) má výrazný efekt voči Staphylococcus aureus, aj na meticilín rezistentné kmene Staphylococcus aureus, ďalej na Escherichia coli a Candida albicans81. Salvipizón ako extrakt zo šalvie lekárskej (Salvia officinalis) výrazne inhibuje trvorbu biofilmov Staphylococcus epidremidis a Staphylococcus aureus82. Bola tiež potvrdená inhibícia tvorby biofilmu Pseudomonas aeruginosa a Escherichia coli O157: H7 rastlinným metabolitom ε-viniferínom83. Iná látka rastlinného pôvodu, purpurín, potláča morfogenézu Candida albicans a spôsobuje deformovanú tvorbu biofilmu. Vzhľadom na uvedené skutočnosti predstavuje purpurín potenciálneho kandidáta pri ďalšom výskume účinných antimykotík za in in vivo podmienok84. Bioaktívne látky produkované baktériami Medzi bioaktívne látky, produkované baktériami sa radia bakteriocíny, enzýmy, vitamíny, aminokyseliny, oligosacharidy, exopolysacharidy, biosurfaktanty a imunomodulačné zlúčeniny85. Medzi bioaktívne látky, ktoré sa najčastejšie spájajú so štúdiom inhibície tvorby biofilmu, patria bakteriocíny, biosurfaktanty a exopolysacharidy. 172

Bakteriocíny Bakteriocíny sú relatívne veľkou a heterogénnou skupinou špecifických ribozomálne syntetizovaných bioaktívnych peptidov alebo proteínov, ktoré produkujú mnohé baktérie. Zahŕňajú peptidy a proteíny s variabilnými molekulovými hmotnosťami, chemickými vlastnosťami, mechanizmami účinku, spektrom aktivity, umiestnením a poradím aminokyselín86. Produkujú ich tak Gram-pozitívne (napr. zástupcovia rodov Weissella, Enterococcus, Pediococcus, Streptococcus a čeľade Lactobacillaceae), ako aj Gram-negatívne baktérie. Bakteriocíny inhibujú väčšinou fylogeneticky príbuzné kmene, ale vykazujú taktiež veľký potenciál voči bakteriálnym kmeňom rezistentným na antibiotiká87. Bakteriocíny majú vynikajúce baktericídne účinky za in vitro podmienok88. Ich antibiofilmový potenciál možno vysvetliť disperziou, čiže rozptýlením štruktúry vytvoreného biofilmu alebo zabránením adhézie baktérií na povrchy, čím nedochádza k tvorbe biofilmu89. Bakteriocíny produkované mnohými druhmi baktérií, vrátane baktérií mliečneho kvasenia (LAB – Lactic Acid Bacteria), sa môžu podieľať na protektívnej úlohe a manažmente mnohých chorôb bakteriálneho pôvodu. Napríklad pri zubnom kaze bolo preukázané, že bakteriocín produkovaný kmeňom Latilactobacillus curvatus LHM inhibuje tvorbu biofilmu tvoreného Streptococcus mutans a Streptococcus sanguinis. Ďalší z mnohých bakteriocínov napríklad entianín, pôsobí voči meticilín rezistentnému kmeňu Staphylococcus aureus (ATCC 43300), ako aj voči vankomycín rezsitentnému kmeňu Enterococcus faecalis (ATCC 51299)90. Bakteriocíny sú považované za jednu z budúcich náhrad antibiotík88. Biosurfaktanty Biosurfaktanty sú produkované širokým spektrom mikroorganizmov, ako sú baktérie, huby a kvasinky. Produkcia biosurfaktantov bola zaznamenaná napríklad aj u baktérií z rodu Pseudomonas, Bacillus, Acinetobacter, Arthrobacter, Rhodococcus, Clostridium, Halomonas, Lactobacillus, Leuconostoc, Myroides a Serratia a tiež aj u niektorých kvasiniek, napr. z rodu Debrayomyces a Rhodotorula91. Biosurfaktanty sú amfifilné molekuly produkované na povrchu mikrobiálnych buniek alebo sú vylučované do vonkajšieho prostredia. Sú produkované ako sekundárne produkty ich metabolizmu a majú výrazné povrchové a emulgačné vlastnosti92. Po chemickej stránke predstavujú zlúčeniny tvorené molekulárnymi štruktúrami s hydrofilnými aj hydrofóbnymi skupinami, preto sú zvyčajne distribuované na rozhraní medzi kvapalnými fázami s rôznym stupňom polarity93. V ostatnom čase sa do popredia dostávajú vďaka možnému širokému využitiu, nízkej toxicite a vysokej biologickej rozložiteľnosti. Bol popísaný ich antibiofilmový, antiadhezívny antimikrobiálny, antivírusový, antikarcinogénny, 173

protizápalový a imunomodulačný účinok94. Antiadhezívne vlastnosti biosurfaktantov zohrávajú významnú úlohu, keďže sa ich pôsobenie pripisuje skôr schopnosti inhibovať adhéziu patogénov92. Najmä biosurfaktanty produkované zástupcami rodu Lactobacillus sa čoraz viac používajú ako antiadhezívne činidlá pri prevencii a kontrole infekcií spôsobených patogénmi tvoriacimi biofilm95. Štúdia zaoberajúca sa účinkom biosurfaktantov izolovaných z Lactobacillus jensenii a Lacticaseibacillus rhamnosus preukázala antimikrobiálnu, antiadhéznu a antibiofilmovú aktivitu voči multirezistentným patogénom ako je Acinetobacter baumannii, Escherichia coli a Staphylococcus aureus. Všetky spomenuté vlastnosti biosurfaktantov môžu v budúcnosti prispieť k ich potenciálnemu využitiu pri prevencii a liečbe infekcií ako alternatíva k existujúcim terapeutickým prístupom96. Exopolysacharidy Povrch väčšiny bakteriálnych buniek je pokrytý vrstvou polysacharidov označovanou aj ako glykokalyx. Tieto polyméry môžu byť s povrchom bunky spojené pevnými kovalentnými väzbami, čím vytvárajú kapsulu, a teda sú nazývané kapsulárnymi polysacharidmi (CPS = Capsular Polysaccharides), zatiaľ čo polysacharidy spojené s bunkou voľne alebo úplne oddelené a sekretované do okolitého prostredia za tvorby slizu sa označujú ako exopolysacharidy (EPS)97. EPS sú syntetizované baktériami počas ich rastu. Medzi najvýznamnejších producentov EPS patria baktérie z čeľade Lactobacillaceae a z rodov Lactococcus, Bifidobacterium, Streptococcus, Enterococcus a Weissella. Vo všeobecnosti majú EPS imunomodulačný, antibiofilmový či antikarcinogénny účinok, pričom niektoré vykazujú antimikrobiálne vlastnosti voči rôznym patogénnym mikroorganizmom. EPS sa v rámci svojej štruktúry výrazne odlišujú stupňom rozvetvenia a v zložení monosacharidu, na základe čoho sa rozdeľujú na homopolysacharidy, ktoré majú rovnaké sacharidové jednotky, a heteropolysacharidy zložené z rôznych monosacharidov98. Úlohou EPS je zabezpečenie interakcií medzi baktériami a ich prostredím. Exopolysacharidy, produkované probiotickými bakteriálnymi druhmi, majú široké využitie v potravinárskom, farmaceutickom a chemickom priemysle99. Bola preukázaná vlastnosť inhibície rastu rôznych bakteriálnych biofilmov prostrednictvom EPS, pričom mechanizmus antibiofilmového účinku EPS môže súvisieť s modifikáciou povrchu bakteriálnych buniek alebo so zabránením iniciálneho prichytenia bakteriálnej bunky k povrchu, prípadne down-reguláciou génovej expresie podieľajúcej sa na tvorbe biofilmu, kde pôsobia ako signálne molekuly97. Tiež bolo napríklad zistené že EPS môže priamo kontrolovať tvorbu biofilmu prostredníctvom regulácie produkcie proteínu curli a chemotaxie ako faktorov virulencie spojených s biofilmom v enterohemorhagickej Escherichia 174

coli O157: H799. V rámci kompetície o živiny a priestor sa tvorba biofilmu prospešnými baktériami považuje za účinnú stratégiu proti biofilmom, ktoré sú tvorené patogénnymi mikroorganizmami. Navyše môžu biofilmy, tvorené potenciálne prospešnými baktériami, stimulovať kolonizáciu, a teda aj ich dlhšiu prežívateľnosť, resp. stabilitu, čím sa redukuje osídľovanie povrchov patogénmi. Redukcia biofilmu je úmerná použitej koncentrácii EPS100. 5.1.5 Využitie baktérií tvoriacich biofilm v priemysle Potravinársky priemysel Probiotické mikroorganizmy, ktoré tvoria biofilmy, vykazujú vyššiu odolnosť voči teplote, pH prostredia a niektorým mechanickým silám v porovnaní s ich planktónovými formami. Patria medzi ne niektoré baktérie mliečneho kvasenia, ako je Lactiplantibacillus plantarum, Lacticaseibacillus rhamnosus a Limosilactobacillus fermentum, ktoré majú schopnosť viazať sa k matrici biofilmu101. Biofilmy, tvorené Aspergillus niger, môžu byť použité na produkciu celulázy102. Mikrobiálne bakteriálne interakcie v biofilmoch a komunikácia medzi bunkami majú významnú úlohu pri varení piva a tiež pri zrení syra a pri výrobe vína. Napríklad v období zrenia syra boli vo fermentačnom médiu pozorované zmiešané bakteriálne spoločenstvá. Keď syr dozrieval, bolo zaznamenané, že Leucobacter spp. alebo rast Brevibacterium aurantiacum významne závisel od výskytu kvasiniek Geotrichum candidum103. Iný kmeň baktérií a kvasiniek pomáha pri fermentácii olív a stáva sa hlavnou flórou na ovocí, čím bráni mikrobiálnemu kazeniu olív spôsobeného Gram-negatívnymi baktériami104. Nedávne štúdie ukázali, že druhy kvasiniek, ako je Candida albicans a Saccharomyces cerevisiae, môžu mať biotechnologické aplikácie nakoľko produkujú aromatické alkoholy. Candida albicans produkuje tyrozol a kvasinka Saccharomyces cerevisiae produkuje tryptofol a fenyletylalkohol105. Signalizačná sieť riadená tryptofolom a fenyletylalkoholom Saccharomyces cerevisiae je veľmi podobná komunikačnej sieti pri quorum sensing Gram- negatívnych baktérií106. Čistenie vody a odpadových vôd Na čistenie vôd a odpadových vôd sa úspešne využívajú výhody biofilmov už viac ako storočie. Biologické filtre sa podieľajú na znižovaní množstva biologicky odbúrateľného organického uhlíka, ktorý prichádza do rozvodov vody. V čističkách odpadových vôd môžu byť na čistenie odpadových vôd použité biofilmy fototrofných cyanobaktérií. Biofilmové bioreaktory eliminujú organický uhlík, ako aj dusík104. 175

Degradácia/regenerácia ropy V oblasti degradácie, resp. regenerácie ropy sú najviac študované biofilmy tvorené Clostridium acetobutylicum107. Biopalivá V tejto oblasti je výskum zameraný na produkciu etanolu mikrobiálnymi biofilmami za využitia rastlinnej celulózy. Najviac sú študované mikroorganizmy produkujúce hydrolytické enzýmy z rodu Cellulomonas a Aspergillus108, 109. Biocementy Biofilmy môžu v niektorých prípadoch oddialiť degradáciu na miestach, ako sú budovy postavené z kameňa, pamätníky a sochy110. Baktérie môžu podporovať usadzovanie minerálov na vytvorenie lepidla obsahujúceho vápenaté soli, močovinu a uhlík. Existujúce polyméry vo vnútri biofilmových médií pomáhajú viazať kovové ióny a podporujú minerálnu stavbu. 5.2 BIOFILM A QUORUM SENSING Biofilm tvorí súbor k povrchu pripojených buniek mikroorganizmov, ktoré sú chránené matricou extracelulárnych polymérnych látok (EPS) označovanou aj ako exopolysacharidový glykokalyx. Produkcia biofilmu patrí medzi dôležité mechanizmy bakteriálnej rezistencie vedúcej k vzniku infekcií s často chronickým priebehom. Liečba sa stáva komplikovanejšou ak biofilm, ktorý sa svojím charakterom sám o sebe vyznačuje rezistenciou voči antibakteriálnym látkam, tvoria baktérie multirezistentné voči antibiotikám. V takom prípade hrozí riziko šírenia génov rezistencie na baktérie nachádzajúce sa v prostredí biofilmu prostredníctvom horizontálneho prenosu genetickej informácie. Biofilmy predstavujú problém nielen z pohľadu príčinnej súvislosti s manifestáciou infekčných ochorení, ale aj vo vzťahu k spracovaniu potravín, znečisťovania vodných zdrojov a priemyselných zariadení. Quorum sensing (QS) je bakteriálny proces komunikácie medzi bunkami, ktorý je závislý od hustoty populácie baktérií a napomáha im pri kontrolovanom sa množení vo vnútri biofilmu. Regulačný mechanizmus QS ma vplyv na virulenciu baktérií a to tak, že umožňuje samotným bunkám biofilmu fungovať ako skupina, pričom ich vzájomná interakcia je na úrovni typickej pre mnohobunkové organizmy. Medzibunková komunikácia je zabezpečená prostredníctvom signálnych molekúl nazývaných ako autoinduktory (AI), tvorenými samotnými baktériami ako prostriedok vzájomného vnímania sa pre efektívne využívanie a zdieľanie dostupných zdrojov. 176

Produkované AI sa špecificky viažu na QS receptory jednotlivých bakteriálnych druhov pri regulácii rastu biofilmu, ale predpokladá sa, že sa môžu viazať aj na iné receptory, čím fungujú ako medzidruhové signalizačné systémy zapojené do komunikácie medzi baktériami v polymikrobiálnych spoločenstvách. Mechanizmus QS je regulovaný na génovej, signálnej a behaviorálnej úrovni. 5.2.1 Quorum sensing Viacvrstvový biofilm agregovaných buniek chráni extracelulárna vrstva zložená z polysacharidovej matrice, lipidov a proteínov, ktoré produkujú samotné mikroorganizmy111,112. Biofilm vzniká často v podmienkach, keď sú baktérie vystavené nepriaznivému vplyvu okolia ako je nedostatok živín, vysoký osmotický tlak, nízke pH, oxidačný stres, vplyv antibiotík a antimikrobiálnych činidiel113. Preto je tvorba biofilmu jednou z foriem bakteriálnej rezistencie voči negatívnemu účinku vonkajšieho prostredia a je prirodzenou schopnosťou u väčšiny bakteriálnych druhov2. Vznik biofilmu nie je viazaný na konkrétny a špecifický povrch, čo potvrdzuje jeho prítomnosť na rôznych plochách vo vonkajšom prostredí vodných a priemyselných systémov, na lekárskych prístrojoch a zariadeniach alebo v živých organizmoch. Zásadnou vlastnosťou tejto štruktúry je vysoká odolnosť predstavujúca komplikáciu pri potlačení a odstránení z miest, kde je jeho prítomnosť nežiaduca. V živých organizmoch sú vytvorené biofilmy častou príčinou infekcií prejavujúcich sa zápalom stredného ucha u detí, zápalom močových ciest alebo sú to katétrové infekcie. Tvorba zubných plakov a zápaly ďasien sú taktiež dôsledkom prebiehajúcich infekcií vyvolaných biofilm tvoriacimi baktériami, ktoré môžu byť príčinou ťažko liečiteľných alebo recidivujúcich infekcií so závažným priebehom spôsobujúcim smrť114. Zloženie a konzistencia exopolysacharidového glykokalyxu zabezpečujú pre biofilm zníženú difúziu látok smerom k bunkám, čím na jednej strane vytvára bariéru chrániacu baktérie pred nepriaznivými podmienkami prostredia alebo hostiteľského organizmu, ale na druhej strane výrazne ovplyvňuje aj distribúciu živín a kyslíka pre bunky v celom biofilme. Dôsledkom toho dochádza k poklesu metabolickej aktivity baktérií, ktoré tak prechádzajú do spiacej rastovej fázy (dormant growth phase), ktorej výsledkom je znížená citlivosť na antimikrobiálne látky aplikované za terapeutickým účelom. Baktérie ako prokaryotické organizmy predstavujú autonómny živý systém závislý od príjmu živín z prostredia a ich existencia nie je priamo viazaná na iné bakteriálne bunky. Napriek tomu sú schopné vo vytvorených biofilmoch navzájom komunikovať na medzibunkovej úrovni. 177

Spoločne koordinovaná činnosť prispieva k ochrane buniek pred látkami s negatívnym účinkom alebo vplyvom environmentálneho stresu. Fakultatívne patogénne baktérie, schopné vyvolať ochorenie iba za podmienok výskytu vhodných predispozičných faktorov, sa môžu v organizme vyskytovať a deliť bez manifestácie ochorenia. V prípade, že dosiahnu určitú koncentráciu, pri ktorej sú v dostatočnom množstve, dochádza k prekonaniu imunity hostiteľského organizmu, čo sa prejaví vznikom ochorenia. Tvorba biofilmu v hostiteľskom organizme oportúnne patogénnymi baktériami je častou príčinou infekčnej choroby u imonosupresívnych jedincov. Proces komunikácie medzi bunkami sa označuje ako quorum sensing (QS) systém, ktorý umožňuje baktériám vnímať svoje okolie a regulovať svoju hustotu na úrovni spoločnej existencie viacerých buniek vystupujúcich ako mnohobunkový organizmus. Medzibunková komunikácia prebieha prostredníctvom malých signálnych molekúl nazývaných autoinduktory (AI), ktoré produkujú samotné baktérie a v závislosti od indexu hustoty susednej populácie regulujú svoje kolektívne správanie115. Signálne molekuly sú medzidruhovo odlišné, pričom niektoré bakteriálne druhy môžu produkovať množstvo rôznych signálov a iné baktérie reagujú iba na niektoré vybrané signály. QS koordinuje génovú expresiu špecifických génov zodpovedných za dôležité biologické procesy baktérií ako je napríklad patogenita, sporulácia, kompetencia, mobilita, sekundárny metabolizmus a formovanie biofilmu116. Správne fungovanie systému QS je založené na niekoľkých princípoch, ktoré sú spoločné pre všetky typy systémov QS. Prvým je, že prenos signálu z bunky do bunky sa uskutočňuje pomocou malých signálnych molekúl rôznej chemickej povahy. Druhý princíp QS spočíva v prítomnosti špecifických receptorov v cytoplazme alebo na membránach, na ktoré po naviazaní signálnych molekúl dochádza k aktivácii cieľových génov. Tretím princípom je spúšťanie QS systému, k čomu dochádza vplyvom hustoty populácie buniek korelujúcej s koncentráciou signálnych molekúl nad prahovú úroveň. Podstatou štvrtého princípu je samoudržiavanie fungovania, keď riadenie syntézy nových signálnych molekúl a receptorov prebieha rovnako ako u cieľových génov pri absencii aktivácie represívnych systémov. Piatym princípom je, že v bunkách mikroorganizmov sú na QS závislé, ale aj nezávislé gény negatívnej regulácie, ktorých produkty môžu selektívne vypínať jednotlivé časti alebo celý QS systém. Začiatok fungovania QS je časovo viazaný na prvotné štádiá exponenciálneho rastu, pre ktorý je charakteristický nárast hustoty bunkovej populácie, ale k samotnej expresii cieľových génov dochádza až prechodom bunkovej populácie do stacionárnej fázy. Na molekulovej úrovni je zmena v správaní sa mikroorganizmov zabezpečená zmenou úrovne aktivity určitých génov ako 178

reakcia na prahovú úroveň excitácie receptorov reagujúcich na signálnu látku. Zhlukovanie predstavuje kľúčový signál spúšťajúci premenu mnohých rozdielnych jednotlivcov na jednu koordinovanú a súdržnú komunitu. Vývoj QS systémov v baktériách možno definovať ako jeden z predbežných krokov v mnohobunkovom vývoji. Mechanizmy reakcií QS sú medzi Gram-pozitívnymi (G+) a Gram-negatívnymi (G-) baktériami odlišné117, a preto regulačné mechanizmy QS pri tvorbe biofilmov nie je možné zovšeobecniť. Na základe typov signálnych molekúl možno systémy QS rozdeliť do niekoľkých kategórií. Známe sú systémy AHL (N-acyl-homoserínový laktón) a AIP (autoinduktorový peptid), ktoré boli známe ako systém AI-1, systém AI-2 a systém AI-3118. G+ baktérie obvykle komunikujú pomocou oligopeptidových signálnych molekúl. Signalizácia najčastejšie zahŕňa dvojzložkový mechanizmus a stav kvóra sa dosiahne, ak populácia buniek vstúpi do stacionárnej fázy rastu, keď sú detegované signálne molekuly, pomocou ktorých sa bunky navzájom kontaktujú. Vo všeobecnosti G+ baktérie komunikujú tak, že sa najprv v bunke syntetizuje prekurzor, ktorý sa modifikuje na zrelý oligopeptid. Po jeho vylúčení mimo bunku dochádza k jeho hromadeniu v medzibunkovom priestore v pozitívnej korelácii k zvyšujúcej sa hustote bakteriálnych buniek. Signál je následne rozpoznaný a importovaný do bunky pomocou transportného systému, ktorého aktivita je regulovaná dvojzložkovou senzorickou kinázou zabezpečujúcou jeho fosforyláciu. Fosforylovaný oligopeptid interaguje s cieľovými génmi ako induktor operónu119. Schéma komunikácie u G- baktérií systémom snímania kvóra je zabezpečená proteínmi rodiny LuxI autoinduktorových syntáz katalyzujúcich tvorbu špecifických acylovaných homoserín laktónových autoinduktorových molekúl. Autoinduktory voľne difundujú cez membrány, kde sa v závislosti od zvyšujúcej sa hustoty buniek akumulujú. Proteíny LuxR plnia funkciu cytoplazmatických receptorov viažucich autoinduktory po dosiahnutí dostatočne vysokej koncentrácie signálnych molekúl a následne sa stávajú transkripčnými aktivátormi príslušných génov120. Medzidruhová komunikácia interakciami založenými na snímaní kvóra sa uplatňuje v biofilmoch s viacdruhovými baktériami alebo pri symbiotických vzťahoch s eukaryotickými hostiteľmi. Spôsoby komunikácie medzi geneticky identickými bunkami sa líšia od signálov v medzidruhovej komunikácii. Zistilo sa, že autoinduktor 2 (AI-2) a autoinduktor 3 (AI-3) sú hlavné signálne molekuly v medzidruhovej komunikácii a ich prítomnosť bola dokázaná u viac ako 30 druhov G+ a G- baktérií121. Keďže systémy snímania kvóra kontrolujú virulenciu patogénnych mikroorganizmov možno ich využiť ako cieľ pre pôsobenie antimikrobiálnych látok. Existuje niekoľko stratégií 179

využívajúcich rozdielny mechanizmus účinku látok s cieľom vplývať na QS. Narušenie snímania kvóra možno docieliť inhibíciou syntézy signálnych molekúl, blokáciou systémov riadiacich uvoľňovanie a difúziu signálnych molekúl, kompetíciou o väzbu pre signálne molekuly alebo enzymatickým štiepením signálnych molekúl prípadne využitím špecifických protilátok viažucich sa na signálne molekuly. 5.2.1.1 Quorum sensing regulácia tvorby biofilmu u Gram-negatívnych baktérií Komunikačný systém nachádzajúci sa u G- bakteriálnych druhov tvorí niekoľko signálnych molekúl známych ako autoinduktory (AI). Najbežnejšou triedou AI sú N-acyl-homoserínové laktóny (AHL), ktorých produkcia je závislá od prekurzora S-adenozylmetionínu (SAM), ktorý môže byť metabolizovaný na špeciálne signály snímané rôznymi bakteriálnymi druhmi122. AI produkované bunkami ľahko difundujú na vonkajšiu alebo vnútornú časť membrány a ich koncentrácia stúpa zvyšovaním hustoty bunkovej populácie, v dôsledku čoho dochádza k ovplyvňovaniu expresie génov zapojených do QS. Hlavným, ale nie jediným typom enzýmov produkujúcim AHL sú syntetázy LuxI. AI rodiny difúzneho signálneho faktora (DSF) sú syntetizované proteínmi RpfF u Pseudomonas aeruginosa a Burkholderia cenocepacia a autoinduktor cholery 1 (CAI-1) u Vibrio cholerae je produkovaný syntetázou CqsA123. Prítomné AI sa viažu na špecifické membránové receptory alebo cytoplazmatické proteíny122. Receptory typu LuxR sú cytoplazmatické transkripčné faktory detegujúce voľné difúzne AHL, v cytoplazme, ktoré viažu. Vzniknutý stabilný dimerizovaný komplex LuxR-AHL sa viaže na krátke DNA sekvencie nazývané „lux boxy“ nachádzajúce sa upstream od cieľových génov. V neprítomnosti príbuzného AI sa väčšina nenaviazaných receptorov typu LuxR degraduje122. Niektoré proteíny LuxR v neprítomnosti LuxI syntetáz detegujú rôzne molekuly AHL produkované inými bakteriálnymi druhmi, čím sprostredkúvajú medzidruhovú komunikáciu. Proteíny LuxR, ktoré nemajú žiadne LuxI syntetázy, patria do triedy LuxR-solo transkripčných faktorov. Medzi také molekuly patria QscR u P. aeruginosa alebo homológ LuxR SdiA u zástupcov rodu Escherichia124. Kombinované receptory fungujú ako transkripčné faktory regulujúce gény zapojené do procesu tvorby biofilmu, podieľajúce sa na virulencii a mnohých ďalších procesoch v bakteriálnych bunkách. Receptory molekúl QS vytvárajú pri regulácii expresie génov slučku, ktorá sa nazýva autoindukcia. Mechanizmom autoindukcie sa zvyšuje syntéza autoinduktorov, čím sa následne podporuje expresia synchrónnych génov v populácii122. 180

5.2.1.2 Quorum sensing regulácia tvorby biofilmu u Gram-pozitívnych baktérií Gram-pozitívne baktérie neprodukujú AHL molekuly ako Gram-negatívne, ale využívajú molekuly peptidov, ktoré po post-translačnej modifikácii interagujú s dvojzložkovým systémom prenosu signálu prostredníctvom histidínkinázy. Autoinduktory u G+ baktérií sú oligopeptidy (AIP), prostredníctvom ktorých je regulovaná tvorba biofilmu systémom QS. Bakteriálne bunky produkujú malý oligopeptid, ktorý je modifikovaný na zrelý AIP a ten je následne transportovaný do okolia bunky. Po dosiahnutí prahových hodnôt koncentrácie AIP dochádza k jeho naviazaniu na extracelulárny segment histidínkinázy, ktorá má funkciu transmembránového receptora nachádzajúceho sa na membráne bunky. Po naviazaní sa kináza aktivuje a prebieha fosforylácia regulačných faktorov odozvy, čo má za následok reguláciu expresie génov zapojených do tvorby biofilmu125. Bakteriálny druh Staphylococcus aureus ma vo svojom genóme operón agr, ktorý obsahuje päť génov, agrA, agrB, agrC, agrD a hld126. Signálny AIP je konvertovaný z prekurzorového peptidu AgrD prostredníctvom transmembránového proteínu AgrB a transportovaný z bunky. Pri dosiahnutí prahovej koncentrácie AIP dochádza k jeho naviazaniu na extracelulárnu časť AgrC integrálneho transmembránového proteínu, fungujúceho ako histidínkináza a k aktivácii kinázy. Aktivovaním AgrC dochádza k fosforylácii downstream regulátora odozvy AgrA, ktorý po naviazaní na intergénovú DNA medzi promótormi P2 a P3 aktivuje transkripciu RNA regulačných molekúl (RNAIII a RNAII). Indukcia syntézy RNAIII vedie k zníženej produkcii povrchových proteínov a k zvýšeniu produkcie exotoxínov, proteáz a kapsuly. Na druhej strane sa transkripciou z P2 produkuje RNAII, ktorá reguluje operón agr reguláciou produkcie agrA, agrB, agrC a agrD116. Preto zvýšená expresia agr negatívne ovplyvňuje tvorbu biofilmu. U biofilm tvoriacich kmeňov Staphylococcus aureus prebieha tvorba biofilmu pravdepodobne dvoma procesmi. Prvý proces využíva polysacharidový intercelulárny adhezín (PIA) a extracelulárny polysacharid, pričom druhý proces prebieha procesom nezávislým od PIA s dominanciou adhezívnch proteínov a regulátorov sarA a agr. Systém agr zohráva dôležitú úlohu pri oddeľovaní bunkových zhlukov v procese maturácie pri formovaní biofilmu. 5.2.1.3 Medzidruhové quorum sensing signály Mnohé AI produkované bakteriálnymi druhmi sú vysoko špecifické a rozpoznávajú ich iba konkrétne bakteriálne druhy. Napriek tomu existujú aj molekuly, ktoré majú medzidruhový komunikačný potenciál127. U molekuly AI-2 bol dokázaný nielen jej podiel na vnútrodruhovej 181

signalizácii, ale bola sledovaná aj jej úloha v medzidruhovej komunikácii. QS sprostredkovaný AI-2 zohráva kritickú rolu pri interakciách medzi rôznymi kmeňmi a úzko súvisí s tvorbou zmiešaných biofilmov a aj v génovej regulácii medzi nimi128. Extracelulárna AI-2 môže byť rozpoznaná troma špecifickými receptormi129. Prvým z receptorov je periplazmatický väzbový proteín LuxP, nachádzajúci sa u zástupcov radu Vibrionales130. Druhý je periplazmatický proteín LsrB s vysokou afinitou viažuci substrát u Salmonella typhimurium, Bacillus cereus a Escherichia coli131. A tretím je RbsB receptor pre AI-2 u Aggregatibacter actinomycetemcomitans a Haemophilus influenza132. Baktérie sa vyvíjali spoločne s hostiteľom, a preto v mnohých prípadoch majú dôležitú úlohu v jeho metabolických procesoch. Mnohokrát je ich prítomnosť nevyhnutná pri metabolizovaní živín ako sú aminokyseliny a sacharidy. Metabolity vznikajúce činnosťou baktérií sú zapojené nielen do regulácie fyziológie hostiteľského organizmu a uplatňujú sa v činnosti imunitného systému, ale môžu mať aj funkciu komunikačných signálov ovplyvňujúcich bakteriálne správanie. Príkladom takejto signalizácie je aktivita baktérií produkujúcich a neprodukujúcich indol133. Expresia operónu tna, kódujúceho TnaA a TnaB (permeázy vychytávajúce tryptofán z prostredia) je zvýšená pri vysokých koncentráciách extracelulárneho tryptofánu134. Produkcia indolu je v bunkách stabilne udržiavaná, ale podmienky prostredia zásadne ovplyvňujú jeho extracelulárnu koncentráciu. Molekuly indolu môžu aktivovať gény alebo pôsobiť na regulačné proteíny s rôznymi biologickými funkciami (tvorba spór alebo biofilmu, rezistencia na antibiotiká, virulencia)116. Niektoré bakteriálne metabolity využívajú iné baktérie ako zdroj živín pre kolonizáciu prostredia, v ktorom sa nachádzajú. Molekuly, vznikajúce činnosťou baktérií, vplývajú na expresiu génov, zodpovedných za virulenciu a inváziu patogénov. Baktérie sa rozpoznávaním signálov QS prostredníctvom metabolitov pasívne prispôsobujú prostrediu tak, aby prežili. Naopak klasický mechanizmus QS nesie známky evolučného procesu za účelom vytvárania spoločenstiev. 5.2.2 Stratégie inhibície QS Mechanizmy látok, inhibujúcich QS a potláčajúcich tvorbu biofilmu prostredníctvom inhibítorov QS (QSI) alebo enzýmov zhášania kvóra (QQ), sú rozdelené na základe ich funkčných cieľov na tri kategórie. Prvú tvoria látky s mechanizmom účinku cieleným na signálne molekuly, druhá kategória sú látky cielené na receptory a tretia kategória zahŕňa látky s downstreamovým účinkom na signálne kaskády AI118. 182

V oblasti antibakteriálneho výskumu, zameraného na hľadanie alternatívnych spôsobov za účelom náhrady antibiotík ako terapeutických látok, došlo k objaveniu mnohých látok inhibujúcich QS. Tieto látky môžu účinne inhibovať virulenciu a aj tvorbu bakteriálnych biofilmov, a preto sú potenciálnymi kandidátmi na liečbu infekcií bez aplikácie antibiotík, ktorých účinnosť klesá v dôsledku zvyšujúceho sa stupňa bakteriálnej rezistencie. 5.2.2.1 Syntéza derivátov QSI Jednou z účinných stratégií môže byť syntéza derivátov označovaných ako inhibítory quorum sensing, ktoré nemenia základnú štruktúru signálnych molekúl. QSI sú obvykle štruktúrne analógy AI, ktoré spôsobujú inaktiváciu QS kompetitívnym viazaním sa na receptor. Boli pripravené analógy schopné inhibovať tvorbu biofilmu alebo faktory virulencie u P. aeruginosa135,136. 5.2.2.2 Modifikácia quorum zhášacích (QQ) enzýmov Ďalšou sľubnou stratégiu je využitie interferujúcich enzýmov s QS modifikáciou QQ enzýmov pomocou metód proteínového inžinierstva. Mnoho nových QQ enzýmov je navrhnutých tak, aby účinne degradovali rôzne AHL137,138. 5.2.2.3 Prírodné látky a lieky inhibujúce QS Rastlinné látky a látky produkované mikroorganizmami sú bohatým zdrojom molekúl s potenciálnou schopnosťou inhibovať signalizáciu QS a tvorbu biofilmu. Prírodné zlúčeniny rastlinného pôvodu ako napríklad kyselina salicylová môžu významne inhibovať expresiu QS regulačných génov zapojených do virulencie a procesu tvorby biofilmu139. Medzi účinné terapeutiká patria aj lieky schválené pre klinickú prax, obsahujúce látky inhibujúce QS. Výhodou ich použitia je, že u týchto liekov už boli vykonané dlhodobé klinické štúdie garantujúce ich bezpečnosť a spoľahlivosť. Príkladom takého lieku je antihelmintický liek niclosamid, ktorý má silné inhibičné účinky na odpoveď QS pôsobením na génovú expresiu faktorov virulencie a tvorbu biofilmu u P. aeruginosa140. Boli sledované inhibičné účinky systému QS aj u ďalších liekov ako je napríklad klofoktol, albendazol141,142 alebo aj u niektorých antibiotík zo skupiny aminoglykozidov143,144. 183

5.2.2.4 Využitie látok inhibujúcich QS pri kontrole tvorby biofilmu Látky inhibujúce QS sa ako nový typ antimikrobiálnych činidiel uplatnili hlavne v medicínskej oblasti, ale aj pri spracovaní potravín a úprave vody. Hlavným využitím je medicína, kde sa dlhodobo výskum zameriava na možnosti liečby problematických nozokomiálnych infekcií, spôsobených predovšetkým multirezistentnými kmeňmi P. aeruginosa145. Nemenej závažným problémov v oblasti medicíny je aj tvorba biofilmov na lekárskych zariadeniach, keďže tvorba biofilmu patrí medzi dôležité faktory virulencie patogénnych baktérií146. Činidlá inhibujúce QS našli uplatnenie aj ako podporné látky pri liečbe bakteriálnych infekcií pomocou antibiotík147. Inhibítory QS našli svoje uplatnenie aj v potravinárskom priemysle, kde sa kladie najvyšší dôraz na bezpečnosť potravín. Biofilmová kontaminácia potravinových balení alebo spracovateľských zariadení predstavuje riziko pre zdravie spotrebiteľov hlavne v prípade, keď vytvorené biofilmy odolávajú dezinfekcii spôsobom určeným na ich elimináciu116,148. Niektoré esenciálne oleje vykazujú silnú QS inhibičnú a antibiofilmovú aktivitu, čím výrazne blokujú adhéziu buniek, prípadne ich metabolickú aktivitu a produkciu EPS, a preto sú ideálne na využitie v potravinárstve149. Látky, vplývajúce negatívne proti QS, nachádzajú svoje uplatnenie aj pri úprave vody v procese čistenia pomocou membránových bioreaktorov (MBR), ktoré sú v prevažnej miere zdrojom bioznečistenia vrstvou biofilmu116,150. Sľubné výsledky boli získané použitím enzýmov QQ, kedy sa sledovalo signifikantné potlačenie tvorby zrelého biofilmu. 5.3 CHEMOTAXIA Fenomén bakteriálnej chemotaxie objavili Engelmann a Pfeffer v 80. rokoch 19. storočia. Dôkladné skúmanie fenoménu začalo v 60. rokoch 20. storočia kvantitatívnymi, genetickými a biochemickými štúdiami Adlera151. Bakteriálne populácie sa môžu počas svojich životných cyklov stretnúť so širokým spektrom prostredí. Vzhľadom na ich malé rozmery a relatívnu jednoduchosť je ich schopnosť prispôsobiť si prostredie svojim potrebám veľmi obmedzená. Namiesto toho zjavne prijali stratégiu prechodu z jedného prostredia do druhého. Chemotaxia je riadený pohyb buniek v koncentračnom gradiente rozpustných látok. Baktérie sa pohybujú smerom k vyššej koncentrácii rozpustných živín (atraktanty) – pozitívna chemotaxia, smerom od miest s vyššou koncentráciou škodlivých látok (repelenty) – negatívna chemotaxia. Chemotaxia, ako aj iné typy taxie (napr. termotaxia a fototaxia) tak umožňujú baktériám priblížiť sa a zostať v prospešných prostrediach a uniknúť z nepriaznivých prostredí. 184

Chemotaxia tiež slúži ako prostriedok medzibunkovej komunikácie a náboru buniek v stresových podmienkach. Preto nie je prekvapujúce, že veľký počet bakteriálnych druhov je pohyblivých a chemotaktických. V skutočnosti je väčšina tyčinkovitých baktérií pohyblivá, nezávisle od ich klasifikácie (napr. Gram-pozitívne alebo Gram-negatívne, aeróby alebo anaeróby, atď.). Naproti tomu väčšina kokovitých baktérií je nepohyblivá. Bakteriálne druhy sa v rámci správania navzájom líšia v mnohých aspektoch, vrátane ich spôsobov pohybu, ich stratégií reakcie na vonkajšie podnety a podnety, na ktoré sú citlivé. 5.3.1 Typy aktívneho pohybu baktérií Pre mnohé baktérie je pohyb nevyhnutný pre prežitie, rast, virulenciu, tvorbu biofilmu a vnútrodruhové/medzidruhové interakcie. Baktérie kolonizovali širokú škálu biotopov, od morských hlbín až po telá rastlín a živočíchov. Keďže sa tieto prirodzené prostredia líšia, baktérie si vyvinuli pozoruhodné stratégie pohybu, aby sa prispôsobili. Delia sa do dvoch tried: bunky buď voľne plávajú vo vodnom prostredí alebo sa pohybujú vo vodnom prostredí po pevných povrchoch. Bunky voľne plávajú otáčaním dlhých vlákien alebo otáčaním svojich bunkových tiel v reakcii na sily generované rotáciou vnútorných vlákien. Naproti tomu, keď sa bunky pohybujú po pevných povrchoch, ich pohyb riadia sily pôsobiace v miestach ich priľnutia. Séria technických objavov v priebehu posledných desaťročí viedla k vývoju kryoelektrónovej mikroskopie (kryo-EM), ktorá umožnila zobraziť architektúru buniek alebo proteínových komplexov v atómovom rozlíšení ako aj následné vytváranie 3D modelov molekúl, vrátane hnacích štruktúr, ktoré umožňujú pohyb baktérií spojený s plávaním ako aj pohyb spojený s povrchom prostredníctvom rojenia, zášklbov (zášklbového pohybu) alebo kĺzania152,153. 5.3.1.1 Pohyb sprostredkovaný bičíkmi Zloženie bičíka Vlákno, bazálne teliesko a komponenty, ktoré ich spájajú (univerzálny kĺb a tyčka), tvoria komplex nazývaný „bičík“154 Tento komplex obsahuje približne 30 rôznych proteínov (Obr. 5.2). Bazálne teliesko Gram-negatívnych baktérií obsahuje päť prstencov: L asociovaný s lipopolysacharidovou vrstvou, P v peptidoglykánovej vrstve, M v plazmatickej membráne a S na jej vonkajšej strane (prstence M a S sú niekedy uvádzané ako MS prstenec) a C 185

cytoplazmatický prstenec pripojený z vnútornej strany plazmatickej membrány k M prstencu. Prstenec MS sa skladá z transmembránového proteínu FliF. Proteíny FliG, FliM a FliN tvoria C prstenec. Prstenec L a P sú tvorené lipoproteínom FlgH a periplazmatickým proteínom FlgI a tvoria oporu tyčky155. LP komplex nie je prítomný u Gram-pozitívnych baktérií156 a u niektorých spirochét157. Obr. 5.2 Štruktúra bakteriálneho bičíka Gram-negatívnych baktérií (Imada 2018; upravené)165. Rôzne farby predstavujú rôzne funkčné jednotky. Názvy proteínových komponentov v každej funkčnej jednotke sú uvedené v zátvorkách. Rotor pozostáva z MS prstenca (FliF), ktorý je vložený do cytoplazmatickej membrány, a prstenca C (FliGMN), ktorý je vložený do cytoplazmy. Protónom poháňané statorové jednotky (MotA-MotB) premosťujú cytoplazmatickú membránu, aby sa naviazali na peptidoglykánovú vrstvu a spojili sa s C prstencom. Pentamér MotA sa otáča okolo diméru MotB, aby aplikoval krútiaci moment na C prstenec. Tento krútiaci moment sa prenáša cez hnací hriadeľ (tyčku) a univerzálny kĺb (hák) na vlákno. L prstenenec a P prstenec, ktoré sú vložené do vonkajšej membrány a peptidoglykánovej vrstvy, fungujú ako opora hnacieho hriadeľa (tyčky). CM = cytoplazmatická membrána, PG = peptidoglykánová vrstva, OM = vonkajšia membrána. Univerzállny kĺb spája vlákno bičíka s bazálnym telieskom. Spolu s bazálnym telieskom tvoria útvar zvaný univerzálny kĺb-bazálne teliesko (HBB), ktorého stredom prechádza dutá trubica, na ktorú nadväzuje duté vlákno bičíka. Univerzálny kĺb funguje ako molekulárny univerzálny kĺb, ktorý flexibilne prenáša na vlákno krútiacu silu v rôznych uhloch generovanú v bazálnom teliesku. Spojenie vlákna s bazálnym telieskom pomocou univerzálného kĺbu umožňuje zmenu rotácie vlákna158. Univerzálny kĺb je dlhý približne 55 nm, zakrivený a umiestnený extracelulárne159. Je zložený z približne 130 kópií proteínu, flagelínu FlgE. Proteín FlgE tvorí 186

krátku závitnicovitú tubulárnu štruktúru z 11 protofilamentov160. Celý FlgE reťazec je usporiadaný do domén D0, D1, D2 a nedávno pomocou kryo-EM štúdie odhalenej menšej Dc, ktorá spája D0 a D1 β-vlásenkou. Predpokladá sa, že jej úlohou by mohlo byť zaisťovanie stability univerzálného kĺbu161. U peritrichálnych baktérií umožňuje univerzálny kĺb usporiadanie vlákien bičíkov do zväzku poháňajúceho baktériu vpred a rozvoľnenie tohto usporiadania pre zastavenie sa154. Pre maximálnu stabilitu zväzku vlákien je dôležitá aj jeho dĺžka. Kratšie univerzálne kĺby sú príliš tuhé na to, aby fungovali ako univerzálny kĺb, zatiaľ čo dlhšie sa krivia a vytvárajú nestabilitu bičíkového zväzku162. Dĺžka univerzálného kĺbu je riadená proteínom FliK, ktorý je vylučovaný sekrečným systémom typu III (T3SS) počas jeho zostavovania163. Priemer univerzálného kĺbu je o niekoľko nm väčší ako priemer FlgG proteínu tyčky na distálnom konci, čo súvisí s absenciou D2 homológnej domény u FlgG proteínu tyčky. Na vlákno je univerzálny kĺb napojený proteínmi FlgL a FlgK, zatiaľ čo na opačnom konci ja priamo napojený na tyčku bazálneho telieska161. Komplex HBB sa považuje za motor bičíka a medzi bakteriálnymi druhmi vykazuje veľkú rôznorodosť. Udáva sa, že motor bakteriálneho bičíka je najmenším iónovou silou poháňaným rotačným motorom na svete164 . Tyčka je pevný a dutý helikálny valec prechádzajúci periplazmatickým priestorom a plní funkciu sekrečného kanála. Skladá sa z proximálnych proteínov FliE, FlgB, FlgC, FlgF a distálneho proteínu FlgG. Predpokladá sa, že proteín FliE spája MS prstenec a najbližšiu časť tyčky tvorenú proteínom FlgB166. U salmonel domény D0 a D1 proteínu FlgG vykazujú vysokú sekvenčnú a štruktúrnu podobnosť s doménami FlgE, čím umožňujú priame spojenie tuhej tyčky s flexibilným univerzálnym kĺbom. Avšak jedným hlavným štruktúrnym rozdielom medzi tyčkou a univerzálnym kĺbom je orientácia ich D1 domén vzhľadom na tubulárnu os, preto sú axiálne interakcie medzi doménami D1 u FlgG tesné, zatiaľ čo u FlgE sú voľné. Takýto štruktúrny rozdiel je pravdepodobne zodpovedný za tuhosť tyčky v ohybe a flexibilitu univerzálného kĺbu167. Vlákno bičíka je duté a pevné, aby bolo schopné vyvolať pohyb celej bunky. Tvorí centrálny kanál kvôli helikálnej štruktúre. Rastie polymerizáciou na svojom distálnom konci, čo závisí od exportu flagelínového proteínu skrz centrálny kanál. Zvyčajne býva niekoľkonásobne dlhšie ako samotná bunka a predstavuje až 90 % hmotnosti celého bakteriálneho bičíka. Má priemer asi 20 nm a dĺžku približne 15 – 20 µm. Bičíkové vlákno E. coli je tvorené ~ 30 000 kópiami jedného proteínu, flagelínu FliC158. Salmonella spp. má okrem génu fliC aj gén fljB kódujúci ďalšiu podjednotku flagelínu. Pretože flagelín je hlavným cieľom imunitného systému hostiteľa (H antigén), takáto ďalšia flagelínová podjednotka umožňuje salmonelám uniknúť pred adaptívnou imunitnou odpoveďou hostiteľa efektívnejšie v porovnaní s bunkami E. coli. Proteín 187

FliC u zástupcov rodu Salmonella sa skladá zo štyroch domén DO, D1, D2 a D3, usporiadaných od vnútornej k vonkajšej časti štruktúry vlákna. Domény DO a D1 sú medzi bakteriálnymi druhmi dobre konzervované, zatiaľ čo domény D2 a D3 sú variabilné dokonca aj medzi Salmonella spp., pretože tieto dve domény sú hlavnými cieľmi protilátok168. Hoci bičíkové vlákno E. coli je tvorené jediným flagelínom, mnoho bakteriálnych druhov má viacero flagelínov pre syntézu bičíkových vlákien. Napríklad, polárny bičík Caulobacter crescentus sa skladá zo šiestich flagelínov, FljJ, FljK, FljL, FljM, FljN a FljO169. Bipolárne bičíkové vlákna Campylobacter jejuni obsahujú dve odlišné podjednotky FlaA a FlaB, z ktorých obe zdieľajú 92,3 % sekvenčnú identitu170. Zostavovanie bičíkového vlákna viacerými flagelínmi ovplyvňuje jeho mechanické vlastnosti, čo môže optimalizovať jeho funkčnosť v rôznych prostrediach, v ktorých baktérie žijú a pretrvávajú171. K vonkajšiemu koncu flagelínového vlákna je asociovaný proteín FliD, nazývaný cap-proteín. U niektorých baktérií súvisí s adherenciou na povrchy172. U baktérií ako Salmonella Enteritidis tento komplex pozostáva z piatich FliD kópií, ktoré interagujú s vláknom pri jeho predlžovaní. Symetria komplexu sa medzidruhovo líši, u Serratia marcescens nachádzame tetramér, u E. coli hexamér a podobne, pričom pentametrické zostavenie je medzi druhmi najbežnejšie173,174. Bakteriálny bičík sa zostavuje rýchlosťou stoviek nm za minútu. Regulácia skladania bičíka je sprostredkovaná z veľkej časti na úrovni expresie génov kódujúcich komponenty bičíka a schopnosti samousporiadania jednotlivých komponentov. Transkripcia génov u E.coli či S. Enteritidis je rozdelená do troch tried regulovaných génov175. Do prvej triedy patrí hlavný operón flhDC. Jeho proteínové produkty predstavujú transkripčný faktor FlhD4C2 a spúšťajú kaskádu expresie génov. Uvedený faktor aktivuje transkripciu génov druhej triedy, ktoré zaisťujú zostavovanie komplexu HBB. Zároveň inaktivuje gény tretej triedy, ktoré zodpovedajú za zostavovanie vlákna, statorov a chemoreceptorov. Chemosenzorické gény sa začnú prepisovať až po kompletizácii aspoň jedného komplexu HBB. Pri zostavovaní bičíka sa najskôr pasívne tvoria samozostavovacie aparáty a následne aktívne osové štruktúry. Zostavovania sa zúčastňujú aj kontrolné mechanizmy kontrolujúce dĺžku vláknitých štruktúr. Ako už bolo spomínané, dĺžka univerzálného kĺbu sa reguluje proteínom FliK. U väčšiny baktérií sa reguluje tiež dĺžka vlákna s výnimkou napr. salmonel. Skladanie bičíka začína inzerciou MS prstenca do plazmatickej membrány. Nasleduje vytvorenie C prstenca a aparátu T3SS. Priemer C prstenca sa medzidruhovo môže líšiť157. Po dokončení sekrečného systému je vytvorený centrálny kanál a ním sú sekretované proteíny tvoriace osové časti bičíka. T3SS využíva protónový tok (transmembránová oblasť) spolu s prídavnou ATP hydrolýzou (oblasť v cytoplazme). Tento systém u Gram-negatívnych baktérií pozostáva zo 188

šiestich membránových proteínov (FlhA, FlhB, FliO, FliP, FliQ, FliR) a z troch rozpustných proteínov v cytoplazme (FliH, FliI, FliJ). Membránové proteíny formujú otvor pre export, zatiaľ čo rozpustné proteíny podporujú export väzbou a dopravením exportovaného materiálu k otvoru176. Transport osových komponentov cez centrálny kanál bičíka podlieha prísnemu poradiu. Najprv sú sekretované proteíny tvoriace tyčku a univerzálny kĺb bičíka a po jeho dokončení sú sekretované proteíny tvoriace vlákno bičíka. Sekrécia je spojená s regulačnou funkciou chaperónov sekrečného systému. Tieto chaperóny v cytoplazme viažu proteíny určené na sekréciu a tvorbu vonkajších bičíkových štruktúr a bránia ich degradácii a vnútrobunkovej agregácii. FliT predstavuje chaperón sprostredkujúci sekréciu cap proteínov flagelínového vlákna. Na regulácii dĺžky a rastu vlákna bičíka sa zúčastňuje cap proteín FliD, ktorý reguluje pridávanie podjednotiek vlákna na jeho konci a je pre tvorbu vlákna nevyhnutný177. Plávanie (Swimming) Tyčinkovité baktérie Rotácia bakteriálneho bičíka Najčastejšie študovaným spôsobom pohybu baktérií je plávanie rotáciou bičíkových vlákien (Obr. 5.3a)156. Rotácia bičíkového vlákna je poháňaná na jeho základni reverzibilným rotačným motorom. Ako je uvedené v Tab. 5.1, existujú rôzne stratégie pohybu baktérií pomocou bičíkov, ktoré závisia od umiestnenia a počtu bičíkov, ako aj od druhu baktérií. Bičíkový pohyb je veľmi efektívny a dosahuje rýchlosť až 0,00017 km/h, čo pri prepočte na dĺžku baktérie činí 60 dĺžok bunky za sekundu. Stratégia pohybu E. coli a Salmonella spp. pozostáva z priameho plávania v pomerne rovnej línii, nazývaného „beh“, ktorý je prerušovaný aktívnym preorientovaním baktérie v priestore, nazývaným „prevracanie/pády“ (Obr. 5.3b). Pri absencii stimulov sa pády zvyčajne vyskytujú raz za 1 – 5 sekúnd (v závislosti od bakteriálneho kmeňa). V dôsledku toho bakteriálne bunky vykonávajú náhodnú „chôdzu“, zloženú z behov a pádov v podstate bez čistého vektorového pohybu179. „Beh“ je dôsledkom rotácie bičíka proti smeru hodinových ručičiek. Keďže vlákna bičíkov sú ľavotočivé špirály (s rozstupom ~ 2, 3 µm a polomerom ~ 0, 5 µm), ich otáčanie proti smeru hodinových ručičiek vyvíja tlakovú silu na bunku. Nakoľko bičíky okolo bunky majú rôznu dĺžku a ich rozloženie nie je symetrické, čistá sila nie je nulová, čo umožňuje pohyb bunky v 189

smere čistej sily. V dôsledku viskózneho odporu média sú bičíky zhrnuté do zadnej časti bunky a vytvárajú ľavotočivý zväzok (zarovnaný s dlhou osou bunky), ktorý posúva bunku dopredu. Zväzky sa otáčajú rýchlosťou ~ 130 Hz a bunka pláva rýchlosťou ~ 25 µm/s180,181. Obr. 5.3 Pohyb bakteriálnych buniek v tekutom prostredí pomocou bičíkov (Wadhwa a Berg 2022; upravené)178. (a) Mnohé baktérie vybavené bičíkmi, ako napríklad Escherichia coli, sa v tekutom prostredí pohybujú (plávu) pomocou rotácie pevných špirálových vlákien. Rotácia vlákien v okolitom tekutom prostredí generuje ťah, čo je sila pôsobiaca proti viskóznemu odporu, ktorá poháňa bunku. (b) Séria obrázkov, ktoré ukazujú prechod medzi priamym pohybom a zmenou smeru pohybu v tekutom prostredí. Na prvom obrázku sa všetky bičíky otáčajú proti smeru hodinových ručičiek, čo umožní zviazanie všetkých vlákien za bunkou. Výsledkom je priamy pohyb bakteriálnej bunky v tekutom prostredí (plávanie). Na druhom obrázku sa jeden motor prepol z protismeru hodinových ručičiek na pravotočivý (v smere hodinových ručičiek) a zväzok vlákien sa začína rozpadať. Na treťom obrázku sa jedno vlákno zväzku transformovalo z normálneho na polozvinuté a všetky ostatné vlákna sa vo zväzku uvoľnili, čo viedlo k aktívnej zmene orientácie bunky. „Prevracanie/pády“ sú dôsledkom otáčania bičíka v smere hodinových ručičiek. Na rozdiel od rotácie proti smeru hodinových ručičiek, ktorá stabilizuje ľavotočivú formu bičíka, rotácia v smere hodinových ručičiek destabilizuje ľavotočivú špirálu. Následne bičík podstupuje prechod z ľavotočivej špirály na pravotočivú, pričom tento prechod sa šíri od bičíkového spojenia s telom bunky smerom k distálnemu koncu vlákna. Pretože periódy otáčania v smere hodinových ručičiek sú relatívne krátke, transformácia z ľavotočivej na pravotočivú špirálu zvyčajne nie je úplná. Dôsledkom toho je, že niektoré bičíky majú segmenty s opačnou orientáciou v rámci toho istého vlákna, čo má za následok veľký uhol medzi segmentmi. Tento uhol, ktorý umožňuje bakteriálnej bunke uhlový pohyb, bráni tvorbe zväzkov a núti každý bičík konať oddelene (každý vyvíja silu v inom smere), čo spôsobuje padanie. K prevracaniu, resp. pádom 190

dochádza pravdepodobne iba vtedy, keď 25 % alebo viac bičíkov na danej bunke rotuje v smere hodinových ručičiek. To znamená, že v závislosti od počtu bičíkov na bunku môže rotácia 1–2 bičíkov v smere hodinových ručičiek postačovať na to, aby spôsobila prevrátenie. Ak sa jeden bičík otáča v smere hodinových ručičiek a najmenej tri ďalšie bičíky na tej istej bunke sa otáčajú proti smeru hodinových ručičiek, pravotočivý bičík sa oddelí od zväzku otáčajúceho sa proti smeru hodinových ručičiek a mierne (bez pádu) zmení smer plávania bunky. Vo všeobecnosti platí, že čím väčší je podiel bičíkov rotujúcich v smere hodinových ručičiek, tým väčšia a prudšia je zmena smeru plávania182. Plávajúce baktérie používajú mnoho ďalších stratégií na zmenu smeru. Vibrio alginolyticus, ktoré pláva s jedným polárnym bičíkom, používa tzv. stratégiu „beh – spätý chod – švih“183. Bičík tlačí bunku dopredu alebo ťahá dozadu. Keď sa baktéria pokúsi opäť plávať vpred, bičíkový univerzálny kĺb sa ohne a bunka sa preorientuje asi o 90 °. U niektorých druhov (napr. Pseudomonas spp., Spirillum spp., Chromatium spp. a Halobacterium spp.) bunky plávajú dopredu a dozadu a reorientácia sa javí ako pasívna sprostredkovaná Brownovým pohybom. Rhodobacter sphaeroides, ktorý má jeden laterálny bičík, používa stratégiu „beh – pauza – beh“. Predvolená konformácia bičíkového vlákna je pravotočivá špirála a bičík sa otáča iba v smere hodinových ručičiek bez prepínania smeru otáčania. Motor sa prerušovane zastaví, čo umožňuje bunke preorientovať sa silou generovanou stočením nehybného vlákna a Brownovým pohybom160. Pôdna baktéria Sinorhizobium meliloti má tiež jednosmerný rotačný motor a využíva stratégiu „beh – spomalenie – beh“, pričom mení svoj smer plávania moduláciou rýchlosti otáčania jednotlivých motorov184. Bičíkový rotačný motor Bičík je poháňaný rotačným motorom (Mot komplexom), najrozsiahlejšie preštudovaným u E. coli a Salmonella Enteritidis156,185. Bičíkový motor sa môže otáčať extrémne rýchlo, až 270 otáčok za sekundu. Motor je súčasťou bazálneho telieska bičíkového aparátu a zodpovedá za rotáciu vlákna bičíka a tým i za pohyb baktérie. Pozostáva z rotora a statora. Rotor predstavuje pohyblivú časť motora, ktorého pohyb je transformovaný na rotáciu vlákna bičíka. Rotor je tvorený MS prstencom a C prstencom. MS a C prstence sú vzájomne spojené a tvoria kompaktný útvar. Stator predstavuje nepohyblivú časť motora umiestnenú v plazmatickej membráne. Obsahuje protónovú pumpu, ktorá prepúšťa protóny cez plazmatickú membránu, čím vytvára energiu pre rotor. V tejto časti popisujeme ako príklad bičíkový rotačný motor u E. coli (Obr. 5.2). Motory u iných baktérií sú variáciami tohto modelu. Zo všetkých proteínov, podieľajúcich sa väčšinou na 191

štruktúre bakteriálneho bičíka, iba päť dokáže vyvolať krútiaci moment. Sú to MotA a MotB formujúce stator a FliG, FliM a FliN z rotorového komplexu175. Membránové jednotky statora (MotA a MotB) obklopujú rotor (proteín FliF MS prstenca) a vytvárajú sily, ktoré spôsobujú jeho otáčanie. Proteíny (FliG, FliM a FliN) C prstenca sú zodpovedné za spojenie so statorovými jednotkami a za smer rotácie bičíka; tvoria tzv. prepínací komplex. FliG tvorí spodný lem cytoplazmatickej membrány a je zložený z troch domén: FliGM, FliGC a FliGN. FliF je cez N-koniec proteínu FliGN spojený s C prstencom tvoreným FliM186. Proteín FliM má tiež tri domény: FliMN, FliMM a FliMC. S FliMN interaguje proteín CheY-P konečný efektor chemotaktickej kaskády, čo pravdepodobne spôsobuje preusporiadanie proteínov C prstenca a tým rotáciu bičíka proti smeru hodinových ručičiek a priamy pohyb vpred. Efekt je sprostredkovaný proteínom FliG, ktorý interaguje so statorom bičíka. Stredná doména FliMM vykazuje nízku podobnosť v sekvencii, avšak nie v aktivite, s fosfatázou CheC, patriacou do rodiny CheY fosfatáz187. FliMC zasa nesie podobné sekvencie a štruktúru s FliN a je dôležitý pri ich interakcii. FliN tvorí konštrukciu pre cytoplazmatické komponenty T3SS188. U niektorých druhov Gram-pozitivních baktérií (Bacillus subtilis) sa nemusí vyskytovať FliN, ale paralóg FliY. Je to 41 kDa veľký proteín, ktorý vo svojej C-koncovej doméne vykazuje čiastočnú homológiu s FliM a FliN u E. coli a Salmonella Typhimurium a vo svojej N-koncovej doméne je homológny k fosfatázám CheC a CheX189. Z MS prstenca tyčka (proteíny FliE a FlgBCFG) prenáša točivý moment do vlákna cez pružný univerzálny kĺb (proteín FlgE). P prstenec a L prstenec (proteíny FlgI a FlgH) držia tyčku na mieste v rámci obalu bunky a uľahčujú jej rotáciu190-192. Vnútorné a vonkajšie komponenty motora sa otáčajú ako jeden celok; to znamená, že C prstenec sa otáča rovnakou rýchlosťou ako univerzálny kĺb a vlákno. Motor je úzko spojený so sekrečným systémom T3SS, ktorý vylučuje proteíny, ktoré zostavujú vlákno, univerzálny kĺb a tyčku193. Statorové jednotky, vytvárajúce silu, poháňajú otáčanie motora. Energiu potrebnú na napájanie statorových jednotiek dodáva elektrochemický potenciál protónov vodíka (protónová hnacia sila) naprieč cytoplazmatickou membránou. Protónová hybná sila je produkovaná dýchaním alebo za anaeróbnych podmienok protónovou ATPázou na úkor hydrolýzy ATP. Protónový elektrochemický potenciál poháňa prítok 1 000 protónov za otáčku cez protónový vodivý kanál zložený z MotA a MotB158. Niektoré baktérie majú bičíkové motory, ktoré sú poháňané sodíkovou hnacou silou. Patria sem alkalofilné druhy z rodu Bacillus a Vibrio. Je zaujímavé, že za určitých podmienok môže Vibrio vlastniť dva typy bičíkov, z ktorých každý je poháňaný iným iónom: laterálne bičíky poháňané tokom protónov vodíka a polárne bičíky poháňané tokom sodných katiónov. Motory poháňané iónmi sodíka sa môžu otáčať ešte rýchlejšie ako 192

motory poháňané protónmi vodíka, až 600 otáčok za sekundu. Celkovo je motor baktérií poháňaný sodnými katiónmi komplexnejší a obsahuje prídavné štruktúry. Ióny sodíka prúdia cez sodíkové vodivé kanály, zložené z proteínov MotX a MotY a PomA a PomB194. Ďalšie štruktúry motora sú T, H a O prstence. Predpokladá sa, že tieto prídavné štruktúry sú zodpovedné za vyvinutie rýchlych rotácií motora u Vibrio. O prstenec, nachádzajúci sa z vonkajšej strany puzdra bázy vlákna, môže spolu s T a H prstencami slúžiť na spevnenie zložiek statora. Okrem toho môžu byť motory bičíkov niektorých druhov baktérií poháňané aj inými iónmi, napríklad niektoré druhy rodu Paenibacillus využívajú horečnaté a vápenaté ióny195. Ako tok protónov riadi generovanie sily v statorových jednotkách, nebolo známe, hlavne kvôli absencii 3D štruktúry komplexu statorovej jednotky. Toto bolo čiastočne vyriešené vďaka nedávnym kryo-EM štúdiám, ktoré popisujú štruktúry atómového rozlíšenia pre statorovú jednotku bičíkového motora u niektorých bakteriálnych druhov a návrh nového modelu rotácie na generovanie krútiaceho momentu196-198. Štúdie odhalili, že statorová jednotka pozostáva z pentaméru MotA obklopujúceho dimér MotB. Tok protónov vodíka spôsobuje rotáciu pentaméru MotA okolo diméru MotB, ktorý zostáva fixovaný na pevnú peptidoglykánovú štruktúru v periplazme. Cytoplazmatický koniec MotA sa spája s rotorom cez FliG podjednotky C prstenca, a tým prenáša rotáciu na bičíkové vlákno. Je pozoruhodné, že rotačný bičíkový motor je poháňaný radom ešte menších rotačných motorov. To predstavuje veľký posun v myslení o tom, ako fungujú statorové jednotky199. Ďalšia nedávna kryo-EM štúdia200, uskutočnená u Borrelia burgdorferi, načrtáva konformačné zmeny, ktoré sa vyskytujú na C prstenci počas prepínania smeru. V režime proti smeru hodinových ručičiek má C prstenec kompaktnú konformáciu a statorové jednotky sú v kontakte s FliG podjednotkami na vonkajšej strane C prstenca. MotA pentamér sa otáča v smere hodinových ručičiek, takže C prstenec sa otáča proti smeru hodinových ručičiek. Po naviazaní fosforylovaného chemotaktického proteínu CheY sa C prstenec roztiahne a statorové jednotky teraz kontaktujú FliG podjednotky na vnútornej strane C prstenca a tá istá rotácia MotA teraz otáča C prstenec v smere hodinových ručičiek. Týmto spôsobom jednosmerná rotácia MotA okolo MotB poháňa obojsmernú rotáciu bičíkového motora. Okrem mimoriadnej zložitosti svojej štruktúry, má bičíkový motor tiež schopnosť dynamicky sa prestavovať v reakcii na zmeny v prostredí. Komponenty rotora aj statora sa vymieňajú s voľne cirkulujúcou zásobou voľných podjednotiek. Kinetika týchto výmen je ladená environmentálnymi podnetmi. Napríklad u E. coli sa počet FliM podjednotiek na C prstenci zvyšuje pri nízkych koncentráciách fosforylovaného CheY, čo zvyšuje počet miest, kde sa 193

fosforylovaný CheY môže viazať a tým sa zvyšuje citlivosť motora na malé zmeny v koncentráciách chemikálií201,202. Podobne sa stator prestavuje v reakcii na zmeny mechanického zaťaženia. Počet aktívnych statorových jednotiek sa zvyšuje pri vysokom zaťažení a znižuje sa pri nízkom zaťažení. Vysoké zaťaženie stabilizuje motorom viazané statorové jednotky v motoroch rotujúcich proti smeru hodinových ručičiek aj v smere hodinových ručičiek, čím sa ich počet zvyšuje v časovom rámci niekoľkých minút. Naopak, nízky krútiaci moment znižuje životnosť statorových jednotiek viazaných na motor. Tento proces umožňuje motoru prispôsobiť svoj krútiaci moment požiadavkám, ktoré naň kladie externé zaťaženie úpravou svojho zloženia203-205. Špirálovité baktérie Na rozdiel od tyčinkovitých baktérií môžu špirálovité baktérie generovať časť ťahu rotáciou svojho bunkového tela. Môžeme ich rozdeliť do dvoch skupín: bunky s vonkajšími bičíkovými vláknami a bunky s vnútornými bičíkovými vláknami. Hydrodynamika pohonu pomocou špirálovitého bunkového tela je rovnaká ako pri pohone pomocou špirálovitých bičíkov, avšak špecifické mechanizmy pohonu sú odlišné. Plávanie rotáciou vonkajších bičíkových vlákien Aj napriek niekoľkým štúdiám správania zástupcov rodu Spirillum pri plávaní206,207 a súvisiacej hydrodynamiky208,209 základné mechanizmy ich pohybu nie sú dostatočne preštudované. Spirillum volutans je veľká špirálovitá baktéria, ktorá má na oboch koncoch zväzky asi 75 vonkajších bičíkov. Bunky plávajú so špirálovitým zväzkom umiestneným vzadu (zväzok chvosta) a zväzkom ovinutým okolo tela bunky vpredu (zväzok hlavy). Zväzok chvosta tlačí bunku dopredu a otáča ju okolo jej špirálovitej osi, zatiaľ čo zväzok hlavy iba otáča bunku okolo jej špirálovitej osi. Príležitostne bičíkové motory (u oboch zväzkov) zmenia smer otáčania. Výsledkom je, že zväzok hlavy sa stane zväzkom chvosta (a naopak) a bunka zmení smer plávania. Koordinácia medzi motormi na oboch koncoch bunky je rozhodujúca pre pohyb baktérií rodu Spirillum. Obraty na oboch koncoch bunky (vzdialených ~ 50 μm) sa vyskytujú takmer súčasne. Ak je synchronizácia medzi dvoma koncami inhibovaná, potom oba konce bunky skončia v rovnakej konfigurácii (oba ako hlava alebo oba ako chvost). V tomto prípade hydrodynamické sily generované dvoma koncami sú proti sebe, čím vzniká stacionárna bunka. Aby sa dosiahli synchrónne obraty, jeden koniec bunky musí odoslať signál druhému koncu rýchlosťou, ktorá 194

je 100 – 1 000 krát vyššia ako difúzia malej molekuly, čo si vyžaduje elektrogénny mechanizmus, ktorý zatiaľ nebol indentifikovaný. Plávanie rotáciou vnútorných bičíkových vlákien Spirochéty používajú odlišnú formu plávania, ktorá zahŕňa vlnenie celého tela bunky, poháňaného „vnútornými bičíkmi“ (nazývanými axiálne vlákna) uzavretými v periplazmatickom priestore. Tieto Gram-negatívne baktérie pozostávajú z dlhého špirálovitého protoplazmatického cylindra, obsahujúceho cytoplazmatický priestor, vnútornú membránu a peptidoglykánovú vrstvu so subpolárnymi bičíkmi, ktorých vlákna prebiehajú medzi peptidoglykánovou vrstvou a vonkajšou membránou210. V závislosti od voľnosti vonkajšej membrány a relatívnej pevnosti protoplazmatického cylindra a vlákien možno rozlíšiť tri stratégie plávania. V prvom prípade je vonkajšia membrána voľne pripojená k peptidoglykánovej vrstve a protoplazmatický cylinder je tuhší ako bičíkové vlákna. Príkladom je Treponema primitia211. Jednotlivé periplazmatické bičíky vystupujú z oboch koncov bunky, prebiehajú po celej dĺžke bunky a ich vlákna sa v strede prekrývajú. Bičíkové motory na opačných koncoch bunky rotujú v opačných smeroch. Rotácia bičíkov poháňa pohyb voľne pripevnenej vonkajšej membrány po obvode, ktorá generuje krútiaci moment spôsobujúci rotáciu špirálovitej bunky okolo svojej osi a pohyb dopredu. V druhom prípade je vonkajšia membrána tesne pripojená k peptidoglykánovej vrstve (a preto nemôže byť poháňaná po obvode) a protoplazmatický cylinder je tenký a pružnejší ako bičíkové vlákna. Príkladom je Leptospira illini212,213, ktorá má bičíkové motory na oboch koncoch bunky s vláknami, ktoré sú príliš krátke na to, aby sa v strede prekrývali. Protoplazmatický cylinder je špirálovitý, ale s oveľa menšou amplitúdou. Keď leptospíra pláva, rotácie bičíkov transformujú konce buniek do tvaru ľavotočivej špirály alebo polkruhového háku a otáčajú ich proti smeru hodinových ručičiek. Medzitým sa protoplazmatický cylinder otáča v smere hodinových ručičiek okolo svojej lokálnej špirálovitej osi, aby sa vyrovnal krútiaci moment. Oba konce bunkového tela leptospíry často menia svoj tvar (medzi špirálovitým a hákovým tvarom) so zmenou smeru otáčania a konfigurácia buniek je spájaná s formou pohybu; pri zobrazení tvaru špirály na jednom konci a tvaru háka na druhom konci, bunka pláva v smere špirálovitého konca a pri zobrazení symetrických konfigurácií (napríklad oba konce bunky majú tvar špirály) sa bunka otáča bez posunutia. V treťom prípade je vonkajšia membrána tesne pripojená a tuhosť protoplazmatického valca a bičíkových vlákien je porovnateľná. Príkladom tohto prípadu je Borrelia burgdorferi214, ktorá 195

má niekoľko bičíkových motorov na oboch koncoch bunky s vláknami, ktoré sa v strede prekrývajú. V dôsledku porovnateľnej tuhosti bičíkových vlákien a protoplazmatického cylindra bičíková rotácia spôsobuje, že sa bunka nielen otáča, ale aj vytvára planárne sa pohybujúce vlny, ktoré ju tlačia dopredu. V každom prípade je špirálovité telo bunky, najmä keď je tenké, schopné efektívne sa pohybovať cez gélové médiá; napríklad hlien, ktorý lemuje povrchy epitelu v tele, a intersticiálne tekutiny extracelulárnej matrice, ktoré obsahujú kyselinu hyalurónovú a rôzne glykoproteíny. V takýchto médiách tvorí rozpustená látka voľnú sieť, do ktorej ľahko prenikajú malé častice. Makroskopická objemová viskozita média môže byť vysoká, zatiaľ čo mikroskopická viskozita v póroch je podobná viskozite rozpúšťadla. Štíhla špirálovitá bunka, ktorá sa otáča okolo svojej špirálovej osi, sa prostredníctvom mikroskopických pórov„zaskrutkuje“ v takomto médiu215. Rojenie (Swarming) Rojenie je fenomén kolektívneho (skupinového) pohybu pozorovaný u rôznych organizmov vrátane baktérií, hmyzu, vtákov, rýb a cicavcov216. V kontexte baktérií sa pojem rojenie vzťahuje na špecifický typ pohybu, pri ktorom bičíkovité bunky organizovane ako husté konzorcium v kolónii migrujú po povrchoch217. Výrazom „špecifický typ“ sa rozumie, že rojenie je biologický režim, do ktorého môžu prejsť niektoré bakteriálne druhy. Tento prechod zahŕňa niekoľko bunkových procesov, ako sú zmeny v expresii kľúčových proteínov, v chemickej komunikácii medzi baktériami, ako aj mechanické zmeny218. Rojenie nie je len kolektívny pohyb (napr. plávanie) v koncentrovaných roztokoch, ale je to prirodzený jav, kedy sa bunky kolektívne „rozhodujú“ o prechode do tohto stavu219. To naznačuje, že zmeny v bunkách pred začiatkom rojenia môžu byť výhodou pre prežitie kolónie. Okrem toho, na rozdiel od baktérií, ktoré plávajú, rojace sa baktérie sú v neustálej interakcii s hranicou povrchu. Kolónia roja je odlišná od bakteriálneho biofilmu, ktorý podľa definície pozostáva z množstva metabolicky pokojných buniek pripojených k povrchu. Naproti tomu baktérie v roji sú pohyblivé, nepripútané a metabolicky aktívne220. Rojenie nielen pomáha baktériám kolonizovať nové niky, ale tiež môže uľahčovať ich prežívanie v prítomnosti antibiotík, ktoré sú smrteľné pre tie isté baktérie pri plávaní v kvapaline221. Husté suspenzie plávajúcich baktérií, získané umelou koncentráciou buniek do vysoko objemových frakcií, tiež vykazujú kolektívny pohyb222,223, ale tieto baktérie nie sú ekvivalentné s rojovým kolektívom, pretože rojové baktérie majú zmenenú fyziológiu218. Prvýkrát tento spôsob pohybu bol opísaný u zástupcov rodu Proteus (Obr. 5.4)224. 196

Obr. 5.4 Pohyb (rojenie) Proteus mirabilis na pevnom živnom médiu (Tuson a kol. 2013; upravené)233. Vegetatívne bunky Proteus mirabilis pri kontakte s povrchom pevného živného média (agar) sa morfologicky diferencujú (predlžujú sa a narastá počet ich bičíkov) na bunky, ktoré následne vytvárajú mnohobunkové zoskupenia (rafty). Uvedené mnohobunkové zoskupenia buniek sa spoločne pohybujú na pevnom živnom médiu až do času, keď sa začnú opäť diferencovať (bunky sa skracujú a klesá počet ich bičíkov) a z mnohobunkového spoločenstva (raftu) sa začnú uvoľňovať samostatné bunky. Ďalej u druhov rodu Escherichia, Salmonell 225, Bacillus226, Vibrio227, Pseudomonas228, Serratia229 a Paenibacillus230. Príkladmi rojacich sa druhov v laboratórnych podmienkach sú Escherichia coli, Bacillus subtilis, Serratia marcescens, Salmonella Enteritidis, Paenibacillus dendritiformis, Paenibacillus vortex, Proteus mirabilis a Pseudomonas aeruginosa. In situ štúdie rojenia (napr. in vivo alebo na medicínskych zariadeniach) sú zriedkavé. Jediným známym príkladom, ktorý môže mať medicínsky význam, je rojenie P. mirabilis pri infekcii močových ciest, kde sa množiace bunky pevne prichytia k povrchu katétra a migrujú z uretrálneho otvoru do močového mechúra231. Rojenie sa pozoruje, keď bičíkovité baktérie rastú na vlhkom pevnom povrchu bohatom na živiny218. Za týchto podmienok sa vegetatívne bunky často diferencujú na fenotyp roja, ktorý je charakteristický predĺžením buniek alebo zvýšením povrchovej hustoty bičíkov (hyperflageláciou) resp. oboma232. Baktérie v roji sa charakteristicky pohybujú v skupinách a vykazujú zložitý vírivý pohyb, v ktorom sa stovky bakteriálnych klastrov (raftov) nepretržite spájajú a oddeľujú, pričom vytvárajú rozsiahle víriace a prúdiace obrazce obsahujúce miliardy buniek. Tieto veľké skupiny buniek, poháňané rotáciou bičíkov, sa rýchlo pohybujú po povrchu a pohyb v kombinácii s rastom nových buniek vedie k rýchlej expanzii kolónie smerom von234,235. 197

Kolónia rojacej sa baktérie sa zvyčajne skladá z monovrstvy buniek na jej okraji, s postupne sa zvyšujúcou hustotou buniek smerom do vnútra kolónie, kde sú evidentné viaceré vrstvy buniek. Hoci plávanie ako aj rojenie je riadené bičíkmi, k rojeniu na rozdiel od plávania dochádza v akoby dvojrozmernom (2D) priestore v hornej časti pevného povrchu. Keďže bunky sa môžu rojiť iba v tekutine, na povrchu agaru sa musí vytvoriť tenká vrstva tekutiny. To si vyžaduje prítomnosť buď osmolytov alebo povrchovo aktívnych látok v blízkosti prednej časti kolónie. Mnohé rojace sa baktérie skutočne vylučujú osmolyty alebo povrchovo aktívne látky, resp. oboje. Osmolyty vytvárajú nerovnováhu osmotického tlaku, čo priťahuje tekutinu na povrch236. Povrchovo aktívne látky robia to isté znížením lokálneho povrchového napätia, čo umožňuje šírenie tekutého filmu pred prednou stranou roja. V laboratórnych podmienkach na povrchu živného média musí byť koncentrácia agaru dostatočne nízka, aby sa tekutina mohla rýchlo pohybovať cez jeho póry, ale dostatočne vysoká na to, aby sa do živného média nedostali baktérie. Pre väčšinu baktérií je koncentrácia agaru, ktorá podporuje rojenie, medzi 0,3 % a 1 %218. Čo spúšťa diferenciáciu vegetatívnej bunky na fenotyp roja? Predpokladá sa, že sa to týka fyzikálnych (napríklad povrchový kontakt) ako aj chemických signálov (napríklad quorum sensing), avšak špecifické mechanizmy sú stále nedostatočne preštudované237,238. U Vibrio parahaemolyticus a Proteus mirabilis vedie inhibícia rotácie polárneho bičíka k diferenciácii buniek na fenotyp roja, čo naznačuje, že bičík funguje ako „mechanosenzor“ na spustenie rojenia239. Špecifikácia a presný zdroj signálu snímania povrchu zostávajú neznáme. Objav mechanosenzitívnej prestavby bičíkového statora však poukazuje na bičíkový motor ako jeden zo zdrojov signálu snímania povrchu240,241. Nie je úplne známe, ako morfologické zmeny, spojené s fenotypom roja (predlžovanie buniek a zvýšenie povrchovej hustoty bičíkov), prispievajú k efektívnemu rojeniu. Dynamika rojenia, teda schopnosť buniek efektívne sa rojiť, je modulovaná fyzikálnymi faktormi, ako je pomer strán bunky242. Zvýšený pomer strán bunky napomáha pozdĺžnemu usporiadaniu buniek do multicelulárnych raftov. Teoretické ako aj experimentálne štúdie skutočne demonštrujú dôležitú úlohu pomeru strán buniek pri určovaní kolektívneho správania243,244. V súlade s pohľadom na rojenie ako na kolektívne správanie, hustota buniek podstatne ovplyvňuje dynamiku roja245. Nadmerný počet bičíkov môže byť adaptáciou na vysoko viskózny odpor, ktorému sú vystavené baktérie v preplnenom prostredí blízko povrchu roja. Bolo pozorované, že bunky roja P. mirabilis mali povrchovú hustotu bičíkov, ktorá bola ~ 5-krát väčšia ako u vegetatívnych buniek a boli pohyblivé v tekutinách s viskozitou, ktorá inhibuje pohyb vegetatívnych buniek233. Nie všetky baktérie však vykazujú všetky tieto fenotypy súvisiace s 198

rojením. Rojace sa bunky E. coli a Salmonella Enteritidis sú dvakrát dlhšie ako vegetatívne bunky, ale bičíková hustota zostáva nezmenená234,238. Naproti tomu bunky Proteus spp. vykazujú až 50-násobné zväčšenie dĺžky buniek aj hustoty bičíkov232. Tieto fenotypové rozdiely sú pravdepodobne spôsobené rôznymi ekologickými nikami, ktoré tieto baktérie kolonizujú. Úloha chemotaxie pri rojení je stále nejasná. Zdá sa, že nepretržitý krúživý pohyb jednotlivých buniek v rámci expandujúceho roja je náhodný, neusmernený a nezávislý od chemotaktického signalizačného systému. Rojace sa bunky E. coli nevyužívajú mechanizmus „pádov/prevrátenia“, ale občas zmenia smer pohybu246. Merania jednotlivých buniek u niekoľkých ďaľšich druhov (Proteus mirabilis, Serratia marcescens, Salmonella Enteritidis, Bacillus subtilis a Pseudomonas aeruginosa) potvrdzujú, že podobne ako u E. coli, predpojaté prevrátenie je znížené pri rojacich sa bunkách247,248. Avšak mutantom Salmonella Enteritidis, ktorým úplne chýba schopnosť pádov (napríklad v dôsledku mutácií v dráhe chemotaxie), sa nedarí rojiť. Naproti tomu mutanty, ktoré nie sú schopné chemotaxie, ale môžu prepínať rotáciu bičíkového motora, získajú schopnosť znovu sa rojiť249. Tieto údaje naznačujú, že zmeny v smere pohybu buniek pramenia z prepínania bičíkového rotora, ktoré nesúvisí s chemickými podnetmi. To je v kontraste s plávajúcimi baktériami, ktoré migrujú smerom k zdroju živín pomocou náhodnej chôdze riadenej chemosenzorickou signálnou transdukciou alebo chemotaxiou. 5.3.1.2 Zášklbový pohyb (Twitching) Najrozšírenejšou formou pohybu súvisiacou s povrchom je trhaný pohyb, nazývaný aj ako zášklbový, ktorý nie je sprostredkovaný bičíkmi, ale štíhlymi vláknami nazývanými fimbrie typu IV, resp. pilusy IV typu. Pilusy IV typu (T4P) sú prítomné pri baktériách a archeách250,251 a sprostredkovávajú také rôznorodé procesy, ako je adhézia252, príjem DNA253, predátorstvo254, virulencia255, fototaxia256, chemotaxia257 a snímanie povrchu258. Mechanizmus T4P úzko súvisí so sekrečným systémom typu II Gram-negatívnych baktérií259, ako aj s bičíkovým mechanizmom archeí250. Pilusy typu IV podstupujú cykly rýchleho predlžovania a sťahovania rýchlosťou ~ 1 µm/s. Distálne konce týchto pilusov ľahko priľnú k rôznym substrátom260. Keď sa pilus pripojí k pevnému substrátu a potom sa stiahne, funguje ako uchopovací hák a ťahá bunku k sebe, teda dopredu, pričom vyvíja silu až 150 pN261. Tento cyklus elongácie, prichytenia a retrakcie pilusu je základom zášklbovej pohyblivosti. 199

Z veľkej časti, je tento typ pohybu obmedzený na Gram-negatívne baktérie, najmä zástupcov β, γ a δ triedy kmeňa Proteobacterium, pričom najviac je preštudovaný u druhov Pseudomonas aeruginosa, Neisseria gonorrhoeae a Myxococcus xanthus. U M. xanthus sa nazýva aj „sociálny“ systém kĺzavého pohybu, pričom sa bunky spolu koordinovane pohybujú keď sú v skupinách262. Ale môžu sa takýmto spôsobom pohybovať aj Gram-pozitívne baktérie ako napr. klostrídie263. Zástupcovia morských cyanobaktérií tiež využívajú T4P pri udržiavaní vhodnej pozície vo vodnom prostredí v súvislosti s fototaxiou264. Udáva sa, že v črevnom trakte, ktorý vytvára rôznorodé prostredie (v dôsledku príjmu potravy, peristaltiky a modifikácie enterocytov), je asi 30 % známych črevných baktérií schopných produkovať T4P263. P. aeruginosa vykazuje aktívny zášklbový pohyb na intersticiálnom povrchu medzi agarom a plastom alebo sklom s radiálnou rýchlosťou expanzie blížiacou sa 1 mm/h, čo vedie k tvorbe veľkých, ale jemných zášklbových zón s priemerom 2 – 3 cm. Zóna zášklbov tiež vykazuje charakteristické koncentrické prstence, ktoré odrážajú periodické cykly rozširovania kolónie sprostredkované zášklbmi, pričom expresia pilusov typu IV a zášklbová aktivita sú obmedzené na najokrajovejšiu zónu265. Zášklbový pohyb zvyčajne zahŕňa kontakt medzi bunkami. Izolované bunky sa týmto spôsobom pohybujú len zriedka, okrem prípadov, keď sú v určitej vzdialenosti (až do niekoľkých µm) od ostatných, ktorá zodpovedá dĺžke pilusu typu IV266. Použitím časozbernej videomikroskopie na rozhraní prostredia gél-sklo v in vitro podmienkach, sa zášklbová aktivita u P. aeruginosa prejavuje spočiatku prostredníctvom pohybu raftov alebo klastrov agregovaných buniek smerom von z centra kolónie. Tieto rafty sa pohybujú radiálne po dlhej osi buniek, ktoré sú zarovnané v tesnom kontakte, hoci rafty vytvárajú meandre a jednotlivé bunky v nich môžu meniť smer. Predpokladá sa, že za týmito postupujúcimi raftami sa skupiny buniek naťahujú a rozpadajú na menšie agregáty, ktoré sa pohybujú rôznymi smermi a krížovo sa spájajú s inými skupinami buniek. Bunky z jednej skupiny sa pripoja k druhej skupine len vtedy, keď sú v tesnej blízkosti. Takéto bunky najprv posúvajú pilus smerom k ostatným bunkám, dotknú sa ich a potom rýchlo zapadnú do zarovnanej polohy, čo sa prejaví charakteristickým „šklbavým“ pohybom. Tento proces v konečnom dôsledku vedie k vytvoreniu dynamickej siete dráh podobnej mriežke, v rámci ktorej sa bunky rýchlo pohybujú hore a dole ako jednotlivé jednotky alebo malé skupiny, pričom často obracajú smer, ale vždy sledujú dlhú os bunky. Po vytvorení zrelej mriežky sa zdá, že bunky sa usadia a vytvoria trojrozmernú mikrokolóniovú štruktúru, ktorá sa podobá biofilmu265. Je dôležité si uvedomiť, že zášklbový pohyb môže byť využívaný bunkami na tvorbu biofilmov v nepriaznivých 200