E. Pilipčinec a kol._KEGA monografia 2022_č.j. 07UVLVF-4-2021

súvislú kolonizáciu sliznice čreva a neprodukujú enterotoxíny ako ETEC, ale na sliznici tenkého čreva vytvárajú biofilm. EAEC majú schopnosť adherovať k enterocytom tenkého aj hrubého čreva441. Predpokladom perzistentnej kolonizácie čreva a pravdepodobného vzniku nutričnej malabsorbcie je zvýšená produkcia hlienovitej vrstvy na povrchu sliznice čreva, čo vedie k vytvoreniu tzv. biofilmu. Súčasťou biofilmu sú aj charakteristicky uložené bunky EAEC437. Medzi ďalšie faktory virulencie EAEC patrí enteroagregatívny termostabilný enterotoxín (EAST1) a plazmidom kódovaný toxín (Pet)396,442. EAST1 je svojím účinkom podobný termostabilnému enterotoxínu ETEC typu a (STa) a je taktiež kódovaný plazmidom pAA. Prítomnosť EAST 1 bola potvrdená asi u 40 % enteroagregatívnych E. coli. Predpokladá sa, že EAST 1 prispieva k virulencii EAEC, pretože priebeh hnačky vyvolanej kmeňmi produkujúcimi tento toxín je závažnejší a ťažší ako pri kmeňoch, ktoré ho neprodukujú. Plazmidom kódovaný toxín (Pet = Plasmid encoded toxin) je 107 kDa cytotoxínom a je prvým popísaným enterotoxínom z rodiny autotransportérov SPATE (SPATE = Serine Protease Autotransporters Enterobacteriaceae), ktorý indukuje zvýšené uvoľňovanie hlienu, odlupovanie epiteliálnych buniek čreva a vytváranie abscesov krýpt. Gén, ktorý kóduje jeho produkciu, je lokalizovaný na plazmide pAA2 EAEC442. I keď sa predpokladá, že agregatívno-adherenčné fimbrie sú zodpovedné za agregatívno- adherenčný fenotyp EAEC, nevylučuje sa, že aj ďalšie, i keď doposiaľ nepoznané faktory adherencie zohrávajú úlohu pri väzbe baktérií na sliznicu a tvorbe biofilmu437,376. Medzi najčastejšie sérotypy EAEC patria O3:H2, O15:H18, O44:H18, O77:H18, O104:H4, O111:H21 a O127:H2443. U sérotypu O104:H4 bol izolovaný vysoko virulentný patotyp E. coli, ktorý je kombináciou enteroagregatívneho a enterohemoragického patotypu E. coli. Z uvedeného dôvodu bol označený ako enteroagregatívny a hemoragický patotyp E. coli (EAHEC)444. Klinickým prejavom EAEC infekcie v dôsledku poškodenia epiteliálnych buniek čreva EAST1 toxínom a cytotoxínom je buď vodnatá hnačka alebo hnačka s prímesou hlienu, niekedy sprevádzaná zvracaním a zvýšenou teplotou35,445. Shiga toxín produkujúce E. coli (STEC) a enterohemoragické E. coli (EHEC) Shiga toxín produkujúce E. coli sú charakterizované tvorbou Shiga toxínov, ktoré sú takmer identické alebo podobné so Shiga toxínom Shigella dysenteriae sérotypu 1. Synonymom pre 351

STEC sú verotoxigénne alebo verotoxín produkujúce E. coli (VTEC), čo je odvodené od skutočnosti, že Shiga toxíny usmrcujú za in vitro podmienok VERO bunky368,446. V súčasnosti je známych viac ako 200 sérotypov STEC, z ktorých asi 10 % sérotypov býva pre človeka vysoko virulentných a sú označené ako enterohemoragické E. coli. Enterohemoragické E. coli predstavujú patotyp E. coli, ktoré produkujú Shiga toxín a sú pôvodcami hemoragickej kolitídy, hemolyticko-uremického syndrómu alebo trombocytopenickej purpury človeka. EHEC boli predtým tiež známe ako Shiga-like toxín produkujúce E. coli (SLTEC)373. Enterohemoragické E. coli sa niekedy automaticky stotožňujú so Shiga toxín produkujúcimi E. coli, čo nemusí byť to isté, nakoľko nie všetky STEC sú zároveň EHEC, i keď všetky kmene EHEC sú Shiga toxín produkujúce E. coli. Za enterohemoragické E. coli sú považované iba tie kmene E. coli, ktoré: a) produkujú jeden alebo viac typov Shiga toxínov, ktorý je hlavným faktorom virulencie tohto patotypu; b) vyvolávajú hnačku rôznej závažnosti, ktorá v dôsledku systémovej toxémie môže byť komplikovaná hemolyticko-uremickým syndrómom; c) majú faktory virulencie kódované na chromozomálnom ostrove patogenity, ktorý je označený ako LEE lokus (LEE = Locus of Enterocyte Effacement), gény ktorého kódujú schopnosť tohto patotypu vyvolať na enterocytoch histopatologické zmeny označované ako „attaching and effacing“ lézie; d) obsahujú plazmidy rôznej veľkosti, vrátane veľkého plazmidu virulencie, ktoré kódujú ďalšie tzv. non-Stx faktory virulencie; e) patria k určitému spektru sérotypov, z ktorých nasledovných päť je najčastejších: O26:H11, O103:H2, O111:H8, O145:H28 a O157:H7 a f) sú rezervoárovými zvieratami, najčastejšie hovädzím dobytkom, asymptomaticky vylučované do prostredia. Enterohemoragické E. coli vyvolávajú relatívne široké spektrum ľudských ochorení od nekomplikovanej vodnatej hnačky, cez hnačku s prímesou krvi, až po hemoragickú kolitídu, hemolyticko-uremický syndróm a trombocytopenickú purpuru447. Sérotypy enterohemoragických E. coli Najznámejší sérotyp EHEC, sérotyp O157:H7, bol prvýkrát izolovaný v roku 1982 pri infekcii ľudí v štáte Michigan a Oregon (USA), ktorí sa infikovali v zariadení rýchleho občerstvenia konzumáciou nedostatočne tepelne opracovaného hamburgera33. 352

V súčasnosti je známych viac ako 100 sérotypov Shiga toxín produkujúcich E. coli, ktoré boli popísané v spojitosti s ľudským ochorením. K ďalším piatim, už hore uvedeným, patria ďalšie, často sa vyskytujúce, tzv. non-O157:H7 sérotypy EHEC ako je O55:H7, O91:H21, O113:H21, O117:H14, O118:H16 a O121:H19373,431. Faktory virulencie enterohemoragických E. coli Medzi najdôležitejšie faktory virulencie EHEC patria toxíny, vrátane Shiga toxínov, adhezíny a sekrečné systémy typu II a typu III368,373,448-451. Shiga toxíny Produkcia Shiga toxínov je kódovaná stx génmi, ktoré sú pri E. coli lokalizované na aktívnych alebo kryptických lambdoidných profágoch449. Fágy, ktoré nesú stx gény pre syntézu Shiga toxínov, sú označované ako Stx fágy alebo ako stx fágy. Uvedené fágy patria do skupiny tzv. temperovaných fágov, nakoľko majú lyzogénny typ reprodukcie, obdobne ako λ fágy. V lyzogénnom štádiu je DNA Stx fágov inkorporovaná do chromozómu bakteriálnej bunky a expresia väčšiny ich génov, vrátane stx génov je inhibovaná. Ak nedochádza k podnetom z vonkajšieho prostredia, fágový genóm ostáva ako epizóm inzertovaný v DNA hostiteľskej bunky a reprodukuje sa súčasne s bakteriálnym chromozómom. Hovoríme, že Stx fág ostáva v lyzogénnej bunke v štádiu profága. I keď vzniká relatívne stabilný klon lyzogénnych bakteriálnych buniek s profágom, u časti z nich však môže dôjsť k spontánnemu lytickému cyklu. Prípadne za určitých podmienok môže dôjsť k expresii fágových génov, produkcii a uvoľneniu Stx fágov. Podnet na prechod z lyzogénneho do lytického štádia Stx fága sa nazýva indukciou. Indukcia môže byť vyvolaná napr. aj antibiotikami452. Počas lytického štádia Stx fága nedochádza iba k bakteriofágom indukovanej bakteriolýze, ale dochádza aj k expresii stx génov a produkcii Shiga toxínu453. Shiga toxín (Stx) je členom tzv. rodiny Shiga toxínov. Je produkovaný S. dysenteriae sérotypu 1 a príležitostne aj S. sonnei a S. dysenteriae sérotypu 4454,455. Tento toxín má enterotoxický, neurotoxický a cytotoxický účinok. Doposiaľ neboli popísané žiadne varianty Shiga toxínu produkovaného zástupcami rodu Shigella. Shiga toxíny E. coli sú rozdelené do dvoch hlavných antigénnych typov: Stx1 (predtým Shiga- like toxín I alebo Verotoxín 1) a Stx2 (predtým Shiga-like toxín II alebo Verotoxín 2), ktoré sú ďalej rozdelené do ďalších subtypov. Podľa najnovšej nomenklatúry Shiga toxínov, založenej na fylogenetickej príbuznosti proteínov, označenie Stx (bez čísiel) je rezervované pre Shiga toxíny, ktoré sú produkované zástupcami rodu Shigella. Subtypy Shiga toxínov, produkované 353

E. coli, sú označované ako Stx1a, Stx1c, Stx1d, Stx2a, Stx2b, Stx2c, Stx2d, Stx2e, Stx2f a Stx2g456. I keď všetky Shiga toxíny zdieľajú spoločné rysy v štruktúre a enzymatickej aktivite, líšia sa v sekvencii aminokyselín, biologickej a sérologickej aktivite. Keď napr. Stx1 E. coli sa od Stx S. dysenteriae sérotypu 1 líši iba jednou aminokyselinou, Stx2 E. coli zdieľa už len 56 % identity v sekvencii aminokyselín s Stx1. U kmeňov EHEC humánneho pôvodu sa najčastejšie vyskytujú nasledovné subtypy Shiga toxínov: Stx1a, Stx1c, Stx2a, Stx2b, Stx2c a Stx2d. So vznikom hemolyticko-uremického syndrómu sú spojené kmene EHEC, ktoré produkujú Stx2a, Stx2c a Stx2d. Naopak, kmene EHEC produkujúce Stx1a, Stx1c, Stx1d, Stx2b, Stx2e, Stx2f a Stx2g sú väčšinou izolované u pacientov s nekomplikovanou hnačkou, nanajvýš s hemoragickou kolitídou, bez prechodu do hemolyticko-uremického syndrómu457. Všetky Shiga toxíny sú tzv. AB5 holotoxíny a patria do skupiny A-B toxínov, nakoľko pozostávajú z jednej A podjednotky o molekulovej hmotnosti približne 32 kDa, ktorá sa nekovalentnou väzbou viaže s B podjednotkou. Podjednotka A je zodpovedná za enzymatickú aktivitu toxínu a je proteolyticky štiepená na A1 a A2 peptidy, ktoré sú spojené disulfidickou väzbou. B podjednotka je zložená z ďalších piatich proteínových podjednotiek, ktoré vytvárajú pentamér vo forme prstenca. Každá z piatich proteínových podjednotiek pentaméru má molekulovú hmotnosť približne 7,7 kDa. Mechanizmus pôsobenia týchto toxínov spočíva vo väzbe B podjednotky (pentaméru) na glykolipidový receptor v bunkovej membráne cieľovej hostiteľskej bunky (globotriaosylceramid – Gb3, v prípade Stx2e dochádza k väzbe na globotetraosylceramid – Gb4), ďalej v translokácii a uvoľnení podjednotky A, aktívnej časti toxínu, v cytoplazme hostiteľskej bunky, kde je proteolyticky štiepená na A1 a A2 fragment. Fragment A1 pôsobí ako N-glykozidáza, ktorá odštepuje adenín na ribozomálnych podjednotkách, čo vedie k inhibícii proteosyntézy. Shiga toxíny ako intracelulárne toxíny môžu spôsobovať apoptózu mnohých typov eukaryotických buniek. Najväčšiu afinitu majú k cievnemu endotelu, predovšetkým k endoteliálnym bunkám malých krvných ciev tráviaceho aparátu, obličiek, mozgu a pľúc. Poškodenie cievneho endotelu glomerulov obličiek vedie k hemolyticko-uremickému syndrómu455,458-462. Non-Shiga toxíny Enterohemoragické E. coli okrem Shiga toxínov produkujú aj ďalšie tzv. non-Shiga toxíny, ktoré môžu zohrávať dôležitú úlohu v patogenéze ochorenia, predovšetkým pri vzniku 354

hemolyticko-uremického syndrómu. Medzi tieto non-Shiga toxíny patrí: EHEC hemolyzín, serínová proteáza EspP, cytoletálny distendujúci toxín a cytotoxín subtiláza373,463,464. EHEC hemolyzín (enterohemolyzín) je cytolyzín, ktorý pri vyšších dávkach vyvoláva lýzu mikrovaskulárnych endotelových buniek a pri sublytických dávkach spôsobuje ich apoptózu, vrátane apoptózy črevných epiteliálnych buniek. Je kódovaný plazmidom pO157. Veľkosť plazmidu pO157 sa pohybuje okolo 100 kb, je prítomný u všetkých kmeňov EHEC sérotypu O157:H7, O26:H11 ako aj u väčšiny Shiga toxín produkujúcich E. coli465. U Shiga toxín produkujúcich kmeňov E. coli sérotypu O113:H21 bola popísaná produkcia EHEC hemolyzínu (EHEC-hlyA alebo ehx) na veľkom pO113 plazmide466. Serínová proteáza EspP (Esp = E. coli secreted serine protease) je proteínom z rodiny autotransportérov SPATE (SPATE = Serine Protease Autotransporters Enterobacteriaceae) so schopnosťou štiepiť koagulačný faktor V prítomný v plazme. Bolo popísaných niekoľko subtypov EspP (EspP α, β, γ, δ a ε), pričom subtyp EspP α je prítomný u EHEC O157:H7 a ďalších, O26:H11/NM, O111:H8/NM a O145:H25/H28/NM, najčastejšie sa vyskytujúcich non-O157:H7 sérotypov, pôvodcov závažných ochorení človeka, vrátane hemolyticko- uremického syndrómu467. Cytoletálny distendujúci toxín (CDC = Cytolethal Distending Toxin) je proteínom, ktorý má schopnosť poškodzovať DNA, v dôsledku čoho dochádza k zastaveniu bunkového cyklu v G1 alebo v G2 fáze, čo vedie k inhibícii proliferácie a vytvoreniu charakteristickej „nafúknutej“ (distended) morfológie bunky, prípadne nastáva smrť bunky. Z uvedeného dôvodu je CDC klasifikovaný ako genotoxín a cyklomodulín. Pri rôznych patotypoch E. coli je známych päť typov CDC, z ktorých dva (CDC-III a CDC-V) boli identifikované u EHEC468,469 . Cytotoxín subtiláza je AB5 toxín, ktorý pri experimentálnom podaní myšiam vyvoláva rozsiahle mikrovaskulárne trombózy a nekrózy v obličkách a v mozgu, ktoré sú podobné histopatologickým zmenám u pacientov s hemolyticko-uremickým syndrómom470,471. Gény zodpovedné za produkciu subtilázy (subAB) boli pôvodne objavené na plazmide virulencie u Shiga toxín produkujúcich kmeňov E. coli sérotypu O113:H21 a neskôr aj na ostrove patogenity bakteriálneho chromozómu iných Shiga toxín produkujúcich kmeňov E. coli472-474. Adhezíny Enterohemoragické E. coli produkujú viaceré fimbriálne a nefimbriálne adhezíny. Z nich je najdôležitejší a najlepšie preštudovaný nefimbriálny adhezín intimín. Intimín je proteínom vonkajšej membrány o molekulovej hmotnosti 94 – 97 kDa. Je kódovaný eae génom, ktorý je lokalizovaný na ostrove patogenity bakteriálneho chromozómu, ktorý je označený ako LEE 355

lokus a spolu s ďalšími efektorovými proteínmi sekrečného systému typu III je zodpovedný za tvorbu tzv. „attaching and effacing“ lézií na sliznici hrubého čreva475-477. Existuje viac ako 20 typov a subtypov intimínu, ktoré boli identifikované pri enteropatogénnych E. coli a vyskytujú sa taktiež pri väčšine najčastejšie izolovaných sérotypov EHEC478. Medzi ďalšie nefimbriálne adhezíny EHEC patria Efa1 (Efa = EHEC factor for adherence), ToxB (ToxB = Toxin B), Saa (Saa = Stx producing E. coli autoagglutinating adhesin), OmpA (Omp = Outer membrane protein A), Iha (Iha = Iron regulated gene A homologue adhesin). Z fimbriálnych adhezínov je to LPF (LPF = Long Polar Fimbriae)384,479-483. Mechanizmus patogenézy EHEC je v počiatočnom štádiu infekcie obdobný ako pri EPEC, keď dochádza k vytvoreniu tzv. „vyhladzovacích“ alebo A/E lézií na enterocytoch hrubého čreva. V ďalšom štádiu infekcie EHEC dochádza k produkcii Shiga toxínu, resp. Shiga toxínov, ktoré sa dostávajú do krvi a nastáva toxémia. Rozsah a stupeň poškodenia endotelu krvných ciev Shiga toxínom záleží od jeho typu, resp. subtypu. Nekomplikované hnačky vyvolané Shiga toxín produkujúcimi E. coli postihujú predovšetkým deti, ale rizikovú skupinu predstavujú aj starší ľudia. Vyskytujú sa sporadicky alebo v menších epidémiách. Obyčajne začínajú po 3- až 8-dňovej inkubačnej dobe kŕčovitými bolesťami brucha s vodnatou hnačkou, ktorá môže prejsť do hnačky s prímesou krvi. Priebeh hnačky je afebrilný a trvá 2 – 12 dní, keď dochádza k spontánnemu uzdraveniu. Hnačka vyvolaná enterohemoragickými kmeňmi E. coli začína 3 – 7 dní po infekcii bolesťami brucha s vodnatou hnačkou, ktorá v priebehu 1 – 3 dní prechádza u väčšiny pacientov do krvavej hnačky, čo je už prejavom hemoragickej kolitídy. V 85 – 90 % prípadoch môže dôjsť v tomto štádiu choroby k spontánnemu uzdraveniu a v 10 – 15 % sa môže rozvinúť hemolyticko-uremický syndróm. Hemolyticko-uremický syndróm sa vyvíja obyčajne 5 – 13 dní po začiatku hnačky. Je charakterizovaný mikroangiopatickou hemolytickou anémiou, trombocytopéniou a akútnym renálnym zlyhaním. Hemolyticko-uremický syndróm sa vyvíja ako systémová komplikácia hnačky, vyvolanej EHEC, predovšetkým u detí do veku 5 rokov. Varovným príznakom, najmä u detí tejto vekovej kategórie, je vzostup teploty a/alebo narastajúca leukocytóza po 2 – 4 dňoch trvania choroby. Patofyziologickým podkladom hemolyticko-uremického syndrómu je trombotická mikroangiopatia, ktorá postihuje predovšetkým kapiláry obličkových glomerulov, hrubého čreva a mozgu, a vzniká poškodením mikrovaskulárneho endotelu účinkom Shiga toxínu. K úmrtiu dochádza u 3 – 5 % postihnutých detí, najčastejšie na následky neurologických komplikácií, pričom až u 30 % pacientov, ktorí sa uzdravia z akútneho ochorenia, má infekcia trvalé následky vo forme hypertenzie, 356

proteinúrie, zúženia čreva, neurologických komplikácií, prípadne chronického zlyhania obličiek, vedúceho k celoživotnej dialýze, či nutnosti transplantácie obličiek484-486. Rezervoárové zvieratá a epidemiológia enterohemoragických E. coli Zvieratá môžu byť asymptomatickými nosičmi EHEC, ktoré sa na prechodnú dobu stávajú súčasťou ich normálnej črevnej mikroflóry. Najdôležitejším rezervoárovým zvieraťom EHEC je hovädzí dobytok, pričom kmene EHEC boli izolované aj zo vzoriek oviec, kôz, koní, hydiny, psov, mačiek, čajok, krýs a niektorých ďalších zvierat397,487. Bolo preukázané, že hovädzí dobytok môže vo svojom féces vylučovať až 106 EHEC na 1 gram féces, pričom EHEC sú vylučované vo väčšom počte mladými teľatami, ihneď po odstave v porovnaní s dospelými zvieratami. Vylučovanie EHEC vo féces hovädzieho dobytka je vyššie počas letných mesiacov a začiatkom jesene v porovnaní s ostatným ročným obdobím. EHEC prežívajú v prostredí až 20 mesiacov488. Najčastejším spôsobom prenosu EHEC na človeka je konzumácia kontaminovaných a tepelne nedostatočne opracovaných potravín živočíšneho pôvodu, najmä hovädzieho mäsa, nepasterizovaného mlieka a výrobkov z neho. Ďalej k prenosu EHEC na človeka môže dôjsť konzumáciou kontaminovaných potravín rastlinného pôvodu, ktoré neboli dostatočne umyté alebo tepelne opracované. K vzniku epidémií i sporadických infekcií môže viesť aj pitie kontaminovanej pitnej vody a kúpanie sa vo vodných zdrojoch kontaminovaných zvieracím trusom489,490. Nakoľko infekčná dávka EHEC je veľmi nízka (10 – 100 baktérií), infekcia sa prenáša aj fekálno-orálnou cestou zo zvieraťa na človeka alebo z človeka na človeka491. Difúzno-adherentné (alebo difúzno-agregatívne) E. coli (DAEC) Difúzno-adherentné (alebo difúzno-agregatívne) E. coli sú viac príčinou hnačiek starších detí ako novorodencov, najmä detí od 18 mesiacov do 5 rokov492-496. DAEC sú charakteristické tým, že k HeLa alebo k HEp-2 bunkovým kultúram adherujú difúzne497. Hovoríme, že vykazujú difúzny alebo DA typ adherencie, ktorá je asi v 75 % sprostredkovaná afimbriálnymi adhezínmi z rodiny Afa/Dr adhezínov a afimbriálnym adhezínom AIDA-I (AIDA = Adhesin Involved in Diffuse Adherence)498,499. Na difúznom type adherencie DAEC sa podieľa aj fimbriálny adhezín F1845. Následne, po adherencii DAEC k enterocytom sa u enterocytov predlžujú mikroklky do prstovitých útvarov500. 357

Medzi ďalšie faktory virulencie DAEC patrí tzv. SAT proteín (SAT = Secreted Autotransporter Toxin) z rodiny autotransportérov SPATE (SPATE = Serine Protease Autotransporters Enterobacteriaceae), ktorý má schopnosť narúšať tesné spojenie medzi epiteliálnymi bunkami, čo môže následne viesť k zvýšeniu ich permeability. DAEC majú aj prozápalový efekt, nakoľko u epiteliálnych buniek vedú k zvýšenej sekrécii IL-8. IL-8 napomáha transmigrácii polymorfonukleárov cez epiteliálny monolayer, ale zároveň vedie u nich k zvýšenej apoptóze a zníženej fagocytárnej aktivite. V skutočnosti to znamená, že následkom DAEC infekcie prebieha síce zápalová odpoveď, ale bez eliminácie patogénu501. Medzi najčastejšie sérotypy DAEC patria O86, O127, 142 a O158. Hnačka vyvolaná DAEC je vodnatá, bez prímesi krvi (Tab. 6.29). Vznik nových alebo kombinovaných kategórií (patotypov) E. coli Plasticita v genetickej výbave E. coli prináša vznik nových alebo kombinovaných kategórií (patotypov) E. coli, akými sú: „cell-detaching“ E. coli (CDEC), „cytolethal distending toxin- producing“ E. coli (CDTEC), enteroagregatívne a hemoragické E. coli (EAHEC)404,444,492,502. V súvislosti so štúdiom Crohnovej choroby boli popísané aj tzv. adherentno-invazívne E. coli (AIEC). Nie je však stále vylúčené, že tento patotyp E. coli nie je príčinou intestinálnych chorôb človeka a neuplatňuje sa v patogenéze zápalových procesov v čreve. „Cell-detaching“ E. coli (CDEC) CDEC boli prvýkrát izolované v roku 1993 u detí austrálskych Aborigénov s hnačkou492. Majú schopnosť za in vitro podmienok „odlupovať“ bunky tkanivových kultúr z monolayera, čo je vyjadrené aj v ich pomenovaní. Medzi faktory virulencie uvedeného patotypu patrí α- hemolyzín HlyA, P-fimbrie a cytotoxický nekrotizujúci faktor 1 (CNF1). „Cytolethal distending toxin-producing“ E. coli (CDTEC) Cytoletálny distendujúci toxín (CDT) bol prvýkrát popísaný v roku 1987 ako nový toxín pri kmeňoch E. coli, ktoré boli pôvodcami hnačiek503. Neskôr boli popísané ďalšie príbuzné toxíny u ďalších intestinálnych aj extraintestinálnych patogénov ako je Campylobacter spp., Salmonella Typhi, Haemophilus ducreyi, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Shigella spp. a Helicobacter spp504. Rodina CDT je obyčajne kódovaná súborom troch génov (cdtA, cdtB a cdtC), ktoré kódujú tri proteíny CDT holotoxínu. Cytoletálne distendujúce toxíny majú schopnosť poškodzovať DNA, v dôsledku čoho dochádza k zastaveniu bunkového cyklu v G1 alebo G2 fáze, čo vedie 358

k inhibícii proliferácie a vytvoreniu charakteristickej „nafúknutej“ (distended) morfológie bunky, prípadne nastane smrť bunky. Z uvedeného dôvodu sú cytoletálne distendujúce toxíny klasifikované ako genotoxíny a cyklomodulíny. CDT+ kmene E. coli neboli izolované iba pri intestinálnych, ale aj pri extraintestinálnych chorobách človeka, najmä pri urinárnych infekciách a meningitídach404. Navyše, CDT+ kmene E. coli boli izolované aj zo zdravých a chorých zvierat, najmä z hovädzieho dobytka, ošípaných, psov a viacerých druhoch vtákov505-509. Niektoré cdt+/CDT+ kmene E. coli vlastnia aj stx gény. Tieto kmene sú väčšinou animálneho pôvodu, izolované najmä z hovädzieho dobytka alebo z holubov. Na strane druhej, niektoré humánne Shiga toxín produkujúce kmene E. coli (STEC) vzácne vlastnia cdt gény. Enteroagregatívne a hemoragické E. coli (EAHEC) EAHEC patria k vysoko virulentnému kombinovanému patotypu E. coli444. Boli izolované pri sérotype O104:H4 a sú kombináciou enteroagregatívneho (EAEC) a enterohemoragického patotypu (EHEC) E. coli510,511. EAHEC vlastnia plazmid, ktorý je podobný plazmidu pAA kmeňov EAEC, ktorý kóduje agregatívno-adherenčné fimbrie typu I (AAF/I). Navyše, tento patotyp vlastní profága, ktorý kóduje Shiga toxín typu Stx2. Infekcie EAHEC sa vyznačujú gastroenteritídami, ktoré môžu prejsť do hemolyticko- uremického syndrómu. Uropatogénne E. coli (UPEC) Uropatogénne E. coli sa podieľajú na vzniku infekcií dolných a horných močových ciest (cystitída, pyelonefritída) a vzniku tzv. asymptomatickej bakteriúrie (ABU)512. Pacienti s asymptomatickou bakteriúriou, ktorých močové cesty sú kolonizované tzv. ABU kmeňmi UPEC, obyčajne nie sú liečení, naopak, osídlenie močových ciest ABU kmeňmi UPEC sa považuje za určitú prevenciu voči infekcii virulentnými kmeňmi UPEC. Jednou z príčin, prečo ABU kmene nie sú virulentné, je aj ich neschopnosť produkovať adhezíny a tvoriť hemolyzíny513-515. Virulentné kmene UPEC sa podieľajú 70 – 95 % na komunitných infekciách močových ciest a 50 % na nemocničných infekciách močových ciest. Infekcie močových ciest sa pre relatívne krátku uretru vyskytujú štrnásťkrát častejšie u žien ako u mužov516-519. 359

Virulentné kmene UPEC patria predovšetkým do fylogenetickej skupiny B2, menej často do fylogenetickej skupiny D. Ich schopnosť vyvolať klinickú formu urinárnej infekcie je spojená s faktormi virulencie495. Faktory virulencie UPEC sa obyčajne rozdeľujú do dvoch skupín. Prvá skupina zahŕňa povrchové morfologické štruktúry bakteriálnej bunky a druhá skupina predstavuje sekrečné faktory, ktoré sú tvorené a dopravované bakteriálnou bunkou na miesto účinku. Povrchové štruktúry bakteriálnej bunky patria medzi najdôležitejšie faktory virulencie UPEC, nakoľko priamym a bezprostredným kontaktom spúšťajú signálne cesty hostiteľských i bakteriálnych buniek, podieľajú sa na transporte a predávaní bakteriálnych produktov do hostiteľských buniek a v neposlednom rade zabezpečujú bakteriálnu inváziu do hostiteľských buniek, resp. tkanív. Medzi povrchové faktory virulencie UPEC patria: fimbriálne a afimbriálne adhezíny, lipopolysacharid, kapsula a bičíky520-522. Medzi sekrečné faktory virulencie UPEC patria toxíny, najmä: α-hemolyzín (HlyA), cytotoxický nekrotizujúci faktor 1 (CNF-1), cytoletálny distendujúci toxín (CDT) a sekrečný autotransportérový toxín (SAT). UPEC, obdobne ako ostatné extraintestinálne patotypy E. coli, majú schopnosť získavať železo pomocou siderofórov (aerobaktín)523. Prvým predpokladom urinárnej infekcie je adherencia UPEC k epiteliálnym bunkám močového aparátu pomocou fimbriálnych a afimbriálnych adhezínov521,522. Fimbriálne adhezíny UPEC sa na základe svojej hemaglutinačnej aktivity rozdeľujú do troch kategórií. Prvú kategóriu predstavujú manózo-rezistentné fimbrie, ktoré sa neviažu na D- manózu a v jej prítomnosti aglutinujú ľudské erytrocyty. Medzi tieto fimbrie patria P (Pap), M a S fimbrie. Druhú kategóriu predstavujú manózo-senzitívne fimbrie, ktoré sa viažu na D- manózu a iba v jej neprítomnosti aglutinujú morčacie erytrocyty. Medzi tieto fimbrie patria fimbrie typu 1 (F1 fimbrie). Tretiu kategóriu predstavujú fimbrie, ktoré neaglutinujú žiadne erytrocyty bez ohľadu na prítomnosť alebo neprítomnosť D-manózy. Medzi tieto fimbrie patria F1C fimbrie524-530. Z afimbriálnych adhezínov sú u uropatogénnych kmeňov E. coli prítomné adhezíny Afa/Dr rodiny, ako je Dr adhezín, AfaE-I, AfaE-II, AfaE-III a AfaE-V531,532. Lipopolysacharid, ktorý je integrálnou súčasťou bunkovej steny Gram-negatívnych baktérií má schopnosť indukovať prozápalovú odpoveď hostiteľa tým, že zvyšuje hladinu prozápalových cytokínov. Medzi najčastejšie séroskupiny kmeňov UPEC patrí O1, O2, O4, O6, O7, O8, O15. O16, O18, O21, O22, O25, O75 a O83524,533-535. 360

Kapsula, ktorá má najčastejšie polysacharidovú štruktúru, chráni bakteriálnu bunku predovšetkým pred fagocytózou a komplementom sprostredkovaným baktericídnym účinkom séra. Niektoré typy kapsúl, ako je napríklad kapsula K-1, ktorá je súčasťou aj iných extraintestinálnych a aviárnych patotypov E. coli a je polymérom N-acetylneuramínovej kyseliny (kyselina sialová), má okrem antifagocytárnej a antikomplementovej aktivity aj schopnosť „maskovať“ patogénne kmene E. coli pred imunitným systémom hostiteľa vytváraním tzv. molekulových mimikier k okolitému tkanivu536,537. Bičíky, ktoré sú organelami pohybu, sú zároveň aj významným faktorom virulencie kmeňov UPEC. Pohyblivé kmene UPEC ľahšie prekonávajú cestu z močového mechúra do obličiek a navyše, flagelín má aj funkciu invazínu. 70 – 90 % všetkých infekcií močového aparátu je vyvolaných kmeňmi UPEC, ktoré sú vybavené bičíkmi538,539. α-hemolyzín (HlyA) je významným faktorom virulencie asi u 50 % kmeňov UPEC, kde prispieva k rozvoju cystitídy a akútnej pyelonefritídy. Pôsobí cytolyticky na rôzne typy buniek, najmä erytrocyty, leukocyty a epiteliálne bunky a má taktiež schopnosť indukovať prozápalovú odpoveď tým, že zvyšuje hladinu prozápalového cytokínu IL-1β540. α-hemolyzín je polypeptid, ktorý sa po uvoľnení do vonkajšieho prostredia sekrečným systémom typu 1 pripája k membráne hostiteľských buniek a vytvára v nich póry. Produkciu toxínu kódujú gény hlyC, hlyA, hlyB a hlyD, ktoré tvoria operón (hlyCABD), ktorý sa nachádza buď na chromozomálnom ostrove patogenity spolu s ďalšími génmi virulencie alebo u niektorých patotypov sú gény kódujúce produkciu toxínu súčasťou plazmidu541,542. Z intestinálnych kmeňov E. coli je α-hemolyzín dôležitým faktorom virulencie pri CDEC patotype. Cytotoxický nekrotizujúci faktor 1 (CNF-1) je vysoko letálnym toxínom z rodiny dermonekrotických toxínov. Za in vitro podmienok spôsobuje zväčšenie a mnohojadrovosť HeLa buniek. Za in vivo podmienok spôsobuje odlupovanie epiteliálnych buniek močových ciest, čo vytvára predpoklady pre bakteriálnu inváziu do subepiteliálnej vrstvy a priľahlého tkaniva543-545. Cytotoxický nekrotizujúci faktor 1 je produkovaný asi jednou tretinou kmeňov UPEC izolovaných pri pyelonefritíde. CNF-1 sa uplatňuje ako faktor virulencie aj pri ďalších extraintestinálnych kmeňoch E. coli, najmä pri kmeňoch vyvolávajúcich septikémiu a neonatálnu meningitídu. Z intestinálnych kmeňov E. coli je CNF-1 dôležitým faktorom virulencie pri CDEC patotype. 361

I keď cytoletálny distendujúci toxín (CDT) je hlavným faktorom virulencie CDTEC patotypu a niektorých ďalších intestinálnych patotypov E. coli, bol však popísaný aj pri extraintestinálnych patotypoch E. coli, vrátane uropatogénnych kmeňov546. SAT proteín alebo sekrečný autotransportérový toxín (SAT = Secreted Autotransporter Toxin) z rodiny autotransportérov SPATE (SPATE = Serine Protease Autotransporters Enterobacteriaceae) je významným faktorom virulencie kmeňov UPEC izolovaných pri pyelonefritíde. Má schopnosť vakualizovať epiteliálne bunky obličiek a močového mechúra547. Z intestinálnych kmeňov E. coli je SAT dôležitým faktorom virulencie pri DAEC patotype. E. coli vyvolávajúce neonatálnu meningitídu (NMEC) a septikémiu (SEPEC) K neonatálnej meningitíde, pôvodcom ktorej sú E. coli, dochádza buď pri infekcii z pôrodných ciest alebo pri infekcii pupočnej šnúry, prípadne pri infekcii respiračného alebo intestinálneho traktu, kedy sa môžu baktérie dostať do krvi a vyvolať bakteriémiu. Bakteriémia je predpokladom toho, že dôjde k naviazaniu a invázii baktérií do mikrovaskulárnych endoteliálnych buniek mozgu s ich následnou inváziou do mozgových a miechových blán a centrálneho nervového systému364. Medzi najčastejšie sérotypy E. coli, vyvolávajúce neonatálnu meningitídu, patrí sérotyp O18:K1 a sérotyp O1:K1. I keď obidva sérotypy vlastnia kapsulárny antigén K-1, na neonatálnej meningitíde sa podieľajú asi v 20 % prípadov aj kmene NMEC s iným typom kapsulárneho antigénu. Sérotyp O18:K1, ako aj väčšina kmeňov NMEC patrí do fylogenetickej skupiny B2, na rozdiel od sérotypu O1:K1, ktorý patrí do fylogenetickej skupiny D548,549. Medzi najdôležitejšie faktory virulencie NMEC kmeňov okrem K-1 kapsulárneho polysacharidu patrí proteín vonkajšej membrány OmpA a lipopolysacharid bunkovej steny. Tieto faktory virulencie chránia bakteriálnu bunku pred baktericídnym účinkom séra, opsonizáciou a fagocytózou, čo do značnej miery umožní rozvoj bakteriémie, kolonizáciu a inváziu mikrovaskulárnych endoteliálnych buniek mozgu550-552. Na invazívnych vlastnostiach NMEC kmeňov sa podieľajú bakteriálne invazíny IbeA, IbeB, IbeC (Ibe = Invasion of brain endothelial cells) a AslA (AslA = Arylsulfatase Activity)553. Súčasťou invázie mozgových mikrovaskulárnych endoteliálnych buniek je aj preskupenie aktínového cytoskeletu, na ktorom sa podieľa OmpA a CNF-1554,555. Ak sa baktérie, za určitých klinických podmienok, dostanú do krvného systému, hovoríme o bakteriémii. V prípade, že stav bakteriémie pretrváva a baktérie sa začnú rozmnožovať, hovoríme o septikémii alebo sepse. Septikémia je vždy život ohrozujúci stav, vyvolaný 362

bakteriálnou infekciou krvného riečiska a býva niekedy označovaný ako syndróm systémovej zápalovej odpovede. Pôvodcami septikémie okrem kmeňov SEPEC, ktoré patria väčšinou do fylogenetickej skupiny B2, môžu byť za určitých okolností aj iné patotypy E. coli, predovšetkým E. coli vyvolávajúce neonatálnu meningitídu, uropatogénne kmene E. coli, prípadne patogénne kmene E. coli pri ďalších extraintestinálnych infekciách (pneumónia, peritonitída, celulitída). Medzi najviac sepsou ohrozené skupiny patria novorodenci, imunosupresívni pacienti a staršie osoby. Neonatálna alebo novorodenecká septikémia je klasifikovaná buď ako „včasné“ alebo ako „neskoré“ vzplanutie. „Včasné vzplanutie“ postihuje novorodencov od narodenia do veku 6 dní po narodení a „neskoré vzplanutie“ postihuje novorodencov vo veku od 7 do 90 dní po narodení556. Pôvodcami neonatálnej septikémie do veku jedného týždňa po narodení sú predovšetkým streptokoky skupiny B a kmene E. coli. Väčšina novorodencov môže byť nimi kolonizovaná z pôrodných ciest ešte pred narodením557. V neskoršom veku môžu byť pôvodcami neonatálnej septikémie okrem streptokokov skupiny B a E. coli aj iné bakteriálne patogény, buď z nemocničného alebo komunitného prostredia, akými sú napr. Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Elizabethkingia meningoseptica, koaguláza negatívne stafylokoky, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, prípadne ďalšie558. Medzi najčastejšie séroskupiny kmeňov SEPEC patrí séroskupina O2 a O78559. Medzi najdôležitejšie faktory virulencie SEPEC kmeňov patria adhezíny (fimbrie typu 1, P fimbrie a „curli“ fimbrie), kapsula K-1 (u séroskupiny O2), resp. kapsula typu IV u séroskupiny O78, systém na získavanie železa (produkcia siderofórov aerobaktínu a yersiniabaktínu, expresia IroN receptora pre enterobaktín), sekrečný systém typu III (T3SS) a vonkajší membránový proteín OmpA, ktorý chráni baktérie pred baktericídnym účinkom neutrofilov vyviazaním neutrofilmi produkovanej elastázy364,530,559-562. K ďalším faktorom virulencie mnohých kmeňov SEPEC patrí Col V plazmidom kódovaná produkcia kolicínu V. Col V plazmidmi je kódovaná aj syntéza Iss (Iss = Increased serum survival) proteínu vonkajšej membrány, ktorý spolu s TraT lipoproteínom vonkajšej membrány, ktorý je kódovaný R6-5 alebo R100 plazmidom, zabezpečujú rezistenciu baktérií voči baktericídnemu účinku krvného séra a fagocytóze563. 363

6.3.14 Rod Salmonella Zástupcovia rodu Salmonella sú Gram-negatívne, fakultatívne anaeróbne, rovné, obyčajne pohyblivé tyčinky (Salmonella Gallinarum biovar Gallinarum a Salmonella Gallinarum biovar Pullorum sú nepohyblivé) veľkosti 0,7– 1,5 × 2,0 – 5,0 μm. Zástupcovia rodu Salmonella sa vyskytujú celosvetovo a sú pôvodcami salmonelózy ľudí a zvierat 564,565. Infekcie človeka vyvolané zástupcami rodu Salmonella sú zoonózy, nakoľko jednotlivé sérovary salmonel, ktoré sú pôvodcami salmonelózy zvierat, sú prenosné aj na človeka. Zoonotický potenciál nemajú jedine salmonely hostiteľsky špecifické (S. Typhi a S. Paratyphi A, B, C) (Tab. 6.31). Tab. 6.31 Najvýznamnejšie sérovary salmonel a s nimi spojené choroby človeka Hostiteľ Sérovary Choroba Hostiteľsky salmonel Hostiteľsky Hostiteľsky špecifické adaptované nešpecifické Človek S. Typhi - - Brušný týfus S. Paratyphi A - - Paratýfus A S. Paratyphi B S. Paratyphi C - - Paratýfus B - - Paratýfus C - - S. Enteritidis Salmonelová gastroenteritída - - S. Typhimurium Salmonelová gastroenteritída - - Ďalšie často Salmonelová izolované sérovary gastroenteritída S. enterica subsp. enterica: S. Virchow, S. Hadar, S. Heidelberg, S. Newport, S. Infantis, S. Agona - S. Choleraesuis - Septikémia Extraintestinálna forma salmonelózy - S. Dublin - Septikémia Extraintestinálna forma salmonelózy Medzi najvýznamnejšie a najčastejšie sa vyskytujúce sérovary S. enterica subsp. enterica, ktoré sú pôvodcami salmonelózy ľudí a zvierat, patrí Salmonella Enteritidis a Salmonella Typhimurium. Medzi ďalšie často izolované sérovary S. enterica subsp. enterica pri 364

salmonelóze ľudí patrí Salmonella Virchow, Salmonella Hadar, Salmonella Heidelberg, Salmonella Newport, Salmonella Infantis a Salmonella Agona (Tab. 6.31)46. Infekcie človeka vyvolané zástupcami rodu Salmonella Zástupcovia rodu Salmonella môžu byť u človeka pôvodcami relatívne širokého spektra klinických prejavov566,567. Medzi najdôležitejšie z nich patrí (Tab. 6.31): a) tyfoidná forma salmonelózy (brušný týfus a paratýfus); b) salmonelová gastroenteritída (salmonelóza); c) bakteriémia s fokálnymi léziami (extraintestinálna forma salmonelózy). Ani u človeka sa nevylučuje asymptomatické nosičstvo bez klinických príznakov spojené s kontinuálnym alebo sporadickým vylučovaním salmonel féces. Pôvodcami tyfoidnej formy salmonelózy sú primárne patogénne salmonely hostiteľsky špecifické pre človeka: Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A, Salmonella Paratyphi B a Salmonella Paratyphi C (Tab. 6.32). Tab. 6.32 Pôvodcovia brušného týfusu a paratýfusu a ich výskyt Choroba Pôvodca Antigénna Výskyt Brušný týfus Salmonella Typhi skladba Celosvetový 9,12, [Vi]; d (Najmä rozvojové krajiny Ázie, Afriky Paratýfus A Salmonella Paratyphi A 1,2,12; a; [1,5] a Latinskej Ameriky) Stredomorie, Blízky Východ, Stredná Ázia, indický subkontinent, Čína Paratýfus B Salmonella Paratyphi B 1,4,[5],12; b; 1,2 Celosvetový Paratýfus C (predtým 6,7, [Vi]; c; 1,5 (Najmä južná Európa, západná Afrika, Salmonella schottmülleri) Ďaleký východ) Salmonella Paratyphi C Ojedinelý, najmä juhovýchodná Ázia (predtým a Latinská Amerika Salmonella hirschfeldii) Salmonely, ktoré sú hostiteľsky špecifické pre človeka, nemajú svojich rezervoárových hostiteľov u zvierat. Prameňom nákazy je iba akútne chorý človek alebo bacilonosič, u ktorého sú salmonely prítomné v žlčníku. Nákaza sa prenáša fekálne-orálnou cestou, najmä fekálne, prípadne močom, kontaminovanou vodou alebo potravinami, ale aj kontaminovanými predmetmi. Brušný týfus a paratýfus prebieha ako horúčkovité ochorenie a na rozdiel od salmonelových gastroenteritíd, hnačka u nich nie je dominantným klinickým príznakom. I z uvedeného dôvodu synonymum pre brušný týfus je týfusová horúčka alebo črevná horúčka. 365

Je dôležité nezamieňať si brušný týfús so škvrnitým týfusom, pôvodcom ktorého je Rickettsia prowazekii. V anglickej literatúre pomenovaním pre brušný týfus je typhoid fever a pomenovaním pre škvrnitý týfus je typhus. Brušný týfus Ochorenie podobné týfusu popísal už Hippokrates (asi 460 pred n. l. – 370 pred n. l.). I jeho pomenovanie typhos (dym, zákal, hmla) pochádza z gréčtiny a má vyjadrovať stav oblúznenia, malátnosti a bolesti hlavy, čo sú jedny z príznakov tejto nákazy568. Na svete ročne ochorie na brušný týfus okolo 17 miliónov ľudí a viac ako pol milióna z nich mu aj podľahne. Vysoká incidencia nákazy je najmä v rozvojových krajinách Ázie, Afriky a Latinskej Ameriky569-572. V priemyselne vyspelých krajinách sveta, vrátane Slovenskej republiky, sa v súčasnosti brušný týfus a paratýfus vyskytuje prevažne len ako importovaná nákaza. S. Typhi sa vylučuje stolicou už týždeň pred objavením sa klinických príznakov a potom v priebehu infekcie. Asi 10 % neliečených pacientov vylučuje stolicou S. Typhi ešte 3 mesiace po chorobe573,574. U 2 – 5 % neliečených pacientov dochádza k celoživotnému nosičstvu. Vstupnou bránou infekcie je tráviaci trakt575,576. V prvom štádiu infekcie prenikajú baktérie v distálnej časti ilea cez sliznicu čreva do lymfatických folikulov a Peyerových plakov, kde sa množia a šíria ďalej do mezenteriálnych lymfatických uzlín s následnou primárnou bakteriémiou. Baktérie sú však vychytávané makrofágmi retikuloendoteliálneho systému, predovšetkým v pečeni, slezine, kostnej dreni a v lymfatických uzlinách. Dochádza však aj k ich ďalšiemu pomnožovaniu a vzniku sekundárnej bakteriémie. Rozpadom baktérií je uvoľňovaný endotoxín, následkom čoho dochádza u pacientov k ťažkým až smrteľným komplikáciám ako je postihnutie myokardu alebo vznik encefalitídy. S. Typhi má veľkú afinitu k tkanivu žlčníka, najmä u ľudí s anomáliami v tejto oblasti. Môže sa usídliť vo vývodových žlčových cestách, v žlčníku alebo v iných orgánoch. Baktérie sú ďalej vylučované stolicou, ktorá sa stáva prameňom infekcie pre ďalších jedincov. V tomto štádiu choroby dochádza taktiež k hromadeniu makrofágov s fagocytovanými baktériami vo forme uzlíkových ložísk, tzv. tyfómov. Tieto sa vytvárajú najmä mimo intestinálneho traktu, predovšetkým v lymfatických uzlinách, pečeni, slezine a kostnej dreni574,575,577. Po inkubačnej dobe, trvajúcej 7 až 14 dní, sa objavujú prvé príznaky choroby574,576,578. Ochorenie je charakterizované vysokými horúčkami dosahujúcimi 39 – 40 °C, malátnosťou, bolesťami hlavy (odtiaľ je aj český názov choroby hlavnička), bolesťami svalov a kĺbov 366

a hepatosplenomegáliou. Medzi 7. – 10. dňom od objavenia sa prvých klinických príznakov, sa môže v podbruší objaviť makulopustulózny exantém (týfusová roseola). V prvom a druhom týždni choroby je typická zápcha, ktorá vzniká v dôsledku zúženia lúmenu čreva hyperpláziou lymfatických folikulov a Peyerových plakov a je doprevádzaná distenziou čreva. V ďalšom týždni nastupuje u neliečených pacientov anorexia, pacient stráca na hmotnosti, zvýrazňuje sa zväčšenie brucha a môže sa objaviť aj riedka zelenožltá stolica. Zhoršuje sa neurologický status, pacient je apatický, zmätený, niekedy až psychotický. Dochádza ku vzniku koagulačnej nekrózy lymfatických folikulov a Peyerových plakov, čo môže spôsobiť perforáciu čreva s peritonitídou. V tomto štádiu nekrózy môže dôjsť k úmrtiu pacienta nielen na dôsledky perforácie čreva, ale aj v dôsledku toxického šoku, myokarditídy alebo renálneho zlyhania. Po štádiu nekrózy nastáva štádium tvorby a štádium hojenia vredov, sprevádzané ohraničením nekrotického ložiska leukocytmi, odlúčením nekrotických častí tkaniva a tvorbou dlhých vredov pozdĺžne s osou čreva a ich vyhojením. Diagnostickým dôkazom S. Typhi je pozitívna hemokultivácia, resp. S. Typhi by mala byť potvrdená izoláciou zo žlče, kostnej drene alebo moču579-581. S. Typhi môže byť vykultivovaná aj zo stolice, ale pre potvrdenie alebo vylúčenie črevnej horúčky negatívna kultivácia zo stolice nie je preukazná. Doplňujúcim testom je sérologické vyšetrenie (Widalova reakcia)574. Paratýfus Paratýfus pripomína brušný týfus, prebieha však miernejšie, kratšie a má lepšiu prognózu. Inkubačná doba je približne 6 dn582. Paratýfus A sa vyskytuje v Stredomorí, na Arabskom polostrove, v Indii a Číne. Paratýfus B sa vyskytuje, obdobne ako týfus, celosvetovo. Paratýfus C sa vyskytuje vzácne v ohraničených oblastiach juhovýchodnej Ázie a Južnej Ameriky a postihuje najmä osoby oslabené chronickou maláriou, amebiázou, prípadne inou infekciou569,583,584. V roku 2020 bol na Slovensku diagnostikovaný jeden prípad paratýfusu (S. Paratyphi B var. Java)585. Salmonelová gastroenteritída (salmonelóza) Gastroenteritída je najčastejšou a najtypickejšou formou salmonelózy ľudí. V závislosti od sérovaru, veľkosti infekčnej dávky, veku a vnímavosti hostiteľa, má aj rôznu intenzitu klinických príznakov, od ľahkej hnačky až po ťažký klinický stav s rizikom bakteriémie. 367

V priebehu 6 – 48 hodín po požití kontaminovanej potravy dochádza k vzostupu telesnej teploty na 39 – 40 °C, kŕčovitým bolestiam brucha a zvracaniu. Spočiatku kašovitá stolica sa rýchlo mení na vodnatú, často zeleno sfarbenú, niekedy s prímesou hlienu a krvi. Behom jedného dňa zvracanie ustáva a v priebehu ďalších 2 – 3 dní klesá teplota. Vodnatá hnačka s bolesťami brucha môže pretrvávať niekoľko dní. Pacienti sú najviac ohrození dehydratáciou. Priebeh choroby býva väčšinou priaznivý a netrvá dlhšie ako jeden týždeň. Po odznení klinických príznakov dochádza po dobu niekoľkých týždňov až mesiacov k rekonvalenscentnému nosičstvu a vylučovaniu salmonel stolicou. Salmonelóza človeka je alimentárnou zoonózou a jej pôvodcom môže byť ktorýkoľvek sérovar. Najčastejšie je to však Salmonella Enteritidis a Salmonella Typhimurium. Salmonely sú druhou najčastejšie hlásenou gastrointestinálnou infekciou bakteriálneho pôvodu v krajinách EÚ. K infekcii človeka dochádza najčastejšie požitím kontaminovanej potravy živočíšneho pôvodu. Prameňom infekcie bývajú najmä vajcia, hydinové, bravčové a hovädzie mäso a výrobky z nich, nedostatočne tepelne opracované. Prípadne kontaminované mäso rýb, plazov a výrobky z nich. Prameňom infekcie môže byť aj fekálne kontaminovaná voda a zelenina586. K nákaze môže dôjsť aj priamym kontaktom s plazmi, obojživelníkmi a hydinou (najmä kurčatami a kačicami), ale aj s ďalšími zvieratami, vrátane hospodárskych a exotických zvierat. Infekčná dávka sa pohybuje od 107 až 109 zárodkov. Priamy medziľudský prenos salmonel je vzácny. Pravdepodobnejší je nepriamy prenos cestou kontaminácie potravín, vody a predmetov. Extraintestinálna forma salmonelózy Extraintestinálna forma salmonelózy vzniká ako dôsledok salmonelovej bakteriémie. Bakteriémiu s následnou disemináciou baktérií do iných orgánov môže vyvolať ktorýkoľvek sérovar587. Najväčšiu tendenciu má však S. Choleraesuis a S. Dublin588. Salmonely, kolujúce v krvi, sa najčastejšie zachytia v mieste preexistujúceho trombu, hematómu alebo inej cievnej lézie. Z extraintestinálnych foriem salmonelóz býva pomerne častou salmonelová artritída a osteomyelitída. Bola však popísaná aj abscedujúca pneumónia, absces pečene, cholecystitída, pyelonefritída, peritonitída, encefalopatia, či endoftalmitída589-591. Avšak, medzi najzávažnejšie extraintestinálne formy salmonelózy patria infekcie cievneho riečiska, pri ktorých úmrtnosť dosahuje 14 – 60 %. Najčastejšie sa jedná o endokarditídu alebo septickú tromboflebitídu. 368

Faktory virulencie zástupcov rodu Salmonella Faktory virulencie sú u salmonel kódované génmi, ktoré sú zoskupené na špecifických oblastiach chromozómu, nazývaných ostrovy patogenity alebo sú nesené plazmidmi virulencie. Medzi najdôležitejšie faktory virulencie salmonel, časť ktorých je kódovaná aj ostrovmi patogenity alebo plazmidmi virulencie, patrí kapsula, lipopolysacharid, bičíky, adhezíny, enterotoxín, siderofóry, stresové proteíny a sekrečné systémy typu I, III a VI592-594 (Tab. 6.33). Tab. 6.33 Faktory virulencie salmonel (môžu sa líšiť medzi jednotlivými sérovarmi) Faktor virulencie Úloha v patogenéze Kapsula (Vi antigén) Chráni bakteriálnu bunku pred lýzou komplementom, nakoľko nedôjde k väzbe membránu atakujúceho komplexu komplementovej kaskády na stenu bakteriálnej bunky. Má taktiež charakter nefimbriálneho adhezínu. LPS Podieľa sa na adherencii a kolonizácii intestinálneho traktu. Indukuje zápalovú odpoveď, nakoľko komplex CD14 – LPS je spúšťačom prozápalových cytokínov (IL-1, IL-6, faktor nekrotizujúci nádorové bunky, prostaglandíny). Aktivuje komplement. Má charakter nefimbriálneho adhezínu. Bičíky Majú charakter nefimbriálnych adhezínov a zvyšujú invazívne schopnosti salmonel. Adhezíny Sprostredkúvajú adherenciu salmonel k epiteliálnym bunkám intestinálneho traktu, M bunkám a k membránam fagocytujúcich buniek. Enterotoxín Udržuje integritu bunkovej membrány. Siderofóry Pomocou siderofórov získavajú salmonely Fe3+ z hostiteľských molekúl obsahujúcich nehémové železo (transferín, laktoferín). Stresové proteíny Chránia bakteriálnu bunku pred environmentálnym stresom (zmena teploty, Sekrečný systém typu osmotického tlaku, pH a pod.). I (T1SS) Zabezpečuje translokáciu viacerých efektorových proteínov, vrátane injikovania Kódovaný SPI-4 adhezínu (SiiE) do hostiteľských buniek. SiiC, SiiD a SiiF, proteínové podjednotky a čiastočne aj SPI-9 T1SS môžu mať funkciu TolC-like proteínu vonkajšej membrány, prípadne slúžiť Sekrečný systém typu na transport ATP-ázy. Zabezpečuje inváziu epiteliálnych buniek čreva. III-1 (T3SS-1) Zabezpečuje intracelulárne prežívanie v hostiteľských bunkách. Kódovaný SPI-1 Sekrečný systém typu III-2 (T3SS-2) T6SS, obdobne ako T3SS a T4SS „injikujú“ efektorové molekuly priamo do Kódovaný SPI-2 cytosólu eukaryotickej bunky. Sekrečný systém typu VI (T6SS) Kódovaný SPI-6 Ostrovy patogenity Ostrovy patogenity alebo ostrovy virulencie boli prvýkrát popísané v 80-tych rokoch minulého storočia pri štúdiu hly génu, kódujúceho produkciu α-hemolyzínu uropatogénnych Escherichia coli. Uvedený gén sa nachádza na úseku chromozomálnej DNA, ktorý je označovaný ako hemolyzínový ostrov595,596. Od uvedeného času boli ostrovy patogenity popísané nielen pri ďalších Gram-negatívnych (Yersinia, Salmonella, Vibrio, Helicobacter a Neisseria) a Gram-pozitívnych (Staphylococcus, 369

Listeria, Clostridium) patogénoch človeka a zvierat, ale aj u patogénov rastlín (Erwinia, Xanthomonas, Pseudomonas). Ostrovy patogenity sú prítomné iba u patogénnych baktérií a nesú gény pre celý rad faktorov virulencie, najčastejšie však pre produkciu adhezínov, sekrečné systémy a systémy pre získavanie železa. Ich veľkosť kolíše od 10 – 200 kb a okrem génov virulencie obsahujú aj gény umožňujúce ich mobilitu (integráza, transponáza), čo im dáva možnosť horizontálneho prenosu597. Prvé ostrovy patogenity salmonel boli popísané v rokoch 1995 a 1996598,599. Pri sérovaroch S. enterica je doposiaľ známych 22 ostrovov patogenity. Ich počet pri jednotlivých sérovaroch kolíše a ani u jedného z nich nie sú prítomné všetky597,600,601. Ostrovy patogenity sa u salmonel označujú v skratke ako SPI z angl. Salmonella patogenicity islands a sú označené arabskou číslicou od 1 do 22. Pri S. Typhimurium boli popísané nasledovné SPI: SPI-1, SPI-2, SPI-3, SPI-4, SPI-5, SPI-6, SPI-9, SPI-12, SPI-13, SPI-14 a SPI-16597,599,600,602,603. Pri S. Enteritidis a S. Gallinarum biovar Gallinarum a biovar Pullorum bol popísaný SPI-1, SPI- 2, SPI-3, SPI-4, SPI-5, SPI-6, SPI-9, SPI-10, SPI-12, SPI-13, SPI-14, SPI-16, SPI-17 a SPI- 19601,604. Pri S. Typhi bol popísaný SPI-1, SPI-2, SPI-3, SPI-4, SPI-5, SPI-6, SPI-7, SPI-8, SPI-9, SPI- 10, SPI-12, SPI-15, SPI-16, SPI-17 a SPI-18605,606. Sérovary S. bongori obsahujú inú skupinu ostrovov patogenity a sú označené ako SPI-1, SPI- 3A, SPI-3B, SPI-4, SPI-9 a SPI-22607. I keď funkcia všetkých ostrovov patogenity nie je ešte doposiaľ známa, medzi najlepšie preštudované ostrovy patogenity patrí SPI-1, SPI-2, SPI-3, SPI-4608. Hlavnou funkciou SPI-1 je zabezpečenie invázie epiteliálnych buniek čreva. Pomocou T3SS-1 a jeho efektorových proteínov dochádza k prestavbe cytoskeletu enterocytov, v anglickej literatúre označovanej ako „membrane ruffle formation“, čo by sa dalo preložiť aj ako „zvlnenie“, „nariasenie“ alebo vytvorenie „volánov“ na membráne enterocytov. Výsledkom uvedenej programovej prestavby cytoskeletu je následný prestup baktérií do enterocytu603,609,610. Hlavnou funkciou SPI-2 je zabezpečenie intracelulárneho prežitia v makrofágoch pomocou T3SS-2 a jeho efektorových proteínov611,612. Gény SPI-3 zabezpečujú produkciu proteínu, ktorý patrí medzi autotransportéry rodiny MisL. Uvedený proteín sa podieľa na väzbe S. Typhimurium k fibronektínu prítomnému v medzibunkovej hmote hostiteľských buniek, čím prispieva k intestinálnej kolonizácii 370

salmonel. Navyše, gény SPI-3 (napr. mgtC) zabezpečujú produkciu efektorových proteínov pre transport magnézia pri intracelulárnom prežívaní v makrofágoch (Mgts = Magnesium transport system)613. SPI-4 pozostáva z 24 kb oblasti, ktorá je tvorená šiestimi génmi označenými ako siiABCDEF. SiiC, SiiD a SiiF tvoria základ sekrečného systému typu I (T1SS) pre produkciu SiiE. SiiE je intestinálnym nefimbriálnym adhezínom dôležitým pre účinnú translokáciu efektorových proteínov SPI-1 S. Typhimurium614. SPI-6 je málo preštudovaným ostrovom patogenity, kóduje však sekrečný systém typu VI (T6SS) a fimbriálny operón safABCD615. SPI-9 nesie tri gény pre tvorbu T1SS a jeden gén pre produkciu veľkého BapA proteínu o molekulovej hmotnosti 386 kDa. BapA proteín sa zúčastňuje na tvorbe biofilmu a kolonizácii hostiteľských buniek. Je tiež produkovaný T1SS612. SPI-12 nesie oafA gén, ktorý kóduje O-antigénny proteín, čím dochádza k povrchovej variácii salmonel. SPI-16 pozostáva z troch otvorených čítacích rámcov (ORF = Open Reading Frames), ktoré sa podieľajú na glykozylácii O-antigénu a povrchovej variácii salmonel. Plazmidy virulencie Pri salmonelách je prítomných vždy viacero plazmidov rôznej veľkosti. Niektoré z nich sú spojené s virulenciou. Najvýznamnejšie z nich sú z rodiny veľkých (~ 50 – 100 kb) plazmidov označených ako Spv plazmidy (Spv = Salmonella plasmid virulence)616-618. Spv plazmidy sú označované tiež ako sérovar špecifické plazmidy virulencie, nakoľko sú prítomné predovšetkým pri hostiteľsky špecifických, resp. hostiteľsky adaptovaných sérovaroch salmonel, ktoré majú potenciál vyvolávať systémovú formu salmonelózy. Patrí k nim S. Abortusovis, S. Abortusequi, S. Gallinarum biovar Gallinarum, S. Gallinarum biovar Pullorum a S. Choleraesuis. Z hostiteľsky nešpecifických sérovarov salmonel sú Spv plazmidy prítomné u S. Sendai, S. Dublin, S. Enteritidis a S. Typhimurium. Prítomnosť Spv plazmidov nie je vylúčená ani u ostaných sérovarov poddruhov S. enterica s výnimkou sérovarov poddruhu S. enterica subsp. diarizonae618-621. spv operón pozostáva z piatich génov spvRABCD, pričom produkt spvR génu reguluje expresiu génov zvyšnej časti operónu. Expresia génov spv operónu napomáha prežiť salmonelám v environmentálne nepriaznivom intracelulárnom prostredí fagolyzozómu (nízke pH, nedostatočný príjem uhlíka, železa). Ostatné gény Spv plazmidov zabezpečujú rezistenciu voči 371

séru (komplementom sprostredkovaná lýza bakteriálnej bunky), adherenciu a inváziu cieľových buniek622,623. Kapsula Pri kmeňoch sérovaru S. Typhi, S. Paratyphi C a pri niektorých kmeňoch sérovaru S. Dublin sa môže vytvárať kapsula polysacharidového typu574. Po chemickej stránke sa jedná o α-1,4-2-deoxy-2-N-acetylgalaktózamín kyseliny urónovej. Uvedený typ kapsuly vytvárajú aj niektoré kmene zástupcov rodu Citrobacter spp.574,624. Kapsula je antigénom, ktorý bol označený ako Vi (Vi = Virulence) antigén. Vi antigén je súčasťou antigénneho zloženia uvedených sérovarov (Tab. 6.33). I keď kapsula pri salmonelách nemá klasickú antifagocytárnu funkciu, chráni bakteriálnu bunku pred lýzou komplementom, nakoľko nedôjde k väzbe membránu atakujúceho komplexu komplementovej kaskády na stenu bakteriálnej bunky. Navyše, má charakter nefimbriálneho adhezínu625,626. Nie je známe, aby kapsula mala nejakú úlohu pri intracelulárnom prežívaní salmonel. Lipopolysacharid Lipopolysacharid (LPS) bunkovej steny je považovaný za významný faktor virulencie salmonel593,627. Lipid A, ktorý je súčasťou LPS, je toxický, viaže sa na plazmový proteín, nazývaný ako lipid-viažuci proteín, ktorý sa následne viaže na CD14628,629. Vytvorený komplex CD14 – LPS je spúšťačom prozápalových cytokínov (IL-1, IL-6, faktor nekrotizujúci nádorové bunky, prostaglandíny), nakoľko sa viaže na receptory podobné Toll receptorom na povrchu makrofágov a dendritických buniek. Vytvára taktiež produkty aktivujúce komplement. K virulencii LPS prispievajú aj postranné polysacharidové reťazce (O-antigény), nakoľko v závislosti na svojej dĺžke chránia bakteriálnu bunku, obdobne ako Vi antigén, pred väzbou membránu atakujúceho komplexu komplementovej kaskády na stenu bakteriálnej bunky a následnou lýzou komplementom630,631. LPS zohráva úlohu aj pri adherencii a kolonizácii intestinálneho traktu. Bičíky Všetky salmonely s výnimkou S. Gallinarum biovar Gallinarum a S. Gallinarum biovar Pullorum sú pohyblivé pomocou bičíkov (peritrichy)632,633. Sérovary poddruhov I, II, IIIa a VI sú bifázické, t. j. schopné vytvárať dva, niekedy až tri rôzne typy funkčne a antigénne (imunologicky) odlišných bičíkov. Obdobne ako O a Vi antigény, aj bičíkové (H) antigény, sú súčasťou antigénneho zloženia sérovarov salmonel (Tab. 6.33)634. 372

Fáza 1 bičíkových H antigénov sa označuje malými písmenami abecedy od „a“ po „z“ a potom ako „z1“, „z2“, „z3“, atď. a fáza 2 bičíkových H antigénov sa označuje arabskými číslicami ako „1“, „2“, „3“, atď. H antigény, obdobne ako O alebo Vi antigény, sa stanovujú aglutinačnou reakciou pomocou špecifických antisér. Bičíky zvyšujú invazívne schopnosti salmonel, nakoľko napomáhajú tesnejšiemu kontaktu baktérií k epiteliálnym povrchom, a tým aj efektívnejšiemu transferu efektorových proteínov pomocou sekrečného systému typu III-1 (T3SS-1) počas invázie epiteliálnych buniek635,636. Adhezíny Pri salmonelách boli popísané tri nefimbriálne adhezíny (kapsula, LPS a bičíky) a najmenej, v závislosti na sérovare, 11 fimbriálnych adhezínov. Syntéza fimbriálnych adhezínov je u salmonel kódovaná nasledovnými operónmi: agf (csg), fim, pef, lpf, bcf, saf, stb, stc, std, sth, sti a stj594,637,638. Fimbriálne adhezíny sprostredkúvajú adherenciu salmonel k epiteliálnemu povrchu intestinálneho traktu. Vzhľadom na svoju relatívnu hydrofóbnosť môžu sprostredkovať aj adherenciu k membránam fagocytujúcich buniek. Medzi najdôležitejšie fimbriálne adhezíny salmonel z pohľadu kolonizácie intestinálneho traktu patrí Pef, Agf a Lpf 639-641. Pef fimbrie (Pef = Plasmid encoded fimbriae) sú kódované plazmidom virulencie S. Typhimurium pSLT a sú dôležité pre adherenciu salmonel k epiteliálnym bunkám čreva. Agf fimbrie (Agf = Aggregative fimbriae) sú podobné „curli“ fimbriám Escherichia coli. Napomáhajú autoagregácii (priľnavosť buniek rovnakého kmeňa k povrchom), tvorbe biofilmu a adherencii k epiteliálnym bunkám tenkého čreva. Lpf fimbrie (Lpf = Long polar fimbriae) napomáhajú adherencii salmonel k M bunkám, nie však k enterocytom. Enterotoxín Pri salmonelách bol popísaný tzv. Stn enterotoxín (Stn = Salmonella enterotoxin), pri ktorom nebola doposiaľ jednoznačne preukázaná enterotoxigénna aktivita. Má však skôr význam pre udržanie integrity bunkovej membrány642,643. 373

Siderofóry V prípade nedostatku železa všetky patogénne sérovary salmonel produkujú katecholátový siderofór enterobaktín a, s výnimkou sérovarov S. bongori, aj salmochelín, ktorý je glykozylovaným derivátom enterobaktínu644-647. Stresové proteíny Stresové proteíny sú vytvárané bakteriálnou bunkou v podmienkach environmentálneho stresu, najmä pri zmene teploty, pH, osmotického tlaku a pod. Produkciu stresových proteínov regulujú tzv. RNA polymeráza sigma faktory (Rpo = RNA polymerase). Napr. RpoH reguluje produkciu stresových proteínov pri teplotnom šoku, RpoE pri osmotickom šoku a pod. RpoS je hlavným alebo univerzálnym faktorom na odpoveď voči environmentálnemu stresu. Okrem Rpo sigma faktorov sa na odpovedi voči environmentálnemu stresu podieľajú aj ďalšie regulačné proteíny, ktoré napomáhajú adaptácii bakteriálnej bunky na zmenené podmienky prostredia648-650. Salmonely patria medzi fakultatívne intracelulárne patogény. Z hľadiska vzniku systémových infekcií, ktoré majú ťažší, niekedy až fatálny priebeh, predstavujú pre človeka a zvieratá najväčšie riziko tzv. primárne patogénne salmonely, kam patria hostiteľsky špecifické a hostiteľsky adaptované sérovary (Tab. 6.31). Hostiteľsky nešpecifické sérovary salmonel sú pôvodcami salmonelóz (gastroenteritíd) človeka a zvierat. Salmonelóza človeka patrí medzi alimentárne zoonózy. Salmonelová infekcia je vždy výsledkom koordinácie expresie mnohých génov virulencie prítomných najmä na ostrovoch patogenity alebo plazmidoch virulencie. Prvým predpokladom salmonelovej infekcie je prežitie salmonel v kyslom prostredí žalúdka po ich ingescii. Salmonely majú niekoľko možností ako odpovedať na kyslé prostredie žalúdka alebo ako opraviť poškodenie spôsobené nízkym pH. Schopnosť salmonel prežívať v kyslom prostredí sa nazýva tolerancia na kyslé prostredie (ATR = Acid Tolerance Response)651,652. V princípe existujú dva systémy tolerancie alebo dva typy odpovede na kyslé prostredie. Prvý systém je indukovaný počas exponenciálnej fázy rastu bakteriálnej bunky a je spojený s expresiou viac ako 50 tzv. stresových proteínov a ďalších faktorov regulácie, vrátane RpoS, Fur a PhoPQ. Druhý systém je indukovaný počas tzv. na RpoS nezávislej stacionárnej fázy rastu bakteriálnej bunky a je regulovaný OmpR/EnvZ649. 374

Druhým predpokladom salmonelovej infekcie je kolonizácia intestinálneho traktu a invázia epiteliálnych buniek čreva. Salmonely prioritne kolonizujú M bunky Peyerových plakov v distálnej časti tenkého a proximálnej časti hrubého čreva. Predpokladom kolonizácie intestinálneho traktu a invázie epiteliálnych buniek čreva je adherencia, invázia, maturácia vezikúl obsahujúcich salmonely a replikácia salmonel. Na adherencii S. Typhimurium k epiteliálnym bunkám čreva sa podieľajú fimbriálne aj nefimbriálne adhezíny kódované ostrovmi patogenity SPI-3, SPI-4, SPI-6, SPI-9, SPI-12 a SPI- 16, najmä však Pef, Agf a Lpf fimbrie639,640,641. Na invázii epiteliálnych buniek čreva S. Typhimurium sa podieľa SPI-1 so svojím sekrečným systémom T3SS-1 a jeho efektorovými proteínmi, ktoré zabezpečia prestavbu cytoskeletu enterocytov tak, aby došlo k „nariaseniu“ membrány enterocytov a následnej makropinocytóze bakteriálnych buniek653. Salmonely po invázii epiteliálnych buniek ostávajú uzavreté vo vezikule označenej ako „salmonely obsahujúca vezikula“ (SCV = Salmonella Containing Vesicle), ktorá je tvorená z „nariasenej“ membrány enterocytu a prechádza „vývojom“ od raného po neskoré štádium, ktoré dosiahne maturáciou654. Niekoľko hodín po invázii salmonel dochádza vo vezikule k ich replikácii a následne k navodeniu apoptózy hostiteľskej bunky a uvoľneniu salmonel do prostredia. Po prekonaní epiteliálnej bariéry a usmrtení hostiteľských buniek môžu salmonely pomocou fagocytujúcich buniek lymfatického systému prenikať ďalej do vnútorných orgánov a vyvolať systémovú infekciu. Intracelulárne prežitie v makrofágoch im zabezpečí sekrečný systém T3SS-2 a jeho efektorové proteíny611,612. 6.3.15 Rod Shigella Zástupcovia rodu Shigella sú Gram-negatívne, fakultatívne anaeróbne, rovné, nepohyblivé tyčinky o veľkosti 0,7 – 1,0 × 1,0 – 3,0 μm. Môžu byť usporiadané jednotlivo, v pároch alebo v krátkych retiazkach. V súčasnosti do rodu Shigella patrí S. boydii, S. dysenteriae, S. flexneri a S. sonnei. Rod Shigella je pomenovaný na počesť Kiyoshiho Shighu (1870 – 1957), japonského lekára a bakteriológa, ktorý v roku 1897 objavil Bacillus dysentericus (teraz S. dysenteriae), pôvodcu dyzentérie človeka. Po ňom je pomenovaný aj tzv. Shiga toxín. Zástupcovia rodu Shigella sú pôvodcami šigelózy človeka a primátov. Šigelóza sa vyskytuje celosvetovo, najmä v rozvojových krajinách s nízkym hygienickým štandardom a nedostatočným zdravotným zabezpečením. 375

Na Slovensku je pri šigelóze najčastejšie izolovaná S. sonnei (50 – 90 %) a S. flexneri (10 – 40 %). Nákaza prebieha väčšinou vo forme miernej kolitídy. S. dysenteriae sa na Slovensku vyskytuje vzácne, obdobne aj S. boydii a väčšinou sú na naše územie importované. S. boydii sa vyskytuje hlavne na indickom subkontinente. Šigelóza Šigelóza, nazývaná tiež bacilárna dyzentéria alebo bacilárna úplavica, je vysokonákazlivé črevné ochorenie postihujúce distálnu časť hrubého čreva. Bacilárna dyzentéria bola od najstarších dôb obávaným ochorením a zmienku o úplavici nachádzame už v Ebersovom papyruse, egyptskom lekárskom pojednaní o chorobách, ich liečení a receptoch zo 16. storočia pred n. l. Túto nákazu popísal Hippokrates (asi 460 – 370 pred n. l.) a po ňom veľa ďalších klasikov lekárskej vedy. V starom arabskom lekárstve sa tradovali poznatky Avicenu (980 – 1037). Bacilárna dyzentéria sa šírila epidemicky v dobách vojnových a patrila medzi ochorenia s vysokou úmrtnosťou. Najväčšia epidemická vlna sa prehnala Európou v roku 1538. Infekcia sa prejavuje zvýšenou teplotou, bolesťou brucha, bolestivým nutkaním na stolicu, vodnatou stolicou s prímesou hlienu a krvi, vracaním a celkovou slabosťou. Bacilárnu dyzentériu môže vyvolať ktorýkoľvek zo zástupcov rodu Shigella. Závažnosť ochorenia je ovplyvnená vekom, výživným stavom pacienta, druhom a sérotypom etiologického agensa a veľkosťou infekčnej dávky. Môže prebiehať od miernej kolitídy s vodnatou hnačkou až po ťažkú formu dyzentérie s celkovým postihnutím organizmu. Najťažšia forma bacilárnej dyzentérie je vyvolaná S. dysenteriae sérotypu 1 v dôsledku produkcie Shiga toxínu. Navyše, k infekcii S. dysenteriae sérotypu 1 dochádza už pri veľmi nízkej infekčnej dávke, ktorá predstavuje 10 – 100 mikroorganizmov. Pri S. sonnei a S. flexneri predstavuje infekčná dávka 100 – 200 mikroorganizmov. Jedno z možných vysvetlení takejto nízkej infekčnej dávky je schopnosť šigel prežívať pri nízkom pH prostredia, ktoré je v žalúdku. Väčšina virulentných kmeňov prežíva minimálne dve hodiny pri pH 2,5. Pri kmeňoch S. sonnei bola popísaná aj asymptomatická forma infekcie. Medzi komplikácie šigelovej infekcie patrí akútna nedostatočnosť obličiek pri poškodení cievneho endotelu glomerulov Shiga toxínom (hemolyticko-uremický syndróm) a reaktívna artritída. Život ohrozujúca môže byť aj rýchla dehydratácia a perforácia steny hrubého čreva. Nákaza sa prenáša buď fekálno-orálnou cestou („špinavými rukami“), prípadne priamo z človeka na človeka alebo pitím, resp. konzumáciou fekálne kontaminovanej vody alebo potravín. Nákaza sa môže preniesť aj kontaminovanými predmetmi. Epidémie šigelózy sú 376

spájané predovšetkým s kolektívmi žijúcimi v tesnom kontakte, v malom priestore a za nízkych hygienických a sociálnych podmienok. Niekedy i bez základného hygienického a sociálneho zázemia, akým je kanalizácia, toalety, pitná voda. I z uvedeného dôvodu sa epidémie šigelózy vyskytujú častejšie v školských kolektívoch, opatrovateľských ústavoch, stanových táboroch, núdzových ubytovniach, azylových domoch, vo väzniciach, psychiatrických zariadeniach a v marginalizovaných rómskych komunitách. Rizikovú skupinu predstavujú deti do 5 rokov, cestovatelia a homosexuálne orientovaní muži. Epidemiologicky závažné sú infekcie ľudí, ktorí prichádzajú do styku s potravinami. Zvlášť, ak vezmeme do úvahy, že šigely sú vylučované stolicou počas 4 týždňov od vzplanutia infekcie. Faktory virulencie zástupcov rodu Shigella V súvislosti s virulenciou zástupcov rodu Shigella sa hovorí o evolúcii patogénnych šigel alebo o evolúcii šigelovej virulencie z apatogénneho Escherichia coli predchodcu. Pritom bakteriálna evolúcia je ponímaná ako dynamický proces, počas ktorého bakteriálna bunka v procese horizontálneho prenosu genetickej informácie gény nielen nadobúda, ale ich aj pri delécii stráca. Medzi významné výsledky evolúcie faktorov virulencie Shigella spp. patrí vytvorenie ostrovov patogenity a získanie veľkého plazmidu virulencie. Ostrovy patogenity (virulencie) vznikali po horizontálnom prenose veľkých mobilných celkov nesúcich gény virulencie a ich následnej inkorporácii do chromozómu apatogénneho Escherichia coli predchodcu. Naopak, v procese evolúcie šigelovej virulencie, šigely stratili gény z apatogénneho Escherichia coli predchodcu, ktoré neboli nevyhnutné pre ich intracelulárny parazitizmus. Napr. gény pre syntézu bičíkov alebo gény pre syntézu fimbrií, prípadne ďalšie gény, ktoré by im bránili v ich virulencii. Navyše, strata týchto povrchových štruktúr, ktoré majú antigénny charakter, minimalizuje kontakt bakteriálnej bunky so zložkami imunitného systému hostiteľa. Adaptáciou zástupcov rodu Shigella na intracelulárny parazitizmus došlo u nich v porovnaní s avirulentným laboratórnym kmeňom Escherichia coli K-12 k strate v priemere viac ako 700 génov. Navyše, v každom kmeni šigel je ďalších viac ako 200 tzv. pseudogénov. I z uvedeného dôvodu pri šigelách sa hovorí o faktoroch virulencie, ktoré sú kódované génmi ostrovov patogenity, o faktoroch virulencie, ktoré sú kódované stx génmi na chromozóme a o faktoroch virulencie, ktoré sú kódované génmi veľkého plazmidu virulencie. Faktory virulencie šigel sú najviac študované pri S. flexneri. 377

a) Faktory virulencie Shigella spp. kódované génmi ostrovov patogenity (virulencie) V Tab. 6.34 sú uvedené faktory virulencie Shigella spp., ktoré sú kódované génmi ostrovov patogenity (virulencie) nesené na genómovej (chromozomálnej) DNA. K najvýznamnejším z nich patrí cytopatická proteáza, serínová proteáza (mucináza), enterotoxín ShET1, produkcia a transport aerobaktínu, lipopolysacharid a na nie poslednom mieste efluxový systém a tvorba enzýmov, ktoré zabezpečujú rezistenciu voči viacerým antibiotikám. - šigelové enterotoxíny: Zástupcovia rodu Shigella môžu produkovať dva enterotoxíny: šigelový enterotoxín 1 (ShET1) a šigelový enterotoxín 2 (ShET2). Šigelový enterotoxín ShET1 je kódovaný na SHI-1génmi set1A a set1B a je prítomný pri všetkých kmeňoch S. flexneri sérotypu 2a. Šigelový enterotoxín ShET2 je kódovaný génom sen/ospD3 na veľkom plazmide virulencie a je prítomný pri mnohých, ale nie všetkých sérotypoch Shigella spp. V priebehu šigelovej infekcie dochádza k produkcii obidvoch toxínov v jejune, bez invázie šigel do epiteliálnych buniek čreva, čo je sprevádzané vodnatou hnačkou. - cytopatická proteáza: SigA, imunoglobulínu A podobná cytopatická proteáza, je cytopatickým toxínom. Spolu s enterotoxínom ShET1 a ShET2 vyvoláva akumuláciu tekutiny v čreve. - schopnosť získavať železo: Zástupcovia rodu Shigella majú schopnosť získavať železo pomocou aerobaktínu, endogénne produkovaným siderofórom hydroxamátového typu. Navyše, železo získavajú aj väzbou na citrát. - lipopolysacharid (LPS): Lipopolysacharid šigel je kľúčovým faktorom virulencie, nakoľko imunita voči zástupcom rodu Shigella je sérotypovo špecifická. A relatívne veľký, navyše, stále sa rozrastajúci počet sérotypov jednotlivých sérologických skupín šigel, zodpovedá zmenám v jeho chemickom zložení. Modifikácia O antigénu a zmena jeho sérotypu je zároveň aj jedna z možností ako sa vyhnúť imunitnému systému hostiteľa. 378

- antibiotikorezistencia: Rezistencia na niektoré antibiotiká, či už zabezpečovaná efluxovým systémom alebo ich enzymatickou degradáciou, vedie v konečnom dôsledku k vytváraniu polyrezistentných kmeňov (Tab. 6.34). Tab. 6.34 Faktory virulencie Shigella spp. kódované génmi ostrovov patogenity Ostrov patogenity Gén/Gény Biochemická aktivita Funkcia spojená s (virulencie) virulenciou Shigella spp. sigA SigA – imunoglobulínu A Cytopatický toxín, akumulácia SHI-1 pic podobná cytopatická intestinálnej tekutiny. (SHI = Shigella proteáza pathogenicity island) Pic – serínová proteáza, Permeabilizácia sliznice, mucináza rezistencia voči séru, hemaglutinácia. set1A, set1B Enterotoxín ShET1 Akumulácia intestinálnej tekutiny, vznik vodnatej hnačky. SHI-2 iucABCD, iutA Produkcia a transport Získavanie železa. siderofóru (aerobaktín) shiD Nie je známa Imunita voči kolicínu I a V. SHI-3 iucABCD, iutA Produkcia a transport Získavanie železa. (Iba u S. boydii) siderofóru (aerobaktín) SHI-O gtrA, gtrB, gtrV Modifikácia O-antigénu, Vyhnutie sa imunitnej zmena sérotypu odpovedi hostiteľa. SRL fecABCDE, fecE, Príjem dicitrátu železitého Získavanie železa viazaného (SRL = Shigella fecI, fecR na citrát. resistance locus) tetABCD, tetR Efluxový systém Rezistencia k tetracyklínu. cat Acetyltransferáza oxa-1 β-laktamáza Rezistencia aadA1 Adenyltransferáza k chloramfenikolu. Rezistencia k ampicilínu. Rezistencia k streptomycínu. b) Faktory virulencie Shigella spp. kódované stx génmi na chromozóme Významným faktorom virulencie zástupcov rodu Shigella a enterohemoragických Escherichia coli (EHEC) je produkcia Shiga toxínov. Produkcia Shiga toxínov je kódovaná stx génmi, ktoré sú u S. dysenteriae lokalizované na chromozóme a u EHEC na aktívnych alebo kryptických lambdoidných profágoch. Shiga toxín (Stx) je členom tzv. rodiny Shiga toxínov. Je produkovaný S. dysenteriae sérotypu 1 a príležitostne aj S. sonnei a S. dystenteriae sérotypu 4. Tento toxín má enterotoxický, neurotoxický a cytotoxický účinok. Doposiaľ neboli popísané žiadne varianty Shiga toxínu produkovaného zástupcami rodu Shigella. Ďalšie informácie o Shiga toxínoch sú uvedené v časti o enterohemoragických E. coli. 379

c) Faktory virulencie Shigella spp. kódované veľkým plazmidom virulencie I keď patogenéza a klinické prejavy šigelózy sú výsledkom komplexu všetkých faktorov virulencie, dôležitá časť molekulových mechanizmov podieľajúcich sa na invázii a intracelulárnom prežívaní šigel je kódovaná na veľkom plazmide virulencie. Veľkým plazmidom virulencie o molekulovej hmotnosti 220 kb sú vybavení všetci zástupcovia rodu Shigella a enteroinvazívne kmene E. coli (EIEC). Tieto plazmidy sú vo všeobecnosti označované ako pINV plazmidy a pozostávajú z asi 100 génov. Na 31 kb segmente pINV plazmidu, ktorý sa nazýva „vstupná“ alebo „invazívna“ oblasť, je uložený súbor 34 génov, ktoré zabezpečujú syntézu sekrečného systému typu III a ďalších asi 25 efektorových bielkovín, ktoré zabezpečujú inváziu epiteliálnych buniek hrubého čreva, smrť makrofágov v subepiteliálnej oblasti hrubého čreva, intracelulárne prežívanie a aktínom sprostredkovanú intracelulárnu motilitu v enterocytoch hrubého čreva. Na veľkom plazmide virulencie je kódovaná aj produkcia šigelového enterotoxínu ShET2. Zástupcovia rodu Shigella sú fakultatívne intracelulárne parazity, pričom prvá, neinvazívna fáza infekcie, je spojená iba s pôsobením šigelových enterotoxínov ShET1 a ShET2 v jejune a je sprevádzaná vodnatou hnačkou. Druhá, invazívna fáza infekcie nastupuje po kolonizácii distálnej časti hrubého čreva. Invázia šigel cez vrstvu epiteliálnych buniek hrubého čreva sa uskutočňuje transepitelovým prestupom pomocou M buniek Peyerových plakov. Transcytózou prenesené bakteriálne bunky sú následne v subepiteliálnej vrstve hrubého čreva pohltené makrofágmi, následkom čoho makrofágy podliehajú pyroptóze (programovaná bunková smrť), ktorá na rozdiel od apoptózy nie je spojená iba s deštrukciou makrofágov a uvoľnením šigel, ale je sprevádzaná aj uvoľnením prozápalových cytokínov typu IL-1β a IL-18. Navyše, ako odpoveď na šigelovú infekciu produkujú monocyty TNF-α, ďalší cytokín, ktorý prispieva k deštruktívnym zápalovým zmenám. Z makrofágov uvoľnené šigely aktívne invadujú enterocyty tým, že pomocou sekrečného systému typu III injikujú invazíny a ďalšie efektorové molekuly (IpaA, IpaB, IpaC, IpgB1, IpgD a VirA) do enterocytov, čo im umožní endocytózou preniknúť do enterocytu z bazolaterálneho povrchu, následne sa z endocytickej vakuoly uvoľniť a replikovať sa v cytoplazme enterocytu. Pomocou IcsA (VirG), efektorového proteínu sekrečného systému typu III, dochádza k polymerizácii aktínu hostiteľskej bunky a tvorbe polárne umiestnených aktínových bičíkov na povrchu bakteriálnej bunky. Aktínové bičíky nezabezpečujú šigelám iba intracelulárny pohyb v enterocytoch, ale aj transverzálny (priečny) prestup šigel cez bunkovú stenu dvoch susedných enterocytov (z bunky infikovanej do bunky neinfikovanej). Aktínová motilita je základným mechanizmom patogenézy šigelovej infekcie. Navyše, prítomnosť 380

šigelového lipopolysacharidu v enterocytoch vedie k aktivácii NF-κB (Nukleárny faktor-κB) a produkcii IL-8. Uvoľnenie IL-8 a prozápalových cytokínov typu IL-1β a IL-18 má okrem iného za následok migráciu polymorfonukleárov do subepiteliálneho priestoru a ich následnú transepitelovú migráciu. Transepitelová migrácia polymorfonukleárov medzi dvoma susednými enterocytmi smerom od bazálnej k apikálnej časti enterocytov má za následok porušenie integrity medzi dvoma susednými enterocytmi a vytvorenie voľnej cesty pre prestup šigel z lúmenu čreva priamo do jeho subepiteliálnej časti. S. flexneri má schopnosť prenikať do submukózy medzi dvoma susednými enterocytmi i bez predchádzajúceho narušenia ich spojenia polymorfonukleármi. Patologické zmeny pri šigelóze postihujú iba epiteliálnu a subepiteliálnu časť čreva, čo sa podľa rozsahu zmien prejaví nekrózou a ulceráciami epiteliálnej vrstvy a klinicky výskytom hlienu, prípadne krvi v stolici pri erózii krvných kapilár. Pri šigelóze je vzácny hlbší prienik šigel do tkaniva, prípadná bakteriémia alebo systémové ochorenie. 6.3.16 Rod Yersinia Zástupcovia rodu Yersinia sú Gram-negatívne, fakultatívne anaeróbne, rovné tyčinky alebo kokobacily o veľkosti 0,5 – 0,8 × 1,0 – 3,0 μm. Môžu byť usporiadané jednotlivo, vo dvojiciach, v zhlukoch alebo tvoria krátke retiazky. Netvoria kapsulu a sú pohyblivé iba pri teplote 30 °C a nižšej. Pri teplote 37 °C sú nepohyblivé. Výnimkou je Y. pestis, ktorá je nepohyblivá stále a Y. ruckeri, pri ktorej existuje nepohyblivý a lipáza negatívny biotyp 2248. Pomenovanie rodu je po Alexandre Emile Jean Yersinovi (1863 – 1943), švajčiarskom lekárovi a bakteriológovi francúzskeho pôvodu. A. E. J. Yersin z Pasteurovho ústavu v Paríži bol v roku 1894 na poverenie francúzskeho ministra pre koloniálne záležitosti vyslaný do Hongkongu, aby sa venoval výskumu epidémie moru. V tom istom roku tu objavuje Bacterium pestis (teraz Yersinia pestis), pôvodcu moru. Rod Yersinia má v súčasnosti 26 druhov655. Najväčší medicínsky význam má Y. enterocolitica, Y. pestis a Y. pseudotuberculosis (Tab. 6.35). Y. enterocolitica je saprofytom vonkajšieho prostredia a súčasťou črevného obsahu viacerých cicavcov. Je potenciálnym patogénom človeka a viacerých druhov zvierat a prenáša sa alimentárne. Y. pseudotuberculosis je taktiež schopná saprofytického spôsobu života, o čom svedčí jej zachovaná motilita a schopnosť rastu pri nízkych teplotách. 381

Tab. 6.35 Najvýznamnejší zástupcovia rodu Yersinia a s nimi spojené choroby človeka a zvierat Zástupca rodu Hostiteľ Choroba Prenos Prameň Yersinia Človek Bubonická, septická alebo Poštípanie infekcie Y. pestis pľúcna forma moru. blchami, Latentne infikované pohryzenie hlodavce Hlodavce Silvatický mor. krysou. Latentne Mačky Obyčajne latentná forma moru Poštípanie infikované hlodavcov s občasným hlodavce vzplanutím choroby. blchami, Latentne Felinný mor. ingesciou infikované Vyskytuje sa u mačiek hlodavce v endemických oblastiach alebo a najčastejšie sa prejavuje inhaláciou. lymfadenitídou mandibulárnych lymfatických uzlín, horúčkou, Ingesciou depresiou, anorexiou, kýchaním infikovaných a niekedy aj nervovými príznakmi. Väčšinou má hlodavcov u postihnutých zvierat fatálny Y. enterocolitica Človek priebeh. Orálnou Ošípané sú cestou nosičmi Enterokolitída. kmeňov, ktoré Lymfadenitída mezenteriálnych sú patogénne lymfatických uzlín pre človeka (pseudoapendicitída). Najčastejšie u detí. Ovce Sporadické aborty. Subklinické črevné infekcie so Ošípané, sporadickými prípadmi enteritídy ostatné hospodárske alebo celkovej infekcie. zvieratá Zvlášť vnímavé sú jelene pri Y. pseudotuberculosis Človek farmovom chove. Orálnou Féces nosičov cestou – latentne Lymfadenitída mezenteriálnych infikovaných lymfatických uzlín. Enterokolitída (akútna ileitída), hlodavcov vzácne septikémia. a voľne Najvnímavejšie sú deti a mladí žijúcich vtákov dospelí jedinci. Ovce Orchitída a epididymitída. Hovädzí Enteritída u mladých zvierat. dobytok, Lymfadenitída mezenteriálnych ovce, kozy, lymfatických uzlín. byvoly, Sporadické aborty (hovädzí jelene pri dobytok, ovce, kozy). farmovom Subklinická infekcia u starších chove zvierat. Morčatá Pseudotuberkulóza: a ostatné a) septikemická forma, laboratórne b) klasická forma s uzlíkmi hlodavce, (pseudotuberkuly) na králiky, vnútorných orgánoch, voľne žijúce najčastejšie u morčiat vtáky a a kanárikov. vtáky žijúce vo voliérach 382

Y. pseudotuberculosis sa prenáša taktiež alimentárne ako Y. enterocolitica, ale je patogénom človeka a zvierat dobre adaptovaným na intracelulárny parazitizmus. Obdobne ako Y. pestis má afinitu k lymforetikulárnemu tkanivu656. Y. pestis je obligátnym patogénom a nevyskytuje sa v prírode v saprofytickej forme. Neprenáša sa alimentárnou cestou, ale pomocou vektora alebo aerogénnou cestou. Nie je viazaná na gastrointestinálny trakt, ale primárne infikuje lymforetikulárne tkanivo657. Uvedení traja zástupcovia rodu Yersinia majú však niekoľko spoločných vlastností, predovšetkým: a) charakter fakultatívnych intracelulárnych patogénov; b) tropizmus k lymfoidnému tkanivu; c) rezistenciu voči nešpecifickej imunitnej odpovedi a fagocytóze makrofágmi; d) schopnosť vytvárať extracelulárne kolónie v tkanivách; e) prítomnosť plazmidov virulencie; f) prítomnosť ostrovov patogenity zabudovaných do chromozómu a označených ako HPI (HPI = High Pathogenicity Island); g) prítomnosť proteínov vonkajšej membrány označených ako Yops (Yops = Yersinia outer membrane proteins); h) rezervoárové zvieratá, z ktorých sú prenášaní na človeka buď priamou alebo nepriamou cestou. Y. enterocolitica a Y. pseudotuberculosis sú považované za enteropatogénne yersínie658-660. Infekcie vyvolané Y. enterocolitica a Y. pseudotuberculosis patria medzi alimentárne zoonózy a sú vyvolané kontaminovanou potravou alebo vodou660. Mor Mor nie je dodnes eradikovanou nákazou a táto infekcia je stále celosvetovou hrozbou661. Príkladom toho nie je iba ostatná epidémia moru, ktorá vypukla v roku 1994 v Indii, ale aj skutočnosť, že i dnes sa ročne morom nakazí okolo 2 500 ľudí662. Mortalita medzi nakazenými sa v súčasnosti pohybuje medzi 5 – 15 %. Pôvodcom moru človeka a silvatických (z lat. silva = les) foriem moru zvierat je Y. pestis663. Y. pestis je sérologicky uniformná, nakoľko stratila schopnosť vytvárať kompletný lipopolysacharid, a tým aj O-antigén. Z uvedeného dôvodu nestanovujeme pri Y. pestis sérotypy alebo sérovary664. 383

Na základe schopnosti redukovať dusičnany na dusitany, ako aj na základe schopnosti fermentovať glycerol a melobiózu, sa kmene Y. pestis delia do štyroch biotypov alebo biovarov: Antiqua, Medievalis, Orientalis a Microtus665-667. Biotyp Microtus je najbližšie príbuzným k Y. pseudotuberculosis. Mor je nákazou s prírodnou ohniskovosťou. Obdobne ako ostatné yersiniózy, aj mor je zoonózou, ktorá primárne postihuje hlodavce. Hlodavce sú zároveň aj rezervoárovými zvieratami. Mor sa medzi hlodavcami prenáša ingesciou alebo inhaláciou, ale najdôležitejší je medzi nimi prenos vektorom (blchou). Blcha sa infikuje cicaním krvi nakazeného hlodavca a Y. pestis sa pomnoží v jej intestinálnom trakte663,667. Udržanie moru v ekosystéme je absolútne závislé na prenose Y. pestis medzi hlodavcami a blchami a človek z pohľadu dlhodobého udržania Y. pestis v ekosystéme nemá žiadnu úlohu663. Hovoríme o endemickej alebo silvatickej forme moru668. Endemický mor je prirodzeným ohniskom a prameňom infekcie Y. pestis669. Vyskytuje sa v polopúštnych oblastiach všetkých svetadielov s výnimkou západnej Európy a Austrálie. Medzi krajiny, kde sa endemická forma moru vyskytuje trvale, patrí Brazília, Demokratická republika Kongo, Madagaskar, Mjanmarsko (bývalá Barma), Peru, USA a Vietnam. Toto sú zároveň aj krajiny, z ktorých sú každoročne hlásené menšie alebo väčšie epidémie moru človeka661,670. Pri epidemickej forme moru je Y. pestis prenášaná na človeka, najmä blchami z hlodavcov. K infekcii človeka môže dôjsť aj po pohryzení alebo poškrabaní hlodavcami, prípadne inhaláciou infekčného aerosólu. Dnes je väčšina prípadov výskytu moru človeka výsledkom jeho kontaktu s voľne žijúcimi zvieratami (najmä hlodavcami) pri silvatickej forme moru, na rozdiel od minulosti, keď epidémie moru s následnými pandémiami vznikali importovaním infikovaných potkanov na palubách lodí z endemických oblastí výskytu moru670,671. Na svete je známych asi 2 500 druhov bĺch a doposiaľ u viac ako 30 druhov z nich bola potvrdená schopnosť prenášať Y. pestis672. Ako hlavný vektor tretej pandémie moru bola identifikovaná Xenopsylla cheopis, nazývaná tiež ako morová blcha, čo je orientálny alebo tropický druh potkanej blchy, ktorá sa v stredovekej Európe pravdepodobne nevyskytovala. Vyskytovali sa tu však iné druhy bĺch. Len na území Slovenska ich v súčasnosti žije do 100 druhov. I keď, napr. potkania blcha (Nosopsyllus fasciatus) na človeku prakticky neparazituje a mačacia blcha (Ctenocephalides felis) spolu so psou (Ctenocephalides canis) a ľudskou blchou (Pulex irritans) sa za dobrých vektorov Y. pestis nepovažujú673. I napriek uvedenému ich podiel, prípadne mnohých iných druhov, na stredovekom more, vylúčiť nemôžeme, nakoľko podľa dobových záznamov sa druhá pandémia moru šírila aj šatstvom, teda ľudskou blchou. 384

K infekcii Y. pestis sú vnímavé aj mačky, ktoré v endemických oblastiach výskytu moru môžu byť zdravotným rizikom pre človeka674. U človeka a vnímavých zvierat môže mať mor tri formy: bubonickú, septickú alebo pneumonickú661. Bubonická (žľazová) forma je najčastejšou formou moru človeka a vzniká po poštípaní blchou. Nákaza začína horúčkou s teplotami 39 – 40 °C, zimnicou, triaškou a bolesťami hlavy. Zároveň alebo v priebehu niekoľkých hodín dochádza v mieste poštípania blchou k zápalu lymfatických ciev a uzlín, čo sa prejaví ich zväčšením, obvykle v slabine, podpazuší alebo na krku. Zdurené lymfatické uzliny prominujú cez načervenalú a horúcu kožu, sú bolestivé a nejavia známky fluktuácie. Pneumonická (pľúcna) forma moru sa môže vyvinúť po preniknutí Y. pestis hematogénnou cestou do pľúc pri generalizovanej bubonickej alebo septickej forme moru. Ide o sekundárnu pneumonickú formu moru. Primárna pneumonická forma nastáva priamou inhaláciou Y. pestis v infekčnom aerosóle. Pri primárnej i sekundárnej pneumonickej forme moru môže dôjsť k interhumánnemu prenosu infekcie respiračnou cestou. Pneumonická forma moru klinicky prebieha po krátkej, 1 – 3-dňovej inkubačnej dobe, ako ťažká forma pneumónie675. Septická forma moru sa väčšinou vyvinie hematogénnou cestou pri generalizovanej bubonickej forme moru. Niekedy sa môže vyvinúť aj bez lymfadenopatie676,677. Medzi vzácne formy moru patrí faryngelálny a gastrointestinálny mor, ktorý sa môže vyskytnúť u ľudí po konzumácii surového alebo nedostatočne tepelne opracovaného mäsa živočíšneho pôvodu kontaminovaného Y. pestis678-680. S infekciami Y. pestis sa spája aj kožná forma moru, meningitída a endoftalmitída671. V súčasnosti sa mor v celej Európe nevyskytuje. Sú však každoročne hlásené prípady výskytu moru z Južnej a Severnej Ameriky, Južnej a Juhovýchodnej Ázie a z Afriky. Yersinióza Yersinióza je treťou najčastejšie hlásenou bakteriálnou zoonózou v EÚ681. V našich podmienkach majú na nej najväčší podiel infekcie vyvolané Y. enterocolitica, najmä sérovary O:3 (prevažný zdroj ošípaná), O:5, O:8, O:9 (prevažný zdroj hovädzí dobytok), Y. kristensenii a Y. frederiksenii. K prenosu infekcie na človeka dochádza najčastejšie pri konzumácii nedostatočne tepelne upraveného kontaminovaného mäsa, nepasterizovaného mlieka, mliečnych výrobkov a zeleninových šalátov. 385

Klinické kritériá ochorenia spĺňa každá osoba, ktorá má aspoň jeden z piatich príznakov: horúčka, hnačka, zvracanie, bolesť brucha a bolestivé nutkanie na stolicu. Y. enterocolitica bola prvýkrát popísaná v roku 1939 ako Bacterium enterocoliticum a v súčasnosti má dva poddruhy: Y. enterocolitica subsp. enterocolitica a Y. enterocolitica subsp. palearctica. Kmene Y. enterocolitica sú na základe biochemických a ďalších vlastností rozdelené do 6 biotypov: 1A, 1B, 2, 3, 4 a 5656,682. Kmene biotypu 1A sú apatogénne656. Kmene ostatných biotypov sú patogénne pre človeka a zvieratá. Biotypy sa od seba vzájomne líšia prítomnosťou plazmidov virulencie a ostrovov patogenity (Tab. 6.36). Tab. 6.36 Biotypy Y. enterocolitica Biotyp Stupeň virulencie Plazmid virulencie (pYV)a Ostrov patogenity (HPI)b Neprítomný Neprítomný 1A Avirulentné kmene Prítomný Prítomný Prítomný Neprítomný 1B Vysoko virulentné kmene Prítomný Neprítomný Prítomný Neprítomný 2 Virulentné kmene Prítomný Neprítomný 3 Virulentné kmene 4 Virulentné kmene 5 Virulentné kmene a – pYV = plasmid Yersinia Virulence b– HPI = High Pathogenicity Island Kmene Y. enterocolitica subsp. enterocolitica patria do biotypu 1B a sú vysoko virulentné. Sú tiež označované ako kmene severoamerické. Kmene Y. enterocolitica subsp. palearctica patria do biotypov 1A, 2, 3, 4 a 5 a tieto sa vyskytujú celosvetovo. Na základe charakteru lipopolysacharidového O antigénu je pri Y. enterocolitica známych 76 sérovarov (O:1 – O:76). Pre človeka sú patogénne predovšetkým sérovary O:3, O:5, O:8, O:9, O:13 a O:27. Väčšina európskych kmeňov, ktoré sú pôvodcami infekcií ľudí, patrí k sérovaru O:3 (biotyp 4) a O:9 (biotyp 2). V USA je najčastejším sérovarom O:8 (biotyp 1B). Nosičmi kmeňov Y. enterocolitica, ktoré sú patogénne pre človeka, sú najčastejšie ošípané683. Medzi ďalšie rezervoárové zvieratá Y. enterocolitica patrí hovädzí dobytok, ovce, zajace, hlodavce. Infekcia vyvolaná Y. enterocolitica prebieha asi v dvoch tretinách prípadov ako enterokolitída s horúčkou, bolesťami brucha a hnačkou s prímesou krvi a hlienu. Asi v 15 % prípadov je sprevádzaná zvracaním. Inkubačná doba je 3 – 7 dní a celý priebeh infekcie nie je dlhší ako 7 – 10 dní. 386

U detí a mladých jedincov môže byť Y. enterocolitica príčinou mezenteriálnej lymfadenitídy a/alebo ileitídy, prípadne, veľmi vzácne u starých a imunodeficientných osôb, príčinou bakteriémie s následnou sepsou alebo vytvorením metastatických ložísk v iných orgánoch. Medzi postinfekčné komplikácie patrí asi v 30 % erythema nodosum, najmä u žien, ktorá vzniká asi do troch týždňov od začiatku ochorenia a reumatoidná artritída, ktorá môže postihnúť 10 – 30 % pacientov po niekoľkých dňoch až štyroch týždňoch od ukončenia hnačky659,684. Infekcie vyvolané Y. pseudotuberculosis Y. pseudotuberculosis bola prvýkrát izolovaná v roku 1883 u morčiat z nálezu, ktorý bol podobný tuberkulóze. Najbližšie príbuzná Y. pseudotuberculosis je Y. pestis. Na základe výsledkov DNA hybridizácie sú genómy Y. pseudotuberculosis a Y. pestis takmer identické, nakoľko vykazujú viac ako 90 % zhodu685-687. Na základe genetických štúdií bolo zistené, že Y. pestis je nedávno (1 500 – 20 000 rokov) vytvoreným klonom Y. pseudotuberculosis subtypu O:1b v dôsledku straty veľkého počtu génov zodpovedných za enteropatogénnu virulenciu685. Z hľadiska taxonomických pravidiel, by sa malo jednať o jeden druh (Y. pseudotuberculosis) s dvoma poddruhmi (Y. pseudotuberculosis subsp. pseudotuberculosis a Y. pseudotuberculosis subsp. pestis). Z hľadiska dodržiavania maximálnej bezpečnosti pri práci s kmeňmi Y. pestis sa urobila taxonomická výnimka a je i naďalej zachované druhové pomenovanie pre Y. pseudotuberculosis a Y. pestis. I napriek veľmi blízkej genetickej príbuznosti vyvolávajú Y. pseudotuberculosis a Y. pestis rôzne choroby s rôznymi epidemiologickými cyklami. Y. pseudotuberculosis je buď komenzálom alebo patogénom zvierat, najmä vtákov a hlodavcov, príležitostne aj domácich zvierat (najmä ošípaných)688-690. Je taktiež izolovaná z potravín a vody690,691. Človek nie je primárnym hostiteľom Y. pseudotuberculosis (Tab. 6.35). K jeho infekcii dochádza najmä konzumáciou kontaminovaných potravín alebo vody692. Infekcia Y. pseudotuberculosis môže u človeka prebiehať od miernej gastroenteritídy až po systémovú infekciu spojenú s mezenteriálnou lymfadenitídou a rizikom sepsy693,694. Infekcia Y. pseudotuberculosis je veľmi často sprevádzaná výskytom postinfekčných komplikácií (erythema nodosum, artritída, iritída, nefritída)695,696. V Európe sa infekcia ľudí Y. pseudotuberculosis vyskytuje iba sporadicky, najčastejšie vo forme gastroenteritídy, pri ktorej dochádza k spontánnemu vyliečeniu697. V Rusku a Japonsku má však infekcia ťažký systémový priebeh. Tento variant choroby sa nazýva ako „Far East scarlet-like fever“694,698,699 (Tab.6.38). 387

Klinické príznaky choroby sú závislé na faktoroch virulencie jednotlivých kmeňov Y. pseudotuberculosis688. Tab. 6.37 Genetické skupiny Y. pseudotuberculosis Genetická Skvasovanie Subtyp mitogénu Plazmid Ostrov Stupeň virulencie virulencie skupina melibiózy Y. pseudotuberculosis patogenity Virulentné kmene (pYV)b (HPI)c Virulentné kmene (YPM)a Prítomný Prítomný Virulentné kmene Prítomný Prítomný Avirulentné kmene G1 + YPMa Prítomný Prítomný Mierne virulentné Neprítomný G2 + YPMa Prítomný Neprítomný kmene Prítomná G3 + YPMa Prítomný iba časť Virulentné kmene G4 - YPMb HPI Prítomný G5 - YPMc G6 + YPMa a – YPM = Yersinia Pseudotuberculosis Mitogen b – pYV = plasmid Yersinia Virulence c – HPI = High Pathogenicity Island Na základe troch kľúčových faktorov virulencie, t. j. prítomnosti plazmidu virulencie (pYV), prítomnosti ostrova patogenity (HPI) a subtypu mitogénu Y. pseudotuberculosis (YPMa, YPMb alebo YPMc) sa kmene Y. pseudotuberculosis v súčasnosti rozdeľujú do šiestich genetických skupín (G1 – G6)688 (Tab. 6.37). Tab. 6.38 Geografické zastúpenie sérovarov a subtypov Y. pseudotuberculosis Sérovar Subtyp Izolovaný z klinických vzoriek Miesto izolácie O:1 O:1a Ánoa Európa O:1b Ánoa Európa a Ďaleký Východ O:1c Nie Ďaleký Východ O:2 O:2a Áno Európa a Ďaleký Východ O:2b Áno Európa a Ďaleký Východ O:2c Nie Ďaleký Východ O:3 Áno Európa a Ďaleký Východ O:4 O:4a Áno Ďaleký Východ O:4b Ánob Ďaleký Východ O:5 O:5a Áno Európa a Ďaleký Východ O:5b Ánob Ďaleký Východ O:6 - Áno Európa O:7 - Nie Ďaleký Východ O:8 - Nie Ďaleký Východ O:9 - Nie Ďaleký Východ O:10 - Nie Ďaleký Východ O:11 - Nie Ďaleký Východ O:12 - Nie Ďaleký Východ O:13 - Nie Ďaleký Východ O:14 - Nie Ďaleký Východ O:15 - Áno Ďaleký Východ a – Najčastejšie izolované sérovary a subtypy v Európe b – Najčastejšie izolované sérovary a subtypy na Ďalekom Východe (Rusko, Japonsko) 388

Kmene genetickej skupiny G1 – G3 a kmene genetickej skupiny G6 sú plne virulentné, vybavené plazmidom virulencie, ostrovom patogenity a subtypom mitogénu YPMa. Kmene genetickej skupiny G4 sú avirulentné bez plazmidu virulencie alebo bez ostrova patogenity, majúce subtyp mitogénu YPMb. Kmene genetickej skupiny G5 sú mierne virulentné, nesúce plazmid virulencie, čiastočne aj ostrov patogenity, majúce subtyp mitogénu YPMc. Plne virulentné kmene skvasujú melibiózu. Kmene Y. pseudotuberculosis, izolované v Európe, patria najčastejšie do genetickej skupiny G2 a kmene Y. pseudotuberculosis, izolované na Ďalekom Východe, patria najčastejšie do genetickej skupiny G3. Niekedy sa hovorí o Európskom gastroenterickom (genetická skupina G2) a Ďalekovýchodnom systémovom (genetická skupina G3) patotype Y. pseudotuberculosis. Na základe charakteru lipopolysacharidového O antigénu je pri Y. pseudotuberculosis známych 15 sérovarov (O:1 – O:15) a desať subtypov (O:1a – c, O:2a – c, O:4a – b, O:5a – b)694 (Tab. 6.38). Potenciálne patogénne sú kmene všetkých sérovarov a subtypov Y. pseudotuberculosis. Ale z klinických vzoriek boli doposiaľ izolované iba kmene sérovarov O:1 – O:6 a sérovaru O:15 s výnimkou subtypu O:1c a subtypu O:2c. Kmene sérovarov O:7 – O:14 boli izolované iba z vonkajšieho prostredia a zvierat (Tab. 6.38). Medzi najčastejšie izolované sérovary a subtypy v Európe patrí O:1a a O:1b, na rozdiel od ázijských kmeňov, kde k najčastejším sérovarom a subtypom patrí O:4b a O:5b. V Tab. 6.38 je uvedený prehľad geografického zastúpenia všetkých sérovarov a subtypov Y. pseudotuberculosis. Faktory virulencie zástupcov rodu Yersinia Faktory virulencie Y. enterocolitica, Y. pestis a Y. pseudotuberculosis sú kódované plazmidmi virulencie, ostrovmi patogenity, ktoré sú súčasťou bakteriálneho chromozómu alebo génmi ostatnej časti chromozómu663,700 (Tab. 6.39). Faktory virulencie Y. pestis Faktory virulencie Y. pestis kódované plazmidmi virulencie Pri väčšine kmeňov Y. pestis, bez ohľadu na ich biotyp alebo pôvod, sú prítomné tri plazmidy virulencie: pCD1, pFra a pPCP1700-702. 389

Plazmid pCD1 Plazmid pCD1 (označovaný tiež ako plazmid pCad, pLcr, pVW alebo pYV) je plazmidom o veľkosti 68 – 75 kb, gény ktorého kódujú sekrečný systém typu III (T3SS), proteíny vonkajšej membrány označené ako Yops (Yops = Yersinia outer membrane proteins) a faktor V, proteín vonkajšej membrány označený tiež ako LcrV (LcrV = Low calcium response virulence), ktorý má viacero funkcií702,703. Plazmid pCD1 je okrem kmeňov Y. pestis prítomný aj pri virulentných kmeňoch Y. enterocolitica a Y. pseudotuberculosis označený ako pYV (pYV = plasmid Yersinia Virulence). Tab. 6.39 Faktory virulencie Y. enterocolitica, Y. pestis a Y. pseudotuberculosis Faktory virulencie a ich lokalizácia Patogén Plazmid Y. pestis Y. enterocolitica Y. pseudotuberculosis + pCD1 (pYV) ++ + Sekrečný systém typu III (T3SS) ++ + Yops (Yops = Yersinia outer membrane proteins) + + + – proteíny vonkajšej membrány - LcrV (LcrV = Low calcium response virulence) + + - – proteín vonkajšej membrány - pFra +- - Fra 1 (Fra 1 = Fraction 1) – kapsula +- - - Ymt (Ymt = Yersinia murine toxin) +- - – yersíniový murínny toxín + pPCP1 +- + Pesticín +- - Koaguláza +- + Pla (Pla = Plasminogen activator) +- + – aktivátor plazminogénu Pla - Ostrov patogenity ++ + Yersíniobaktín – siderofór ++ + + Hms (Hms = Hemin storage) +- - – proteíny vonkajšej membrány + Ostatné časti chromozómu ++ Gsr (Gsr = Global stress requirement) + + – stresový proteín Psa A (Psa = pH 6 antigen) – fibrilárny proteín + - Ail (Ail = Attachment invasion locus) – adhezín - + Inv (Inv = Invasin) – adhezín - + Yad (Yad = Yersinia adhesin) – adhezín - + Yst (Yst = Yersinia stable toxin) – enterotoxín - + (YPM = Yersinia Pseudotuberculosis Mitogen) - - – exotoxín, mitogén Plazmid pFra Plazmid pFra (označovaný tiež ako plazmid pMT1) je plazmidom o veľkosti 100 – 110 kb, gény ktorého kódujú tvorbu kapsuly typu Fra 1 (Fra 1 = Fraction 1), nazývanú tiež ako kapsula typu Caf 1 (Caf 1 = Capsular antigen fraction 1) alebo len kapsula typu F1 390

(F1 = Fraction 1) a produkciu yersíniového murínneho toxínu označovaného tiež ako Ymt (Ymt = Yersinia murine toxin)702,704. Plazmid pFra je prítomný iba pri kmeňoch Y. pestis. Plazmid pPCP1 Plazmid pPCP1 (označovaný tiež ako plazmid pPla alebo plazmid pPst) je plazmidom o veľkosti 9,6 kb, gény ktorého kódujú bakteriocín pesticín, koagulázu a aktivátor plazminogénu Pla (Pla = Plasminogen activator)702,705. Plazmid pPCP1 je prítomný iba pri kmeňoch Y. pestis. Sekrečný systém typu III (T3SS) Sekrečný systém typu III (T3SS) je kódovaný ysc (ysc = Yop secretion apparatus) génmi, prítomnými na plazmide pCD1. T3SS zabezpečuje injikovanie efektorových proteínov (Yops a LcrV) do cieľových hostiteľských buniek. Uvedené efektorové proteíny, obdobne ako aj T3SS sú kódované plazmidom pCD1706. Yops proteíny Súbor proteínov vonkajšej membrány, označených ako Yops proteíny, predstavuje komplex najmenej 14 proteínov, ktoré sú kódované yop génmi, prítomnými na plazmide pCD1707. Yops proteíny chránia yersínie pred nešpecifickými obrannými mechanizmami hostiteľa tým, že zablokujú fagocytárnu schopnosť makrofágov a neutrofilných granulocytov, inhibujú zápalovú odpoveď, prípadne spôsobia ich smrť708. Expresia yop génov je závislá na teplote a koncentrácii Ca2+. Pri teplote 37 °C a neprítomnosti Ca2+ dochádza k maximálnej expresii a produkcii Yops proteínov. Teplota 26 °C a prítomnosť Ca2+ zastavuje expresiu yop génov a syntézu Yops proteínov. Najmenej šesť proteínov z uvedeného komplexu je injikovaných T3SS priamo do bunkovej steny alebo cytosólu eukaryotických buniek: YopB, YopD, Yop E, YopH, YopM a YopT. V dôsledku uvedenej skutočnosti dôjde v bunkovej stene infikovaných buniek v prvom kroku k tvorbe pórov, tzv. tranzitných tunelov (YopB a YopD) pre transport ďalších efektorových proteínov. Na prestavbe, resp. deštrukcii aktínového cytoskeletu fagocytujúcich buniek a zablokovaní ich fagocytárnej aktivity, vrátane ich metabolického vzplanutia sa podieľajú YopE, YopT, YopH a YopM proteíny709-713. Navyše, inhibíciou syntézy nukleárneho κB faktora zablokujú zápalovú odpoveď hostiteľa. 391

Expresia uvedených efektorových proteínov sa spúšťa iba v organizme hostiteľa (37 °C), nie však v organizme vektora (26 °C) a za neprítomnosti Ca2+, čo predstavuje prostredie cytoplazmy eukaryotických hostiteľských buniek, kde Ca2+ nie je prítomné, nakoľko je vyviazané kalcium viažucimi proteínmi, napr. kalmodulínom. LcrV proteín LcrV proteín je proteínom vonkajšej membrány, kódovaný génmi plazmidu pCD1 a expresia ktorého je obdobne ako expresia Yops proteínov závislá na teplote a koncentrácii Ca2+ 714. LcrV proteín je nápomocný pri injikovaní efektorových Yops proteínov do hostiteľskej bunky. Po injikovaní efektorových Yops proteínov do fagocytujúcich buniek blokuje syntézu prozápalových cytokínov a inhibuje chemotaxiu neutrofilov. Kapsula Kapsula je pri Y. pestis kódovaná génmi plazmidu pFra o veľkosti 100 – 110 kb. Je označovaná buď ako kapsula typu Fra 1 alebo ako kapsula typu Caf 1, prípadne len kapsula typu F1b702. Má viacero funkcií, ale medzi najdôležitejšie z nich patrí antifagocytárna aktivita a ochrana bakteriálnej bunky pred lýzou komplementom, nakoľko nedôjde k väzbe membránu atakujúceho komplexu komplementovej kaskády na stenu bakteriálnej bunky715. Na rozdiel od yersíniového murínneho toxínu, ktorý je tiež kódovaný génmi plazmidu pFra, kapsula sa tvorí iba pri teplote vyššej ako 30 °C a v priebehu infekcie cicavcov. Yersíniový murínny toxín Yersíniový murínny toxín (Ymt) je fosfolipáza D, ktorá chráni Y. pestis pred tráviacimi enzýmami blchy počas kolonizácie a tvorby biofilmu v jej proventrikule (časť tráviacej sústavy blchy medzi pažerákom a vlastným žalúdkom). Je kódovaný plazmidom pFra. Yersíniový murínny toxín sa tvorí pri teplote 26 °C, čo zodpovedá teplote vektora (blchy) Y. pestis. Jeho produkcia je však veľmi nízka pri teplote 37 °C, i keď prvé štúdie predpokladali jeho toxicitu pre myši a krysy, u ktorých mal byť príčinou cirkulačného kolapsu. I z uvedeného dôvodu bol pomenovaný ako yersíniový murínny toxín716. Pesticín Pesticín je bakteriocínom produkovaným Y. pestis s doposiaľ nie veľmi jasnou úlohou v patogenéze nákazy717,718. Je kódovaný plazmidom pPCP1. 392

Pesticín inhibuje rast Y. pseudotuberculosis sérotypu O:1 a subtypu O:1a a O:1b. Inhibuje taktiež rast vysoko invazívneho sérovaru O:8 Y. enterocolitica a niektorých klinických kmeňov Escherichia coli. Koaguláza a aktivátor plazminogénu Koaguláza spolu s aktivátorom plazminogénu Pla a pesticínom je kódovaná génmi plazmidu pPCP1. Koaguláza alebo plazmakoaguláza je enzýmom, ktorý Y. pestis tvorí iba pri teplote 26 °C počas kolonizácie a tvorby biofilmu v proventrikule sajúcej blchy. Koaguláza spôsobuje konverziu fibrinogénu na fibrín, čím dôjde k uzavretiu proventrikula. Aktivátor plazminogénu Pla je proteínom vonkajšej membrány, má proteázovú aktivitu a tvorí sa iba pri teplote 37 °C. Podieľa sa na aktivácii plazminogénu a proteolytickej aktivite voči C3 zložke komplementu, proteolýze a poškodení tkanív a na invázii epiteliálnych buniek. Aktiváciou plazminogénu pri teplote 37 °C dochádza k tvorbe plazmínu, ktorý je dôležitý pre rozpustenie fibrínu (fibrinolýza) v proventrikule blchy a v spriechodnení jej tráviacej sústavy719. Faktory virulencie Y. pestis kódované ostrovmi patogenity Ostrovy patogenity alebo pri patogénnych yersíniách nazývané tiež ako ostrovy vysokej patogenity (HPI = High Pathogenicity Island) sú súbory génov na chromozóme, ktoré pri Y. pestis kódujú biosyntézu siderofóru yersíniobaktínu a biosyntézu tzv. Hms (Hms = Hemin storage) proteínov720-722. Ostrov patogenity pre biosyntézu siderofóru yersíniobaktínu je súborom ybt (ybt = yersiniobactin) génov o veľkosti 35 kb. Ostrov patogenity pre biosyntézu Hms proteínov je súborom hms (hms = Hemin storage) génov o veľkosti 6 kb. Obidva ostrovy patogenity sú súčasťou tzv. pgm (pgm = pigmentation) lokusu o veľkosti 102 kb723. Na chromozóme je kódovaná taktiež biosyntéza tzv. Gsr (Gsr = Global stress requirement) a Psa A (Psa = pH 6 antigen) proteínu. Yersíniobaktín Siderofór yersíniobaktín je významným faktorom virulencie Y. pestis pri získavaní železa z hemoglobínu722,724. 393

Hms proteíny Hms proteíny zohrávajú kľúčovú úlohu v patogenéze infekcie Y. pestis, nakoľko sa podieľajú na tvorbe biofilmu Y. pestis v proventrikule sajúcej blchy. Kolonizovaný a fibrínom uzavretý proventrikulus (vplyvom bakteriálnej koagulázy) sa stáva nepriechodnou časťou tráviacej sústavy, blcha je trvale hladná a vedie ju to k opätovnému vyhľadávaniu hostiteľa, človeka nevynímajúc. Pri ďalšom nasatí dochádza najprv k regurgitácii baktérií prítomných v pažeráku a proventrikule do miesta vpichu, čo môže byť dostatočné množstvo na vyvolanie infekcie723,725,726. K zablokovaniu proventrikula blchy dochádza asi do dvoch týždňov od nasatia krvi s Y. pestis. Na ochranu pred tráviacimi enzýmami blchy si Y. pestis počas kolonizácie a tvorby biofilmu vytvára yersíniový murínny toxín (Ymt), čo je fosfolipáza D. U bĺch, vrátane ľudskej blchy, ktoré sa nepovažujú za dobrých vektorov Y. pestis, nedochádza k tvorbe biofilmu, kolonizácii a uzavretiu proventrikula a hostiteľ je infikovaný „iba“ kontaminovaným sacím ústrojenstvom sajúcej blchy. Hms+ fenotyp Ako Hms+ fenotyp sú označované kmene Y. pestis, pri ktorých sú prítomné obidva ostrovy patogenity a produkujú yersíniobaktín a Hms proteíny723. Kolónie kmeňov Y. pestis Hms+ fenotypu sa pri kultivácii na krvnom agare stávajú pigmentované (tmavé, zelenohnedo sfarbené) uvoľnením hemínu z hemoglobínu, ktorý je pre ne zdrojom železa. I z uvedeného dôvodu sa celý 102 kb chromozomálny lokus, v ktorom sú uložené obidva ostrovy patogenity, nazýva ako pmg lokus725. Gsr proteín Gsr proteín zabezpečuje prežitie Y. pestis v podmienkach fagolyzozómu makrofágov. Psa A proteín Psa A proteín je fibrilárnym proteínom, ktorý zabezpečuje inváziu Y. pestis do makrofágov, a taktiež transport niektorých Yop proteínov (napr. YopE) do fagocytov727. K jeho expresii dochádza pri kyslom pH prostredia (pH 5 – 7), najmä vo fagolyzozóme, ďalej pri nízkej koncentrácii vápnika a teplote 37 °C. Y. pestis počas infekcie človeka prekonáva štádium intracelulárneho a štádium extracelulárneho parazita. 394

Štádium intracelulárneho parazita prekonáva Y. pestis v makrofágoch počas raného štádia infekcie, kde je chránená najmä Gsr proteínom. Krátko po prisatí sa blchy na hostiteľa a regurgitácii Y. pestis v mieste vpichu je časť baktérií ihneď fagocytovaná a usmrtená neutrofilnými granulocytmi a druhá časť je fagocytovaná makrofágmi a transportovaná do regionálnych lymfatických uzlín728,729. V makrofágoch, pri teplote 37 °C a nízkej koncentrácii Ca2+, dochádza k aktivácii sekrečného systému typu III, produkcii efektorových Yops a LcrV proteínov a syntéze kapsuly. Následne dochádza k apoptóze makrofágov a uvoľneniu Y. pestis do prostredia, kde začína jej štádium extracelulárneho parazita728,730. V štádiu extracelulárneho parazita je však už Y. pestis rezistentná nielen voči fagocytujúcim makrofágom, ale aj voči fagocytujúcim neutrofilným granulocytom, nakoľko LcrV proteín blokuje syntézu prozápalových cytokínov a inhibuje chemotaxiu neutrofilov a Yops proteíny blokujú ich fagocytárnu aktivitu, vrátane ich metabolického vzplanutia. Extracelulárna replikácia Y. pestis je zabezpečená nielen vďaka F1 kapsule, ktorá okrem svojej antifagocytárnej aktivity chráni bakteriálnu bunku aj pred lýzou komplementom, ale aj vďaka schopnosti získavať železo pomocou yersíniobaktínu. Extracelulárna replikácia umožní Y. pestis jej rozsiahlu disemináciu, prejavom čoho sú hemoragické zápalové ložiská (petéchie) po tele infikovaného a zväčšené lymfatické uzliny (bubonická forma moru), prípadne dôjde k navodeniu sepsy hostiteľa (septická forma moru). Infekčná dávka Y. pestis je veľmi nízka a bola stanovená medzi 1 až 100 zárodkami663. Faktory virulencie Y. enterocolitica Faktory virulencie Y. enterocolitica sú kódované plazmidom virulencie pYV, ostrovom patogenity a ďalšími génmi bakteriálneho chromozómu656,660 (Tab. 6.39). Plazmid virulencie pYV je plazmidom, gény ktorého, obdobne ako pri Y. pestis a Y. pseudotuberculosis, kódujú sekrečný systém typu III (T3SS), proteíny vonkajšej membrány označené ako Yops a proteín vonkajšej membrány označený ako LcrV731,732. Ostrov patogenity lokalizovaný na chromozóme zabezpečuje syntézu siderofóru yersíniobaktínu. Ostatné gény lokalizované na chromozóme Y. enterocolitica zabezpečujú produkciu stresového Gsr proteínu, Ail, Inv a Yad adhezínov a termostabilného Yst enterotoxínu. 395

Adhezíny Y. enterocolitica a Y. pseudotuberculosis produkujú tri typy adhezínov, ktoré im zabezpečujú adherenciu k β-integrínom luminálneho povrchu M buniek a bazolaterálnemu povrchu ileálnych epiteliálnych buniek657,732,733. Ail (Ail = Attachment invasion locus) adhezín zabezpečuje adherenciu k luminálnemu povrchu M buniek. Zabezpečuje taktiež ochranu bakteriálnej bunky pred väzbou membránu atakujúceho komplexu komplementovej kaskády734. Inv (Inv = Invasin) adhezín zabezpečuje adherenciu k luminálnemu povrchu M buniek a bazolaterálnemu povrchu ileálnych epiteliálnych buniek735. Yad (Yad = Yersinia adhesin) adhezín zabezpečuje adherenciu k luminálnemu povrchu M buniek a bazolaterálnemu povrchu ileálnych epiteliálnych buniek. Zabezpečuje taktiež ochranu bakteriálnej bunky pred väzbou membránu atakujúceho komplexu komplementovej kaskády732. Termostabilný Yst enterotoxín Termostabilný Yst (Yst = Yersinia stable toxin) enterotoxín je z yersínií produkovaný iba kmeňmi Y. enterocolitica. Svojím účinkom je podobný termostabilnému enterotoxínu typu a (STa) Escherichia coli 736. Termostabilný Yst obdobne ako STa aktivuje v enterocytoch tenkého čreva guanylátcyklázovú aktivitu, čím sa v bunkách zvyšuje produkcia cyklického guanozínmonofosfátu (cGMP), čo má za následok zvýšenú sekréciu chloridových iónov (Cl-) a akumuláciu sodíkových iónov (Na+) a vody v čreve. Klinicky sa to prejaví hnačkou. Patogenéza Y. enterocolitica je rovnaká ako pri infekcii Y. pseudotuberculosis s tým rozdielom, že pri infekcii Y. enterocolitica nedochádza k hnačke v dôsledku invázie epiteliálnych buniek, ale v dôsledku produkcie termostabilného Yst enterotoxínu. Navyše, Y. enterocolitica nemá schopnosť tvoriť YPM mitogén656. Infekčná dávka Y. enterocolitica bola u človeka stanovená na 108 zárodkov pri orálnej infekcii. Faktory virulencie Y. pseudotuberculosis Faktory virulencie Y. pseudotuberculosis sú kódované plazmidom virulencie pYV, ostrovom patogenity a ďalšími génmi bakteriálneho chromozómu656,660,721 (Tab. 6.39). Plazmid virulencie pYV je plazmidom, gény ktorého, obdobne ako u Y. pestis a Y. enterocolitica, kódujú sekrečný systém typu III (T3SS), proteíny vonkajšej membrány označené ako Yops a proteín vonkajšej membrány označený ako LcrV694,731,732. 396

Ostrov patogenity, lokalizovaný na chromozóme, zabezpečuje syntézu siderofóru yersíniobaktínu. Ostatné gény, lokalizované na chromozóme Y. pseudotuberculosis, zabezpečujú produkciu stresového Gsr proteínu, Ail, Inv a Yad adhezínov a YPM mitogénu. Y. pseudotuberculosis na rozdiel od Y. enterocolitica netvorí termostabilný Yst enterotoxín. YPM mitogén Niektoré kmene Y. pseudotuberculosis produkujú jednu z troch foriem YPM (YPM = Yersinia Pseudotuberculosis Mitogen) mitogénu. YPM je exotoxínom a významným faktorom virulencie Y. pseudotuberculosis (Tab. 6.39). V závislosti od kmeňa je produkovaný vo forme a, b alebo c (YPMa, YPMb a YPMc). Má funkciu superantigénu, stimuluje proliferáciu T buniek CD4+, čiastočne aj CD8+ a zvyšuje produkciu IL-8, čo u hostiteľa vedie k zápalovej odpovedi694,737. Y. pseudotuberculosis vďaka adhezínom (Ail, Inv a Yad) adheruje v distálnej časti tenkého čreva k luminálnemu povrchu M buniek Peyerových plakov. Adherencia Y. pseudotuberculosis k M bunkám aktivuje prestavbu ich cytoskeletu, čo vedie k prestupu baktérií do M buniek pomocou tzv. „zipovacieho“ fenoménu, keď okolo každej yersínie, ktorá priľne k M bunke, sa z bunkovej steny M bunky vytvorí puzdro, výsledkom čoho je ich internalizácia. Baktérie sa množia vo folikuloch Peyerových plakov a môžu sa šíriť ďalej do ďalších lymfatických tkanív, resp. mezenteriálnych lymfatických uzlín, kde spôsobujú lymfadenitídu. Pomocou makrofágov sa šíria ďalej krvnou cestou do sleziny a pečene738. Y. pseudotuberculosis, obdobne ako Y. pestis, prekonáva v makrofágoch intracelulárnu formu parazitizmu, nakoľko pri teplote 37 °C a neprítomnosti Ca2+ dochádza k expresii sekrečného systému typu III a produkcii efektorových Yops a LcrV proteínov. Navyše, prítomnosť Gsr proteínu im zabezpečí prežitie v podmienkach fagolyzozómu makrofágov. Nakoniec, po apoptóze makrofágov, sa do extracelulárneho prostredia uvoľňujú bunky Y. pseudotuberculosis, ktoré sú rezistentné voči fagocytóze zabezpečenej Yops a LcrV proteínmi a expresia Ail a Yad adhezínov im zabezpečí ochranu pred väzbou membránu atakujúceho komplexu komplementovej kaskády. Extracelulárna replikácia Y. pseudotuberculosis je navyše zabezpečená ich schopnosťou získavať železo pomocou yersíniobaktínu, syntéza ktorého je kódovaná génmi ostrova patogenity. Y. pseudotuberculosis nemá schopnosť invadovať iba M bunky, aby sa dostala do lamina propria, ale z tohto subepiteliálneho priestoru invaduje pomocou Yad a Inv adhezínov taktiež ileálne epiteliálne bunky cez ich bazolaterálny povrch732. 397

Výsledkom infekcie Y. pseudotuberculosis nie je iba enteritída sprevádzaná zvracaním a hnačkou, ale aj tvorba nekrotických ložísk v stene čreva, abdominálnych lymfatických uzlinách, pečeni a slezine. Infekčná dávka Y. pseudotuberculosis bola u človeka stanovená na 109 zárodkov pri orálnej infekcii. 6.3.17 Rod Haemophilus Zástupcovia rodu Haemophilus sú Gram-negatívne, nepohyblivé, aeróbne alebo fakultatívne anaeróbne pleomorfné kokobacily alebo tyčinky veľkosti ≤ 1 × 1,0 – 3,0 μm. Niekedy vytvárajú dlhšie filamentózne útvary. Tab. 6.40 Zástupcovia rodu Haemophilus a ich podiel na chorobách človeka a zvierat Zástupca rodu Haemophilus Hostiteľ Choroba H. aegyptius Ovce Meningoencefalitída Človek Akútna kontagiózna konjunktivitída, Brazílska purpurová horúčka H. ducreyi Človek Mäkký vred (chancroid) H. felis Mačky Respiračné choroby, konjunktivitída Infekcie rán po pohryznutí mačkou Človek H. haemolyticus Človek Komenzál respiračného traktu človeka, potenciálny patogén H. influenzae Človek Neinvazívne infekcie: konjunktivitída, sínusitída, otitis media, bronchitída, pneumónia Invazívne (systémové) infekcie: epiglotitída, meningitída, orbitálna celulitída, febrilný stav s bakteriémiou, artritída, osteomyelitída Perinatálne infekcie: novorodenecká sepsa, celulitída alebo sepsa rodičky H. massiliensis Človek Izolovaný z peritoneálnej tekutiny u ženy s diagnostikovanou panvovou peritonitídou H. paracuniculus Králiky Enteritída H. parahaemolyticus Ošípané Respiračné choroby Človek Akútna faryngitída, príležitostne subakútna endokarditída H. parainfluenzae Králiky Respiračné choroby Morčatá Respiračné choroby Človek Akútna otitis media, sínusitída, chronická bronchitída, endokarditída H. paraphrohaemolyticus Človek Respiračné choroby H. piscium Lososovité Vredovitosť lososovitých rýb; v našich podmienkach: pstruh ryby potočný (Salmo trutta trutta morpha fario), pstruh dúhový (Oncorhynchus mykiss), sivoň potočný (Salvelinus fontinalis) H. pittmaniae Človek Súčasť normálnej mikroflóry slizníc, potenciálny patogén rôznych orgánových systémov H. seminalis Človek Izolovaný zo vzorky semena muža H. sputorum Človek Zápal zubného lôžka (alveolitída) 398

Rod Haemophilus má v súčasnosti 14 členov. Zo zástupcov rodu Haemophilus má pri chorobách človeka najväčší význam H. influenzae, pôvodca invazívnych i neinvazívnych a perinatálnych infekcií človeka, H. ducreyi, pôvodca mäkkého vredu, pohlavne prenosnej choroby človeka a H. parainfluenzae, pôvodca infekčnej endokarditídy človeka739-742. Najohrozenejšou skupinou voči infekcii H. influenzae typu b boli, až do času zavedenia plošnej vakcinácie, nevakcinované deti vo veku 18 – 24 mesiacov. Je to obdobie, kedy už deti nie sú chránené voči infekcii materskými protilátkami. Z uvedených infekcií je najnebezpečnejšia epiglotitída u detí vo veku 2 – 3 rokov a meningitída u detí vo veku od 2 mesiacov do 2 rokov. Po zavedení plošnej vakcinácie je v našich podmienkach výskyt obidvoch infekcií u detí vzácny743. Podiel zástupcov rodu Haemophilus na chorobách človeka je uvedený v Tab. 6.40. Faktory virulencie H. influenzae Medzi najdôležitejšie faktory virulencie H. influenzae patrí kapsula, adhezíny, lipooligosacharid a schopnosť tvoriť IgA1 proteázu. a) kapsula Kapsula H. influenzae je polysacharidového charakteru a považuje sa za jeho hlavný faktor virulencie. Pri H. influenzae je známych šesť antigénnych a chemicky odlišných kapsulárnych polysacharidov a zároveň aj šesť typov kapsúl označených ako a – f. Na základe prítomnosti alebo neprítomnosti kapsuly sú potom všetky kmene H. influenzae rozdelené do skupiny okapsulovaných (typizovateľných) a do skupiny neokapsulovaných (netypizovateľných) kmeňov. Okapsulované kmene H. influenzae sú chránené pred fagocytózou a lytickým účinkom komplementu a sú zároveň invazívne a vyvolávajú systémové infekcie na rozdiel od neokapsulovaných kmeňov, ktoré sú neinvazívne a nevyvolávajú systémové infekcie744-746 (Tab. 6.40). Medzi najvirulentnejšie a zároveň aj invazívne kmene H. influenzae patria kmene s kapsulou typu b. Do začiatku zavedenia povinnej vakcinácie patrili kmene typu b aj k najčastejšie sa vyskytujúcim kmeňom H. influenzae. Kapsulárny polysacharid H. influenzae typu b je (3)-beta- D-ribóza-(1-1)-ribitol-5-fosfát (polyribozylribitolfosfát). Špecifické protilátky proti kapsulárnemu polyribozylribitolfosfátu sú protektívne a imunizovaného jedinca chránia voči invazívnym infekciám H. influenzae typu b. Od roku 1998 bola na Slovensku odporúčaná vakcinácia proti hemofilovej meningitíde (H. influenzae typ b) samostatnou konjugovanou 399

vakcínou. Od roku 2000 bolo zavedené povinné plošné očkovanie detí proti H. influenzae typu b v kombinovanej vakcíne747-749. Syntéza kapsulárnych polysacharidov je kódovaná chromozomálnymi capB génmi, ktoré sú pri H. influenzae typu b prítomné v dvoch identických kópiách o veľkosti 17 – 18 kbp a spojené krátkou bexA oblasťou (1,0 – 1,3 kbp). bexA oblasť je zodpovedná za syntézu proteínu zabezpečujúceho export kapsulárneho materiálu na povrch bunky. Strata jednej kópie capB génov vedie k vzniku kapsula-deficientných mutantov. Asi u 2 % kmeňov H. influenzae typu b je prítomná iba jedna kópia capB génov750-752. Pri kmeňoch H. influenzae s ostatnými typmi kapsúl (a, c, d, e, f) sú capB gény iba v jednej kópii. Neokapsulované a netypizovateľné kmene H. influenzae sú často komenzálmi horných dýchacích ciest človeka. Na rozdiel od okapsulovaných kmeňov, tieto sú veľmi variabilné v produkcii povrchových antigénov. Sú najčastejšie pôvodcami neinvazívnych infekcií, najmä sínusitídy, konjunktivitídy, pneumónie a po Streptococcus pneumoniae sú druhým najčastejšie izolovaným patogénom pri otitis media745,746. Neokapsulované kmene H. influenzae môžu mesiace i roky perzistovať v pľúcach pacientov s chronickou obštrukčnou chorobou pľúc a podieľať sa na ich morbidite a mortalite. Navyše, neokapsulované kmene H. influenzae sú izolované aj u pacientov s cystickou fibrózou, u ktorých infekcia pľúc vedie v mnohých prípadoch k úmrtiu753. Neokapsulované kmene H. influenzae môžu však byť hrozbou aj pre zdravých ľudí, nakoľko vakcinácia založená na imunitnej odpovedi voči kapsulárnemu polyribozylribitolfosfátu H. influenzae typu b, nie je efektívna voči infekciám neokapsulovaných kmeňov754. b) adhezíny Adhezíny zohrávajú dôležitú úlohu pri adherencii okapsulovaných aj neokapsulovaných kmeňov H. influenzae k epiteliálnym bunkám. Medzi najdôležitejšie adhezíny H. influenzae patria proteíny s veľkou molekulovou hmotnosťou HMW1/HMW2 (HMW = High Molecular Weight protein 1, 2), Hia adhezín (Hia = Haemophilus influenzae adhesin), Hap (Hap = Haemophilus adherence and penetration) proteín, proteín E, pili a proteíny vonkajšej membrány755-758. Proteíny s veľkou molekulovou hmotnosťou (HMW1/HMW2) spolu s Hia adhezínom a Hap proteínom sú autotransportérovými proteínmi. HMW1/HMW2 sú prítomné u 75 – 80 % neokapsulovaných kmeňov H. influenzae. Sú kódované chromozomálnymi génmi hmw1 a hmw2 a nie sú prítomné u okapsulovaných kmeňov H. influenzae. Existuje priama súvislosť 400