E. Pilipčinec a kol._KEGA monografia 2022_č.j. 07UVLVF-4-2021

a) syntéza endogénneho siderofóru enterobaktínu kódovaného chromozomálne; b) syntéza endogénneho siderofóru aerobaktínu kódovaného plazmidom; c) získavanie železa pomocou exogénnych hydroxamátových siderofórov (ferichrom, koprogen, kys. rhodotorulová); d) získavanie železa viazaného na citrát. Mechanizmy, ktoré umožňujú získavať železo pomocou siderofórov, sú aktivované jeho nedostatkom v prostredí. Bolo pozorované, že mikroorganizmy rastúce v prostredí s limitovanou dostupnosťou železa exprimujú membránové proteíny, ktoré majú funkciu špecifických receptorov a slúžia na príjem siderofórov s naviazaným železom. Pri Gram- negatívnych baktériách sú tieto receptory lokalizované na vonkajšej membráne bakteriálnej bunky a komplex siderofór-železo je po väzbe na receptor transportovaný do periplazmatického priestoru a následne translokovaný cez cytoplazmatickú membránu do cytoplazmy, kde dochádza k uvoľneniu železa. Prenos uvedeného komplexu je sprostredkovaný pravdepodobne membránovými permeázami. Uvoľnenie trojmocného železa zo siderofóru je spojené s jeho redukciou na dvojmocné katióny, ku ktorým majú siderofóry výrazne nižšiu afinitu. Pri mnohých baktériách a hubách bola objavená na membránu viazaná cytoplazmatická ferrisiderofórreduktáza. Voľné siderofóry sú potom bunkou recyklované alebo degradované. Napr. pri Escherichia coli je aerobaktín recyklovaný, zatiaľ čo enterobaktín je intracelulárne degradovaný. V prípade katecholátových siderofórov prispieva k uvoľneniu železa z uvedeného komplexu taktiež intracelulárna degradácia siderofórov. Bunková regulácia celého procesu, t. j. syntéza siderofórov, syntéza príslušných receptorov a ďalších asociovaných molekúl, ktorá je indukovaná nedostatkom železa, je riadená proteínom označovaným ako Fur proteín (Ferric uptake regulation). Fur proteín o molekulovej hmotnosti 16,8 kDa sa v prítomnosti železa viaže na špecifické sekvencie v promótorovej oblasti tzv. fur- kontrolovaných génov a pôsobí ako represor transkripcie. Pri znížení hladiny železa v bunke stráca Fur proteín väzobnú aktivitu a represia transkripcie kontrolovaných génov je zrušená. Špecifické väzobné miesto pri fur-kontrolovaných génoch bolo nazvané ako „FUR box“ alebo ako „IRON box“ a jeho univerzálna sekvencia je GATAATGATAATCATTATC. Všetky doposiaľ identifikované gény zodpovedné za syntézu siderofórov sú regulované Fur proteínom. Ten sa viaže i na promótor vlastného génu a autoreguluje tak i svoju vlastnú expresiu. Vedľa negatívnej regulácie získavania a transportu železa pomocou siderofórov, keď nadbytok železa tlmí syntézu špecifického receptora pôsobením Fur proteínu, je známa aj pozitívna 301

regulácia získavania a transportu železa, pri ktorej je stimulujúcim signálom pre expresiu špecifického receptora prítomnosť siderofóru. Špecifické receptory pre molekuly viažuce nehémové železo (transferín, laktoferín) boli popísané pri celom rade baktérií a niektorých prvokov, pričom pri prvokoch dochádza k endocytóze komplexu receptor-transferín/laktoferín s následným uvoľnením železa vo vnútri bunky, na rozdiel od baktérií, pri ktorých k uvoľneniu železa z ligandu dochádza na povrchu bakteriálnej bunky a jeho následnému transportu v komplexe s proteínom FbpA (Ferric-ion- binding protein A, Fe3+-binding protein A, Major ferric iron-binding protein) cez periplazmatický priestor k plazmatickej membráne. Na uvedenom transporte sa významným spôsobom podieľa taktiež komplex membránových proteínov TonB, ExbB, ExbD. Väzba transferínu na receptor je hostiteľsky špecifická. Pri baktériách žijúcich v prostredí bohatom na transferín (Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Actinobacillus pleropneumoniae) boli popísané dva receptory pre transferín a to Tbp A a Tbp B (Transferrin binding protein A, B). Mechanizmy získavania železa z laktoferínu sú u baktérií veľmi podobné s mechanizmami získavania železa z transferínu. Receptory pre laktoferín boli popísané pri Neisseria spp., predovšetkým pri Neisseria meningitidis, Bordetella pertussis, Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus. Špecifické receptory pre molekuly viažuce hémové železo, vrátane proteínov obsahujúcich hémové železo (hemoglobín, hemopexín, haptoglobín) boli popísané pri mnohých patogénnych baktériách, ktoré využívajú hemoglobín a produkty jeho degradácie ako hlavný zdroj železa. Avšak väzba hemoglobínu, ktorý sa uvoľňuje najčastejšie pôsobením bakteriálnych hemolyzínov alebo v dôsledku patofyziologických procesov, je na rozdiel od transferínu alebo laktoferínu hostiteľsky nešpecifická a jeden druh baktérie môže využívať hemoglobín rôznych cicavcov. Mechanizmus získavania hémového železa bol najlepšie preštudovaný pri Neisseria meningitidis. Tento patogén exprimuje na svojom povrchu dva druhy receptorov pre príjem hémového železa: a) receptory viažuce hemoglobín a voľný hém a b) receptory špecifické iba pre voľný hém. Receptory prvého typu sú schopné okrem väzby hemoglobínu na povrchu bunky zaistiť aj rozštiepenie hému. Voľný hém je potom transportovaný cez periplazmatický priestor do bakteriálnej bunky pomocou komplexu membránových proteínov TonB, ExbB, ExbD. Hém je počas uvedeného transportu viazaný na proteín FbpA. Po transporte hému do cytoplazmy dochádza k rozrušeniu porfyrínového kruhu enzýmom hémoxygenáza a uvoľneniu železa. 302

Bordetely majú schopnosť získavať nehémové železo (transferín, laktoferín) od hostiteľa pomocou vlastného endogénneho siderofóru alkaligínu, ktorý je hydroxamátového typu, ďalej využívaním exogénneho siderofóru enterobaktínu, ktorý je katecholátového typu a je najčastejšie produkovaný zástupcami čeľade Enterobacteriaceae, prípadne železo získavajú z molekúl viažucich hémové železo. Príkladom je expresia BhuR membránového receptora (Bordetella heme uptake Receptor) pre získavanie hémového železa203-206. g) sekrečný systém typu III Sekrečný systém typu III bol identifikovaný u B. bronchiseptica a B. parapertussis. Je to súbor asi 30 proteínov, ktoré vytvárajú dutý útvar podobný injekčnej ihle ukotvený vo vonkajšej membráne bakteriálnej bunky, cez ktorý sa „injikujú“ efektorové proteíny bakteriálnej bunky priamo do cieľovej hostiteľskej bunky (epiteliálne bunky trachey, fagocyty). Výsledkom je strata integrity epiteliálnych buniek respiračného traktu, zníženie až strata fagocytárnej aktivity, zníženie až strata prezentácie antigénu antigén prezentujúcimi bunkami a v konečnom dôsledku strata imunitnej odpovede a apotóza190. Doposiaľ však ešte neboli presne identifikované efektorové proteíny bordetel. Bordetely sú vybavené širokou škálou faktorov virulencie, ktoré v závislosti od pôvodcu, sa rôznou mierou podieľajú na poškodení riasinkového epitelu respiračného traktu (Tab. 6.20). Tento proces je hnisavý a vedie najčastejšie k rinitíde, sinusitíde alebo tracheitíde. Absencia alebo poškodenie čistiacej funkcie riasinkového epitelu môže viesť k pneumónii, ktorá býva často sprevádzaná sekundárnou bakteriálnou infekciou. Medzi najvýznamnejšie choroby človeka vyvolané bordetelami patrí čierny kašeľ. 6.3.7 Rod Burkholderia Zástupcovia rodu Burkholderia sú Gram-negatívne rovné alebo ohnuté tyčinky veľkosti 0,5 – 1,0 × 1,5 – 5,0 μm, pohyblivé pomocou jedného alebo častejšie viacerých polárne umiestnených bičíkov s výnimkou B. mallei, ktorá je nepohyblivá. V súčasnosti má rod Burkholderia 33 zástupcov, z ktorých B. mallei a B. pseudomallei sú primárnymi patogénmi ľudí a zvierat207. B. mallei je pôvodcom vysoko infekčného ochorenia koňovitých (Equidae), najmä koní, somárov a mulov, ktoré je označované ako sopľavka alebo malleus a je prenosné aj na mäsožravce a človeka, prípadne ďalšie zvieratá208. Kontagiózny charakter nákazy preukázal už v roku 1664 Jacques de Sollysel vo Francúzsku, čo sa v nasledujúcich storočiach, najmä od 303

začiatku 19. storočia, aj prejavilo pri prenose nákazy z koní na človeka, nakoľko sopľavka koní bola prevalentnou nákazou vojenských koní v mnohých krajinách Európy. B. pseudomallei je pôvodcom taktiež vysoko infekčného, sopľavke podobného ochorenia človeka a zvierat označovaného tiež ako melioidóza alebo pseudomaleus. Ďalšiu veľmi významnú skupinu zástupcov rodu Burkholderia predstavuje skupina viac ako 20 zástupcov tzv. Burkholderia cepacia komplexu, ktorý je významnou skupinou oportúnnych patogénov pre ľudí s cystickou fibrózou alebo imunodeficientných pacientov209-211. Melioidóza Burkholderia pseudomallei je pôvodcom vysoko infekčného, sopľavke podobného ochorenia človeka a zvierat, označovaného tiež ako melioidóza alebo pseudomaleus212. Melioidózu ako prvý popísal Alfred Whitmore (1876 – 1946), anglický vojenský patológ s hodnosťou majora so svojím asistentom C. S. Krishnaswami v roku 1912 v Rangune, vtedajšom hlavnom meste Barmy (dnes Mjanmarsko) u ľudí žijúcich na hranici biedy, žobrákov a narkomanov užívajúcich ópium213,214. Zo vzoriek odobraných post mortem od mŕtvych, ktorí podľahli infekcii podobnej sopľavke, izolovali Gram-negatívne tyčinky podobné Bacillus mallei, tieto však boli pohyblivé, dobre rástli na peptónovom agare a na rozdiel od Bacillus mallei na pevnom živnom médiu vytvárali kolónie zvráskaveného vzhľadu pevne priľnúce k jeho povrchu. Preto ich označili ako Bacillus pseudomallei. Infekcia sa v tom období stala známou ako Whitemorova choroba. V anglickej literatúre tiež v tom čase ako „morphine injector´s septicemia“. V roku 1921 Ambrose T. Stanton a William Fletcher, výskumní pracovníci lekárskeho výskumného inštitútu v Kuala Lumpur, popísali v kolónii morčiat infekciu, pôvodca ktorej bol neskôr identifikovaný ako Bacillus pseudomallei. V roku 1925 navrhli obidvaja vedci premenovať Whitemorovu chorobu na melioidosis, nakoľko má podobné klinické príznaky ako sopľavka. Označenie melioidosis odvodili od gréckeho „melis“ = choroba somárov (prvé pomenovanie sopľavky od Aristotela), „oeidēs” = podobný čomu, „osis” = choroba. I napriek tomu, že uvedené pomenovanie sa ujalo, v odbornej literatúre sa môžeme stretnúť aj s tzv. Stantonovou chorobou ako synonymom pre melioidózu. Medzi endemické oblasti výskytu melioidózy patrí v súčasnosti juhovýchodná Ázia, severná Austrália a tropické pásmo, tiahnuce sa medzi 20° severnej zemepisnej šírky a 20° južnej zemepisnej šírky215. V Austrálii je melioidóza, ktorá tu bola prvýkrát zaznamenaná v roku 1950, známa aj ako choroba Nightcliff gardeners (Nightcliff je severné predmestie mesta Darwin v Severnom 304

teritóriu, gardeners z angl. = záhradníci). Prípady sú hlásené najmä v období dažďov. Ochorenie sa najčastejšie vyskytuje na severe Queenslandu a Severného teritória. Sporadické prípady sú hlásené aj zo Západnej Austrálie a z ostrovov Torres Strait216. K infekcii človeka môže dôjsť po inhalácii, ingescii alebo poranenou kožou. Je vzácny prenos infekcie z človeka na človeka. V súčasnosti sa za primárnu a najdôležitejšiu cestu infekcie človeka B. pseudomallei považuje cesta cez porušenú kožnú bariéru, najmä pri rôznych kožných abráziách a ragádach. Zodpovedá tomu aj vysoká incidencia výskytu melioidózy u ľudí, pracujúcich na ryžových poliach. V endemických oblastiach výskytu melioidózy nie je zanedbateľnou ani inhalačná cesta vzniku infekcie. Bola popísaná taktiež u amerických pilotov helikoptér počas vietnamskej vojny (1964 – 1975), ktorí svojimi preletmi nízko nad zemou vytvárali aerodisperziu patogénu, vyskytujúceho sa v pôde. Následné vdýchnutie takto zvíreného kontaminovaného prachu malo pre nich väčšinou fatálne následky217. Medzi životné činnosti, resp. životné štýly, ktoré v endemických oblastiach zvyšujú riziko infekcie ľudí B. pseudomallei, patrí pestovanie ryže v Thajsku (ale aj vo Vietname a Indii) a spôsob života Aborigénov, pôvodných obyvateľov Austrálie (z latinského ab origine = od začiatku, pôvodne), ktorí sa veľakrát pohybujú na samotnej hranici chudoby a sociálnej neistoty. Medzi ďalšie rizikové faktory, ktoré zvyšujú riziko infekcie B. pseudomallei, patrí u ľudí cukrovka, talasémia (dedičná porucha syntézy hemoglobínu), alkoholizmus, choroby obličiek, chronické choroby pľúc a imunodeficiencia, najmä znížená funkcia neutrofilov. Melioidóza sa môže u človeka vyvinúť ako akútna pneumónia alebo akútna septikémia, ktoré sú ťažkými formami choroby. Choroba sa môže manifestovať tiež ako chronická infekcia s dlho pretrvávajúcimi hnisavými abscesmi na mnohých častiach tela alebo ako subklinická infekcia, ktorá nemusí byť diagnostikovaná celé roky. Tak chronická ako aj subklinická infekcia môžu zostať nediagnostikované až do času aktivácie buď nejakou traumatickou udalosťou alebo v dôsledku imunosupresie. I napriek antibiotickej terapii je pri melioidóze ľudí mortalita relatívne vysoká, najmä v prípadoch akútnej septikémie alebo pri jej pľúcnej forme po priamej inhalácii patogénu. Je taktiež častý výskyt recidívy. Zaujímavosťou je, že v severnej Austrálii je najčastejšou formou melioidózy forma akútnej septikémie na rozdiel od Thajska, kde prevláda pľúcna forma. Navyše, takmer 5 % prípadov melioidózy v Austrálii prebieha ako encefalomyelitída, ktorá je však vzácna v Thajsku alebo v juhovýchodnej Ázii. 305

Sopľavka (Malleus) Burkholderia mallei je pôvodcom vysoko infekčného ochorenia koňovitých (Equidae), najmä koní, somárov a mulov, ktoré je označované ako sopľavka alebo malleus a je prenosné aj na mäsožravce a človeka, prípadne ďalšie zvieratá208. Malleus aj melioidóza patria k nebezpečným zoonózam, t. j. chorobám prenosným zo zvierat na človeka. Ako bolo uvedené, kontagiózny charakter nákazy preukázal už v roku 1664 Jacques de Sollysel vo Francúzsku, čo sa v nasledujúcich storočiach, najmä od začiatku 19. storočia, aj potvrdilo pri prenose nákazy z koní na človeka, nakoľko sopľavka koní bola prevalentnou nákazou vojenských koní v mnohých krajinách Európy. K infekcii človeka B. mallei dochádza najčastejšie pri priamom kontakte s klinicky chorým alebo latentne infikovaným zvieraťom, prípadne pri manipulácii s kadáverom uhynutého zvieraťa. V závislosti od cesty infekcie a veľkosti infekčnej dávky sa inkubačná doba pohybuje od niekoľkých dní do niekoľkých týždňov. Septikémia alebo lokalizovaná forma infekcie sa u človeka vyvinie v priebehu jedného až piatich dní. Pľúcna forma sa prejaví po 10 – 14 dňoch po infekcii. U človeka môže sopľavka prebiehať v štyroch nasledovných formách: septikemická forma, pľúcna forma, akútna lokalizovaná forma a chronická forma, pričom jedna forma infekcie môže prechádzať do druhej a môžu sa vyskytnúť aj kombinácie klinických prejavov jednotlivých foriem. Maleus zvierat sa ešte sporadicky vyskytuje v krajinách východnej Ázie (Ďaleký východ), Južnej Ameriky, Severnej Afriky a Stredného východu. V Európe bola sopľavka rozšírená najmä v rokoch 1921 – 1934. Na Slovensku bola nákaza definitívne utlmená ešte v roku 1950. Faktory virulencie zástupcov rodu Burkholderia Burkholderia pseudomallei B. pseudomallei je veľmi adaptabilným a rezistentným patogénom, tak za prirodzených vonkajších podmienok ako aj pri infekcii vnímavého hostiteľa. Je schopná prežívať pri nedostatku živín, pri extrémnych teplotách, pri vystaveniu rôznym dezinfekčným prostriedkom, pri pôsobení viacerých antibiotík, ako aj v kyslom a zásaditom pH prostredí. Predpokladá sa, že vo voľnej prírode živiny nevyhnutné pre svoj život získava z rozkladajúcej sa organickej hmoty. V destilovanej vode prežíva aj desať rokov. 306

B. pseudomallei je environmentálnou, saprofytickou baktériou izolovanou v endemických oblastiach výskytu melioidózy, najmä z ryžových polí, premočených pôd a stojatých vôd. B. pseudomallei infikuje v prírode voľne žijúce améby (meňavky) druhu Acanthamoeba astronyx. Genóm B. pseudomallei pozostáva z dvoch chromozómov a patrí k jedným z najväčších bakteriálnych genómov (7,0 Mbp). Na chromozóme 1 sú prítomné gény zodpovedné za zabezpečenie základných funkcií bakteriálnej bunky (metabolizmus, motilita, biosyntéza bunkovej steny a proteínov bunky). Na chromozóme 2 sú prítomné špecifické gény zodpovedné za adaptáciu bakteriálnej bunky vo vonkajšom prostredí a v hostiteľovi. K obrovskej plasticite genómu B. pseudomallei prispieva aj horizontálny prenos genetickej informácie (hovorí sa o horizontálnom prenose genetických ostrovov), taktiež rekombinácia a mutácia. Výsledkom uvedenej plasticity genómu sú relatívne veľké rozdiely v genetickej výbave izolátov B. pseudomallei u toho istého pacienta s melioidózou, čo poukazuje na vysokú schopnosť adaptácie B. pseudomallei na hostiteľa. Navyše, boli popísané aj fenotypové zmeny v morfológii kolónií toho istého kmeňa B. pseudomallei, ktorý bol izolovaný z rôznych tkanív pacienta s melioidózou. Faktory virulencie skupiny Burkholderia pseudomallei (B. mallei a B. pseudomallei) sú uvedené v Tab. 6.21218-221. B. pseudomallei je schopná adherovať a invadovať mnohé epiteliálne bunky, vrátane buniek alveolárnych, bronchiálnych, laryngeálnych, orálnych a konjunktiválnych. Táto počiatočná adherencia je sprostredkovaná polysacharidovou kapsulou a fimbriami typu IV. Po adherencii sa B. pseudomallei môže replikovať tak vo fagocytujúcich ako aj v nefagocytujúcich bunkách hostiteľa. V bunkách neutrofilov alebo v makrofágoch sa replikuje buď po tom, ako je fagocytovaná alebo po ich invázii. Invázia hostiteľských buniek B. pseudomallei, prežívanie v nich ako aj jej replikácia je zabezpečovaná efektorovými proteínmi sekrečného systému typu III (Tab. 6.21). BimA, efektorový proteín sekrečného systému typu V, umožňuje polymerizáciu aktínu hostiteľskej bunky, čo nakoniec vedie k tvorbe polárne umiestnených aktínových bičíkov na povrchu bakteriálnej bunky222,223. Uvedené aktínové bičíky zabezpečujú transverzálny (priečny) prestup B. pseudomallei cez bunkovú stenu dvoch susedných buniek (z bunky infikovanej do bunky neinfikovanej). Polymerizácia aktínu vedie následne, za účasti BipB, efektorového proteínu sekrečného systému typu III, k fúzii infikovaných hostiteľských buniek a tvorbe tzv. obrovských mnohojadrových buniek. 307

Tab. 6.21 Faktory virulencie skupiny Burkholderia pseudomallei (B. mallei a B. pseudomallei) Faktor virulencie Úloha v patogenéze Kapsula (wab operón) Spolu s fimbriami typu IV má funkciu adhezínu na epiteliálne bunky. Prítomnosť kapsuly zvyšuje šancu prežitia B. mallei a B. pseudomallei po infekcii hostiteľa, nakoľko ju chráni pred fagocytózou, resp. väzbou s membránu atakujúcim komplexom komplementovej kaskády a následnou lýzou. Je prítomná u plne virulentných kmeňov. Lipopolysacharid Zabezpečuje rezistenciu voči komplementu a defenzínom (antimikrobiálne (O – antigén) peptidy s nízkou molekulovou hmotnosťou). Bičíky/Flagelín (fli, flg) Zabezpečujú motilitu a invazivitu. Pili typu IV (pil A) Sekrečný systém typu III Spolu s kapsulou plnia funkciu adhezínu. (bsa operón) Po adherencii na hostiteľskú bunku zabezpečuje inváziu, intracelulárne prežívanie a replikáciu B. mallei a B. pseudomallei, tak vo fagocytujúcich ako aj v nefagocytujúcich bunkách hostiteľa. Efektorové proteíny sekrečného systému: BipD a BopE (invazivita), BsaZ a BopA (zabránenie tvorby fagolyzozómu a deštrukcie patogénu), BipB (tvorba obrovských mnohojadrových buniek/apoptóza). Sekrečný systém typu V Produkcia proteínov s funkciou autotransportérov, ktoré hrajú dôležitú úlohu v patogenéze infekcie pri adherencii, invázii, rezistencii voči séru, intracelulárnom prežívaní a tvorbe biofilmu. Medzi najlepšie preštudované autotransportéry patrí: BimA (polymerizácia aktínu), Sekrečný systém typu VI BoaA/BoaB (adherencia). Polymerizácia aktínu (bimA) Zabezpečuje inváziu a intracelulárnu replikáciu v makrofágoch, tvorbu obrovských mnohojadrových buniek a polymerizáciu aktínu. Polymerizácia aktínu na polárnych koncoch patogénu zabezpečí jeho transverzálny/priečny prestup cez bunkovú stenu dvoch susedných buniek. Sekrečný systém typu II Sekrécia hydrolytických enzýmov (lipáz, proteáz, fosfolipázy C) a ďalších ~ 50 proteínov. Fosfolipáza C (plc-1, 2, 3) Získavanie živín (fosfolipáza C štiepi molekulu fosfolipidu za vzniku diacylglycerolu a fosforylovaného alkoholu). Siderofóry Je prítomná u plne virulentných kmeňov. (mbaJ, mbaF, mbaJ, mbaI, fmtA, fptA) Zabezpečujú získavanie železa. B. pseudomallei má schopnosť získavať železo produkciou siderofóru Efluxné pumpy RND rodiny hydroxamátového typu maleobaktínu, pomocou ktorého uvoľňuje (amrAB-oprA, bpeAB-oprB) predovšetkým nehémové železo z transferínu a laktoferínu a čiastočne aj hémové železo z erytrocytov. Druhým siderofórom, ktorý je produkovaný B. pseudomallei je pyochelín, ktorý je katecholátového typu. Zabezpečujú aktívne vyčerpávanie (eflux) antibiotika z bakteriálnej bunky. U B. pseudomallei boli doposiaľ popísané dve efluxné pumpy RND rodiny (AmrAB a BpeAB). Rodina RND (Resistance Nodulation cell Division family) – jeden z piatich efluxných systémov antimikrobiálnej rezistencie. Ostatné rodiny efluxných systémov u baktérií: Rodina ABC (ATP-Binding Cassette Superfamily) Rodina MATE (Multidrug Toxic Compound Extrusion Superfamily) Rodina SMR (Small Multidrug and Resistance Superfamily) Quorum sensing Rodina MFS (Major Facilitator Superfamily) (pmlIR, bpsIR) Spôsob, akým baktérie rozpoznávajú svoju hustotu (množstvo) vo vonkajšom prostredí a v hostiteľovi a ako ju vedia meniť v závislosti od Zmena (prepínanie) morfotypu podmienok. Zabezpečuje reguláciu expresie niektorých génov (metaloproteáza, siderofóry). Faktor virulencie vyžadovaný pre plne virulentné kmene. Zabezpečuje striedanie povrchových determinant za in vivo podmienok. 308

Tvorba obrovských mnohojadrových buniek je častým nálezom tak medzi fagocytujúcimi ako aj medzi nefagocytujúcimi bunkami hostiteľa, infikovaného B. pseudomallei. Predpokladá sa, že práve fúzia infikovaných hostiteľských buniek a tvorba obrovských mnohojadrových buniek napomáha k šíreniu B. pseudomallei v hostiteľskom organizme, ďalej k jej unikaniu pred obrannými mechanizmami hostiteľa a v konečnom dôsledku aj k jej perzistencii in vivo. Navyše, B. pseudomallei syntetizuje veľké množstvo enzýmov, vrátane proteázy, lipázy, katalázy, peroxidázy, superoxiddismutázy a hemolyzínov, prípadne je vybavená ďalšími mechanizmami a faktormi virulencie (Tab. 6.21). B. pseudomallei môže vytvárať tak lokalizovanú (pneumónia, tvorba abscesov) ako aj diseminovanú formu infekcie v sekundárnych orgánoch (koža, pľúca, pečeň, slezina, urogenitálny trakt, mozog a príušné žľazy), ktoré sú veľakrát vzdialené od primárneho miesta infekcie. Presné mechanizmy diseminácie B. pseudomallei od primárneho miesta infekcie do ďalších orgánov organizmu doposiaľ ešte nie sú dostatočne známe. Burkholderia mallei V súčasnosti sa minimálne opticky javí, že o niečo lepšie sú preštudované faktory virulencie pri B. pseudomallei ako pri B. mallei. Dôvodom môže byť neprekonateľná finančná alebo administratívno-bezpečnostná požiadavka na zabezpečenie špeciálnych laboratórií pre prácu s tak infekčnými zárodkami ako je B. mallei (požiadavka na 3. stupeň biologickej ochrany – BSL 3 = Bio Safety Level-3) a navyše, vždy hrozí vysoké riziko laboratórnej infekcie. Pravdou však môže byť aj skutočnosť, že výsledky práce s B. mallei sa publikujú menej, nakoľko sú v prvom rade stredobodom záujmu národných bezpečnostných zložiek, cez ktoré sa takýto výskum obyčajne objednáva, financuje a vykonáva v špeciálnych, nato určených zariadeniach. Príkladom toho môžu byť popísané a publikované prípady laboratórnej infekcie s B. mallei u pracovníkov Ústavu americkej armády pre výskum infekčných chorôb (USAMRIID = U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases) vo Fort Detricku, štát Maryland. Od novembra 1944 do septembra 1953 bolo u pracovníkov uvedeného ústavu zaznamenaných sedem laboratórnych infekcií s B. mallei a naposledy ôsma v roku 2000. V roku 1972 podpisom Zmluvy o zákaze vývoja, výroby a hromadenia zásob biologických (bakteriologických) a toxínových zbraní a ich zničení, boli všetky práce na útočných biologických zbraniach vo Fort Detricku ukončené a následne v roku 1973 boli tieto zbrane aj zlikvidované. Od toho času sa tu vykonáva iba výskum spojený s biologickou ochranou pred B. mallei v súvislosti s bioterorizmom. 309

Avšak, ak vychádzame zo skutočnosti, že B. mallei má s B. pseudomallei viac ako 99 % spoločného genómu, je predpoklad, že približne rovnakým percentom budú mať aj rovnaké faktory virulencie, predovšetkým polysacharidovú kapsulu, lipopolysacharid bunkovej steny, schopnosť adherencie, quorum sensing, schopnosť polymerizovať aktín a prestupovať cez bunkovú stenu dvoch susedných buniek, fúzovať ich a vytvárať obrovské mnohojadrové bunky a v neposlednom rade produkovať efektorové proteíny viacerých sekrečných systémov 220,224- 228. Je však tiež pravdou, že B. mallei, ktorá je obligátnym intracelulárnym patogénom v porovnaní s B. pseudomallei, ktorá je saprofytom, stratila niektoré faktory virulencie práve adaptáciou na intracelulárny parazitizmus, navyše, v neveľkom hostiteľskom zázemí koňovitých (Equidae). B. mallei bola prvou baktériou, pri ktorej bol identifikovaný a popísaný sekrečný systém typu VI, ktorý je zároveň aj významným faktorom jej virulencie ako aj virulencie B. pseudomallei. I keď všetky faktory virulencie B. mallei nie sú ešte dostatočne objasnené, najdôležitejšie z nich, ktoré sú doposiaľ známe, sú uvedené v Tab. 6.21229. K infekcii B. mallei dochádza kontaminovanou potravou, vodou a predmetmi, prípadne inhaláciou alebo poranením. Kožný exsudát a sekrét dýchacích ciest sú hlavným zdrojom infekcie B. mallei. Mechanizmus patogenézy nie je úplne jasný. Primárne lézie sa formujú v mieste vstupu patogénu do organizmu. Infekcia sa ďalej šíri krvným riečiskom a lymfatickou cestou, zanechávajúc nodulárne ložiská v lymfatických uzlinách. Metastatické ložiská vznikajú vo vnútorných orgánoch, najmä pľúcach, pečeni a slezine. Ložiská majú charakter abscesov, ktoré sa spájajú do väčších hnisajúcich ložísk alebo granulómov. B. mallei obdobne ako B. pseudomallei je fakultatívne intracelulárny patogén, schopný prežiť a replikovať sa v makrofágoch. Burkholderia cepacia komplex Burkholderia (predtým Pseudomonas) cepacia komplex predstavuje v súčasnosti súbor viac ako 20 vzájomne od seba odlišných zástupcov rodu Burkholderia, ktorí majú široké zastúpenie v pôde a rizosfére rôznych rastlín. Sú to Gram-negatívne, obligátne aeróbne a kataláza pozitívne baktérie. Neskvasujú glukózu a dokážu prežívať i za minimálnych požiadaviek na výživu, navyše i za prítomnosti niektorých dezinfekčných prostriedkov. 310

Prvé prípady infekcií ľudí s cystickou fibrózou alebo imunodeficientných pacientov zástupcami B. cepacia komplexu boli popísané koncom 70-tych rokov. A to i napriek tomu, že pre nerizikovú skupinu ľudí predstavuje B. cepacia komplex organizmy s nízkou patogenitou. Zástupcovia B. cepacia komplexu sa prenášajú buď priamo z osoby na osobu, najmä v zdravotníckych zariadeniach, ale aj mimo nich, najčastejšie kvapôčkovou infekciou alebo sekrétmi infikovaných pacientov. Nie je vylúčená ani infekcia nepriamou cestou, kontaminovanými roztokmi, vrátane intravenóznych roztokov, prípadne ďalšími prípravkami používanými napríklad pri ošetrovaní kože. Riziko infekcie zástupcami B. cepacia komplexu spočíva predovšetkým v tom, že tieto baktérie vytvárajú v pľúcach pacientov s cystickou fibrózou biofilm, ktorý ich významným spôsobom chráni pred v terapii používanými antibiotikami. V konečnom dôsledku to vedie k zlyhaniu antibiotickej terapie a perzistentnej infekcii. Medzi ďalšie faktory virulencie týchto oportúnnych patogénov patrí regulácia expresie génov pomocou quorum sensing a produkcia exopolysacharidu, ktorý je nápomocný pri ich ochrane pred zložkami imunitného systému209. Bola preukázaná záporná korelácia medzi schopnosťou týchto baktérií produkovať exopolysacharidy a zhoršením funkcie pľúc pri cystickej fibróze. A v neposlednom rade, tvorba lipopolysacharidu vedie k imunitným systémom sprostredkovanému poškodeniu tkaniva. 6.3.8 Rod Neisseria Zástupcovia rodu Neisseria sú Gram-negatívne koky o priemere 0,6 – 1,0 μm usporiadané obyčajne v pároch, pričom ich priľahlé strany, ktorými sa dotýkajú, sú sploštené. N. gonorrhoeae svojím tvarom pripomína kávové zrnko. N. elongata, N. weaveri a N. bacilliformis sú však tyčinkovitého tvaru, usporiadané taktiež v pároch alebo v krátkych retiazkach. Zástupcovia rodu Neisseria sú nepohyblivé. N. cinerea, N. elongata, N. flavescens a N. canis sú asacharolytické neisérie. Niektoré druhy neisérií produkujú nazelenalo žltý pigment a niektoré sú hemolytické. Nerastú na Endovej pôde. Sú kapnofilné (vyžadujú si vyššiu tenziu CO2). Optimálna kultivačná teplota sa pohybuje od 35 °C do 37 °C. Rod Neisseria má v súčasnosti viac ako 30 druhov. Podľa svojho vzťahu k hostiteľovi môžu byť neisérie rozdelené do troch skupín. Prvá skupina je zastúpená obligátnymi patogénmi človeka, druhá skupina je zastúpená komenzálmi človeka, ktoré môžu byť zároveň aj oportúnnymi patogénmi človeka a tretia skupina je zastúpená komenzálmi zvierat, ktoré môžu byť zároveň aj oportúnnymi patogénmi človeka a zvierat. Študuje sa aj 311

štvrtá skupina neisérií, ktoré sa vyskytujú alebo môžu sa vyskytovať aj voľne v prírode a môžu byť použité na bioremediáciu životného prostredia. Príkladom je N. sicca, ktorá bola izolovaná aj z pôdy a bolo zistené, že má schopnosť asimilovať acetátcelulózu, organický ester, ktorý je často používaný v priemysle46. Zo zástupcov rodu Neisseria má najväčší význam N. gonorrhoeae, pôvodca kvapavky človeka a N. meningitidis, pôvodca meningitídy človeka. Medzi ďalšie neisérie, izolované z humánnych klinických vzoriek, patrí N. sicca, N. subflava, N. cinerea, N. elongata subsp. elongata, N. elongata subsp. glycolytica, N. elongata subsp. nitroreducens, N. flavescens, N. mucosa, N. bacilliformis, N. wadsworthii, N. shayeganii, N. oralis, N. canis, N. weaveri, N. zoodegmatis a N. animaloris. Kvapavka (Gonorrhoea) Kvapavka spolu so syfilisom (syn. lues, pôvodcom je Treponema pallidum subsp. pallidum), ulcus molle (syn. chancroid, pôvodcom je Haemophilus ducreyi), lymphogranuloma venereum (pôvodcom je Chlamydia trachomatis sérotypu L1, L2, L2a a L3) a granuloma inguinale (syn. donovanóza, pôvodcom je Klebsiella granulomatis (predtým Calymmatobacterium granulomatis) patrí medzi klasické pohlavné choroby prenášané pohlavným stykom230. Kvapavka je druhou najčastejšie sa vyskytujúcou pohlavnou chorobou vo svete. Podľa odhadov Svetovej zdravotníckej organizácie (WHO = World Health Organization) ročne pribudne 25 miliónov nových prípadov kvapavky230. Najrozšírenejšia je v južnej a juhovýchodnej Ázii a subsaharskej Afrike. Veková distribúcia je u žien najvyššia vo veku 15 – 34 rokov a u mužov vo veku 20 – 34 rokov231. Kvapavka patrí k nákazám, ktoré označujeme ako staroveké a v tomto prípade možno ešte staršie, nakoľko viacerí autori sa odvolávajú na Knihu Levitov (tiež Kniha Leviticus alebo Tretia kniha Mojžišova), ktorá je súčasťou židovského Tanachu a kresťanského Starého zákona, v ktorej je prvá zmienka o tejto chorobe. Človek je v prírode jediným hostiteľom N. gonorrhoeae a taktiež jediným prameňom infekcie. N. gonorrhoeae primárne postihuje cylindrický a prechodný epitel sliznice urogenitálneho traktu, rekta, orofarynxu a očných spojiviek s možnosťou hematogénnej diseminácie, čomu zodpovedajú aj klinické prejavy choroby. Je to choroba, pri ktorej nie je zachovaná rodová rovnosť, nakoľko podľa pohlavia, a teda rozdielnej anatómie a fyziológie pohlavných orgánov muža a ženy poznáme ženskú a mužskú kvapavku, podľa priebehu akútnu a chronickú, podľa lokalizácie genitálnu, extragenitálnu a diseminovanú a podľa aktuálneho klinického obrazu nekomplikovanú a komplikovanú232. Nákaza je povinná hláseniu. 312

Meningitída N. meningitidis je pôvodcom purulentnej meningitídy človeka. Po pneumokokovej meningitíde, pôvodcom ktorej je Streptococcus pneumoniae, je druhou najčastejšie sa vyskytujúcou bakteriálnou meningitídou na Slovensku. Medzi ďalších bakteriálnych pôvodcov hnisavých meningitíd patrí u človeka Haemophillus influenzae typ b, Listeria monocytogenes, Streptococcus agalactiae a streptokoky skupiny B, Escherichia coli, Mycobacterium tuberculosis, Elizabethkingia meningoseptica, prípadne Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginossa, Enterobacter spp., Staphylococcus spp. N. meningitidis je pôvodcom primárnych meningitíd, keď sa baktérie dostávajú do centrálnej nervovej sústavy hematogénnou cestou cez drobné cievy chorioidálneho komplexu alebo cez cievy, ktoré sú súčasťou subarachnoidálneho priestoru. Pôvodcom primárnych meningitíd môže byť v niektorých prípadoch aj Streptococcus pneumoniae. Avšak, Streptococcus pneumoniae a Staphylococcus aureus sú skôr pôvodcami sekundárnych meningitíd, keď sa infekcia šíri z primárneho ložiska per continuitatem, najčastejšie pri mastoiditíde (zápal hlávkového výbežku spánkovej kosti, čo je najčastejšou komplikáciou zápalu stredného ucha), sinusitíde, otitíde alebo osteomyelitíde stavcov. N. meningitidis prekonáva slizničnú bariéru horných dýchacích ciest najčastejšie inváziou a následnou deštrukciou neriasinkových buniek alebo tzv. manévrom Trójskeho koňa, t. j. „prenesením“ fagocytmi cez slizničnú bariéru do subepiteliálneho tkaniva. Ako náhle sa N. meningitidis dostane do krvi, rýchlo sa množí a diseminuje do rôznych častí tela. Vzniká sepsa, príznakom ktorej je okrem iného aj tvorba petéchií, ako dôsledok spustenia tzv. koagulačnej kaskády, ktorá môže viesť až k diseminovanej intravaskulárnej koagulácii. Zvyčajne o niečo neskôr sa aktivujú aj ďalšie biologické kaskády (zápalová alebo komplementová) ako reakcia na uvoľnenie meningokokového endotoxínu. Po prelomení hematoencefalickej bariéry a prestupe mikroorganizmov do mozgomiešneho moku vzniká purulentná meningitída a možnosti eliminácie infekcie vlastnými imunitnými mechanizmami sú dosť obmedzené. Infekcii N. meningitidis do značnej miery napomáha jej schopnosť syntetizovať kapsulárny polysacharid a takto odolávať fagocytóze, ďalej meniť svoj antigénny make up i počas infekcie alebo „maskovať sa“ mimikrami (syntetizuje povrchové štruktúry, ktoré sú podobné antigénom krvných skupín) alebo na svoj povrch viazať inhibítory komplementu a takto sa vyhnúť imunitnému systému. Prípadne „odvádzať pozornosť“ imunitného systému na iné nepodstatné ciele, napr. tým, že počas množenia vytvára aj malé mechúriky s endotoxínom, na ktoré sa následne viažu obranné mechanizmy hostiteľa. 313

Etiológiu purulentných meningitíd bakteriálneho pôvodu za ostatných viac ako dvadsať rokov do značnej miery ovplyvnila vakcinácia. Najprv, od roku 1998 odporúčaná vakcinácia proti hemofilovej meningitíde (Haemophillus influenzae typ b) samostatnou konjugovanou vakcínou a od roku 2000 zavedením povinného plošného očkovania detí proti Haemophillus influenzae typ b v kombinovanej vakcíne. V roku 2009 bolo zavedené povinné plošné očkovanie detí proti pneumokokovej meningitíde (Streptococcus pneumoniae). Navyše, pre rizikové skupiny populácie je odporúčaná (nie je však ani povinná, ani plošná) vakcinácia proti meningokokovej meningitíde (N. meningitidis). K dispozícii sú vakcíny proti N. meningitidis séroskupiny A, B, C, Y a W135. N. meningitidis patrí celosvetovo k jednému z najvýznamnejších pôvodcov meningitíd a septikémií u dojčiat, 1 – 4-ročných detí a adolescentov, často po fyzickej alebo psychickej záťaži. Na základe charakteru (imunologickej reaktivity) kapsulárnych polysacharidových antigénov je známych 13 séroskupín N. meningitidis označených ako A, B, C, D, 29E, H, I, K, L, W-135, X, Y a Z. Takmer všetky meningokokové meningitídy sú vyvolané séroskupinami A, B, C, W- 135, X a Y a vzácne aj séroskupinou Z. Zastúpenie jednotlivých séroskupín sa líši aj geograficky (Tab. 6.24). V krajinách Európskej únie, ale aj v Austrálii a na Novom Zélande je najčastejšou séroskupinou N. meningitidis séroskupina B, v USA séroskupina B, C, Y a v Afrike séroskupina A a v ostatnom období aj W135. Taktiež na Slovensku prevažuje séroskupina B, ale vyskytuje sa aj séroskupina C, prípadne i ďalšie (W135, Y, E29 5 a X) alebo skupinovo neurčiteľné. Faktory virulencie zástupcov rodu Neisseria Neisseria gonorrhoeae N. gonorrhoeae je obligátnym patogénom a na rozdiel od N. meningitidis nie je súčasťou (komenzálom) normálnej mikroflóry človeka. Kompletná nukleotidová sekvencia genómu N. gonorrhoeae kmeňa FA 1090 o veľkosti 2 153 922 párových báz (bp) bola prvýkrát publikovaná v roku 2000. Od toho času je známa sekvencia ďalších, takmer dvadsiatich genómov iných kmeňov N. gonorrhoeae. Veľkosť uvedených genómov sa pohybovala od 2,15 do 2,28 Mbp, čo zodpovedá 2100 – 2300 génom a syntéze 1886 – 2346 proteínov233. Významnou súčasťou genetickej výbavy a zároveň aj významným faktorom virulencie N. gonorrhoeae sú tzv. R plazmidy alebo plazmidy rezistencie k antibiotikám234,235. Prvý 314

konjugatívny plazmid bol u N. gonorrhoeae popísaný už v roku 1974236. V roku 1976 boli popísané dva, svojím pôvodom rozdielne plazmidy, kódujúce produkciu β-laktamázy (penicilinázy)237. Jeden u kmeňov N. gonorrhoeae izolovaných v Juhovýchodnej Ázii a druhý u kmeňov N. gonorrhoeae izolovaných v subsaharskej Afrike. V súčasnosti obidva plazmidy („ázijsky“ aj „africký“) sú súčasťou kmeňov N. gonorrhoeae, cirkulujúcich po celom svete. Medzitým však boli popísané aj ďalšie typy plazmidov, kódujúce produkciu β-laktamázy (Rio/Toronto, Nimes, New Zeland, Johannesburg), ktoré sa vytvorili pravdepodobne inzerciou alebo deléciou časti pôvodného „ázijského“ plazmidu238. Na rezistencii N. gonorrhoeae k antibiotikám sa nie menšou mierou podieľajú aj dva typy efluxných púmp (FarAB a MtrCDE) z rodiny RND efluxných systémov, ďalej schopnosť N. gonorrhoeae syntetizovať „náhradné“ penicilín viažuce proteíny (PBP 1, 2 = Penicilin Binding Proteins 1, 2) a ďalšie mechanizmy. N. gonorrhoeae si postupne vyvinula rezistenciu na všetky antiinfekčné látky, ktoré od druhej polovice 30-tych rokov boli používané na jej liečbu v prvej línii. Predovšetkým na sulfónamidy, penicilíny, tetracyklíny, makrolidy a fluorochinolóny. Jedinou skupinou antibiotík, ktorá ostala pre liečbu kvapavky v prvej línii, sú cefalosporíny tretej generácie, ale aj u nich sa postupne zaznamenáva zvyšujúci sa počet izolovaných kmeňov so zníženou citlivosťou k týmto antibiotikám. Vo viacerých krajinách sveta (Austrália, Japonsko, Nórsko, Švédsko, Anglicko, Francúzsko) boli už izolované aj kmene s vysokou hladinou rezistencie na cefalosporíny tretej generácie. Navyše, tieto kmene boli rezistentné aj voči ostatným používaným antibiotikám. V prípade, že by sa takéto kmene rozšírili v populácii, zásadne by to skomplikovalo možnosti terapie gonokokových infekcií239,240. Sledovaním vývoja rezistencie N. gonorrhoeae voči antibiotikám sa zaoberajú viaceré organizácie na úrovni národnej aj medzinárodnej. V Európe výskyt rezistentných kmeňov N. gonorrhoeae monitoruje Európske centrum pre prevenciu a kontrolu chorôb (ECDC = European Centre for Disease Prevention and Control) v rámci programu Euro GASP (European Gonococcal Antimicrobial Surveillance Programme), ktorého účastníkmi sú krajiny Európskej únie, vrátane Slovenska a Európskeho hospodárskeho priestoru (EEA = European Economic Area). Medzi ďalšie významné faktory virulencie N. gonorrhoeae patria štruktúrne zložky vonkajšej membrány, sekrečné a translokačné proteíny a špecifické receptory pre získavanie hémového a nehémového železa (Tab. 6.22, 6.23). 315

Tab. 6.22 Faktory virulencie N. gonorrhoeae Faktor virulencie Úloha v patogenéze Lipooligosacharid (LOS) Má funkciu endotoxínu. Plní však aj funkciu adhezínu. Pili typu IV (Tfp = Transformation Plnia funkciu adhezínu, taktiež funkciu sekrečného systému typu IV. frequency pilus) Zabezpečujú „twitching motility“. Opacitné proteíny typu Opa Sprostredkúvajú adherenciu k epiteliálnym bunkám cez CD46 Opa (Predtým proteíny typu II) receptory. Poríny (Por B) Poríny N. gonorrhoeae sú polymérmi proteínov vonkajšej (Predtým označovaný ako hlavný membrány (Por) a Rmp proteínu. Svojou trimerickou konfiguráciou proteín vonkajšej membrány alebo ako slúžia na transmembránový transport hydrofilných solubilných látok proteín typu I) (najmä živín) a aniónov cez vonkajšiu membránu. PorB však sprostredkúva aj inváziu a penetráciu do hostiteľských buniek, buď samostatne alebo sprostredkovanú Opa proteínmi. PorB inhibuje taktiež baktericídnu aktivitu komplementu a má schopnosť uvoľniť sa z vonkajšej membrány N. gonorrhoeae a premiestniť sa do mitochondrií hostiteľskej bunky, kde pri interakcii s napäťovo závislými anionickými kanálmi vyvolá apoptózu hostiteľskej bunky. Rmp proteíny Inhibujú baktericídnu aktivitu krvného séra hostiteľa. (Predtým proteíny typu III) Proteáza IgA1 Podieľa sa na degradácii sekrečného imunoglobulínu triedy IgA1 na slizničných povrchoch. Plazmidy antibiotikorezistencie Efluxné pumpy RND rodiny Zabezpečujú rezistenciu voči antibiotikám. Zabezpečujú aktívne vyčerpávanie (eflux) antibiotika z bakteriálnej bunky. U N. gonorrhoeae boli doposiaľ popísané dve efluxné Syntéza „náhradného“ penicilín pumpy RND rodiny (FarAB a MtrCDE). viažuceho proteínu (PBP 1, 2 = Β-laktámové antibiotiká inhibujú syntézu peptidoglykánu Penicilin Binding Proteins 1, 2) bakteriálnej bunky. Posledný transpeptidačný krok v syntéze peptidoglykánu sa uskutočňuje prostredníctvom transpeptidáz, známych tiež ako penicilín viažuce proteíny, nakoľko môžu byť kompetitívne nahradené β-laktámovými antibiotikami, následkom čoho dôjde k inhibícii syntézy peptidoglykánu, lýze a smrti bakteriálnej bunky. Rezistenciu voči β-laktámovým antibiotikám si baktérie zabezpečia tým, že syntetizujú náhradnú transpeptidázu („náhradný“ penicilín viažuci proteín), ktorú nie je možné kompetitívne vytlačiť β-laktámovými antibiotikami a bakteriálna bunka pokračuje v syntéze bunkovej steny, nedochádza k jej lýze a Špecifické povrchové receptory smrti. viažuce nehémové železo Zabezpečujú získavanie nehémového železa z transferínu Špecifické povrchové receptory a laktoferínu u N. gonorrhoeae a N. meningitidis. viažuce hémové železo (Exprimované iba u N. meningitidis) Zabezpečujú získavanie železa z hému a proteínov obsahujúcich hémové železo (najmä z hemoglobínu). a) štruktúrne zložky vonkajšej membrány Medzi najdôležitejšie štruktúrne zložky vonkajšej membrány, ktoré sprostredkúvajú adherenciu k epiteliálnym bunkám a zároveň sú zodpovedné za inváziu a penetráciu do hostiteľských buniek, patria predovšetkým pilusy, lipooligosacharid (LOS), poríny (PorB) a opacitné proteíny (Opa). Rmp proteíny (Reduction modifiable proteins), ktoré sú taktiež súčasťou vonkajšej membrány N. gonorrhoeae sú inhibítormi cídnej aktivity krvného séra hostiteľa241-246. 316

b) sekrečné a translokačné proteíny Nie menej významnou skupinou faktorov virulencie N. gonorrhoeae sú tzv. sekrečné a translokačné proteíny. Medzi sekrečné proteíny patria jednak proteíny, ktoré sú súčasťou sekrečných systémov typu I, IV a V a taktiež autotransportéry, medzi ktoré u N. gonorrhoeae patrí proteáza IgA1, ktorá sa podieľa na degradácii sekrečného imunoglobulínu triedy IgA1 a adhezívno penetračný proteín App (App = Adhesion penetration protein), ktorý sa podieľa na jej adherencii a invazivite247-249. Medzi translokačné proteíny N. gonorrhoeae patrí Por B, ktorý má schopnosť uvoľniť sa z vonkajšej membrány N. gonorrhoeae počas infekcie, lokalizovať sa v mitochondriách hostiteľskej bunky a vyvolať jej apoptózu243. c) špecifické receptory pre získavanie nehémového a hémového železa N. gonorrhoeae a N. meningitidis patria k tým patogénnym mikroorganizmom, ktoré od svojho hostiteľa získavajú železo pomocou špecifických povrchových receptorov, na ktoré viažu nehémové (transferín, laktoferín) alebo hémové železo250. Pri N. gonorrhoeae a N. meningitidis boli popísané dva druhy receptorov pre transferín a to Tbp A a Tbp B (Transferrin binding protein A, B). Obdobne i pre laktoferín bol popísaný Lbp A a LbpB (Lactoferrin binding protein A, B). Železo sa z transferínu alebo laktoferínu, naviazaného na receptor, uvoľňuje na povrchu bakteriálnej bunky a následne v komplexe s transportným, železo viažucim FbpA proteínom (Ferric-ion-binding protein A alebo ako Fe3+-binding protein A alebo Major ferric iron- binding protein) dochádza k jeho transmembránovému transportu cez bunkovú stenu, periplazmatický priestor a cytoplazmatickú membránu do cytoplazmy bunky. Na uvedenom transporte sa významným spôsobom podieľa taktiež komplex membránových proteínov TonB, ExbB a ExbD. Navyše, N. meningitidis pri nedostatku železa exprimuje na svojom povrchu špecifické receptory pre molekuly viažuce hémové železo, vrátane proteínov obsahujúcich hémové železo (najmä z hemoglobínu). N. meningitidis exprimuje na svojom povrchu dva druhy receptorov pre príjem hemového železa250,251: a) receptory viažuce hemoglobín a voľný hém a b) receptory špecifické iba pre voľný hém. Receptory prvého typu sú schopné okrem väzby hemoglobínu na povrchu bunky zaistiť aj rozštiepenie hému. Voľný hém je potom transportovaný cez periplazmatický priestor do 317

bakteriálnej bunky pomocou komplexu membránových proteínov TonB, ExbB a ExbD. Hém je počas uvedeného transportu viazaný na proteín FbpA. Po transporte hému do cytoplazmy dochádza k rozrušeniu porfyrínového kruhu enzýmom hémoxygenáza a k uvoľneniu železa. Významnou súčasťou patogenézy infekcie N. gonorrhoeae je jej schopnosť úspešne kolonizovať slizničné povrchy hostiteľa a penetrovať do subepiteliálneho tkaniva. Predpokladom k tomu sú adhezíny (pilusy, LOS, Opa proteíny, PorB, App), ďalej schopnosť N. gonorrhoeae vytvárať v mieste adherencie bakteriálne agregáty, mikrokolónie a biofilm ako aj schopnosť vyhnúť sa imunitnému systému hostiteľa (proteáza IgA1, PorB, Rmp proteíny, tvorba biofilmu)242,244,246,251,252. Vzájomná interakcia medzi N. gonorrhoeae a epiteliálnym povrchom závisí od infekčnej dávky, charakteru epiteliálneho tkaniva, miesta infekcie a pohlavia253,254. Infekčná dávka sa u žien pohybuje medzi 102 až 107 zárodkov a u mužov okolo 103 zárodkov N. gonorrhoeae. N. gonorrhoeae má afinitu k cylindrickému a prechodnému epitelu urogenitálneho traktu, rekta, nosohltana a očných spojoviek. Dlaždicový epitel vagíny a vulvy dospelých žien nebýva postihnutý, nakoľko je odolnejší a navyše chránený estrogénmi. Na rozdiel od vyššieho epitelu a absencie ochranného vplyvu estrogénov u mladých dievčat, u ktorých môže byť postihnutá aj vulva a vagína. Inváziu a penetráciu N. gonorrhoeae do hostiteľských buniek sprostredkúva predovšetkým porín (PorB), buď samostatne alebo sprostredkovane Opa proteínmi, a adhezívno penetračný proteín (App). PorB inhibuje taktiež baktericídnu aktivitu komplementu a má schopnosť uvoľniť sa z vonkajšej membrány N. gonorrhoeae a premiestniť sa do mitochondrií hostiteľskej bunky, kde pri interakcii s napäťovo závislými anionickými kanálmi vyvolá apoptózu hostiteľskej bunky. Na 3. až 4. deň po infekcii preniká N. gonorrhoeae do subepiteliálneho tkaniva, kde sa množí, vyvoláva zápal, opuch sliznice a akumuláciu veľkého množstva polymorfonukleárnych leukocytov, lymfocytov a plazmatických buniek, čo tvorí hlavnú časť hnisavého exsudátu. Pri neliečených infekciách vznikajú fibrózne zmeny. K aktivácii polymorfonukleárov a tkanivovému poškodeniu dochádza predovšetkým v dôsledku produkcie TNF (TNF = Tumor Necrosis Factor) makrofágmi, ktoré reagujú na uvoľnený peptidoglykán a lipooligosacharid z deštruovaných buniek N. gonorrhoeae. Neisseria meningitidis Prvá kompletná nukleotidová sekvencia genómu N. meningitidis bola publikovaná v roku 2000 u kmeňov séroskupiny A a B, neskôr aj u kmeňa séroskupiny C. Genóm 318

N. meningitidis je približne o veľkosti 2,2 Mb, čo zodpovedá viac ako 2000 génom255,256. Porovnanie sekvencie gonokokového a meningokokového genómu poukázalo na viac ako 95 % homológiu medzi obidvoma druhmi. Tab. 6.23 Adhezíny a invázne proteíny N. meningitidis a N. gonorrhoeae Povrchová štruktúra Molekulová Druhové Vlastnosti Funkcia Cieľové Adherencia bunky hmotnosť zastúpenie a invázia Epiteliálne a endoteliálne Pili typu IV 15 – 20 kDa N. meningitidis Fázová Adherencia bunky a invázia človeka, N. gonorrhoeae a antigénna Adherencia erytrocyty a invázia Epiteliálne variácia bunky Adherencia človeka, Opacitné proteíny 24 – 35 kDa N. meningitidis Fázová fibronektín typu Opa N. gonorrhoeae a antigénna Adherencia Epiteliálne a variácia a endoteliálne Opacitné proteíny diseminácia bunky typu Opc 24 – 35 kDa N. meningitidis Fázová variácia Adherencia? človeka, aktivovaný NhhA 57 kDa N. meningitidis Autotransportér, Adherencia vitronektín Homológ a invázia a fibronektín (Nhha A = Neisseria N. meningitidis Adherencia Epiteliálne hia homológ A) N. gonorrhoeae Haemophilus bunky človeka App 160 kDa influenzae 180 kDa Epiteliálne (App = Adhesion Hsf/Hia bunky 38 kDa Autotransportér, človeka penetration protein) 157 kDa Homológ Adhezívno penetračný Niektoré proteín Haemophilus línie ľudských HrpA (TPS) influenzae Hap epiteliálnych buniek (HrpA = N. meningitidis Homológ Bordetella Epiteliálne Haemagglutinin/ pertussis FHA bunky človeka haemolysin-related Niektoré kmene Autotransportér, N. meningitidis Fázová variácia Epiteliálne a protein A) endoteliálne Hemaglutinín/ Niektoré kmene Autotransportér, bunky hemolyzín príbuzný N. meningitidis Sekrečná forma človeka proteín A NadA (NadA = Neisserial adhesin A) Neisériový adhezín A MspA (MspA = Meningococcal serine protease A) Meningokoková serínová proteáza A Medzi významné faktory virulencie N. meningitidis, obdobne ako pri N. gonorrhoeae, patria štrukturálne zložky vonkajšej membrány, sekrečné a translokačné proteíny a špecifické 319

receptory pre získavanie hémového a nehémového železa244,257-260 (Tab. 6.22, 6.23). Navyše, N. meningitidis má schopnosť syntetizovať tzv. železo regulujúce proteíny typu Frp A a Frp C (Ferrum regulated protein A, C), ktoré patria do tzv. rodiny RTX (Repeats in Toxin) proteínov Gram-negatívnych baktérií. Predpokladá sa, že uvedené proteíny majú význam pri diseminácii N. meningitidis počas infekcie. N. gonorrhoeae ani N. meningitidis neprodukujú toxíny250. Avšak, zásadný a podstatný rozdiel medzi obidvoma patogénmi je v schopnosti N. meningitidis syntetizovať polysacharidové puzdro (kapsulu) ako významný faktor virulencie261,262. Na základe charakteru kapsulárnych polysacharidových antigénov je známych u N. meningitidis 13 séroskupín, z ktorých minimálne päť sa významným spôsobom podieľa na meningitídach alebo septikémiách človeka (Tab. 6.24). Tab. 6.24 Medicínsky významné typy kapsúl N. meningitidis Typ Štruktúra Prevalencia Ďalšie vlastnosti kapsuly výskytu Nie je polymérom kys. sialovej. A (α1-6)-N-acetyl-D-manózoamín-1-fosfát Afrika, Homopolymér kys. sialovej, časť Ázie je slabým imunogénom, navyše vykazuje určitú časť Južnej krížovú reaktivitu s ľudským nervovým systémom. Ameriky Homopolymér kys. sialovej, B (α2-8)-N-acetylneuramínová kyselina Európa je dobrým imunogénom. Ázia Heteropolymér, obsahuje kys. sialovú. Severná Amerika Heteropolymér, obsahuje kys. sialovú. Južná Amerika Austrália Nový Zéland C (α2-9)-N-acetylneuramínová kyselina Európa Ázia Severná Amerika Južná Amerika Austrália Afrika W135 6-D-Gal(α1-4)-N-acetylneuramínová Afrika kys. Y 6-D-Glc(α1-4)-N-acetylneuramínová Severná Amerika kys. Pre obidva patogény je navyše príznačná ich schopnosť veľmi rýchlo meniť (modulovať) svoju povrchovú antigénnu výbavu. Niekedy hovoríme aj o schopnosti modulovať svoj antigénny make up. Schopnosť neustále meniť svoju povrchovú antigénnu výbavu dáva obidvom patogénom veľké predpoklady vyhnúť sa imunitnému systému hostiteľa v priebehu infekcie245,246,263. Na strane druhej, aj neustála extenzívna zmena v povrchovej antigénnej výbave môže prinášať určité problémy pri príprave efektívnych vakcín voči niektorým virulentným kmeňom, resp. séroskupinám N. meningitidis. Voči infekcii N. gonorrhoeae neexistuje doposiaľ žiadna účinná vakcína. 320

6.3.9 Rod Legionella Zástupcovia rodu Legionella sú štíhle, pleomorfné, pohyblivé Gram-negatívne tyčinky o šírke 0,3 – 0,9 μm a dĺžke 2 – 6 μm, ktoré sa podľa Grama farbia veľmi ťažko. V kultúrach môžu vytvárať vláknité formy o dĺžke až 10 μm. I napriek tomu, že sú prítomné v prostredí ako vodné saprofyty, sú veľmi náročné na kultiváciu264. Na rozdiel od iných Gram-negatívnych baktérií ich bunková stena obsahuje 2,3-dihydroxymastné kyseliny. Za ostatných 45 rokov, ktoré uplynuli od vypuknutia prvej epidémie v roku 1976 v hoteli Bellevue Stratford vo Filadelfii (USA) vyvolanej L. pneumophila, bolo objavených viac ako 60 druhov legionel, z ktorých viac ako polovica je pôvodcami chorôb (najmä pneumónií) človeka265. Legionely sa najčastejšie vyskytujú v prírodných vodných ekosystémoch (jazerá, potoky, rieky), v prírodných vodných rezervoároch, v priemyselných a odpadových vodách, v studničnej a vodovodnej vode, v termálnych vodách, sú prítomné v rozvodoch teplej a studenej vody v nemocniciach, hoteloch, ale aj v domácnostiach. Boli izolované z chladiacich veží klimatizačných zariadení, ďalej z rôznych systémov, kde sa vytvára aerosól ako sú sprchy, klimatizačné zariadenia, zvlhčovače vzduchu, vírivky, inhalačné prístroje a dekoratívne fontány. Legionely odolávajú pomerne dobre vysokým teplotám a chlórovým dezinfekčným prostriedkom, nakoľko dokážu parazitovať v amébach, ktoré sú prítomné vo vode, najmä v zástupcoch rodov Acanthamoeba, Naegleria, Hartmanella, Vahlkampfia, Echinamoeba266. Navyše, v rôznych rozvodových systémoch vody vedia vytvárať biofilm, najmä na miestach, kde má voda pomalší prietok, ďalej na slepých miestach potrubí a na ich gumených a silikónových tesneniach. I z uvedeného dôvodu sú preventívne opatrenia proti prameňom legionelových infekcií, zamerané na technickú úpravu, pravidelnú údržbu a dezinfekciu rozvodov vody (predovšetkým teplej úžitkovej vody), klimatických zariadení a zariadení vytvárajúcich aerosól. Vychádza sa zo skutočnosti, že k osídľovaniu uvedených systémov legionelami dochádza najčastejšie v dôsledku nedostatočnej dezinfekcie (chlórovania) vody a nedostatočného ohrevu teplej úžitkovej vody na požadovaných 60 °C. Legionelóza môže prebiehať buď ako život ohrozujúca pneumónia, tzv. legionárska choroba alebo ako tzv. Pontiacka horúčka, ktorá je nepneumonickou formou legionelózy, prípadne asymptomaticky267-270. Pôvodcom legionárskej choroby je v 80 – 90 % prípadoch L. 321

pneumophila, ktorá má 3 poddruhy a 16 séroskupín. Najčastejšie, až v 75 % je izolovaná L. pneumophila séroskupiny 1. Medzi ďalších významných pôvodcov legionárskej choroby človeka patrí L. anisa, L. bozemanae, L. dumoffii, L. jordanis, L. longbeachae a L. micdadei. Pôvodcom Pontiackej horúčky býva najčastejšie L. pneumophila, L. longbeachae, L. feelei, L. micdadei a L. anisa najmä u mladších osôb bez rizikových faktorov. Pontiacká horúčka bola prvýkrát popísaná v roku 1968 v meste Pontiac v štáte Michigan v USA. Ale až dodatočne, po vypuknutí epidémie legionárskej choroby v roku 1976 vo Filadelfii, sa zistilo, že pôvodcom Pontiackej horúčky bola L. pneumophila271. Retrospektívnym štúdiom boli objasnené aj iné dovtedy neodhalené epidémie závažných pneumónií v USA, pôvodcom ktorých boli legionely. Jedna z roku 1957 u zamestnancov mäsokombinátu v Austine (Minesota) a druhá z roku 1965 ako nozokomiálna infekcia u 81 pacientov v nemocnici svätej Alžbety pre duševne chorých vo Washingtone272. Legionelóza K infekcii sú vnímavejšie osoby staršie ako 50 rokov, ďalej pacienti s chronickými chorobami pľúc a obličiek, diabetici, pacienti s malignitami, imunosupresívne osoby, pacienti po transplantácii, pacienti po liečbe kortikosteroidmi alebo po rádioterapii, HIV pozitívni pacienti, fajčiari, alkoholici. Výskyt legionárskej choroby je 2,5-krát častejší u mužov ako u žien273. Človek sa nakazí vdýchnutím infekčného aerosólu obsahujúceho legionely274. Nie sú vylúčené ani iné cesty prenosu, tieto však neboli jednoznačne preukázané275. Obdobne ako nebol preukázaný prenos nákazy z človeka na človeka. Inkubačná doba sa u legionárskej choroby pohybuje medzi 2 až 10 dňami, najčastejšie však medzi 5 až 6 dňami. U Pontiackej horúčky je inkubačná doba 24 – 48 hodín, môže však byť aj o niekoľko hodín kratšia alebo dlhšia. Legionelózy sa vyskytujú celosvetovo. Buď sporadicky alebo ako epidémie, častejšie však v letných a jesenných mesiacoch, teda po letnom období, počas ktorého došlo k ich pomnoženiu vo vodnom prostredí. Legionárska choroba je nákaza povinná hláseniu. Slovensko patrí zatiaľ v Európe ku krajinám s relatívne nízkym výskytom legionelových infekcií. V roku 2015 bolo na Slovensku hlásených 13 prípadov legionárskej choroby a celková priemerná chorobnosť predstavovala 0,24 prípadov na 100 000 obyvateľov. 322

Legionárska choroba aj Pontiacká horúčka začínajú anorexiou, malátnosťou, bolesťami hlavy a svalov. Krátko nato nastupuje horúčka so zimnicou a teplotou okolo 39 – 40,5 °C. Typický je neproduktívny suchý kašeľ, bolesť brucha a hnačka. U legionárskej choroby sa rozvíja pneumónia a dochádza k multisystémovému postihnutiu. Úmrtnosť sa pohybuje od 10 % (u dovtedy zdravých osôb) do 30 – 50 % (u osôb s narušenou imunitou). Pontiacká horúčka je ľahké ochorenie bez postihnutia pľúc a iných orgánov. K uzdraveniu dochádza i bez terapie v priebehu 2 – 5 dní. Faktory virulencie L. pneumophila I keď mechanizmus virulencie L. pneumophila je komplexný, jej faktory virulencie možno rozdeliť aspoň do troch skupín. Prvú skupinu predstavujú „klasické“ faktory virulencie, ktoré sú dôležité z pohľadu jej adherencie a čiastočne aj jej prestupu do alveolárnych makrofágov, resp. protozoí (améby, slizovky). Patrí k nim predovšetkým lipopolysacharid, bičíky, fimbrie, sekrečný systém typu II, proteíny vonkajšej membrány, Mip proteín (Mip = Macrophage infectivity potentiator)276- 280. Z proteínov vonkajšej membrány je to predovšetkým hlavný proteín vonkajšej membrány MOMP (MOMP = Major Outer Membrane Protein), ktorý zabezpečuje tzv. na komplemente závislú fagocytózu L. pneumophila alveolárnymi makrofágmi. L. pneumophila prostredníctvom MOMP vyviaže na seba C3 zložku komplementu, pomocou ktorej je schopná naviazať sa na CR1 a CR3 receptory komplementu, ktoré sú na povrchu alveolárnych makrofágov. Makrofág následne L. pneumophila fagocytuje. Existuje aj tzv. na komplemente nezávislá fagocytóza L. pneumophila makrofágmi bez účasti MOMP. K ďalším významným proteínom L. pneumophila z pohľadu jej adherencie a následného prestupu do makrofágov, resp. protozoí patrí Mip proteín (Mip = Macrophage infectivity potentiator). Mip proteín o molekulovej hmotnosti 24 kDa je kódovaný konzervatívnym mip génom, na detekcii ktorého je založená taktiež diagnostika L. pneumophila pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR). Druhú skupinu faktorov virulencie L. pneumophila predstavuje Dot/Icm sekrečný systém typu IV, kódovaný skupinou 26 dot/icm génov (dot = defect in organelle trafficking/icm = intracellular multipication)281,282. Doposiaľ je známych viac ako 275 efektorových molekúl uvedeného sekrečného systému, ktoré sú zodpovedné za intracelulárne prežívanie a intracelulárnu replikáciu L. pneumophila v makrofágoch a ich následné uvoľnenie do prostredia 323

po deštrukcii makrofágov. Medzi ďalšie známe lokusy podieľajúce sa na intracelulárnej replikácii L. pneumophila v makrofágoch patrí mak (mak = macrophage killing), mil (mil = macrophage-specific infectivity loci) a pmi (pmi = protozoan and macrophage infectivity). Tretiu skupinu faktorov virulencie L. pneumophila predstavujú mnohé cytotoxíny, fosfolipázy, nukleázy, proteázy, proteíny tepelného šoku, β-laktamázy. L. pneumophila proteolyticky degraduje transferín metaloproteázou, ktorú produkuje do prostredia, čo vedie k uvoľneniu železa z transferínu a jeho následnému transportu do bunky. Legionely sú fakultatívne intracelulárne parazity. Množiť sa môžu v alveolárnych makrofágoch a monocytoch283. Už začiatkom 80-tych rokov bol popísaný životný cyklus L. pneumophila v amébach. Bolo taktiež zistené, že L. pneumophila má schopnosť sa replikovať intracelulárne v ľudských alveolárnych makrofágoch, nakoľko zabráni vytvoreniu fagolyzozómu. Neskôr bolo preukázané, že mechanizmus, akým legionely infikujú cicavčie fagocyty (makrofágy a monocyty) a améby je obdobný, vrátane génov a ich produktov, ktoré sa na uvedenom procese zúčastňujú. Infekcia fagocytov virulentnými legionelami sa udeje v niekoľkých krokoch za sebou. Po väzbe patogénu na povrchové receptory fagocytu dochádza k jeho fagocytóze. Nakoľko L. pneumophila má schopnosť zabrániť vytvoreniu fagolyzozómu, nielenže unikne jeho baktericídnemu účinku, ale vo fagocyte si vytvorí replikačnú vakuolu, kde dochádza k jej pomnoženiu a následne po deštrukcii fagocytu dochádza k jej uvoľneniu do prostredia a proces sa opakuje. Výsledkom infekcie L. pneumophila je mnohopočetná ložisková bronchopneumónia, neskôr vedúca k lobárnemu postihnutiu. 6.2.10 Rod Pseudomonas Zástupcovia rodu Pseudomonas sú aeróbne, spóru netvoriace, Gram-negatívne, rovné alebo mierne zakrivené tyčinky veľkosti 0,5 – 1,0 μm × 1,5 – 5,0 μm. Sú pohyblivé pomocou jedného alebo viacerých polárne umiestnených bičíkov. Väčšina druhov je oxidáza pozitívnych (s výnimkou Ps. luteola a Ps. oryzihabitans) a kataláza pozitívnych. Sú kultivovateľné pri teplote 37 °C na štandardných živných médiách, vrátane MacConkey agaru. Niektoré druhy rastú pri teplotnom rozmedzí od 5 °C do 42 °C. Pri kultivácii v tekutých alebo na pevných živných médiách je pre ne typická vôňa po jazmíne, lipovom kvete alebo jahodách. Niektoré z nich produkujú vo vode rozpustné pigmenty, ktoré difundujú do okolitého 324

prostredia. Je to predovšetkým modrozelený pyocyanín, žltozelený pyoverdín (fluoresceín), červený pyorubín a hnedočierny pyomelanín. Niektoré z pigmentov majú funkciu siderofórov. V súčasnosti je do rodu Pseudomonas zaradených viac ako 250 zástupcov. K najvýznamnejším potenciálnym patogénom rodu Pseudomonas, z hľadiska humánnej i veterinárnej medicíny, patrí Ps. aeruginosa. V humánnej medicíne sa môže ešte uplatniť Ps. putida, Ps. fluorescens, Ps. monteilii, Ps. otitidis, Ps. mosselii, Ps. stutzeri, Ps. mendocina, Ps. alcaligenes, Ps. pseudoalcaligenes, Ps. luteola a Ps. oryzihabitans. Ps. aeruginosa sa vo veľkej miere podieľa na kontaminácii nemocničného prostredia, vrátane kontaminácie katétrov, kanýl, dýchacích prístrojov, nebulizátorov, ale aj infúznych roztokov. Nozokomiálne infekcie vyvolané Ps. aeruginosa sú obzvlášť nebezpečné na jednotkách intenzívnej starostlivosti, resuscitačných a novorodeneckých oddeleniach. Riziku pseudomonádových infekcií sú vystavené najmä osoby s postihnutím imunitného systému, príjemcovia transplantátov, pacienti s rozsiahlymi popáleninami, cystickou fibrózou, malignitami (najmä pacienti s leukémiou), HIV pozitívne osoby284. Predispozičným faktorom infekcie je aj dlhodobé podávanie antibiotík, ťažké operačné zákroky, zavedenie cievnych kanýl alebo katétrov močových ciest, diabetes. Ohrozené sú aj nedonosené deti (enterokolitída, meningitída, sepsa). K infekcii Ps. aeruginosa môže dôjsť aj pri abrázii rohovky s následným vytvorením vredu na rohovke a jej ťažkým poškodením alebo stratou zraku. Opakované infekcie očí Ps. aeruginosa môžu byť vyvolané aj dlhodobým používaním kontaktných šošoviek. Infekcie očí a vonkajšieho zvukovodu pseudomonádami bývajú aj častým dôsledkom nedostatočných hygienických podmienok plavární („plavárenská konjunktivitída“, „plavárenské ucho“)285. Zástupcovia rodu Pseudomonas sú významní i z hľadiska potravinárskeho, nakoľko mnohí z nich rastú pri teplote 4 °C (chladničková teplota) a produkujú termostabilné proteolytické a lipolytické enzýmy, ktoré následne spôsobujú kazenie potravín. Patrí k nim Ps. aeruginosa, Ps. fluorescens, Ps. fragi, Ps. lundensis, Ps. putida, Ps. putrefaciens, Ps. chlororaphis, Ps. taetrolens, Ps. mudicolens a Ps. viridiflava286. Pri kazení mlieka a syrov sa najčastejšie uplatňuje Ps. fluorescens a Ps. lundensis. Kazenie masla (povrchové kazenie, hydrolytické žltnutie) okrem Ps. fluorescens spôsobuje často aj Ps. putrefaciens a Ps. fragi287,288. Pri kazení vajíčok sa uplatňuje Ps. taetrolens a Ps. mudicolens. Pri mikrobiálnom kazení mäsa sa z proteolytických a lipolytických pseudomonád uplatňuje najčastejšie Ps. fluorescens, Ps. fragi a Ps. lundesis289. 325

Faktory virulencie Ps. aeruginosa Medzi najdôležitejšie faktory virulencie Ps. aeruginosa patrí kapsula, lipopolysacharid, adhezíny, exotoxíny, vrátane hemolyzínov, siderofóry, tvorba biofilmu, bakteriocíny a pigmenty284,290-292. a) kapsula Kapsula chráni bakteriálnu bunku pred fagocytózou a baktericídnym účinkom krvného séra inhibíciou väzby C3b zložky komplementu na bakteriálnu bunku293,294. b) lipopolysacharid (LPS) Lipopolysacharid Ps. aeruginosa je dôležitým faktorom virulencie nielen prítomnosťou lipidu A, ktorý je súčasťou LPS (endotoxínová aktivita), ale taktiež dĺžka opakujúcich sa postranných polysacharidových reťazcov (O-antigénov) v lipopolysacharide je dôležitá pri ich rezistencii voči komplementovému systému krvného séra, t. j. baktericídnemu účinku krvného séra. Navyše, lipid A má schopnosť viazať sa na plazmový proteín, nazývaný lipid-viažuci proteín a spúšťať tvorbu a uvoľnenie prozápalových cytokínov295,296. c) adhezíny Funkciu adhezínov má niekoľko štrukturálnych útvarov Ps. aeruginosa. Tieto zahŕňajú jednak fimbriálne a afimbriálne adhezíny (pili typu IV, CUP fimbrie /Chaperone-Usher Pathway fimbriae/, lektíny), ktoré majú afinitu k určitým glykoproteínom epiteliálnych buniek297,298. Ďalej bičíky a niektoré proteíny vonkajšej membrány bakteriálnej bunky majú afinitu k hlienu a takto plnia funkciu nefimbriálnych adhezínov299,300. Bičíky majú aj schopnosť adherovať k respiračným epiteliálnym bunkám. Funkciu adhezínu plní aj lipopolysacharid, nakoľko má afinitu k proteínom membránových kanálov hostiteľských buniek pre transport iónov Cl- a alginát, mukoidný exopolysacharid , ktorý sa podieľa aj na tvorbe biofilmu301,302. Navyše, fimbriálne adhezíny väzbou na receptory podobné Toll receptorom na povrchu makrofágov a dendritických buniek spúšťajú tvorbu a uvoľnenie prozápalových cytokínov303. d) exotoxíny Ps. aeruginosa syntetizuje niekoľko exotoxínov proteínového charakteru (exotoxín A, S, T, U a Y), ďalej elastázu a veľký počet ďalších proteínov s biologickou aktivitou (proteázy a fosfolipázy)304-307. 326

Exotoxín A je intracelulárnym alebo dvojzložkovým toxínom, ktorý má väzobnú a toxickú zložku. Po väzbe na špecifický receptor hostiteľskej bunky preniká do cytoplazmy toxická zložka, ktorá blokuje syntézu proteínov, čo vedie k smrti bunky308. Funkciu hemolyzínu má jednak fosfolipáza C a potom termostabilný glykolipid (ramnolipid), ktorý je letálny pre myš a cytotoxický pre tkanivové kultúry309. Exotoxíny S, T, U a Y sú cytotoxické a do hostiteľskej bunky sú „injikované“ priamo sekrečným systémom typu III310,311. Tab. 6.25 Faktory virulencie P. aeruginosa Faktor virulencie Úloha v patogenéze Kapsula Chráni bakteriálnu bunku pred fagocytózou a baktericídnym účinkom krvného séra inhibíciou väzby C3b zložky komplementu na bakteriálnu bunku. Lipopolysacharid (LPS) Adherencia k epiteliálnym bunkám, rezistencia voči fagocytóze a baktericídnemu účinku krvného séra, vytvorený komplex CD14 – LPS je spúšťačom prozápalových cytokínov. Bičíky Motilita, adherencia k hlienu a respiračným epiteliálnym bunkám. Pili typu IV (Tfp) Adherencia k epiteliálnym bunkám a hlienu. Plnia taktiež funkciu (Tfp = Transformation frequency pilus) sekrečného systému typu IV. Zabezpečujú „twitching motility“. Exotoxín A (ADP-ribozyltransferáza) Cytotoxický účinok, invázia do tkaniva a usmrtenie buniek, imunosupresívny účinok. Elastáza (Las B a Las A) Poškodenie pľúcneho tkaniva a krvných ciev. Alkalická proteáza Poškodenie tkaniva. Fosfolipáza C (Hemolyzín) Poškodenie tkaniva, stimulácia mediátorov zápalu. Ramnolipid Poškodenie bunkových membrán a mukociliárnej aktivity (Hemolyzín s lecitinázovou aktivitou) riasinkového epitelu. Produkcia siderofórov Získavanie železa z prostredia. (pyoverdín, pyocyanín, pyochelín, pseudobaktín, tiochinolobaktín) Sekrečný systém typu III Cytotoxický účinok, invázia do tkaniva. (Exotoxíny S, T, U, Y) Tvorba biofilmu na báze alginátu Adherencia k epiteliálnym bunkám, rezistencia voči fagocytóze, (mukoidný exopolysacharid) antibiotikorezistencia. e) siderofóry Zástupcovia rodu Pseudomonas produkujú katecholátové aj hydroxamátové siderofóry. Prototypom katecholátových siderofórov produkovaných zástupcami rodu Pseudomonas je pyoverdín, pyochelín a ďalšie a prototypom hydroxamátových siderofórov je pseudobaktín. Avšak, Ps. aeruginosa využíva aj siderofóry produkované do prostredia inými baktériami, napr. enterobaktín (označovaný tiež ako enterochelín) produkovaný Escherichia coli a ďalšími zástupcami čeľade Enterobacteriaceae a aerobaktín produkovaný Aerobacter aerogenes a Escherichia coli290 . 327

f) pyocíny Pyocíny sú toxíny produkované takmer 90 % kmeňov Ps. aeruginosa. Sú proteínového charakteru, je ich niekoľko typov, jeden kmeň môže produkovať i niekoľko typov pyocínov a pôsobia letálne na iné príbuzné kmene toho istého druhu312. Pyocyanín pri kontakte s kyslíkom vytvára kyslíkové radikály, ktoré sú toxické pre eukaryotické a prokaryotické bunky. Bolo preukázané, že inhibuje proliferáciu lymfocytov hostiteľa313. Ps. aeruginosa sa proti vlastnému toxickému poškodeniu pyocyanínom bráni zvýšenou tvorbou katalázy (antioxidačný enzým, premieňajúci peroxid vodíka na vodu a kyslík) a superoxiddismutázy (antioxidačný enzým, premieňajúci superoxidové radikály na preroxid vodíka). Ps. aeruginosa môže vyvolať infekciu v ktoromkoľvek tkanive alebo orgáne a v ktorejkoľvek časti tela i keď je veľmi zriedkavo pôvodcom primárnych infekcií u zdravých ľudí alebo zvierat. Nebýva taktiež súčasťou normálnej mikroflóry tela, ale veľmi rýchlo osídľuje tie systémy hostiteľa, v ktorých najčastejšie po antibiotickej terapii došlo k narušeniu normálnej mikroflóry. K prognosticky najhorším infekciám, pôvodom ktorých je Ps. aeruginosa, patrí u ľudí infekcia pri popáleninách, sepsa novorodencov, osteomyelitídy a infekcie oka (najmä po devastačnom pôsobení proteolytických enzýmov). Prvým predpokladom infekcie je adherencia a kolonizácia Ps. aeruginosa, na ktorej sa v prvej fáze podieľajú fimbrie, predovšetkým pili typu IV. Svoju úlohu v adherencii majú taktiež bičíky a lipopolysacharid. Nastupujúca kolonizácia a replikácia Ps. aeruginosa je zabezpečovaná antifagocytárnymi vlastnosťami kapsuly, mukoidného exopolysacharidu (alginátu), lipopolysacharidu a antifagocytárneho účinku exotoxínu S294,301,302. Produkcia alginátu a tvorba biofilmu je zvlášť dôležitá pri patogenéze infekcie, spojenej so zavádzaním katétrov alebo kanýl. Ďalšími faktormi virulencie, ktoré prispievajú k rozvoju infekcie, je rezistencia Ps. aeruginosa ku komplementom sprostredkovanej lýze bakteriálnej bunky a získavanie železa pomocou siderofórov. Nasledovná invázia do tkaniva a jeho poškodenie je výsledkom viacerých extracelulárnych toxínov a enzýmov, predovšetkým exotoxínu A, fosfolipázy C a proteáz. Exotoxín A je dvojzložkovým toxínom, ktorý má väzobnú a toxickú zložku. Po väzbe na špecifický receptor hostiteľskej bunky pomocou väzobnej zložky preniká do cytoplazmy toxická zložka, ktorá blokuje syntézu proteínov, čo vedie k smrti bunky. Fosfolipáza C je hemolyzínom. Proteázy, vrátane elastázy poškodzujú bunky v pľúcach a krvných cievach. 328

Ps. aeruginosa je vybavený sekrečným systémom typu II a typu III314,315. V patogenéze infekcie vyvolanej Ps. aeruginosa sa uplatňuje predovšetkým sekrečný systém typu III, pomocou ktorého efektorové proteíny s cytotoxickým účinkom (exotoxíny S, T, U a Y) sú „injikované“ priamo do hostiteľskej bunky, čo má za následok nielen cytotoxický efekt na epiteliálne bunky a tkanivo, ale aj na funkciu neutrofilov a makrofágov. K rozsahu poškodenia prispieva aj tvorba kyslíkových radikálov pri kontakte pyocianínu s kyslíkom. Infekcia môže byť lokálna alebo môže dôjsť k jej diseminácii. K diseminácii infekcie napomáha exotoxín S a systémová toxicita je výsledkom exotoxínu A a endotoxínu. 6.3.11 Rod Francisella Zástupcovia rodu Francisella sú malé, Gram-negatívne, spóru netvoriace, nepohyblivé pleomorfné kokobacily veľkosti 0,4 – 0,6 × 0,8 – 1,0 μm. Vyskytujú sa vždy jednotlivo. Zástupcovia rodu Francisella síce nepredstavujú veľkú skupinu, navyše sú to mikroorganizmy s malou genetickou variabilitou, ale i napriek tomu zaberajú v prírode relatívne rôznorodé prostredie od potenciálnych endosymbiontov prvokov (améby) cez patogény morských rýb až po patogény suchozemských zvierat a človeka (Tab. 6.26). Tab. 6.26 Zástupcovia rodu Francisella a ich podiel na infekciách človeka a zvierat Druh a poddruh Význam Francisella tularensis Vysoko virulentný poddruh izolovaný v Severnej Amerike F. tularensis subsp. tularensis Pôvodca tularémie človeka a zvierat Menej virulentný poddruh izolovaný v Európe, Ázii a Severnej F. tularensis subsp. holarctica biovar I (erytromycín senzitívny) Amerike biovar II (erytromycín rezistentný) Pôvodca tularémie človeka a zvierat biovar japonica Mierne virulentný poddruh izolovaný v Strednej Ázii (Kazachstan, F. tularensis subsp. mediasiatica F. tularensis subsp. novicida Turkmenistan) Avirulentný poddruh izolovaný v štáte Utah (USA) Veľmi ojedinele popísané prípady tularémie u imunodeficientných Francisella philomiragia pacientov Rôzne, ale vzácne infekcie, najčastejšie pneumónie u pacientov Francisella noatunensis s chronickou granulomatóznou chorobou, pacienti po transplantácii Francisella orientalis orgánov, pacienti po topení sa v poloslanej alebo slanej (morskej) vode Francisella halioticida Patogén morských rýb Francisella hispaniensis Patogén morských rýb Francisella opportunistica Patogén mäkkýšov Izolovaná z krvi človeka Izolovaná z krvi a mozgomiešneho moku imunosupresívnych Francisella persica pacientov (Predtým Wolbachia persica) Izolovaná z Malpighiho rúrok kliešťa Argas (persic argas) arboreus, ktorý bol odstránený z hltavky chochlatej (Bubulcus ibis) v Egypte Francisella salimarina Izolovaná z morskej vody pri pobreží 329

Najväčší význam z nich má F. tularensis pôvodca tularémie človeka a zvierat. Podľa kategorizácie potenciálnych kandidátov pre biologické zbrane americkým Centrom pre kontrolu a prevenciu chorôb (CDC = Centers for Disease Control and Prevention) je F. tularensis zaradená do kategórie A – Najvyššia priorita spolu s Bacillus anthracis a Yersinia pestis. Z bakteriálnych toxínov je do kategórie A zaradený botulotoxín Clostridium botulinum a z vírusov je do kategórie A zaradený vírus pravých kiahní (Variola major) a vírusy hemoragickej horúčky (filovírusy – Ebola, Marburg a arenavírusy – Lassa, Machupol). Nanešťastie, F. tularensis ako aj ostatné baktérie, vírusy a botulotoxín tejto skupiny majú všetky atribúty, ktoré z nich robia potenciálne biologické zbrane kategórie A: vyvolávajú vysokú morbiditu a mortalitu, ľahko sa šíria, vyvolávajú paniku a narušujú sociálny systém a zdravotnícky systém by si vyžadoval špeciálne opatrenia na zvládnutie takýchto infekcií, resp. neurotoxickej intoxikácie316. U človeka môže desať mikroorganizmov virulentného kmeňa F. tularensis subsp. tularensis podaných subkutánne alebo 25 mikroorganizmov inhalovaných vyvolať život ohrozujúce ochorenie. Tularémia Tularémia (syn. zajačí mor, zajačia choroba) patrí medzi významné zoonózy s prírodnou ohniskovosťou a je povinná hláseniu. Pôvodcom tularémie ľudí je F. tularensis subsp. tularensis, ktorá sa vyskytuje v Severnej Amerike a patrí medzi najvirulentnejšie formy F. tularensis a potom menej virulentná F. tularensis subsp. holoarctica, ktorá sa vyskytuje v Európe, Ázii a Severnej Amerike. Na Slovensku cirkulujú kmene F. tularensis subsp. holoarctica, biovar II. Koncom osemdesiatych rokov minulého storočia boli u nás v prírodných ohniskách povodia Dunaja prvýkrát izolované kmene F. tularensis subsp. tularensis317. Nákaza cirkuluje v prírodnom ohnisku medzi rezervoárovými zvieratami. F. tularensis má neskutočne široké rezervoárové zázemie. Bola izolovaná u 190 druhov cicavcov, 23 druhov vtákov, 3 druhov obojživelníkov a 88 druhov bezstavovcov s rôznou vnímavosťou k infekcii, pričom každý poddruh F. tularensis má svoje „užšie“ alebo preferované hostiteľské zázemie. V Európe preferovaným hostiteľským zázemím pre F. tularensis subsp. holoarctica sú zajace (Lepus spp.) a hlodavce318,319. V Severnej Amerike preferovaným hostiteľským zázemím pre F. tularensis subsp. tularensis sú dvojitozubce (Lagomorpha) a pre F. tularensis subsp. holoarctica je to ondatra pižmová 330

(Ondatra zibethicus), bobor severoamerický (Castor canadensis) a hraboše (Microtus spp.). Je relatívne málo poznatkov o preferovanom hostiteľskom zázemí F. tularensis subsp. mediasiatica, ktorá bola izolovaná u zajacov a pieskomilov (Gerbillinae) alebo F. tularensis subsp. novicida. Nákaza môže byť prenášaná aj vektormi, predovšetkým kliešťami, ale aj komármi, muchami, ovadmi, všami, blchami, roztočmi, prípadne ďalšími artropódami, ktoré sú taktiež rezervoármi nákazy320. Tularémia je rozšírená celosvetovo a vyskytuje sa hlavne na severnej pologuli, najčastejšie na území USA, Kanady, Škandinávie, Strednej Európy, Strednej Ázie a Japonska48. Na južnej pologuli boli prvé prípady tularémie ľudí popísané v Austrálii v roku 2003 u muža, pôvodcom ktorej bola F. tularensis subsp. novicida a v roku 2011 u dvoch žien po poškrabaní a pohryzení vakovevericou sťahovavou (Pseudocheirus peregrinus), pôvodcom ktorej bola F. tularensis subsp. holarctica biovar japonica321. V roku 2016 bol potvrdený výskyt F. tularensis subsp. holarctica u vakoveverice sťahovavej. Bol to zároveň aj prvý záchyt francisely u zvieraťa v Austrálii322. Prvá písomná zmienka o chorobe podobnej tularémii je z Nórska z roku 1653, ktorá bola popísaná u lumíka pestrého, nazývaného tiež lumík nórsky (Lemmus lemmus). Na území bývalého Československa vypukla prvá epidémia tularémie v roku 1936 na juhovýchodnej Morave v okolí Břeclavi a Valtíc a priľahlej časti západného Slovenska (Záhorská nížina). V jeseni a zime uvedeného roku podľahlo nákaze, ktorá prebiehala väčšinou v ulceroglandulárnej alebo glandulárnej forme, takmer tristo ľudí v súvislosti s manipuláciou s odchytenými, ulovenými alebo uhynutými tularemickými zajacmi poľnými (Lepus europaeus). Druhá veľká epidémia tularémie ľudí vypukla na východnom Slovensku v rokoch 1967 – 1971 a prameňom nákazy bol premnožený škrečok poľný (Cricetus cricetus). K ďalším epidémiám tularémie na Slovensku u ľudí došlo v rokoch 1995 – 1996 a v roku 2002. Incidencia tularémie u ľudí na Slovensku mala od epidémie v roku 2002 klesajúci trend, v roku 2020 bolo hlásených 12 ochorení (chorobnosť 0,22/ 100 000 obyvateľov), čo je oproti roku 2019 pokles o 45 %, oproti 5-ročnému priemeru viac o 5 %. Podľa surveillance tularémie v krajinách EU/EEA za roky 2008 – 2012 sa celková priemerná chorobnosť ľudí pohybovala v rozmedzí od 0,15 do 0,21 prípadov na 100 000 obyvateľov. Najstaršou endemickou oblasťou výskytu tularémie na Slovensku je Záhorská nížina. Výsledky surveillance poukazujú na perzistenciu prírodných ohnísk tularémie a cirkuláciu F. tularensis v endemickej oblasti západného Slovenska s možnosťou ich ďalšieho rozširovania a rizikom akvirovania infekcie. 331

V našich podmienkach sa tularémia najčastejšie prenáša pri priamom styku s infikovanými zajacmi pri sťahovaní kože a kuchynskej úprave ako aj pri práci so stelivom a krmivom kontaminovaným výlučkami chorých zvierat a uhynutými hlodavcami. Od roku 1985 sa pozoruje aj výskyt prípadov ochorení prenesených kliešťami. Tam, kde prameňom nákazy sú poľné zajace, nákaza vrcholí v mesiacoch november a december a najviac ohrozenou skupinou sú poľovníci a ľudia, ktorí manipulujú s ulovenými zajacmi, prípadne pri spracovaní zveriny iného pôvodu. Druhou ohrozenou skupinou sú pracovníci v poľnohospodárstve a v niektorých potravinárskych podnikoch, nakoľko sa hlodavce v jesennom období sťahujú do blízkosti poľnohospodárskych objektov, skládok krmiva, steliva, skladov obilia, ale aj do iných spracovateľských podnikov alebo zariadení, napríklad do cukrovarov, liehovarov, škrobární (vzniká infekčný aerosól pri praní spracúvaných poľnohospodárskych plodín, ktoré sú veľakrát kontaminované exkrétmi hlodavcov, prípadne ich mŕtvymi telami). Tam, kde prameňom nákazy sú drobné hlodavce, nákaza vrcholí v mesiacoch január a február a súvisí to veľakrát s epidemickým výskytom tularémie medzi pracovníkmi v poľnohospodárstve. Infekcia sa neprenáša z človeka na človeka. Po inkubačnej dobe 1 až 10 dní (v priemere 2 až 5 dní) sa nákaza väčšinou prejavuje u všetkých foriem náhlym začiatkom s prudkým vzostupom telesnej teploty, bolesťami v krížoch a vo svaloch končatín. Z lokálnych prejavov je to zdurenie regionálnych lymfatických uzlín. Nákaza prebieha buď akútne alebo chronicky a podľa miesta vstupu patogénu sa rozlišujú vonkajšie a vnútorné formy tularémie. I keď klasifikácia klinických foriem tularémie nie je vo svete jednotná, v rámci Európy medzi základné klinické formy tularémie patrí: a) forma ulceroglandulárna je najčastejšou klinickou formou tularémie človeka (v 70 – 80 % prípadov) prejavujúcou sa horúčkou, triaškou a nevoľnosťou, vstupnou bránou infekcie je koža, pričom v mieste infekcie sa vytvorí bolestivý vriedok (ulcerácia) a zduria sa regionálne lymfatické uzliny; komplikáciou ulceroglandulárnej formy tularémie môže byť, až v tretine prípadov, kolikvácia a fistulovanie postihnutých lymfatických uzlín s vytekaním hnisavého obsahu z nich; b) forma glandulárna je podobná ulceroglandulárnej forme tularémie, pri ktorej však chýba vstupná kožná ulcerácia, buď preto, že vriedok sa zahojil ešte pred nástupom celkových príznakov infekcie alebo absencia lokálnej zápalovej reakcie (vytvorenie bolestivého vriedku) je dôsledkom prestupu patogénu cez neporušenú kožu; 332

c) forma orofaryngeálna (niektorými autormi nazývaná tiež ako forma oroglandulárna alebo faryngeálna), pri ktorej vstupnou bránou infekcie je sliznica dutiny ústnej a najčastejšie vzniká po požití kontaminovanej potravy, vody („vodné“ epidémie tularémie na východnom Slovensku v rokoch 1967 – 1971) alebo zanesením špinavými rukami; prejavuje sa exsudatívnou alebo membranóznou faryngitídou so zdurením krčných lymfatických uzlín; ak infekcia prenikne cez tonzily hovoríme o anginóznej forme tularémie, ktorá sa prejavuje nekrotickou angínou a zdurením podčeľustných lymfatických uzlín; d) forma okuloglandulárna vzniká po zanesení nákazy do spojovkového vaku; i keď sa vyskytuje asi u 1 % postihnutých, je to bolestivá forma infekcie s hnisavým zápalom spojiviek, opuchom viečok a zväčšením preaurikulárnych lymfatických uzlín na postihnutej strane; e) forma pľúcna (pneumonická, torakálna) vzniká po vdýchnutí kontaminovaného prachu alebo aerosólu, napr. pri spracovaní sena alebo slamy kontaminovaných močom hlodavcov; prejavuje sa ako atypická pneumónia so zápalom pohrudnice a zväčšením hilových lymfatických uzlín; f) forma intestinálna (abdominálna), pri ktorej infekčné agens preniká do organizmu cestou alimentárnou za rovnakých okolností ako pri forme orofaryngeálnej, preto sa tieto dve klinické formy tularémie môžu vyskytnúť súbežne alebo vo vzájomnej kombinácii; veľakrát sa najprv objavuje forma intestinálna, ktorá sa prejaví horúčkou, hnačkou, bolesťami brucha, zvracaním a zväčšením sleziny a až potom nastupujú príznaky orofaryngeálnej formy infekcie; intestinálna forma tularémie môže prejsť do tzv. formy tyfoidnej; g) forma tyfoidná je generalizovanou formou tularémie, ktorá sa vyskytuje v 10 – 15 % prípadov, pričom brána vstupu infekčného agensa sa často nezistí, predpokladá sa však, že vzniká po ingescii kontaminovanej potravy alebo nápojov, ale nevylučuje sa ani cesta inhalačná alebo prestupom infekčného agensa cez kožu; okrem vredov a krvácania v brušnej dutine sa objavujú príznaky sepsy a multiorgánového zlyhania; môže byť sprevádzaná sekundárnou pneumóniou, ťažkými hnačkami, hypotenziou a celkovým vyčerpaním323. Ulceroglandulárna, glandulárna, orofaryngeálna a okuloglandulárna forma infekcie sa považujú za vonkajšie formy tularémie. Ostatné klinické formy infekcie sú vnútornými formami tularémie. 333

Asi v 10 % prípadov môže infekcia prebiehať aj inaparentne a prejaví sa iba vzostupom špecifických protilátok. Avšak, v ťažkých prípadoch sa tularémia človeka môže komplikovať meningitídou, perikarditídou, endokarditídou, osteomyelitídou a septickou artritídou. Faktory virulencie F. tularensis Medzi najdôležitejšie faktory virulencie patogénnych poddruhov F. tularensis patrí predovšetkým kapsula, lipopolysacharid, pili typu IV (Tfp), ostrov patogenity (FPI), siderofóry324-327 (Tab. 6.27). Tab. 6.27 Faktory virulencie F. tularensis Úloha v patogenéze Faktor virulencie Chráni bakteriálnu bunku pred baktericídnym Kapsula účinkom krvného séra inhibíciou väzby C3b zložky komplementu na bakteriálnu bunku. Lipopolysacharid (LPS) Odlišný od endotoxínu ostatných Gram- negatívnych baktérií po stránke štruktúrnej aj Pili typu IV (Tfp) biologickej. Významná je jeho fázová variácia, (Tfp = Transformation frequency pilus) ktorá zabezpečuje antigénnu moduláciu a intracelulárne prežívanie francisel. Ostrov patogenity Plnia funkciu adhezínu, taktiež funkciu sekrečného (FPI = Francisella Pathogenicity Island) systému typu IV a zabezpečujú „twitching Kľúčové operóny FPI: motility“. a) mglAB (macrophage growth locus), Súbor 16 – 19 génov, ktoré kódujú faktory b) pdpAD (pathogenicity determining protein locus) virulencie spojené najmä s intracelulárnym c) iglABCD (intracellular growth locus) prežívaním a únikom francisel z fagozómu. Génmi AcpA, B, C, D a Hap A, B proteín uvedeného ostrova je syntetizovaný aj sekrečný (Acp = Acid phosphatase) systém typu IV a VI. (Hap = Histidine acid phosphatase) Produkcia polykarboxylátoveho siderofóru, ktorý je Proteíny inhibujúce respiračné vzplanutie štrukturálne podobný rhizoferínu (produkovaný plesňou makrofágov. Rhizopus spp.) Schopnosť získavať železo z prostredia. a) kapsula Kapsula chráni bakteriálnu bunku pred baktericídnym účinkom krvného séra inhibíciou väzby C3b zložky komplementu na bakteriálnu bunku. Nie je však dôležitá z pohľadu prežitia F. tularensis vo fagocytoch 325,328,329. b) lipopolysacharid (LPS) Lipopolysacharid F. tularensis je po stránke štrukturálnej aj biologickej odlišný od endotoxínu ostatných Gram-negatívnych baktérií330. Bolo zistené, že 70 % celkového množstva lipidu A prítomného v endotoxíne zástupcov rodu Francisella existuje vo “voľnej” forme neviazanej na jadro alebo polysacharid O antigénu. Táto 334

“voľná” forma lipidu A prechádza ďalej deacyláciou v porovnaní s “viazanou” formou lipidu A na LPS. I táto skutočnosť zrejme vysvetľuje jeho nízku endotoxínovú aktivitu, ktorá je viazaná na lipid A, nakoľko lipopolysacharid F. tularensis sa nepovažuje za spúšťača prozápalových cytokínov (interleukínu-1 a faktora nekrotizujúceho nádorové bunky). Pre lipopolysacharid F. tularensis je ďalej charakteristická fázová variácia, ktorá vedie k tvorbe jeho rôznych foriem odlišných vo svojej antigenicite (ako dôsledok fázovej variácie O antigénu) ako aj odolnosti voči toxickému pôsobeniu oxidu dusného vo fagocytoch (ako dôsledok fázovej variácie lipidu A). Fázová variácia lipidu A tak umožňuje intracelulárne prežívanie F. tularensis. c) pili typu IV Pili typu IV okrem funkcie adhezínu plnia aj funkciu sekrečného systému typu IV a zabezpečujú tzv. „twitching motility“331. Boli popísané taktiež pri Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Moraxella bovis, Pseudomonas aeruginosa, Eikenella corrodens, Vibrio cholerae, enteropatogénnych (EPEC) a enterotoxigénnych (ETEC) Escherichia coli a cyanobaktérií Synechocystis spp299,332-339. d) ostrov patogenity Ostrov patogenity predstavuje časť genómu francisel o veľkosti asi 30 kb nesúci 16 – 19 génov dôležitých z hľadiska ich virulencie spojenej predovšetkým s ich intracelulárnym prežívaním a únikom z fagozómu. Z ostrova patogenity je kľúčovým mglAB, pdpAD a iglABCD operón. Génmi uvedeného ostrova je syntetizovaný aj sekrečný systém typu IV a VI340. F. tularensis je fakultatívne intracelulárnym patogénom, ktorý sa primárne množí a prežíva v makrofágoch. Okrem makrofágov môže infikovať aj iné fagocytujúce bunky (neutrofily, eozinofily, dendritické bunky) a niektoré nefagocytujúce bunky (fibroblasty, hepatocyty, endoteliálne a epiteliálne bunky). I keď presný mechanizmus intracelulárneho prežívania tohto patogénu v hostiteľských bunkách doposiaľ ešte objasnený nebol, vie sa, že F. tularensis má schopnosť prežívať vo fagozóme. Po niekoľkých hodinách od infekcie uniká z neho do cytoplazmy, kde sa množí a do 24 hodín po apoptóze hostiteľskej bunky sa uvoľňuje do prostredia. Po uvoľnení do prostredia infikuje ďalšie bunky, najčastejšie makrofágy. K patogenéze choroby prispievajú nepochybne všetky doposiaľ známe faktory virulencie, i keď mnohé efektorové molekuly najmä sekrečného systému typu IV a VI ešte identifikované neboli. 335

6.3.12 Rod Aeromonas Zástupcovia rodu Aeromonas sú Gram-negatívne krátke alebo kokoidné tyčinky o veľkosti 0,3 – 1,0 × 1,0 – 3,5 μm, usporiadané jednotlivo alebo niekedy v krátkych retiazkach. Sú pohyblivé pomocou jedného polárne umiestneného bičíka s výnimkou A. salmonicida (nepohyblivý druh). Rastú pri teplote od 0 do 45 °C. Optimálna kultivačná teplota sa však pohybuje medzi 22 – 37 °C. Niektoré druhy, ako napr. A. salmonicida, nerastú pri teplote 35 °C, ale len pri teplote 22 – 28 °C. Optimálne pH prostredia kolíše medzi 5,5 – 9,0 a optimálna koncentrácia NaCl sa pohybuje medzi 0 až 4 %. Sú kultivovateľné na bežných živných médiách, vrátane MacConkey agaru. Na krvnom agare tvoria niektoré druhy hemolýzu po 24 – 48 hod. inkubácii341. V súčasnosti má rod Aeromonas viac ako 30 druhov. Zástupcovia rodu Aeromonas sa bežne vyskytujú vo vode, vrátane vody studničnej, vodovodnej, minerálnej balenej vo fľašiach, čerstvej, chlórovanej alebo mierne slanej342. Vyskytujú sa taktiež v odpadovej vode, pôde a v potravinách. Nachádzajú sa v tráviacom trakte človeka, zvierat a bezstavovcov, vrátane hmyzu343. Približne 1 – 4 % zdravých, asymptomatických nosičov v ľudskej populácii vylučuje aeromonády stolicou. U zvierat je percento asymptomatických nosičov aeromonád vylučovaných féces o niečo vyššie ako u ľudí. Súvisí to zrejme aj s pôvodom a charakterom prijímaného krmiva a vody. Aeromonády sú pôvodcami chorôb viacerých druhov teplokrvných a studenokrvných živočíchov, vrátane človeka, hospodárskych zvierat, žiab, sladkovodných a morských rýb. Niektoré z nich sú endosymbiontmi bezstavovcov344-346. Prvé infekcie vyvolané zástupcami rodu Aeromonas boli u ľudí diagnostikované a popísané v druhej polovici 60-tych rokov. Medzi najdôležitejšie patogény človeka z rodu Aeromonas patrí A. hydrophila, A. caviae a A. veronii. Tieto sú najčastejšie spájané s gastroenteritídou, predovšetkým u detí do dvoch rokov a osôb nad 60 rokov. Medzi ďalšie rizikové skupiny osôb náchylných k infekcii patria ľudia s oslabeným imunitným systémom, osoby s onkologickým ochorením, ľudia s imunosupresívnou terapiou a ľudia s chronickým základným ochorením (diabetes, hepatitída, cirhóza a pod.). Aeromonády však môžu spôsobiť aj extraintestinálne infekcie, najčastejšie infekcie rán, prípadne nekrotizujúcu fasciitídu. Medzi menej časté infekcie vyvolané aeromonádami patria meningitídy, endokarditídy, osteomyelitídy, cholecystitídy, peritonitídy, pneumónie, uretritídy, konjunktivitídy, prípadne septikémie347. K infekcii A. hydrophila a A. veronii môže dôjsť aj pri hirudoterapii pijavicou lekárskou 336

(Hirudo medicinalis), ktorá sa využíva napr. pri pooperačných zákrokoch, nakoľko aeromonády žijú ako endosymbionti v jej tráviacom trakte, kde napomáhajú tráveniu krvi. U pacientov, u ktorých bola vykonaná terapia pijavicami bez poskytnutia preventívnej antibiotickej liečby, sa incidencia výskytu aeromonádovej infekcie pohybuje medzi 2 – 36 %348. V nemocničnom prostredí prameňom aeromonádovej infekcie bývajú aj kontaminované katétre, prípadne nástroje alebo roztoky. Medzi ďalšie aeromonády, izolované z humánnych klinických vzoriek, patrí A. bestiarum, A. caviae, A. dhakensis, A. diversa, A. jandaei, A. media, A. popoffii, A. salmonicida, A. schubertii, A. sobria, A. taiwanensis a A. tecta. Prameňom infekcie okrem vody a pôdy, najmä kontaminovanej výkalmi, hnojom a organickým odpadom, môžu byť aj hospodárske zvieratá, najčastejšie ošípané, prežúvavce a kone a studenokrvné živočíchy, najmä korytnačky, žaby a hady. Nie na poslednom mieste prameňom infekcie môžu byť aj potraviny, najmä ryby, morské produkty, mäso, mlieko, mliečne výrobky a čerstvá zelenina349,350. Faktory virulencie zástupcov rodu Aeromonas Faktory virulencie sú u zástupcov rodu Aeromonas najlepšie preštudované pri A. hydrophila a A. salmonicida subsp. salmonicida341,351. Virulencia patogénnych kmeňov A. hydrophila a A. salmonicida subsp. salmonicida je multifaktoriálna a väčšinou spojená s tvorbou adhezínov, produkciou cytokínov, hemolyzínov, lipáz alebo proteáz, ďalej schopnosťou tvoriť biofilm a v neposlednom rade schopnosťou regulovať expresiu faktorov virulencie cestou quorum sensing. Navyše, patogénne druhy a kmene aeromonád využívajú na transport a vpravovanie efektorových molekúl do hostiteľských buniek niektorý zo sekrečných systémov352-359 (Tab. 6.28). Sekrečné systémy baktérií sú využívané mnohými bakteriálnymi patogénmi na interakciu s eukaryotickými hostiteľskými bunkami. Pri Gram-negatívnych baktériách bolo doposiaľ popísaných celkove šesť multigénnych sekrečných systémov označených ako sekrečný systém typu I – VI alebo T1SS – T6SS (z angl. Type 1 – 6 Secretion System)360. Jedná sa o zložité systémy, ktoré napomáhajú transportovať a vpravovať efektorové molekuly do hostiteľských buniek, buď pri ich priamom kontakte, prípadne tieto molekuly uvoľňujú v ich bezprostrednej blízkosti alebo k ich uvoľneniu dochádza v intracelulárnom prostredí hostiteľskej bunky, napr. na zabránenie vytvorenia fagolyzozómu. Sekrečné systémy sa čiastočne podieľajú aj na medzibunkovej komunikácii a to tak pri ich vzájomnej kooperácii ako aj pri ich vzájomnej kompetícii. 337

Tab. 6.28 Faktory virulencie A. hydrophila a A. salmonicida subsp. salmonicida Druh Faktor virulencie Funkcia A. hydrophila Bočné (laterálne) bičíky Spolu s polárnymi bičíkmi sa podieľajú na adherencii k enterocytom, kolonizácii povrchov slizníc a optimálnej (latA1 a latA2) Serínové proteázy tvorbe biofilmu. Enzýmy zo skupiny hydroláz, ktoré sú schopné štiepiť (aspA, ahp) peptidovú väzbu medzi dvoma aminokyselinami peptidového reťazca. Ich produkciou dochádza Hemolyzín k poškodeniu tkanív. Označovaný tiež ako aerolyzínu podobný cytotoxický (aer/hem, hlyA) enterotoxín (Act = Aerolysin-related cytotoxic enterotoxin). Má hemolytickú, cytolytickú a enterotoxickú aktivitu pri gastroenteritídach. Cytotonický termolabilný Označovaný tiež ako A. hydrophila heat-lable cytotonic enterotoxín (alt) enterotoxin (Alt). Aktivuje intracelulárny cAMP, čím dochádza k zvýšenej sekrécii vody a elektrolytov do lúmenu čreva. Cytotonický termostabilný Označovaný tiež ako A. hydrophila heat-stable cytotonic enterotoxín (ast) enterotoxin (Ast). Aktivuje intracelulárny cGMP, čím dochádza k zníženej resorpcii tekutín z čreva. Aerolyzín Termolabilný proteín, ktorý narúša integritu epitelových buniek čreva a vytvára póry (kanáliky) v ich plazmatickej membráne, ktorými unikajú z buniek životne dôležité ióny. Glycín C-acetyltransferáza Enzým s hemolytickou aktivitou. (GCAT = Glycine C-acetyltransferase) (gcat) A. salmonicida ADP ribozyltransferáza Označovaný tiež ako A. hydrophila exoenzyme T subsp. salmonicida toxín (aexT) (AexT). Quorum Sensing (QS) Má cytotoxickú aktivitu. Sekrečný systém typu II Zabezpečuje reguláciu expresie génov kódujúcich faktory (T2SS = Type 2 Secretion System) virulencie. Sekrečný systém typu III (T3SS = Type 3 Secretion Zabezpečuje translokáciu širokej škály efektorových System) proteínov bakteriálnej bunky cez periplazmatický priestor (ascV a ascU) a vonkajšiu membránu bakteriálnej bunky. Sekrečný systém typu VI (T6SS = Type 6 Secretion Zabezpečuje priame vpravovanie efektorových proteínov System) bakteriálnej bunky do cytosólu cieľovej hostiteľskej bunky. Má podiel na apoptóze hostiteľských buniek. Fimbrie typu I (fim) Podieľa sa na tvorbe biofilmu. Pili typu IV (tap, flp, msh) Obdobne ako T3SS zabezpečuje vpravenie efektorových proteínov bakteriálnej bunky priamo do cytosólu cieľovej Sekrečný systém typu III bunky. Je dôležitý z pohľadu invázie a intracelulárneho (T3SS = Type 3 Secretion prežívania patogénu v makrofágoch. System) (ascV a ascU) Podieľajú sa na adherencii baktérií k hostiteľským Vap proteín (vapA) bunkám. (Vap = Virulent A protein) Zabezpečujú adherenciu k hostiteľským bunkám a podieľajú sa na invázii do tkanív. Zabezpečuje priame vpravovanie efektorových proteínov bakteriálnej bunky do cytosólu cieľovej hostiteľskej bunky. Má podiel na apoptóze hostiteľských buniek. Podieľa sa na tvorbe biofilmu. Hlavný proteín S vrstvy na povrchu bakteriálnej bunky, ktorá zvyšuje rezistenciu k bakteriofágom, komplementu a proteázam, zvyšuje adhéziu baktérií k makrofágom, prienik do nich a následné prežívanie v ich vnútornom prostredí. 338

Glycerolfosfolipid Enzým s hemolytickou aktivitou. cholesterol acyltransferáza Označovaný tiež ako A. salmonicida exoenzyme T (GCAT) (gcat) (AexT). Má cytotoxickú aktivitu. ADP ribozyltransferáza Slúžia na príjem železa z prostredia. toxín (aexT) Siderofóry (aminobaktín a enterobaktín) Sekrečný systém typu III (T3SS) je obdobne ako sekrečný systém typu IV (T4SS) a sekrečný systém typu VI (T6SS) závislý na priamom kontakte s hostiteľskou bunkou, nakoľko uvedené systémy „injikujú“ efektorové molekuly priamo do cytosólu eukaryotickej bunky. Tieto sekrečné systémy sa označujú tiež ako jednokrokové tunely. T3SS sa skladá asi z 30 rôznych proteínov, ktoré sa podieľajú na stavbe základného tela T3SS ukotveného vo vonkajšej membráne bakteriálnej bunky, vonkajšej molekulovej ihly a translokátora zloženého z dvoch hydrofóbnych a jednej hydrofilnej domény. Súčasťou sekrečného systému sú efektorové molekuly a toxíny. Okrem translokácie bakteriálnych proteínov má T3SS schopnosť vyvolať u hostiteľskej bunky apoptózu. Predpokladá sa, že T3SS sa zúčastňuje taktiež na prvej fáze tvorby biofilmu, kde zaisťuje prichytenie baktérií k povrchu hostiteľských buniek. Sekrečný systém typu II (T2SS) je často označovaný za hlavnú sekrečnú cestu a spolu s T1SS a T5SS sa radí medzi tzv. dvojkrokové sekrečné procesy, nakoľko efektorový proteín (exoproteín) je najprv spolu so signálnym peptidom transportovaný do periplazmatického priestoru, kde dochádza k odštiepeniu signálneho peptidu a translokácii efektorového proteínu cez vonkajšiu membránu. Tento sekrečný systém má schopnosť sekretovať relatívne veľkú škálu efektorových proteínov. U zástupcov rodu Aeromonas je prítomný sekrečný systém typu II, III a VI361,362. 6.3.13 Rod Escherichia Zástupcovia rodu Escherichia sú Gram-negatívne, fakultatívne anaeróbne, rovné, pohyblivé tyčinky o veľkosti 1,1 – 1,5 × 2,0 – 6,0 µm. Vyskytujú sa jednotlivo alebo v dvojiciach. Niektoré kmene nie sú pohyblivé a niektoré vytvárajú kapsulu. Rod Escherichia bol vytvorený v roku 1919 a v súčasnosti má šesť zástupcov: E. albertii, E. coli, E. fergusonii, E. hermannii, E. marmotae a E. ruysiae363. Rod Escherichia je pomenovaný na počesť Theodora Eschericha (1857 – 1911), rakúsko- nemeckého lekára a bakteriológa, ktorý v roku 1885 popísal Bacterium coli commune, ktorá 339

bola neskôr premenovaná najprv na Bacillus coli, potom na Bacterium coli a od roku 1919 je to Escherichia coli. Všetci zástupcovia rodu Escherichia, s výnimkou E. marmotae, môžu byť pôvodcami chorôb človeka. Avšak, pri ochoreniach človeka a zvierat má najväčší význam E. coli. E. coli je komenzálom tráviaceho traktu človeka a zvierat, ale za určitých okolností aj ich fakultatívnym alebo primárnym patogénom. Infekcie človeka alebo zvierat, pôvodcami ktorých sú virulentné kmene E. coli, sú v princípe rozdelené do skupiny intestinálnych a do skupiny extraintestinálnych infekcií. Na obidvoch skupinách infekcií sa podieľajú rôzne fylotypy a patotypy E. coli364. Fylogenetické skupiny E. coli (Fylotypy) Na základe fylogenetickej analýzy je možné kmene E. coli rozdeliť do štyroch hlavných fylogenetických skupín (fylotypov) označených ako A, B1, B2 a D365. Fylogenetická analýza kmeňov E. coli je založená na detekcii prítomnosti, resp. neprítomnosti nasledovných genetických markerov: chuA (gén zodpovedný za transport hému, prvýkrát identifikovaný u E. coli O157:H7), yjaA (gén, funkcia ktorého nie je známa a pôvodne bol identifikovaný u E. coli K12) a DNA fragmentu TspE4.C2 (chromozomálna oblasť prvýkrát identifikovaná u E. coli spôsobujúcej neonatálnu meningitídu). U fylogenetickej skupiny A nie je prítomný ani jeden z uvedených genetických markerov (chuA-, yjaA- a TspE4.C2-). U fylogenetickej skupiny B1 je prítomný iba DNA fragment TspE4.C2 (chuA-, yjaA- a TspE4.C2+). U fylogenetickej skupiny B2 je prítomný genetický marker chuA a yjaA (chuA+, yjaA+ a TspE4.C2-). U fylogenetickej skupiny D je prítomný genetický marker chuA (chuA+, yja- a TspE4.C2-). Do fylogenetickej skupiny A patria komenzálne kmene a kmene intestinálnych patogénov E. coli366. Do fylogenetickej skupiny B1 patria environmentálne a komenzálne kmene E. coli a kmene intestinálnych patogénov E. coli. Do fylogenetickej skupiny B2 patria kmene extraintestinálnych patogénov E. coli. Do fylogenetickej skupiny D patria kmene intestinálnych patogénov E. coli. Kmene z jednotlivých fylogenetických skupín sa od seba vzájomne líšia svojím prostredím z ktorého sú izolované, profilom antibiotikorezistencie, faktormi virulencie, veľkosťou genómu 340

a rýchlosťou rastu. Kmene fylogenetickej skupiny B2 a D sú vybavené väčším počtom faktorov virulencie a väčším genómom v porovnaní s kmeňmi z fylogenetickej skupiny A a B1. Patotypy E. coli Rozdelenie kmeňov E. coli do patotypov je založené na ich vlastnostiach, ktorými sa uplatňujú ako intestinálne, resp. ako extraintestinálne patogény. Každý patotyp je definovaný jedinečným súborom faktorov virulencie, ktoré následne určujú patologické, klinické a epidemiologické, resp. epizootologické rysy choroby, ktorú príslušný patotyp vyvoláva. Úlohu v ich patogenite zohráva aj ich fylogenetický pôvod367,368. Humánne patotypy E. coli Na chorobách človeka, pôvodcami ktorých sú virulentné kmene E. coli, sa podieľa deväť patotypov E. coli. Z toho sedem patotypov E. coli je pôvodcom intestinálnych chorôb a dva patotypy E. coli sú pôvodcami extraintestinálnych chorôb364,368,369. Medzi patotypy E. coli, ktoré sa podieľajú na intestinálnych chorobách človeka, patria: enterotoxigénne E. coli (ETEC), enteroinvazívne E. coli (EIEC), enteropatogénne E. coli (EPEC), enteroagregatívne E. coli (EAEC), difúzno-adherentné E. coli (DAEC) a Shiga toxín produkujúce E. coli (STEC), súčasťou ktorých sú aj enterohemoragické E. coli (EHEC). Adherentno-invazívne E. coli (AIEC) nie sú niektorými autormi považované za samostatný patotyp, ale skôr za súčasť, resp. podskupinu enteroinvazívnych E. coli. ETEC, EPEC, DAEC a AIEC kolonizujú tenké črevo. EIEC, STEC a EHEC kolonizujú hrubé črevo a EAEC môžu kolonizovať tenké aj hrubé črevo. Najväčší zoonotický potenciál majú EHEC, ktoré sa môžu zo zvierat alebo kontaminovaných surovín a potravín živočíšneho a rastlinného pôvodu prenášať na človeka. Medzi patotypy E. coli, ktoré sa podieľajú na extraintestinálnych chorobách človeka, patria: uropatogénne E. coli (UPEC) a E. coli vyvolávajúce neonatálnu meningitídu (NMEC) a septikémiu (SEPEC). Ďalšie extraintestinálne patotypy E. coli sa môžu podieľať na infekcii mäkkých tkanív, infekcii respiračného traktu, peritonea, žlčníka, prostaty alebo kože. Intestinálne aj extraintestinálne kmene patogénnych E. coli patria vo vysokom percente k fylogenetickej skupine D, resp. B2, kým kmene komenzálnych E. coli sa najčastejšie zaraďujú do fylogenetickej skupiny A a B1. Do fylogenetickej skupiny A a B1 sú zaraďované aj niektoré patotypy intestinálnych kmeňov E. coli. 341

V Tab. 6.29 sú uvedené najvýznamnejšie faktory virulencie humánnych intestinálnych patotypov E. coli. Tab. 6.29 Najvýznamnejšie faktory virulencie humánnych intestinálnych patotypov E. coli Patotyp Akronym Faktory virulencie Ochorenie Pacienti/Klinické príznaky Enteropatogénne EPEC LEE lokus, intimín, Akútna/perzistentná Hlavne novorodené E. coli deti/Vodnatá hnačka, Bfp pilus hnačka Shiga toxín STEC/ Shiga toxíny (Stx1 Hemolyticko- zvracanie produkujúce EHEC uremický syndróm, a/alebo Stx2), LEE Hlavne deti do 5 E. coli/ lokus, fimbriálne hemoragická rokov/Krvavá hnačka Enterohemoragické kolitída, a nefimbriálne E. coli adhezíny trombocytopenická Enteroinvazívne EIEC Shiga toxíny, purpura Všetky vekové E. coli schopnosť invázie Šigelóze podobné kategórie/Vodnatá, a proliferácie ochorenie krvavá hnačka („coli-dyzentéria“) v enterocytoch, Ipa proteíny Adherentno- AIEC Fimbrie typu 1, Dáva sa do Všetky vekové invazívne E. coli schopnosť invázie súvislosti kategórie/Pretrvávajúci a proliferácie v s Crohnovou zápal čreva Enterotoxigénne ETEC enterocytoch chorobou Všetky vekové E. coli Adhezíny, kategórie/Vodnatá Novorodenecké enterotoxíny (LT, hnačky, hnačka hnačka ST) cestovateľov (traveller´s Difúzno-adherentné DAEC Adhezíny, diarrhoea) Najmä deti od 18 E. coli SAT proteín Hnačka detí mesiacov do 5 rokov/Vodnatá hnačka Enteroagregatívne EAEC Adhezíny, toxíny, Hnačka detí Hlavne deti, všetky E. coli sekrečné proteíny vekové kategórie pri imunokompromitovaných pacientoch/Vodnatá hnačka alebo hnačka s prímesou hlienu, niekedy sprevádzaná zvracaním Enterotoxigénne E. coli (ETEC) Enterotoxigénne E. coli sú najčastejšími pôvodcami novorodeneckých hnačiek a hnačiek cestovateľov (traveller´s diarrhoea) v rozvojových krajinách tropických a subtropických oblastí sveta370,371. Sérotypy enterotoxigénnych E. coli Medzi najčastejšie sérotypy ETEC patria O6:H16, O8:H9, O11:H27, O15:H11, O20:NM („nonmotile“), O25:H42, NM, O27:H7, O78:H11, H12, O128:H7, O148:H28, O149:H10, O159:H20 a O173:NM372,373. 342

Faktory virulencie enterotoxigénnych E. coli Medzi faktory virulencie ETEC patria najmä adhezíny a enterotoxíny374-376. Adhezíny Adhezíny sú buď funkčné jednotky (organely) zložené z proteínových podjednotiek alebo sú to jedinečné proteíny vonkajšej membrány. V každom prípade sú to vláknité (filamentózne) útvary vystupujúce z povrchu bakteriálnej bunky do prostredia370,375. Adhezíny, ktoré vytvárajú funkčné jednotky, zahŕňajú fimbrie. Adhezíny, ktoré nevytvárajú funkčné jednotky, sú tzv. afimbriálne (Afa) alebo nefimbriálne adhezíny. Adhezíny sú druhovo špecifické pre patogénne E. coli jednotlivých hostiteľov. a) fimbriálne adhezíny – fimbrie Fimbrie E. coli popísané u jednotlivých hostiteľov sa od seba líšia svojou veľkosťou, aminokyselinovým zložením, flexibilitou a schopnosťou aglutinovať erytrocyty za prítomnosti D-manózy. Väčšina kmeňov E. coli produkuje fimbrie typu 1 (F1), ktoré sa viažu na D-manózu. Z uvedeného dôvodu sú tieto fimbrie nazývané tiež ako manóza-senzitívne fimbrie, nakoľko v prítomnosti D-manózy neaglutinujú erytrocyty. Fimbrie typu 1 sú dôležité adhezíny uropatogénnych kmeňov E. coli. Avšak, väčšina patogénnych kmeňov E. coli produkuje manóza-rezistentné fimbrie, ktoré aglutinujú erytrocyty aj za prítomnosti D-manózy. Medzi druhovo špecifické manóza-rezistentné fimbrie ETEC humánneho pôvodu patria374,376- 385: - antigény kolonizačných faktorov (CFA = Colonization Factor Antigens): CFA/I (F2), CFA/II (F3), CFA/III, CFA/IV, CFA/V; - povrchové coli antigény (CS = Coli Surface): CS1, CS2, CS3, CS4, CS5, CS7, CS8, CS11, CS12, CS13, CS14, CS17, CS18, CS19, CS20, CS21, CS22; paradoxne CS6, CS10 a CS15 patria na základe svojho zloženia medzi nefimbriálne adhezíny; - putatívne (zdanlivé, predpokladané) kolonizačné faktory (PCF = Putative Colonization Factors) sú označené séroskupinou E. coli: PCFO157, PCFO166 a ďalšie. Medzi ďalšie významné fimbriálne adhezíny, ktoré sú produkované neenterotoxigénnymi kmeňmi E. coli, patria predovšetkým: agregatívno-adherenčné fimbrie, pilusy tvoriace zväzky, dlhé polárne fimbrie, fimbrie typu IV, P (Pap) fimbrie, M fimbrie, S fimbrie, F1C fimbrie, F1845 a „curli“ fimbrie. 343

Agregatívno-adherenčné fimbrie typu I a II (AAF/I a AAF/II) sprostredkúvajú adherenciu enteroagregatívnych E. coli (EAEC) k HEp2 bunkovej kultúre za in vitro podmienok. Pilusy tvoriace zväzky (Bfp = Bundle forming pili) sú produkované enteropatogénnymi E. coli. Tieto fimbrie tvoria „zväzky“ a sprostredkúvajú lokalizovanú adherenciu EPEC k HEp2 bunkovej kultúre za in vitro podmienok. Pilusy tvoriace zväzky spolu s EspA (Esp = E. coli secreted serine protease), proteínom vonkajšej membrány sprostredkúvajú prvú fázu adherencie EPEC k epiteliálnym bunkám tenkého čreva. Dlhé polárne fimbrie (LPF = Long Polar Fimbriae) sú fimbriálnym adhezínom enterohemoragických E. coli. Fimbrie typu IV okrem funkcie adhezínu plnia aj funkciu sekrečného systému typu IV a zabezpečujú tzv. „twitching motility“. Okrem enterotoxigénnych a enteropatogénnych E. coli boli popísané aj pri Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Moraxella bovis, Pseudomonas aeruginosa, Francisella tularensis, Eikenella corrodens, Vibrio cholerae a cyanobaktérií Synechocystis spp. P fimbrie sú fimbrie uropatogénnych E. coli, ktoré rozpoznávajú krvné antigény skupiny P a podieľajú sa na pyelonefritídach. P fimbrie sú označované tiež ako Pap fimbrie (Pap = Pyelonephritis associated pili). M fimbrie sú fimbrie uropatogénnych E. coli. S fimbrie sú fimbrie kmeňov E. coli, ktoré sú schopné rozpoznávať receptory obsahujúce kyselinu sialovú, nachádzajúcu sa na eukaryotických bunkách. Prítomnosť génov sfa kódujúcich S-fimbrie je typická pre extraintestinálne kmene E. coli, vyvolávajúce infekcie močových ciest, septikémie alebo meningitídy novorodencov. F1C fimbrie sú fimbrie E. coli, ktoré sprostredkúvajú adherenciu k epiteliálnym bunkám obličiek a podieľajú sa na pyelonefritídach. F1845 fimbrie sú fimbrie E. coli, ktoré sprostredkúvajú difúznu adherenciu pri difúzne adherentných E. coli. „Curli“ fimbrie patria medzi tzv. fibrilárne fimbrie, ktoré sú veľmi tenké, vysoko flexibilné a stočené, od čoho je odvodený aj ich názov. Sú produkované patogénnymi aj apatogénnymi kmeňmi E. coli a ďalšími zástupcami čeľade Enterobacteriaceae. Zabezpečujú adherenciu k extracelulárnym matrixovým proteínom ako je napr. fibronektín alebo laminín. Zohrávajú dôležitú úlohu pri tvorbe biofilmu, čo zabezpečuje ich prežitie aj vo vonkajšom prostredí. 344

b) nefimbriálne adhezíny Medzi nefimbriálne alebo afimbriálne adhezíny rôznych patotypov humánnych E. coli patrí intimín, adhezíny Afa/Dr rodiny, AIDA-I, LifA, Efa1, ToxB, Saa, OmpA, Iha, TibA386-390. Intimín je proteínom vonkajšej membrány o molekulovej hmotnosti 94 – 97 kDa a je zodpovedný za tvorbu tzv. „attaching and effacing“ lézií na sliznici hrubého čreva enteropatogénnymi E. coli a väčšiny sérotypov EHEC. Adhezíny Afa/Dr rodiny sa uplatňujú pri patogenéze hnačiek, pôvodcom ktorých sú najmä kmene difúzne adherentných E. coli. Adhezíny Afa/Dr rodiny sú prítomné aj pri uropatogénnych E. coli kmeňov ako je Dr adhezín, AfaE-I, AfaE-II, AfaE-III, AfaE-V. Afimbriálny adhezín AIDA-I (AIDA = Adhesin Involved in Diffuse Adherence) je autotransportérom, ktorý je produkovaný difúzne adherentnými E. coli a sprostredkúva difúzne adherentný fenotyp uvedeného patotypu. LifA (Lif = Lymphostatin) sprostredkúva u EPEC kmeňov spolu so svojím homológom Efa1 (Efa = EHEC factor for adherence) u EHEC kmeňov adherenciu k enterocytom. LifA je zároveň inhibítorom proliferácie lymfocytov a syntézy prozápalových cytokínov. ToxB (ToxB = Toxin B) je tiež homológom LifA a Efa1 a je produkovaný kmeňmi E. coli O157:H7, u ktorých sprostredkúva adherenciu k enterocytom. Označenie ToxB je odvodené od skutočnosti, že afimbriálny adhezín ToxB, ktorý je kódovaný toxB génom, je vo svojom aminokyselinovom zložení čiastočne podobný toxínu B Clostridium difficile. Afimbriálny adhezín Saa (Saa = Stx producing E. coli autoagglutinating adhesin) je izolovaný u non-O157 Shiga toxín produkujúcich kmeňov E. coli, ktorým chýba lokus LEE (LEE = Locus of Enterocyte Effacement). Proteín vonkajšej membrány OmpA (Omp = Outer membrane protein A) je adhezínom EHEC pri ich väzbe na enterocyty hrubého čreva. OmpA je prítomný aj u humánnych kmeňov E. coli, ktoré vyvolávajú meningitídu. Afimbriálny adhezín Iha (Iha = Iron regulated gene A homologue adhesin) je produkovaný kmeňmi EHEC sérotypu O157:H7 a kmeňmi EAEC sérotypu O104:H4. Autotransportér TibA je proteínom vonkajšej membrány o molekulovej hmotnosti 104 kDa, je produkovaný skupinou ETEC kmeňov, najmä séroskupiny O78:H11, sprostredkúva adherenciu k cicavčím bunkám a podieľa sa na tvorbe biofilmu. Toxíny intestinálnych a extraintestinálnych patotypov E. coli Toxíny intestinálnych a extraintestinálnych patotypov E. coli patria do skupiny enterotoxínov, hemolyzínov, cytotoxínov, genotoxínov a cyklomodulínov391-394. 345

Medzi najdôležitejšie enterotoxíny intestinálnych patotypov E. coli patria: termolabilné (LT) a termostabilné enterotoxíny (ST) enterotoxigénnych E. coli, enteroagregatívny termostabilný enterotoxín 1 (EAST1) a termolabilný, plazmidom kódovaný toxín (Pet= Plasmid encoded toxin) enteroagregatívnych E. coli a Shiga toxíny Shiga toxín produkujúcich E. coli. Shiga toxíny majú okrem enterotoxického aj neurotoxický a cytotoxický účinok395-397. Medzi najdôležitejšie hemolyzíny intestinálnych a extraintestinálnych patotypov E. coli patria: α-hemolyzín (HlyA), enterohemolyzín (Ehx) a hemolyzín označovaný buď ako hemolyzín E (HlyE), cytolyzín A (ClyA) alebo ako „silent“ toxín (SheA)398. Medzi najdôležitejšie cytotoxíny intestinálnych a extraintestinálnych patotypov E. coli patria: cytotoxický nekrotizujúci faktor 1 (CNF1) a apyráza (Apy). Cytotoxický účinok má aj termolabilný, plazmidom kódovaný toxín399,400. Medzi najdôležitejšie genotoxíny a cyklomodulíny intestinálnych a extraintestinálnych patotypov E. coli patrí cytoletálny distendujúci toxín (CDT) a faktor inhibujúci bunkový cyklus (Cif = Cycle inhibiting factor). Niektorí autori zaraďujú do skupiny genotoxínov a cyklomodulínov aj CNF1401-404. Termolabilné a termostabilné enterotoxíny enterotoxigénnych E. coli Poznáme dve formy termolabilných enterotoxínov E. coli, ktoré sú označené ako LT1 a LT2 (LT = Heat-labile Toxin ). LT1 je produkovaný kmeňmi E. coli, ktoré sú patogénne tak pre človeka, ako aj pre zvieratá. Je zodpovedný za vznik hnačky pri infekcii kmeňmi ETEC. Medzi LT1 a LT2 nedochádza ku krížovým imunologickým reakciám405,406. LT1 je toxín s molekulovou hmotnosťou približne 86 kDa. Obdobne ako všetky Shiga toxíny je aj LT1 AB5 holotoxínom a patrí do skupiny A-B toxínov, nakoľko pozostáva z jednej A podjednotky o molekulovej hmotnosti približne 28 kDa, ktorá sa nekovalentnou väzbou viaže s podjednotkou B, ktorá pozostáva z ďalších 5-tich identických subjednotiek (každá o molekulovej hmotnosti 11,5 kDa). Subjednotky B sú usporiadané do tvaru prstenca a pevne sa viažu ku gangliozidu GM1, menej pevne ku GD1b a niektorým glykoproteínom epiteliálných buniek čreva. Podjednotka A je zodpovedná za enzymatickú aktivitu toxínu a v hostiteľskej bunke je proteolyticky štiepená na A1 a A2 peptidy, ktoré sú spojené disulfidickou väzbou. Boli popísané dva príbuzné varianty LT1, ktoré vykazujú aj čiastočnú krížovú imunologickú reakciu, a to variant LTp (p = porcine/pig), variant izolovaný pri prasacích kmeňoch a variant LTh (h = human), variant izolovaný pri humánnych kmeňoch407. 346

Gény zodpovedné za produkciu termolabilných enterotoxínov (gén elt alebo etx) sú kódované na plazmidoch, často spolu s génmi zodpovednými za produkciu ST (ST = Heat-stable Toxin) a fimbriálnych antigénov. LT2 je primárne produkovaný kmeňmi E. coli izolovanými zo zvierat a ľudí. Avšak, ani u ľudí, ani u zvierat sa nepodieľa na vzniku hnačky. Aj u LT2 boli popísané dva antigénne varianty označené ako LT2a a LT2b, ktoré v podjednotke A vykazujú 71 % a v podjednotkách B 66 % identitu. Termolabilné enterotoxíny sú príbuzné v štruktúre i v mechanizme účinku na epiteliálne bunky čreva CT enterotoxínu Vibrio cholerae (CT = Cholera Toxin). Termostabilné enterotoxíny sú na rozdiel od oligomérnych termolabilných enterotoxínov malými monomérnymi toxínmi, ktoré pozostávajú z opakujúcich sa cysteínových zvyškov, ktorých disulfidické väzby zodpovedajú za termostabilitu týchto toxínov408-411. Sú známe dve formy ST, ktoré sa líšia štruktúrou a mechanizmom pôsobenia, a to STa a STb. Pri hnačkách ľudí vyvolaných kmeňmi ETEC sa uplatňuje STa. STa toxín (označený tiež ako STI) je produkovaný ETEC a mnohými ďalšími Gram- negatívnymi baktériami, vrátane Yersinia enterocolitica a Vibrio cholerae non-O1. STa má asi 50 % proteínovej identity s termostabilným EAST1 toxínom enteroagregatívnych E. coli. Niektoré kmene ETEC môžu produkovať STa spolu s EAST1. STa je peptidom s 18 – 19 aminokyselinami o molekulovej hmotnosti 2 kDa. Sú známe dva varianty STa a to variant STp (p = porcine/pig), variant izolovaný pri prasacích kmeňoch, označovaný tiež ako variant STIa a variant STh (h = human), izolovaný pri humánnych kmeňoch, označovaný tiež ako variant STIb. Receptorom pre obidva varianty STa je transmembránový proteín guanylcykláza C (GC-C) lokalizovaný v membráne apikálnej časti enterocytov. STb toxín (označený tiež ako STII) bol popísaný iba u ETEC. STb je toxínom, produkcia ktorého sa spája predovšetkým s ETEC, ktoré boli izolované z ošípaných. Boli však popísané aj humánne ETEC kmene pozitívne na produkciu STb. Receptorom pre STb je glykosfingolipid známy ako sulfatid. Gény (estA a estB), zodpovedné za syntézu obidvoch foriem ST, sú kódované na konjugatívnych plazmidoch. K infekcii dochádza hlavne po ingescii virulentného kmeňa ETEC užitím kontaminovanej vody alebo potravy. ETEC osídľujú tenké črevo pomocou špecifických adherenčných fimbrií 347

a k hnačke dochádza pôsobením termolabilného (LT1) alebo termostabilného (STa) enterotoxínu, prípadne oboch412,413. LT1 je svojou štruktúrou i spôsobom účinku podobný cholerovému toxínu, ktorý je produkovaný Vibrio cholerae. Aktivuje v enterocytoch tenkého čreva adenylátcyklázovú aktivitu, čím sa v bunkách zvyšuje produkcia cyklického adenozínmonofosfátu (cAMP), čo má za následok zvýšenú sekréciu tekutín a elektrolytov v tenkom čreve. STa aktivuje v enterocytoch tenkého čreva guanylátcyklázovú aktivitu, čím sa v bunkách zvyšuje produkcia cyklického guanozínmonofosfátu (cGMP), čo má za následok zvýšenú sekréciu chloridových iónov (Cl-) a akumuláciu sodíkových iónov (Na+) a vody v čreve. STb vyvoláva sekréciu HCO3- a Cl- z enterocytov, výsledkom čoho je difúzia Na+ a osmotická akumulácia vody v čreve. Choroba je sprevádzaná nevoľnosťou, zvracaním, vodnatou hnačkou a abdominálnymi kŕčmi (Tab. 6.29, 6.30). Tab. 6.30 Klinické prejavy hnačky človeka bakteriálneho pôvodu Patogén Inkubačná Trvanie Príznaky doba Hnačka Zvracanie Abdominálne Horúčka kŕče Salmonella spp. 6 hod. – 2 dni 48 hod. – 7 Vodnatá + + dní + Campylobacter 2 – 11 dní Krvavá - + spp. 3 dni – 3 + Shigella spp. 1 – 4 dni týždne Krvavá - + Vibrio cholerae 2 – 3 dni Vodnatá + + - Clostridium 8 hod. – 1 2 – 3 dni Vodnatá - + - perfringens deň + Yersinia 4 – 7 dní až 7 dní Krvavá - + enterocolitica + EPEC 12 hodín – 1 + + ETEC deň + + - EHEC + + + EIEC 1 – 2 týždne + + + + 1 – 2 dni Týždne Vodnatá 1 – 7 dní 2 – 6 dní Vodnatá 3 – 4 dni 5 – 10 dní Krvavá 1 – 3 dni 7 – 10 dní Krvavá Enteroinvazívne E. coli (EIEC) EIEC sú svojimi biochemickými, genetickými a patogénnymi vlastnosťami veľmi blízke zástupcom rodu Shigella. Sú nepohyblivé, netvoria fimbrie a sú laktóza negatívne. Sú dôležitými pôvodcami hnačiek a významnou príčinou morbidity a mortality detí v rozvojových krajinách, najmä pri zlých sociálnych podmienkach a nízkom stupni základnej hygieny. Vďaka svojim invazívnym vlastnostiam majú schopnosť proliferovať v enterocytoch hrubého čreva. Výsledkom infekcie je zápal a ulcerácia sliznice hrubého čreva s následnou smrťou 348

enterocytov. Faktory virulencie EIEC sú kódované plazmidom, známym ako pINV plazmid, ktorý nesie gény nevyhnutné pre virulenciu a invazivitu414-417. Medzi najdôležitejšie faktory virulencie EIEC a zástupcov rodu Shigella patrí produkcia Shiga toxínov a schopnosť invázie a proliferácie v enterocytoch. Podmienkou kompletnej virulencie kmeňov EIEC, resp. zástupcov rodu Shigella je expresia niekoľkých, tzv. Ipa (Ipa = Invasion plasmid antigen) proteínov kódovaných plazmidom pINV. Je to predovšetkým proteín A (71 kDa), B (62 kD), C (43 kDa) a D (38 kDa), syntéza ktorých je kódovaná ipa operónom (ipaA; ipaB; ipaC; ipaD) uvedeného plazmidu418. Medzi najčastejšie sérotypy EIEC patria O28ac:NM („nonmotile“), O29:NM, O112ac:NM, O124:H30, NM, O136:NM, O143:NM, O144:NM, O152:NM, O159:H2, NM, O164:NM a O167:H4, H5, NM403 Infekcia EIEC je sprevádzaná horúčkou, nepokojom, silnými abdominálnymi kŕčmi, vodnatou hnačkou vystriedanou hnačkou s prímesou hlienu a krvi v stolici (označovanou niekedy ako „coli-dyzentéria“) (Tab. 6.29, 6.30). Enteropatogénne E. coli (EPEC) Obdobne ako ETEC a EIEC, aj EPEC sú dôležitou príčinou hnačiek detí do veku 6 mesiacov života, najmä v rozvojových krajinách, ale aj v našich podmienkach403,419. Avšak, na rozdiel od ETEC a EIEC, enteropatogénne E. coli neprodukujú žiadne klasické enterotoxíny a nepenetrujú do intestinálnej sliznice, ale na enterocytoch tenkého čreva vyvolávajú histopatologické zmeny označované ako „attaching and effacing“ lézie. Tieto lézie sú tiež nazývané ako „vyhladzovacie“ alebo „A/E“ lézie420. Z uvedeného dôvodu sa tento patotyp enteropatogénnych E. coli označuje aj ako attaching/effacing E. coli (AEEC). Medzi faktory virulencie EPEC patrí produkcia tzv. Bfp pilusov (Bfp = Bundle forming pili) alebo pilusov tvoriacich zväzky, ďalej tvorba adhezínu nefimbriálneho typu, nazývaného intimín a v neposlednom rade tvorba proteínu, označeného ako Tir receptor (Tir = Translocated intimin receptor)421. Uvedené faktory virulencie zabezpečujú zhlukovanie a priľnutie EPEC na mikroklky enterocytov a ich následné skrátenie, až vyhladenie, prípadne deštrukciu422,423. V konečnom dôsledku to vedie k atrofii a smrti enterocytov. V elektrónovo-mikroskopickom obraze je pozorované typické piedestálové uloženie EPEC na povrchu enterocytov s vyhladenými mikroklkmi. I keď mechanizmus hnačky pri EPEC nie je ešte úplne objasnený, strata mikroklkov v tzv. A/E léziách vedie k maldigescii a malabsorpcii. Navyše, poškodenie enterocytov enteropatogénnymi E. coli vedie k poruche transportu iónov v čreve a zápal so zvýšenou intestinálnou permeabilitou má za následok hnačku. 349

Gény zodpovedné za tvorbu A/E lézií sú uložené jednak na plazmide virulencie a jednak na ostrove patogenity. Plazmid virulencie, označený ako EAF plazmid (EAF = EPEC Adherence Factor), nesie súbor 14-tich bfp génov424. Bfp pilusy spolu s EspA, proteínom vonkajšej membrány, sú zodpovedné za prvý kontakt a prvú väzbu EPEC na mikroklky enterocytov. EAF plazmid je prítomný iba u humánnych, nie však u animálnych kmeňov EPEC. Ostatné gény zodpovedné za tvorbu A/E lézií sú uložené na ostrove patogenity bakteriálneho chromozómu, ktorý je označený ako LEE lokus (LEE = Locus of Enterocyte Effacement). LEE lokus pozostáva asi zo 40 génov, ktoré kódujú niekoľko faktorov virulencie, ktoré sa zúčastňujú tvorby A/E lézií373,425-427. Je to predovšetkým intimín a receptor pre intimín známy ako Tir receptor, sekrečný systém typu III a efektorové proteíny428,429. Pomenovanie Tir receptora vychádza zo skutočnosti, že do bunkovej membrány hostiteľskej bunky (enterocytu) je premiestnený (translokovaný) až po jeho injikovaní s inými efektorovými proteínmi sekrečným systémom typu III do enterocytu čreva. Tir receptor takto zabezpečuje pevnú väzbu medzi EPEC a enterocytom, po ktorej nasleduje typické piedestálové uloženie EPEC na povrchu enterocytov s postupným vyhladzovaním mikroklkov. Enteropatogénne E. coli boli prvým patotypom popísaným pri E. coli. Boli izolované v roku 1945 v Anglicku pri hnačke dojčiat430. Medzi najčastejšie sérotypy EPEC patria O55:H6, O86:H34, O111:H2, H12, O119:H6, O125ac:H21, O126:H27, O127:H6, O128:H2, H12 a O142:H6373,419,431,432. Infekcia EPEC je sprevádzaná horúčkou, nepokojom, abdominálnymi kŕčmi, zvracaním a hnačkou s prímesou veľkého množstva hlienu. U detí je priebeh infekcie oveľa ťažší v porovnaní s ostatnými patotypmi E. coli infekcií. Infekcia môže pretrvávať i viac ako dva týždne a dehydratácia, ktorá sa môže rozvinúť veľmi rýchlo, je spojená s bezprostredným ohrozením života433,434 (Tab. 6.29, 6.30). Enteroagregatívne E. coli (EAEC) Enteroagregatívne E. coli, označované niekedy tiež ako EAggEC, sú významnou príčinou akútnych alebo pretrvávajúcich hnačiek detí a dospelých v rozvojových krajinách435. EAEC boli prvýkrát popísané v roku 1987 a svoje pomenovanie dostali podľa skutočnosti, že na HEp-2 bunkových kultúrach sa zhlukujú do agregátov pripomínajúcich stenu z naskladaných tehál. Hovoríme, že vykazujú agregatívny alebo AA typ adherencie, ktorá je sprostredkovaná hydrofóbnymi agregatívno-adherenčnými fimbriami typu I (AAF/I), typu II (AAF/II), typu III (AAF/III) alebo typu IV (AAF/IV), ktoré sú kódované plazmidom pAA436-440. EAEC na rozdiel od EPEC netvoria A/E lézie, nevyznačujú sa invazívnymi schopnosťami ako EIEC, nevytvárajú 350