E. Pilipčinec a kol._KEGA monografia 2022_č.j. 07UVLVF-4-2021

patogénov spôsobujúcich gastrointestinálne infekcie na 152 vzorkách stolice. Nielenže všetky tri systémy dosiahli vo väčšine prípadov 100 % špecificitu, ale boli schopné zaznamenať aj ko- infekcie nedetegované konvenčnými metódami68. Obr. 8.17 Schematické znázornenie detekcie patogénnych baktérií pomocou DNA mikročipov (Tkáčiková a Mydlárová Blaščáková 2015)8 Sondy komplementárne k cieľovým úsekom DNA detegovaných baktérií sú imobilizované na povrch sklíčka. Poloha každej sondy na sklíčku je známa. Sekvencia sond je komplementárna k cieľovým sekvenciám (napr. gény rezistencie voči antibiotikám, bakteriálne toxíny a iné faktory virulencie), ktoré budú detegované vo vzorke. V tejto schéme sú analyzované dve vzorky. Po extrakcii DNA sú vzorky vyšetrené pomocou PCR za použitia fluorescenčne značených primerov. Primery sú súčasťou PCR amplikónov, tzn. že sú fluorescenčne značené. Amplikóny sú použité na hybridizáciu s komplementárnymi sondami na DNA mikročipe. Po hybridizačnej reakcii je DNA mikročip ožiarený laserom a signál je zaznamenaný detektorom skenera. Získaný obraz je spracovaný a analyzovaný pomocou softwéru. DNA mikročipová metóda bola úspešne využitá aj pri vývoji multiplexného testu na detekciu 27 patogénov spôsobujúcich nozokomiálne infekcie dýchacieho aparátu69. Test bol založený na konsenzusových primeroch v kombinácii s imobilizovanými DNA sondami na pevnej fáze detegujúcich gény gyrA, fus/rps a COX-2 piatich Gram-pozitívnych, osemnástich Gram- negatívnych baktérií a štyroch druhov húb. Citlivosť tohto multiplexného detekčného systému bolo 10 až 1000 kópií DNA a špecificita bola porovnateľná s kultivačnými postupmi69. V klinických laboratóriách sa DNA mikročipy môžu využiť aj na identifikáciu mykobaktérií na základe PCR amplifikácie gyrB, rpoB a katG génov, ale aj na stanovenie ich antimikrobiálnej rezistencie napr. u Mycobacterium tuberculosis70,71. 551

Základom profilovania rezistencie mikroorganizmov je simultánna detekcia mnohých génov a mutácií. Kostić a spoluautori (2015) použili na identifikáciu a na profilovanie antibiotickej rezistencie LAMP metódu v kombinácii so 64 alebo 384 jamkovými Gene-Z mikrofluidickými čipmi72,73. Identifikácia bola zameraná na Enterococcus faecalis, E. faecium a S. aureus a do profilovania bolo zahrnutých 20 génov zodpovedných za antibiotickú rezistenciu. LAMP- Gene-Z metóda je rýchlou metódou, keďže v prípade vyšetrenia hrubého tepelne opracovaného bakteriálneho lyzátu, sa čas potrebný na identifikáciu a profilovanie skrátil na 30 minút. Pri porovnaní LAMP-Gene-Z s qPCR bola zhoda 98,2 %72. 8.1.2.4 Využitie sekvenovacích technológií v klinickej mikrobiológii Pomocou celogenómového sekvenovania je možné odhaliť prítomnosť fylogenetických markerových génov, ako aj génov faktorov virulencie a antibiotickej rezistencie analyzovaného mikroorganizmu. Od vynájdenia DNA sekvenovania došlo v tejto oblasti k rýchlemu rozvoju a bolo vyvinutých niekoľko metód. Vývoj sekvenovacích technológií umožnil hlbšiu analýzu genómových sekvencií organizmov. Súbory generované DNA sekvenátorom obsahujú DNA sekvencie zložené z reťazcov nazývaných čítania (z angl. reads). Každé čítanie predstavuje sekvenciu piatich písmen A, T, C, G a N. Prvé štyri reprezentujú nukleotidy adenín, tymín, cytozín, guanín a písmeno N reprezentuje nejednoznačné zaradenie nukleotidu v danej pozícii čítania74. Nasledujúce kapitoly budú venované krátkej charakteristike najčastejšie používaných sekvenčných technológií v genetickej analýze patogénnych mikroorganizmov. Detailný opis jednotlivých techník nájde čitateľ v publikáciách75-81. 8.1.2.4.1 Sekvenovanie podľa Sangera Haemophilus influenzae bola prvá baktéria, ktorej genóm o veľkosti 1 830 140 bp bol sekvenovaný pomocou Sangerovej metódy82. Krátko na to bola publikovaná prvá sekvencia eukaryotického organizmu Saccharomyces cerevisiae o veľkosti genómu 12 156 667 bp83. Metóda je založená na podobnom princípe ako PCR, ale okrem deoxyribonukleotid-trifosfátov (dNTP) sa používajú modifikované dNTP. Každý z nich je vo forme dideoxynukleotidtrifosfátu (ddNTP: ddATP, ddCTP, ddGTP alebo ddTTP), čo znamená že na 3’-uhlíku deoxyribózy im chýba hydroxylová skupina. Z toho dôvodu sa medzi ddNTP a nasledujúcim dNTP nemôže vytvoriť fosfodiesterová väzba a syntéza DNA vlákna sa zastaví. ddNTP sú okrem toho značené 552

unikátnym fluorochrómom. Každý DNA fragment má na 3’-konci vždy fluorochrómom značený ddNTP. Obr. 8.18 Schéma automatizovaného sekvenovania podľa Sangera, využívajúceho fluoroscenčne značené ddNTP a kapilárovú elektorforézu (Tkáčiková a Mydlárová Blaščáková 2015)8 Po sekvenovaní reakcie sú fragmenty na základe ich dĺžky (rozdiel v dĺžke týchto fragmentov je iba jeden nukleotid) elektroforeticky separované. V súčasnosti sa využívajú automatizované kapilárové sekvenátory. Výsledná sekvencia sa určuje zoradením fragmentov podľa dĺžky a fluorescenčného signálu z terminálneho nukleotidu (Obr. 8.18). Pre identifikáciu a diagnostiku patogénnych baktérií založenej na Sangerovej metóde je najvhodnejším fylogenetickým markerom rRNA, najmä 16S a 23S rRNA84. Najčastejšie analyzovaná molekula na identifikáciu mikrobiálnych druhov je 16S rRNA, ktorá je bohato zastúpená v baktériách. Jej dĺžka sa pohybuje okolo 1,5 kbp a je vysoko konzervatívna v štruktúre a funkcii s viacerými variabilnými oblasťami. Z toho dôvodu môžu byť rody a druhy rôznych patogénnych baktérií identifikované na základe sekvenovania 16S rRNA85-87. Identifikácia patogénnych baktérií pomocou Sangerovej metódy je založená na PCR amplifikácii pomocou univerzálnych primerov špecifických pre 16S rRNA gén a následnom sekvenovaní génu v plnej dĺžke. Nevýhodou tejto stratégie je, že pre tieto účely sa musí použiť čistá bakteriálna kultúra. Podiel pozitívnych kultivácií z klinických vzoriek je veľmi nízky, mnoho bakteriálnych druhov nemožno týmto spôsobom detegovať a zmes génov 16S rRNA 553

nemožno použiť na druhovú diferenciáciu. Časová náročnosť Sangerovej metódy a kultivácie v súčasnej dobe nespĺňa požiadavky na včasnosť klinických testov. 8.1.2.4.2 Sekvenovanie novej generácie Sekvenovanie novej generácie (NGS = Next Generation Sequencing) má potenciál urýchliť biologický a biomedicínsky výskum74. NGS je vhodné nielen na sekvenovanie a resekvenovanie genómu, ale aj na analýzu transkriptómu (RNA-Seq), charakterizáciu interakcií DNA a proteínov a epigenomiku88. Komerčné spoločnosti v súčasnej dobe poskytujú klinické mikrobiologické testovanie pomocou NGS. Najzaužívanejšou NGS technológiou je Illumina, ktorá je založená na tzv. sekvenovaní syntézou (angl. sequencing by synthesis), tiež známou pod názvom cyklická reverzibilná terminácia (angl. cyclic reversible termination) na pevnej fáze. Na povrchu prietokových buniek (angl. flow cells) sú imobilizované primery o vysokej hustote, ktoré slúžia na zachytenie (angl. capture) analyzovaných DNA fragmentov – templátov. Pred samotným sekvenovaním je nevyhnutná príprava DNA knižnice. V prvom kroku je analyzovaná DNA fragmentovaná na krátke úseky, na ktorých oba konce sú enzymaticky pripojené adaptéry (Obr. 8.19). Adaptéry sú syntetické DNA oligonukleotidy, ktoré obsahujú funkčné sekvencie nevyhnutné pre imobilizáciu fragmentov na pevnú fázu, pre amplifikáciu a pre hybridizáciu sekvenovacích primerov. Templáty hybridizujú s imobilizovanými primermi na dne prietokových nanobuniek prostredníctvom komplementárnych sekvencií adaptérov. Po pridaní reagencií potrebných pre amplifikáciu, na každom imobilizovanom templáte DNA polymeráza syntetizuje komplementárne vlákno, čím sa vytvoria dsDNA „mostíky“ (Obr. 8.19). Po denaturácii je premývaním templát odstránený a na pevnej fáze ostáva imobilizované komplementárne vlákno. Tento proces sa nazýva aj ako „mostíková amplifikácia“. V ďalšom kroku adaptér novosyntetizovaného komplementárneho vlákna hybridizuje s vedľajším imobilizovaným primerom. DNA polymeráza syntetizuje nové vlákno. Tento proces sa nazýva aj ako „mostíková PCR“ a po denaturácii mostíka vzniknú dve imobilizované ssDNA vlákna. Mnohonásobným opakovaním tohto procesu vzniknú milióny priestorovo lokalizovaných súborov nazývaných klastre, ktoré obsahujú tisíce identických templátových DNA sekvencií79. Po vytvorení klastrov nasleduje samotné sekvenovanie. Názov sekvenovanie syntézou poukazuje na to, že pri tomto procese sekvenovanie prebieha prostredníctvom postupnej syntézy DNA vlákna. Využívajú sa tu fluorescenčne značené 554

nukleotidy, tzv. reverzibilné terminátory. Na rozdiel od ddNTP, používaných pri Sangerovej metóde, reverzibilné terminátory, používané pri technológii Illumina, majú na 3´-uhlíku inhibičnú skupinu a na báze odstrániteľný fluorochróm. Obr. 8.19 Schematické znázornenie tvorby klastrov pri NGS platforme Illumina (Metzker 2010 https://emea.illumina.com/ upravené)79,89 (A) Vzorované prietokové bunky obsahujú miliardy nanobuniek, ktoré poskytujú rovnomerné rozmiestnenie a veľkosť klastrov pre dosiahnutie ich vysokej hustoty. (B) Templáty s adaptérmi sú prostredníctvom primerov naviazaných na dne nanobuniek imobilizované na pevnej fáze. (C) Mostíkovou amplifikáciou sú templáty amplifikované, vďaka čomu sa vytvoria milióny klastrov pozostávajúcich z identických DNA templátov. Po odstránení fluorochrómu a inhibičnej skupiny a po regenerácii hydroxylovej skupiny redukčným činidlom, môže syntéza DNA vlákna pokračovať. Samotný proces sekvenovania zahŕňa postupnú inkorporáciu reverzibilných terminátorov, fluorescenčné zobrazenie a štiepenie reverzibilného terminátora (Obr. 8.20). Do prietokovej bunky sú pridané univerzálne sekvenovacie primery, všetky štyri reverzibilné terminátory a DNA polymeráza. Sekvenovacie primery hybridizujú s komplementárnou sekvenciou adaptéra, ktorá je súčasťou imobilizovaného templátu. Polymeráza pridá k 3´-koncu sekvenovacieho primera len jeden komplementárny fluorescenčne modifikovaný reverzibilný terminátor (Obr. 8.20). Ukončenie syntézy DNA po pridaní jediného nukleotidu je nevyhnutným predpokladom sekvenovania syntézou. Po inkorporácii sa zvyšné nukleotidy vymyjú. Následne je prietoková bunka ožiarená laserom a na základe emitovaného fluorescenčného signálu sa určí identita 555

inkorporovaného nukleotidu. Po premytí prietokovej bunky sa inkorporácia, detekcia fluorescencie, odstránenie inhibičnej skupiny s fluorochrómom mnohonásobne opakuje, vďaka čomu je DNA templát po celej dĺžke sekvenovaný. Detailný opis Illumina technológie, vrátane charakteristiky reverzibilných terminátorov nájde čitateľ v Metzker (2010)79. Obr. 8.20 Schematické znázornenie sekvenovania syntézou a záznam fluorescenčného signálu (Metzker 2010 upravené)79 (A) Pri technológii Illumina sa na sekvenovanie imobilizovaných templátov na pevnej fáze využívajú fluorescenčne značené reverzibilné terminátory. (B) Štvorfarebný obrazový záznam znázorňujúci sekvenčné záznamy fluorescenčných signálov. Uvedené dve sekvencie sú výsledkom konverzie farebného kódovania do poradia nukleotidov z dvoch templátov (zakrúžkované na obrázkoch). Vzhľadom na limity kultivačných metód a vplyv antibiotickej liečby je miera pozitivity klinických mikrobiologických testov nízka a nie je možné odhaliť vzácne, neznáme alebo nové 556

patogény. Na identifikáciu patogénov v rôznych klinických vzorkách sa môže použiť aj NGS, pričom táto metóda v porovnaní s ELISA, PCR a hybridizačnými čipmi vykazuje vyššiu presnosť90. V roku 2010 sa celogenómové sekvenovanie bakteriálnych patogénov začalo presúvať z výskumných laboratórií do praxe verejného zdravotníctva91. Jednou z prvých takýchto štúdií vo verejnom zdravotníctve bola analýza epidemiológie nozokomiálnych infekcií Acinetobacter baumannii92. NGS bolo použité aj v prípade štrnásť ročného chlapca s ťažkou kombinovanou imunodeficienciou (SCID), ktorý bol hospitalizovaný pre horúčku a bolesť hlavy niekoľkokrát v priebehu 4 mesiacov. Lekári nedokázali diagnostickým vyšetrením, vrátane biopsie mozgu, určiť príčinu ochorenia. Pomocou NGS bol identifikovaný druh leptospiry, takže lekári mohli začať s účinnou terapiou vysokými dávkami penicilínu93. Potravinami prenášané patogény sú globálne významnou príčinou chorobnosti a úmrtnosti. NGS je možné použiť počas vypuknutia epidémií94. Počas epidémie otravy z jedla v čínskom meste Nanjing bola u hnačkujúcich pacientov pomocou NGS identifikovaná Salmonella Schwarzengrund. Okrem identifikácie tohto patogénu pomohlo NGS aj pri vystopovaní zdroja kontaminácie95. Výskyt sepsy, vážnej, život ohrozujúcej infekcie s vysokou mierou úmrtnosti, sa v poslednom čase zvyšuje96. Odhaduje sa, že sepsou trpí každoročne na celom svete viac ako 30 miliónov ľudí, čo vedie približne k 6 miliónom úmrtí97. Okrem určenia zastúpenia mikroorganizmov vo vzorkách je možné pomocou NGS podrobnejšie charakterizovať získané izoláty patogénnych baktérií. Paramita a kol. (2020)98,99celogenómovo analyzovali 22 izolátov E. coli z prípadov bakteriémie, ktoré charakterizovali na úrovni sérotypov, MLST (Multi Locus Sequence Type), génov virulencie a génov pre antibiotickú rezistenciu. Zaznamenali 12 sekvenčných typov, z ktorých ST131, všeobecne spájaný s prípadmi bakteriémie, bol detegovaný v 11 prípadoch. Dvadsať izolátov malo gény virulencie pre adherenciu a 15 malo gény kódujúce faktory virulencie, zodpovedné za únik pred imunitnou odpoveďou. ESBL (Extended spectrum β- lactamase, β-laktamázy so širokým spektrom účinku) gény boli prítomné v 17 izolátoch a okrem nich boli zaznamenané aj gény pre rezistenciu voči aminoglykozidom, chinolónom, chloramfenikolu, makrolidom a trimetoprimu. Z fylogenetického hľadiska prevažovali fylogenetické skupiny D a B2, v rámci ktorých boli zaznamenané podskupiny. Analyzované izoláty vykazovali pestrú diverzitu sérotypov98,99. Okrem uvedených prípadov sa NGS použilo na mnohé ďalšie klinické infekcie, ale stále existujú určité nedostatky a technické problémy tejto techniky. Čítania z NGS sú relatívne krátke (do 300 bp), preto je ťažké získať informácie, ako napríklad sekvencie génov rezistencie voči antibiotikám, v plnej dĺžke. Mapovanie krátkych čítaní zvyšuje šancu nepresnej 557

interpretácie výsledkov100,101. Miera detekcie niektorých intracelulárnych patogénov s nízkym výskytom v organizme, ako sú M. tuberculosis, legionely, brucely a huby s hrubými bunkovými stenami, je nízka. Časť extrahovanej DNA pochádza z mŕtvych baktérií a preto pomocou NGS nie je možné určiť, či zistená sekvencia pochádza zo živých alebo mŕtvych baktérií. Čas sekvenovania je o niečo dlhší ako pri iných technikách. Napríklad sekvenovanie pomocou Illumina technológie môže od spustenia sekvenovacieho systému po získanie údajov zabrať viac ako 60 hodín, čo v prípade život ohrozujúcich stavov, napríklad sepsy môže mať fatálne následky102. 8.1.2.4.3 Sekvenovanie tretej generácie Hoci technológie NGS priniesli oproti Sangerovmu sekvenovaniu veľké zlepšenie, ich obmedzenia (najmä krátka dĺžka čítania), ich robia nevhodnými na riešenie niektorých konkrétnych biologických problémov, vrátane zostavovania a určovania komplexných genomických oblastí. Technológia sekvenovania tretej generácie dokáže generovať čítania dlhšie ako 1 Mbp103, ktoré sa už dajú použiť nielen na sekvenovanie mikrobiálneho metagenómu, ale aj na priamu analýzu 16S rRNA v plnej dĺžke a tým aj druhovú identifikáciu patogénnych baktérií. Single-Molecule Real-Time sekvenovanie Single-Molecule Real-Time (SMRT) sekvenovacia technológia bola vyvinutá spoločnosťou Pacific BioSciences (PacBio). V literatúre sa technológia nazýva ako „sekvenovanie PacBio“, ale rovnako sa používa aj označenie „sekvenovanie SMRT“. Na rozdiel od NGS je sekvenovanie PacBio metódou v reálnom čase, ktoré deteguje informácie priamo počas procesu replikácie cieľovej molekuly DNA. Sú tu eliminované jednotlivé kroky (inkorporácia reverzibilného terminátora, premývanie, detekcia fluorescencie, odstránenie inhibičnej skupiny a fluorochrómu, premývanie atď.), ktoré sú súčasťou technológie založenej na sekvenovaní syntézou104. Templátom je uzavretá kruhová ssDNA, ktorá sa vytvára ligáciou vlásenkových adaptérov na oba konce analyzovanej dsDNA molekuly (nazývaný ako SMRTbell) (Obr. 8.21). 558

Obr. 8.21 Schématické znázornenie templátu SMRTbell (Travers a kol., 2010 upravené)105 (A) Templát SMRTbell sa skladá z dsDNA oblasti (analyzovaná DNA molekula), ktorú lemujú dve slučky. Slučky sú oblasti ssDNA, na ktorú sa môže viazať sekvenovací primer (oranžová farba). (B) Keď polymeráza (sivá) predlžuje primer z jednej zo slučiek, používa jedno vlákno ako templát a odsúva druhé vlákno – tzv. strand displacement aktivita. Keď sa polymeráza vráti na 5´-koniec primeru, začne odsúvať vlákno primeru, ktoré bolo syntetizované v predchádzajúcom kole a pokračuje v syntéze DNA (pohybuje sa v smere modrej šípky). Preto dĺžka sekvencie získanej z týchto templátov nie je obmedzená dĺžkou analyzovanej DNA molekuly. Templát difunduje do sekvenovacej jednotky ZMW (Zero-Mode Waveguide) SMRT bunky (SMRTcell). ZMW je otvor o priemere niekoľkých desiatok nanometrov, vyhĺbený v 100 nm kovovej vrstve nanesenej na sklenenom nosiči. Rozmery ZMW zabraňujú tomu, aby viditeľné laserové svetlo o vlnovej dĺžke 600 nm úplne prešlo cez ZMW. Namiesto toho, svetlo osvetľuje len spodných 30 nm ZMW104. V každom ZMW je na dne imobilizovaná jedna polymeráza, ktorá sa môže naviazať na ktorýkoľvek vlásenkový adaptér templátu a spustiť replikáciu (Obr. 8.21 a 8.22). 559

Obr. 8.22 Znázornenie princípu PacBio technológie (Rhoads a Au, 2015 www.wp.unil.ch)106,107 (A) Schematické znázornenie SMRT bunky (SMRTcell) a ukotvených templátov (SMRTbell) polymerázou DNA v zero-mode waveguide (ZMW). (B) Templát difunduje do ZMW a adaptér sa viaže na DNA polymerázu imobilizovanú na dne. Keď polymeráza udrží nukleotid v detekčnom objeme, vytvorí sa svetelný impulz, ktorý identifikuje bázu. (C) Každý zo štyroch nukleotidov je označený iným fluorescenčným farbivom (označeným červenou, žltou, zelenou a modrou farbou pre G, C, T a A), takže majú odlišné emisné spektrá. (1) Fluorescenčne označený nukleotid sa spája s templátom v aktívnom mieste DNA polymerázy. (2) Zvýši sa fluorescenčný signál farby zodpovedajúcej inkorporovanej báze (žltá pre bázu C ako príklad v tomto prípade). (3) Fluorescenčné značenie sa odštiepi od nukleotidu a difunduje zo ZMW, čím sa ukončí fluorescenčný impulz. (4) Templát sa posunie o jeden nukleotid. (5) Ďalší nukleotid sa spája s templátom v aktívnom mieste polymerázy, čím sa iniciuje ďalší fluorescenčný impulz, ktorý tu zodpovedá báze A. Do SMRT bunky sa pridajú štyri fluorescenčne označené nukleotidy, ktoré majú odlišné emisné spektrá. Keď je báza zadržaná DNA polymerázou vzniká svetelný impulz, ktorý identifikuje bázu (Obr. 8.22). Replikačné procesy vo všetkých ZMW sú zaznamenané ako „film“ svetelných impulzov a možno ich interpretovať ako sekvencie báz, tzv. kontinuálne dlhé čítanie. Podrobný opis technológie PacBio nájde čitateľ v Rhoads a Au, 2015106. Dôležitou výhodou sekvenovania PacBio je dĺžka čítania. Zatiaľ čo pôvodný systém PacBio generoval priemernú dĺžku čítania okolo 1,5 kbp, nový vylepšený systém dokáže generovať maximálne dĺžky čítania nad 60 kbp. Na druhej strane, v porovnaní s NGS technológiou PacBio čítania dosahujú vysokú chybovosť a samotná technológia je menej výkonná106. 560

Pri priamom sekvenovaní bez fragmentácie a prípravy DNA knižnice je možné z minimálneho množstva DNA (1 ng) získať výsledok do ôsmich hodín (menej ako polovica času potrebného na prípravu knižnice). Takýmto spôsobom boli sekvenované bakteriálne plazmidy nesúce gény antibiotickej rezistencie a lineárne fragmenty DNA pokrývajúce celý bakteriálny genóm. Keďže cieľová sekvencia nemusí byť známa a vďaka vysokej rýchlosti a malému množstvu vstupnej DNA, by priame DNA sekvenovanie mohlo byť použiteľné oblasti v klinickej mikrobiológie108. Nanopórová technológia Pôvod technológií založených na nanopóroch a iónových kanáloch je možné datovať od 90- tych rokov minulého storočia109. Princípom tejto technológie je elektroforéza nukleovej kyseliny cez póry v membráne v elektro-fyziologickom roztoku (Obr. 8.23). Negatívne nabité DNA alebo RNA molekuly prechádzajú vplyvom elektroforetickej sily vytvorenej napätím na oboch stranách polymérovej membrány cez imobilizované nanopóry. Ich prítomnosť naruší prúdový signál v nanopóroch, ktorý je meraný v reálnom čase. Každý nukleotid prechádzajúci cez nanopór spôsobí charakteristickú zmenu krivky102. Biologické nanopóry sú geneticky modifikované bakteriálne proteíny, ako napríklad α-hemolyzínový pórový proteín, MspA z Mycobacterium smegmatis a Phi29 z Bacillus subtilis81. Technológia nanopórového sekvenovania účinne rieši nedostatky NGS v oblasti diagnostiky bakteriálnych infekcií. Analýza čítaní dlhších ako 1 Mbp umožňuje identifikáciu druhov patogénnych mikroorganizmov pomocou sekvenovania 16S rRNA. Priame RNA sekvenovanie eliminuje úsilie a čas potrebný na reverznú transkripciu110. Kvôli vysokému výkonu, rýchlosti a kompaktným rozmerom sa Oxford Nanopore MinION stáva čoraz populárnejšou technológiou v oblasti diagnostiky infekčných chorôb (Obr. 8.23). V súčasnosti sa technológia nanopórového sekvenovania široko využíva v oblasti epidemiológie, antimikrobiálnej rezistencie a v ďalších oblastiach týkajúcich sa identifikácie patogénnych mikroorganizmov. Moon a spolupracovníci (2017) použili Nanopore MinION na analýzu 16S rRNA amplikónu v prípade meningitídy vyvolanej Campylobacter fetus v Kórei114. Haemophilus influenzae bol identifikovaný u pacientov s pneumóniou pomocou sekvenovania jeho 16S rRNA génu zo spúta115. Na základe celogenómového sekvenovania pomocou MinION sekvenátora stanovili Bainomugisa a spolupracovníci (2018) rezistenciu voči antibiotikám u M. tuberculosis116. Rovnakým spôsobom využili Charalampous a spolupracovníci (2018) nanopórovú technológiu sekvenovania na rýchlu identifikáciu 561

bakteriálnych rodov a druhov a génov antibiotickej rezistencie u pacientov s infekciami dolných dýchacích ciest117. Obr. 8.23 Zjednodušené znázornenie MinION sekvenátora a schematické znázornenie princípu nanopórovej technológie (Lu a kol., 2016 Sutton a kol., 2019 www.yourgenome.org upravené)111,112,113 (A) Sekvenátor MinION je spojený so stolovým počítačom alebo laptopom prostredníctvom USB portu. Po pridaní vzorky do prietokovej bunky sekvenovanie prebieha na stovkách nanopóroch, ktoré sú imobilizované na polymérovej membráne. (B) V prietokovej bunke sekvenátora elektrický prúd núti záporne nabité vlákna DNA alebo RNA sa pohybovať cez nanopóry. Pred vstupom do nanopóru je dsDNA helikázou rozpletená na ssDNA. Priemer póru α-hemolyzínu je približne 1 nm, čo umožní vstup len jedného vlákna DNA. Každý nukleotid sa líši veľkosťou a tvarom molekuly, preto ich prítomnosť v nanopóre spôsobí charakteristickú zmenu v krivke prúdového signálu. Prúdový signál sa meria v reálnom čase integrovaným čipom v prietokovej bunke. Použitý algoritmus konvertuje zmeny krivky prúdového signálu do poradia nukleotidov. 8.2 IN VIVO DIAGNOSTIKA FAKTOROV PATOGENITY A VIRULENCIE BAKTÉRIÍ Patogenitu baktérií podmieňujú významné vlastnosti identifikované ako faktory virulencie, ktoré sa na jednej strane medzi jednotlivými bakteriálnymi patogénmi líšia, ale na druhej strane sú ich stratégie podmieňujúce vznik infekcie a ochorenia rovnaké. Množstvo rôznych baktérií 562

má spoločné mechanizmy pri adhézii, kolonizácii a deštrukcii hostiteľských buniek a tkanív alebo pri úniku pred imunitným systémom hostiteľa. Mnohé z týchto spôsobov ako vyvolať infekciu získali baktérie formou horizontálneho prenosu génov kódujúcich faktory virulencie od spoločného mikrobiálneho predka. Horizontálny prenos génov determinujúcich virulenciu je príčinou výskytu nových kmeňov bakteriálnych patogénov schopných odolávať účinku antibakteriálnych látok. Avšak vznik ochorenia nie je výlučné závislý len od bakteriálnych patogénov, ale aj od hostiteľa. Porozumenie podstate mechanizmov, ktorými bakteriálne patogény navodia ochorenie na molekulárnej úrovni, je dôležité nielen z dôvodu vykonávania presnej diagnostiky, ale aj pri vývoji a zavádzaní nových terapeutických prístupov v liečbe alebo prevencii infekčných ochorení. Na identifikáciu faktorov virulencie u baktérií bolo vyvinutých niekoľko molekulárno- genetických stratégií prostredníctvom, ktorých bolo možné zmapovať transkripčné reakcie patogénov v hostiteľskom prostredí a zároveň definovať podiel príslušných génov v infekčnom procese. Hlavná pozornosť týchto štúdií je zameraná na gény virulencie, ktoré determinujú schopnosť baktérií infikovať hostiteľa, vyhýbať sa jeho imunitnej obrane a následne sa šíriť v infikovanom jedincovi. Tieto gény môžu kódovať produkciu toxínov a adhezínov alebo enzýmov, ktoré zlepšujú metabolické vlastnosti patogénu v hostiteľskom prostredí s obmedzeným prístupom k živinám. Pre štúdium týchto mechanizmov virulencie je preto nevyhnutné využitie vhodných experimentálnych hostiteľov. 8.2.1 Identifikácia hostiteľských faktorov potrebných na infekciu Patogenitu baktérií definuje, okrem schopnosti bakteriálneho druhu vyvolať ochorenie v dôsledku prítomnosti génov kódujúcich faktory virulencie, aj povaha hostiteľského organizmu s charakteristickým transkripčným, translačným a metabolickým profilom. Moderné molekulárno-biologické prístupy umožňujú hľadať a študovať hostiteľské faktory s rozhodujúcou úlohou pre vznik infekcie. Metódy prípravy rekombinantných DNA poskytujú možnosť získať geneticky modifikovaných hostiteľov pomocou ktorých, sa v in vivo podmienkach dá ovplyvňovať a monitorovať proces infekcie. 563

8.2.1.1 Transgénne zvieracie modely Najbežnejšie používanými modelovými zvieratami sú „knockoutované“ myši s odstráneným, skráteným alebo inaktivovaným génom alebo génmi. Okrem týchto modelových zvierat existujú aj transgénne zvieratá, ktoré majú konkrétny gén nahradený génom iného živočíšneho druhu prípadne majú gény so zavedenými mutáciami. Existencia rôznych typov mutovaných myší s definovanými fenotypmi hlavne na úrovni imunitného systému, umožňuje ich využitie pre štúdium sledovania procesov bakteriálnej infekcie. Výhodu pri sledovaní patogenézy bakteriálnych infekcií poskytujú hlavne „humanizované“ myši s nahradenými ľudskými génmi, u ktorých je možné sledovať úlohu týchto génov pri vzniku infekcie, počas a po potlačení ochorenia. Medzi transgénne zvieracie modely patria aj zvieratá obsahujúce vo svojom genóme úseky fúzované s reportérovými génmi, ktoré slúžia na identifikáciu buniek aktivujúcich špecifickú imunitu v priebehu infekcie. Napriek tomu, že myši predstavujú najpoužívanejší zvierací model pri štúdiách zameraných na sledovanie patogenézy infekčných ochorení, uplatňujú sa v tomto type in vivo pokusov aj iné druhy zvierat (potkany, králiky, hydina, ryby, ošípané, prežúvavce) a hmyz, z dôvodu ich jedinečných vlastností využiteľných pre konkrétne aplikácie alebo sledovania určitých chorôb118,119. 8.2.1.1.1 Imunodeficientné transgénne zvieratá Bežnou stratégiou na pochopenie infekčných procesov je sledovanie a porovnanie reakcie transgénneho imunodeficientného hostiteľského organizmu po infekcii bakteriálnym kmeňom divého typu s reakciami po infekcii mutovanými bakteriálnymi kmeňmi s deléciou génu, ktorý kóduje konkrétny faktor virulencie. Tento prístup umožňuje lepšie pochopenie úlohy danej zložky imunitného systému, ako aj vzájomnú interakciu baktérií s hostiteľským organizmom v procese patogenézy. Ďalší prístup, ako získať transgénne imunodeficientné zvieratá s mutáciami v konkrétnych génoch zodpovedných za vznik imunitnej odpovede, je odstránenie buniek exprimujúcich tieto gény genetickou abláciou. Výhodou genetickej ablácie je, že zvieratá rastú normálne do doby, keď sa u nich začne prejavovať znížená expresia sledovaného génu alebo génov, prípadne dochádza k poklesu produkcie niektorých buniek, ktoré môžu byť ovplyvnené pôsobením patogénu. Takto možno skúmať úlohu konkrétneho bakteriálneho antigénu v procese imunitnej reakcie transgénneho zvieraťa s exprimujúcim antigénom počas skorých vývojových štádií, u 564

ktorých následne, po neskoršej infekcii patogénom obsahujúcim daný antigén, nedochádza k vytvoreniu imunitnej odpovede120. 8.2.1.1.2 Humanizované transgénne zvieratá Transgénne myši, obsahujúce ľudské tkanivá alebo exprimujúce špecifické ľudské gény, sú najvhodnejším modelom pre štúdium patogenézy infekcií spôsobených ľudskými patogénmi. Najvhodnejšími príjemcami pre ľudské gény, bunky alebo tkanivá sú imunodeficientné transgénne myši, ktoré nereagujú negatívne na ich prítomnosť v dôsledku imunosupresie. Humanizované transgénne myši slúžia nielen ako ideálny nástroj infekčných modelov pre štúdium úloh zložiek imunity uplatňujúcich sa pri ľudských ochoreniach, ale sú to aj vynikajúce in vivo modely predklinických štúdií liečiv a toxicity121. 8.2.2 In vivo zobrazovacie techniky zvierat počas infekcie Väčšina štúdií zameraných na sledovanie transkripcie a proteomického profilu hostiteľských buniek využívala in vivo infekcie použitím bunkových kultúr. Tento prístup poskytuje informácie iba o interakcii konkrétnych hostiteľských buniek s infekčným agensom. K tomu, aby bolo možné sledovať vzájomnú interakciu hostiteľa s patogénom v procese infekcie sú využívané in vivo zobrazovacie (celotelové biofotónové) techniky zvierat. Tento nový prístup sledovania génovej expresie použitím transgénnych zvierat umožňuje získať nové poznatky o dynamike infekčného procesu a šírení sa infekcie. Pozornosť pri sledovaní infekčného procesu je zameraná hlavne na pozorovanie patogénu v reálnom čase infekcie v jeho prirodzenom hostiteľskom prostredí. In vivo zobrazovacími technikami možno nielen neinvazívne študovať bakteriálnu infekciu, ale aj sledovať priebeh ochorenia a účinnosť terapeutických postupov. Zobrazovanie týmto spôsobom umožňuje genetická modifikácia patogénu alebo hostiteľa vnesením reportérového génu, ktorého expresiou dochádza k bioluminiscencii. Zviera sa následne, pod anestézou, monitoruje meraním bioluminiscencie pomocou zaznamenaných obrazov vytvorených použitím citlivých kamier schopných zachytávať fotóny pri nízkych úrovniach osvetlenia. Medzi najčastejšie využívané bioluminiscenčné reportérové gény patria gény kódujúce bakteriálnu luciferázu (lux) alebo luciferázu svetlušiek (Photinus pyralis) (luc), alebo gény kódujúce fluorofóry akými sú najčastejšie používaný zelený fluorescenčný proteín (GFP = Green Fluorescent Protein) a červený fluorescenčný proteín (RFP = Red Fluorescent Protein), ktorými sa označia 565

študované patogény. Rovnako môžu byť luciferázou alebo fluorescenčnými proteínmi označené gény hostiteľského organizmu, čo umožní sledovať expresiu týchto hostiteľských génov v rôznych tkanivách počas bakteriálnej infekcie122. Ďalší prístup na sledovanie interakcií patogén-hostiteľ využíva molekuly špecificky sa viažuce na bakteriálny povrch (protilátky, lektíny) označené fluorescenčným farbivom. Infekcia zvierat s takto označenými baktériami umožní lokalizovať tieto baktérie počas infekcie. Túto metódu označovania baktérií je možné kombinovať s metódami využívajúcimi transgénne zvieratá, vďaka čomu možno súbežne monitorovať imunitnú odpoveď hostiteľa a lokalizáciu baktérií123. 8.2.3 Komparatívna genomika hostiteľskej odpovede Komplexné fungovanie hostiteľa v rôznorodej populácii a jeho interakciu s prostredím, ale aj s jeho vlastným mikrobiómom, možno označiť ako systémovú genetiku. Pri štúdiách systémovej genetiky dochádza k vytváraniu zámerných genetických alebo environmentálnych zmien v experimentálnom systéme za účelom sledovania účinkov zmenených fenotypov hostiteľa na transkripciu, transláciu a metabolické profily vo vzťahu k mikrobiómu pre vytvorenie vzájomných korelácií na viacerých úrovniach. Stanovením korelačných vlastností medzi jednotlivcami v populácii je možné formulovať modely biologických interakcií využívané pre potreby testovania v klinických štúdiách124,125. 8.2.3.1 Jednonukleotidový polymorfizmus (SNP – Single Nucleotide Polymorphism) Najbežnejšou metódou ako vytvoriť genetickú variáciu v populácii je jednonukleotidový polymorfizmus (SNP = Single Nucleotide Polymorphism), pomocou ktorého možno zmeniť jeden bázový pár. SNP umožňuje vznik genetických variácií, ktoré ovplyvňujú reakcie hostiteľského organizmu na prítomnosť patogénu. Napriek tomu, že zmeny obvykle zahŕňajú viacero alel génov, SNP nemá zásadný vplyv na ich príslušnú biologickú funkciu. SNP môže byť prítomný v kódujúcich alebo nekódujúcich oblastiach genómu a môže ovplyvňovať génovú expresiu alebo funkciu proteínu rôznymi mechanizmami. Význam SNP spočíva aj v prepojení na mnohé ochorenia ľudí a zvierat. Analýza polymorfizmov v genómoch ľudí a zvierat získala význam z hľadiska hľadania súvislosti medzi prítomnosťou špecifických SNPs a náchylnosťou alebo priebehom infekčných ochorení u niektorých rizikových skupín v populácii. Na 566

identifikáciu SNPs súvisiacich s náchylnosťou alebo odolnosťou voči infekcii bolo vyvinutých niekoľko geneticky referenčných populácií myší, ktoré sú ideálne pre mapovanie genotypov126. 8.2.3.2 Celogenómové asociačné štúdie (GWAS – Genome-Wide Association Studies) Na identifikáciu génov alebo genetických rizikových faktorov podieľajúcich sa na reakcii hostiteľa na bakteriálnu infekciu je možné využiť porovnanie rozdielov v sekvenciách DNA v rámci jednotlivých genómov populácie a následne identifikovať varianty spojené so zvýšeným alebo zníženým rizikom ochorenia, rovnako ako aj so zvýšenou a zníženou pravdepodobnosťou dobrej odpovede na liečbu. GWAS pomáhajú identifikovať gény viazané na konkrétne ochorenie pomocou skenovania celého genómu hostiteľa, analýzy SNP a kvantitatívne expresných analýz nevyhnutných pre genotypizáciu génov zapojených do infekčného procesu. Analýzou SNP možno identifikovať v rámci populácie rôzne väzby medzi alelami s variáciami, ktoré môžu byť spoločne dedené alebo sú vo vzájomnej korelácii a tým možno identifikovať SNP vyskytujúce sa častejšie u jedincov, u ktorých došlo po infekcii k prejavom ochorenia. Identifikáciou SNP a ich štúdiom možno sledovať, či pri priamej asociácii dochádza pri zmene v SNP k priamemu ovplyvneniu fenotypového znaku, zatiaľ čo pri nepriamej asociácii, zmeny v SNP nevedú priamo k zmene fenotypového znaku, ale ovplyvnia iný SNP nachádzajúci sa v blízkosti, ktorý má priame spojenie s konkrétnou vlastnosťou. Avšak SNPs identifikované metódou GWAS s nepriamym spojením so znakom ochorenia, v dôsledku iného blízkeho SNP, ktorý má dominantný účinok, musia byť ďalej analyzované za účelom spresnenia lokusu SNP s priamym vplyvom na sledovaný fenotypový znak. Pomocou celogenómových asociačných štúdií je možné identifikovať nielen jednotlivé SNPs a ich vzťah k fenotypovým prejavom, ale poskytujú aj možnosť sledovať spoločné interakcie mnohých SNPs v rámci genómu vo vzťahu k vzniku a priebehu infekcie a terapii ochorenia127. 8.2.4 Celogenómová analýza bakteriálnych genómov Celogenómové sekvenovanie bakteriálnych genómov umožnilo získať nové poznatky o faktoroch zodpovedných za virulenciu a interakciu patogénov s hostiteľským organizmom. Rovnako aj celogenómové sekvenovanie hostiteľských druhov umožnilo identifikovať hostiteľské faktory zapojené do procesu infekcie, ktoré majú kľúčovú úlohu alebo prispievajú k virulencii baktérií. Analýzou genómov pomocou kvantitatívnych meraní a štatistických 567

analýz možno skúmať vzájomné vzťahy medzi genetickými a fenotypovými variáciami na úrovni jedincov a populácií. Porovnávacia genomika rôznych hostiteľov umožnila identifikovať základné rozdiely v náchylnosti hostiteľa na bakteriálne infekcie a na závažnosť priebehu ochorenia. Medzi hlavné postupy celogenómovej analýzy patrí stíšenie génov (gene silencing), keď dochádza úpravou genómu k zníženiu hladiny expresie mRNA a tým k zníženiu tvorby proteínov, alebo úprava génov (gene editing), keď zmenou genetickej informácie dochádza k úprave alebo odstráneniu génov, čo sa prejaví aj na úrovni génovej expresie a následnej translácie128. 8.2.4.1 Stíšenie génov prostredníctvom interferencie RNA (RNAi) Efektívne stíšenie génov možno docieliť použitím génovo špecifickej dvojvláknovej RNA (dsRNA = double-stranded RNA) metódou interferencie RNA (RNAi). Pomocou metódy RNAi bolo možné analyzovať mnohé hostiteľské gény uplatňujúce sa v patogenéze hlavne intracelulárnych patogénov, pre ktoré sú hostiteľské mechanizmy kľúčové pre ich prežitie a ďalšie šírenie. Metóda RNAi je založená na použití krátkych synteticky pripravených dsRNA (obvykle 20 – 25 nukleotidov) najčastejšie označujúcich sa ako malé interferujúce RNA (siRNA = small interfering RNA;„short interfering RNA; silencing RNA), ktoré sa vnášajú do eukaryotických buniek procesom transfekcie129. Vnesením siRNA do buniek dochádza k indukcii selektívnej, bunkou sprostredkovanej degradácie homológnych mRNA, čo vedie k post-transkripčnému stíšeniu konkrétneho génu. Výhodou technológie RNAi je jej použitie na mnohé gény súčasne. V súčasnosti sa na vnášanie siRNA nevyužívajú iba techniky založené na transfekcii syntetickou siRNA, ale aj techniky vnášania prostredníctvom plazmidových alebo vírusových vektorov, ktoré s oveľa vyššou efektivitou doručia siRNA do bunky130. Prokaryotické bunky nedisponujú mechanizmom zabezpečujúcim fungovanie RNAi, preto siRNA neinhibujú bakteriálne gény, ale zabezpečujú iba špecifickú inhibíciu produktov hostiteľských génov exprimovaných počas infekcie. Z toho dôvodu je technológia RNAi vhodná na identifikáciu potenciálnych cieľov hostiteľa s potenciálnym využitím pre zavádzanie nových terapeutických stratégií. 568

8.2.4.2 Úprava génov Pokrok v oblasti génových manipulácií dosiahol stupeň, ktorý v súčasnosti umožňuje dostupnými metódami rýchlo a presne meniť genóm hostiteľa s cieľom študovať funkciu génov a úlohu hostiteľských faktorov v procese vzniku a priebehu ochorenia v podmienkach in vivo v rôznych hostiteľských organizmoch. Zavádzanie mutácií do cieľových miest hostiteľských genómov umožňujú tri rôzne technológie úpravy genómu:  Efektorové nukleázy podobné transkripčnému aktivátoru (TALENs = Transcription Activator-Like Effector Nucleases) sú restrikčné enzýmy, ktoré je možné upraviť tak, aby štiepili špecifické DNA sekvencie. Pripravujú sa spojením TAL efektorovej DNA-väzbovej domény s DNA štiepiacou doménou. Efektor podobný transkripčnému aktivátoru (TALE = Transcription Activator-Like Effector) sa dá skonštruovať tak, aby sa viazal na požadovanú sekvenciu DNA, ktorú v dôsledku prítomnosti nukleázy môžu v konkrétnom mieste štiepiť131.  Nukleázy so zinkovým prstom (ZFNs = Zinc Finger Nucleases) sú umelo pripravené reštrikčné enzýmy, ktoré vznikli fúziou domény viažucej DNA so zinkovým prstom s doménou štiepiacou DNA. Domény so zinkovým prstom sa môžu upraviť tak, aby štiepili presne definovanú sekvenciu DNA, čím je prostredníctvom nukleáz so zinkovým prstom možné štiepiť jedinečné sekvencie v rámci genómu. Dvojreťazcové zlomy vyvolané ZNF následne podliehajú procesu opravy bunkovej DNA, čo vedie k cielenej mutagenéze alebo k cielenej náhrade génov132.  Systém CRISPR-Cas9 (CRISPR = Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; Cas9 = CRISPR-associated 9 ) je oproti predchádzajúcim technológiám úpravy génov všestrannejší a jednoduchší na manipuláciu. Metóda umožňuje špecifické úpravy genómu takmer v každom organizme. CRISPR-Cas je prokaryotický adaptívny systém obrannej odpovede voči cudzím genetickým elementom. Po infekcii bakteriofágmi baktérie zachytávajú krátke úseky DNA týchto vírusov a po ich začlenení do svojej vlastnej DNA vytvoria v určitom vzore segmenty CRISPR. Takto si baktérie dokážu zapamätať patogénne vírusy a pri opätovnej infekcii začnú produkovať nekódujúce segmenty RNA z úsekov CRISPR, ktoré rozpoznávajú a pripájajú sa k špecifickým úsekom DNA vírusov. Následne nukleáza Cas9 štiepi vírusovú DNA. Systém CRISPR-Cas9 je možné využiť na vytvorenie jednoduchej, RNA-programovateľnej metódy na úpravu genómu v eukaryotických organizmoch a môže byť použitý na vypínanie (knockout) génov pomocou inzercie alebo delécie, ale taktiež aj na vnášanie (knockin) nových génov do genómu. Poškodenie DNA 569

vyvolané nukleázou Cas9 sa v bunkách opravuje prostredníctvom opravných mechanizmov buď cestou opravy nehomológnej DNA spájajúcej konce (NHEJ = NonHomologous End Joining) alebo cestou opravy riadenej homológiou (HDR = Homology-Directed Repair). Princíp narušenia génov spočíva v použití jedinej vodiacej RNA (sgRNA = single guide RNA), ktorá pozostáva zo sekvencie crRNA (CRISPR RNA) špecifickej pre cieľovú DNA a sekvencie tracrRNA (trans-activating crispr RNA) interagujúcej s Cas9 s endonukleázovou aktivitou. Komplex spôsobuje cieľovo špecifické štiepenie dsDNA a vzniknuté dvojvláknové zlomy sú následne opravené pridaním či odstránením cieľových segmentov alebo nahradením inou sekvenciou DNA. Technológia CRISPR-Cas9 predstavuje efektívny nástroj pre presnú identifikáciu hostiteľských faktorov potrebných pre vnímavosť hostiteľa na infekciu alebo na sprostredkovanie cytotoxicity v dôsledku infekcie133,134. 570

ZOZNAM SKRATIEK Agr Accessory gene regulator BIP Backward Inner Primer bp bázové páry cDNA Komplementárna DNA CHCA -Cyano-HydroxyCinnamic acid (Kyselina -cyano-hydroxyškoricová) Cq Quantification cycle (Kvantifikačný cyklus) CRISPR Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Cas9 CRISPR-associated 9 crRNA CRISPR RNA ddNTP Deoxyribonukleotidtrifosfát DHB 2,5-DiHydroxyBenzoic acid (Kyselina 2,5-dihydroxybenzoová) dNTP Dideoxyribonukleotidtrifosfát dsDNA double stranded DNA (Dvojvláknová DNA) dsRNA double stranded RNA (Dvojvláknová RNA) ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ESBL Extended Spectrum β-lactamase (Laktamázy so širokým spektrom účinku) FIP Forward Inner PrimerBIP FISH Fluorescence In Situ Hybridization (Fluorescenčná in situ hybridizácia) FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer GFP Green Fluorescent Protein (Zelený fluorescenčný proteín) GWAS Genome-Wide Association Studies (Celogenómové asociačné štúdie) HDR Homology-Directed Repair (Oprava riadená homológiou) KTZ Kolónie tvoriace zárodky LAMP Loop mediated isothermal amplification (Slučkami sprostredkovaná izotermálna amplifikácia) luc Luciferáza svetlušiek lux Bakteriálna luciferáza MALDI-TOF Matrix Assisted Laser Desorption Ionization - Time Of Flight (Matricou asistovaná laserová desorpčná ionizácia s časovo preletovou analýzou) MLST Multi Locus Sequence Type mRNA messenger RNA (Poslíčková RNA) MRSA Meticilín rezistentný Staphylococcus aureus MS Mass Spectrometry (Hmotnostná spektormetria) NDM-1 New Delhi Metalo-β-laktamáza 1 NGS Next Generation Sequencing (Sekvenovanie novej generácie) NHEJ NonHomologous End Joining (Oprava nehomológnej DNA spájajúcej konce) PCR Polymerase chain reaction (Polymerázová reťazová reakcia) PNA Peptide Nucleic Acid qRT-PCR Real Time quantitative PCR (Kvantitatívna PCR v reálnom čase) RFP Red Fluorescent Protein (Červený fluorescenčný proteín) RNAi Interferencia RNA rRNA Ribozomálna RNA RT-PCR Reverse transcription qPCR (Reverzná transkripčná qPCR) sgRNA single guide RNA (Jediná vodiaca RNA) siRNA small interfering RNA, short interfering RNA, silencing RNA (malé interferujúce RNA) 571

SMRT Single Molecule Real-Time sequencing (Sekvenovanie jednej molekuly v reálnom čase) SNP Single Nucleotide Polymorphism (Jednonukleotidový polymorfizmus) ssDNA Single stranded DNA (Jednovláknová DNA) ssRNA Single stranded RNA (Jednovláknová RNA) TALE Transcription Activator-Like Effector (Efektor podobný transkripčnému aktivátoru) TALENs Transcription Activator-Like Effector Nucleases (Efektorové nukleázy podobné transkripčnému aktivátoru) tracrRNA trans-activating crispr RNA VRE Vankomycín-rezistentné enterokoky ZFNs Zinc Finger Nucleases (Nukleázy so zinkovým prstom) ZMW Zero-Mode Waveguide (Vlnovod s nulovým režimom) 572

LITERATÚRA 1. Ehrenreich, A. Appl Microbiol Biotechnol 73, 255-73, (2006) 2. Sanger, F. et al. Proceedings of the National Academy of Sciences 74, 5463-67, (1977) 3. Maxam, A. M. & Gilbert, W. Proceedings of the National Academy of Sciences 74, 560-64, (1977) 4. Smith, L. M. et al. Nature 321, 674-9, (1986) 5. Check Hayden, E. Nature, (2009) 6. Munroe, D. J. & Harris, T. J. Nat Biotechnol 28, 426-8, (2010) 7. Check Hayden, E. Nature, (2012) 8. Tkáčiková, Ľ. & Mydlárová Blaščáková, M. Molekulová mikrobiológia. (2015). 9. Vongthilath-Moeung, R. et al. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology 11, (2021) 10. Jensen, A. N. et al. Journal of Microbiological Methods 55, 249-55, (2003) 11. Bahroun, N. H. O. et al. Analytica Chimica Acta 1028, 121-30, (2018) 12. Orenga, S. et al. Journal of Microbiological Methods 79, 139-55, (2009) 13. Perry, J. D. Clin Microbiol Rev 30, 449-79, (2017) 14. Varadi, L. et al. Chem Soc Rev 46, 4818-32, (2017) 15. Ingham, C. J. et al. PLoS ONE 7, e33818, (2012) 16. Jorgensen, J. H. & Ferraro, M. J. Clin Infect Dis 49, 1749-55, (2009) 17. Clark, A. E. et al. Clin Microbiol Rev 26, 547-603, (2013) 18. Sauer, S. et al. Nat Rev Genet 6, 465-76, (2005) 19. Gross, J. H. Mass Spectrometry: A textbook. Third edn, (2017). 20. Boesl, U. Mass Spectrom Rev 36, 86-109, (2017) 21. Singhal, N. et al. Front Microbiol 6, 791, (2015) 22. De Carolis, E. et al. J Infect Dev Ctries 8, 1081-8, (2014) 23. Seng, P. et al. Clinical Infectious Diseases 49, 543-51, (2009) 24. van den Beld, M. J. C. et al. Microorganisms 10, (2022) 25. Karpanoja, P. et al. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 33, 779-88, (2014) 26. Yahiaoui, R. Y. et al. Clin Microbiol Infect 26, 1088.e1-88.e5, (2020) 27. Kuo, S. F. et al. Diagn Microbiol Infect Dis 83, 229-31, (2015) 28. Perry, M. J. et al. Toxins 9, 94, (2017) 29. Gallegos-Candela, M. et al. Analytical Biochemistry 543, 97-107, (2018) 30. Gagnaire, J. et al. PLoS ONE 7, e40660, (2012) 31. Grundmann, H. et al. Eurosurveillance 15, 19711, (2010) 32. Livermore, D. M. & Woodford, N. Trends Microbiol 14, 413-20, (2006) 33. Miriagou, V. et al. Clin Microbiol Infect 16, 112-22, (2010) 34. Hrabák, J. et al. Zprávy EM (SZÚ, Praha) 21, 148-56, (2012) 35. Burckhardt, I. & Zimmermann, S. J Clin Microbiol 49, 3321-4, (2011) 36. Hrabák, J. et al. J Clin Microbiol 49, 3222-7, (2011) 37. Sparbier, K. et al. J Clin Microbiol 50, 927-37, (2012) 38. www.microbenotes.com. <https://microbenotes.com/latex-agglutination-test/> ( 39. Pepe, O. et al. Applied and Environmental Microbiology 72, 7057-62, (2006) 40. Kuang, H. et al. International Journal of Environmental Research and Public Health 10, 1598-608, (2013) 41. Vanier, L. E. & Prud'Homme, G. J. Journal of Experimental Medicine 176, 37-46, (1992) 42. Hennekinne, J.-A. et al. Toxins 2, 2106-16, (2010) 43. Cook, E. et al. Clinical and Vaccine Immunology 14, 1094-101, (2007) 44. https://www.mybiosource.com/human-elisa-kits/staphylococcus-aureus-enterotoxins-se/162591. 45. https://www.creative-diagnostics.com/Human-SE-ELISA-Kit-237497-499.htm. 46. https://www.abcam.com/staphylococcus-aureus-enterotoxins-a--b--tsst-1-antibody-ab190337.html. 47. Woese, C. R. Microbiol Rev 51, 221-71, (1987) 48. Madar, M. et al. Benef Microbes 6, 899-907, (2015) 49. Kempf, V. A. J. et al. Journal of Clinical Microbiology 38, 830-38, (2000) 50. Pellestor, F. & Paulasova, P. European Journal of Human Genetics 12, 694-700, (2004) 51. Søgaard, M. et al. Journal of Medical Microbiology 56, 914-17, (2007) 52. Espy, M. J. et al. Clinical Microbiology Reviews 19, 165-256, (2006) 53. Morrison, T. B. et al. Biotechniques 24, 954-8, 60, 62, (1998) 54. Ririe, K. M. et al. Anal Biochem 245, 154-60, (1997) 55. Fernández-Romero, N. et al. Diagn Microbiol Infect Dis 80, 93-6, (2014) 56. Arya, M. et al. Expert Rev Mol Diagn 5, 209-19, (2005) 57. Bustin, S. A. et al. Clinical Chemistry 55, 611-22, (2009) 58. SantaLucia, J., Jr. & Hicks, D. Annu Rev Biophys Biomol Struct 33, 415-40, (2004) 573

59. Hendling, M. & Barišić, I. Comput Struct Biotechnol J 17, 1056-65, (2019) 60. Verweij, J. J. & Stensvold, C. R. Clin Microbiol Rev 27, 371-418, (2014) 61. Notomi, T. et al. Nucleic Acids Research 28, e63-e63, (2000) 62. Notomi, T. et al. Journal of Microbiology 53, 1-5, (2015) 63. Zhang, G. et al. Applied and Environmental Microbiology 77, 6495-501, (2011) 64. Warren, D. K. et al. Journal of Clinical Microbiology 42, 5578-81, (2004) 65. Ito, T. et al. Antimicrob Agents Chemother 43, 1449-58, (1999) 66. Huletsky, A. et al. J Clin Microbiol 42, 1875-84, (2004) 67. Blaschke, A. J. et al. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 74, 349-55, (2012) 68. Huang, R. S. et al. Diagn Microbiol Infect Dis 86, 336-39, (2016) 69. Burteau, S. et al. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 27, 17-27, (2008) 70. Miller, M. B. & Tang, Y. W. Clin Microbiol Rev 22, 611-33, (2009) 71. Fukushima, M. et al. J Clin Microbiol 41, 2605-15, (2003) 72. Kostić, T. et al. Applied Microbiology and Biotechnology 99, 7711-22, (2015) 73. Stedtfeld, R. D. et al. Lab on a Chip 12, 1454-62, (2012) 74. Shendure, J. & Ji, H. Nature Biotechnology 26, 1135-45, (2008) 75. Sanger, F. & Coulson, A. R. Journal of Molecular Biology 94, 441-48, (1975) 76. Goodwin, S. et al. Nat Rev Genet 17, 333-51, (2016) 77. Heather, J. M. & Chain, B. Genomics 107, 1-8, (2016) 78. Thudi, M. et al. Briefings in Functional Genomics 11, 3-11, (2012) 79. Metzker, M. L. Nat Rev Genet 11, 31-46, (2010) 80. Liu, L. et al. Journal of Biomedicine and Biotechnology 2012, 1-11, (2012) 81. Lin, B. et al. Biosensors 11, 214, (2021) 82. Fleischmann, R. D. et al. Science 269, 496-512, (1995) 83. Goffeau, A. et al. Science 274, 546, 63-7, (1996) 84. Ludwig, W. & Schleifer, K. H. FEMS Microbiol Rev 15, 155-73, (1994) 85. Clarridge, J. E., 3rd. Clin Microbiol Rev 17, 840-62, table of contents, (2004) 86. Yarza, P. et al. Nat Rev Microbiol 12, 635-45, (2014) 87. Kozich, J. J. et al. Appl Environ Microbiol 79, 5112-20, (2013) 88. de Magalhães, J. P. et al. Ageing Res Rev 9, 315-23, (2010) 89. https://emea.illumina.com.<https://emea.illumina.com/science/technology/next-generation sequencing/sequencing-technology/patterned-flow-cells.html> ( 90. Ravi, R. K. et al. Methods Mol Biol 1706, 223-32, (2018) 91. Besser, J. et al. Clin Microbiol Infect 24, 335-41, (2018) 92. Lewis, T. et al. J Hosp Infect 75, 37-41, (2010) 93. Wilson, M. R. et al. New England Journal of Medicine 370, 2408-17, (2014) 94. Ronholm, J. et al. Clin Microbiol Rev 29, 837-57, (2016) 95. Du, X. et al. Int J Biol Macromol 107, 393-96, (2018) 96. Mayr, F. B. et al. Virulence 5, 4-11, (2014) 97. Fleischmann, C. et al. Am J Respir Crit Care Med 193, 259-72, (2016) 98. Nelwan, E. J. et al. Data Brief 30, 105631, (2020) 99. Paramita, R. I. et al. PLOS ONE 15, e0244358, (2020) 100. Guo, F. et al. PLOS ONE 8, e76185, (2013) 101. Klindworth, A. et al. Nucleic Acids Research 41, e1-e1, (2012) 102. Yu, X. et al. Journal of Cellular and Molecular Medicine 23, 7143-50, (2019) 103. Miga, K. H. et al. Nature 585, 79-84, (2020) 104. Schadt, E. E. et al. Hum Mol Genet 19, R227-40, (2010) 105. Travers, K. J. et al. Nucleic Acids Research 38, e159-e59, (2010) 106. Rhoads, A. & Au, K. F. Genomics, Proteomics & Bioinformatics 13, 278-89, (2015) 107. https://wp.unil.ch/gtf/. 108. Coupland, P. et al. BioTechniques 53, 365-72, (2012) 109. Deamer, D. W. & Akeson, M. Trends in Biotechnology 18, 147-51, (2000) 110. Marinov, G. K. Briefings in Functional Genomics 16, 326-35, (2017) 111. Lu, H. et al. Genomics, Proteomics & Bioinformatics 14, 265-79, (2016) 112. Sutton, M. A. et al. Scientific Reports 9, 5370, (2019) 113. www.yourgenome.org. 114. Moon, J. et al. Emerg Microbes Infect 6, e94, (2017) 115. Moon, J. et al. Emerg Infect Dis 24, 1944-46, (2018) 116. Bainomugisa, A. et al. Microb Genom 4, (2018) 117. Charalampous, T. et al. bioRxiv, 387548, (2018) 574

118. Masemann, D. et al. International Journal of Molecular Sciences 21, 9289, (2020) 119. Swearengen, J. R. Animal Model Exp Med 1, 100-08, (2018) 120. Song, J. et al. Applied Sciences 10, 7369, (2020) 121. Moriwaki, T. et al. Experimental Cell Research 390, 111914, (2020) 122. Youn, H. & Hong, K.-J. Osong Public Health and Research Perspectives 3, 48-59, (2012) 123. Lauber, D. T. et al. Laboratory animals 51, 465-78, (2017) 124. Benevenuto, J. et al. Frontiers in Microbiology 9, (2018) 125. Sackton, T. B. Current Opinion in Insect Science 31, 106-13, (2019) 126. Nogales, A. & M, L. D. Pathogens 8, (2019) 127. Bentley, A. R. et al. Front Genet 13, 873060, (2022) 128. Kampmann, M. et al. Nat Protoc 9, 1825-47, (2014) 129. Kurreck, J. Journal of Biomedicine and Biotechnology 2006, 083757, (2006) 130. Lam, J. K. et al. Mol Ther Nucleic Acids 4, e252, (2015) 131. Forsyth, A. et al. Front Plant Sci 7, 1572, (2016) 132. Carroll, D. Genetics 188, 773-82, (2011) 133. Ran, F. A. et al. Nat Protoc 8, 2281-308, (2013) 134. Nwokoro, E. et al. J Pharm Policy Pract 9, 34, (2016) 575

IX. ZÁVER Emil Pilipčinec, Mangesh Bhide Doterajšie štúdium bakteriálnych faktorov patogenity a virulencie nám nebolo nápomocné iba pri štúdiu a poznávaní patogenézy významných bakteriálnych chorôb človeka a zvierat, ale otvorilo nám aj novú, tzv. antivirulenčnú možnosť boja s nimi. Je totiž predpoklad, že detailné poznanie celého súboru faktorov patogenity a virulencie jednotlivých medicínsky významných bakteriálnych patogénov prispeje v budúcnosti k príprave liečiv voči faktorom virulencie jednotlivých bakteriálnych patogénov, pomocou ktorých ich bude možné blokovať, eliminovať alebo znefunkčniť. Už v súčasnosti sa pracuje na príprave efektívnych liečiv, ktoré by napr. obsadili špecifické miesto adherencie bakteriálneho patogéna na cieľovej hostiteľskej bunke, resp. by zabránili syntéze jeho fimbriálnych alebo afimbriálnych adhezínov, a tak by došlo k zablokovaniu ihneď prvého dôležitého kroku pri patogenéze mnohých bakteriálnych infekcií respiračného, intestinálneho alebo urogenitalného traktu, t. j. k adherencii patogéna k slizničným povrchom a ich osídleniu. Ďalšou možnosťou antivirulenčnej terapie je znefunkčnenie sekrečných systémov, ktoré sú veľmi významné najmä u Gram-negatívnych baktérií pri exportovaní exotoxínov alebo iných efektorových polypeptidov, buď priamo do hostiteľských buniek alebo do ich blízkeho okolia. Pri využívaní sekrečných systémov nie sú výnimkou ani Gram-pozitívne baktérie. Príkladom je Mycobacterium tuberculosis so svojím sekrečným systémom typu VII (T7SS). Ďalšou skupinou antivirulenčných liečiv sú anti-exotoxínové liečivá. Produkcia exotoxínov je významným faktorom virulencie viacerých medicínsky významných bakteriálnych patogénov, vrátane Bacillus anthracis, Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, enterotoxigénnych Escherichia coli, Shigella spp., Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes, Vibrio cholerae, prípadne ďalších. Anti-exotoxínové liečivá sú chemické látky, ktoré buď blokujú ich syntézu alebo bránia ich vstupu do hostiteľských buniek, prípadne sú to špecifické protilátky, ktoré neutralizujú exotoxíny. Antivirulenčná stratégia pri zabránení vzniku infekcií na základe tvorby biofilmu je zase založená na zamedzení adherencie biofilm tvoriacich bakteriálnych patogénov k povrchom (primárne sprostredkovaná fimbriami typu I a „curli“ fimbriami, prípadne tzv. MSCRAMM proteínmi), na zabránení syntézy, maturácie a stabilizácie biofilmu pomocou extracelulárnej polymerickej substancie a na zablokovaní mechanizmu quorum sensing. Liečba bakteriálnych infekcií založená na príprave liečiv voči ich faktorom virulencie by mala priniesť nielen efektívnejšie terapeutické postupy, ale v porovnaní s použitím antibiotík 576

zamedzí aj vzniku antibiotikorezistencie. Ináč povedané, ak pri použití antibiotík sa snažíme zastaviť alebo obmedziť rast, množenie a disemináciu patogéna v organizme hostiteľa, tak pri použití liečiv voči faktorom virulencie bude našou snahou zablokovať potenciálne možnosti, ktorými by bakteriálny patogén vedel poškodiť svojho hostiteľa, bez toho, aby boli poškodené iné bunky hostiteľa, vrátane jeho vlastných, tak ako sa to veľakrát stáva pri použití antibiotík. I z uvedeného dôvodu sa predkladaná monografia zaoberá faktormi patogenity a virulencie medicínsky najvýznamnejších bakteriálnych patogénov 27 rodov Gram-negatívnych a Gram- pozitívnych baktérií. 577

ODBORNÉ PROFILY AUTOROV prof. MVDr. Emil Pilipčinec, PhD. Vysokoškolský profesor na Univerzite veterinárskeho lekárstva a farmácie v Košiciach; osoba zodpovedná za uskutočňovanie, rozvoj a kvalitu študijného programu mikrobiológia v spojenom 1. a 2. ako aj v 3. stupni vysokoškolského štúdia; zodpovedný riešiteľ alebo spoluriešiteľ viacerých domácich alebo medzinárodných vzdelávacích a vedecko-výskumných úloh a projektov; ako autor alebo spoluautor publikoval desiatky vedeckých prác, niekoľko učebných monografií a vysokoškolských učebníc; je spoluautorom jedného autorského osvedčenia a jedného patentu; emeritný rektor univerzity. Ako rektor významnou mierou prispel k výstavbe nových klinických priestorov, vrátane univerzitnej veterinárnej nemocnice a MediParku – medicínskeho univerzitného vedeckého parku, Centra excelentnosti pre nákazy zvierat a zoonózy, Centra excelentnosti pre parazitológiu, Centra excelentnosti biomedicínskych technológií a Kompetenčného centra pre biomodulátory a výživové doplnky. V súčasnosti sa zaoberá štúdiom faktorov virulencie medicínsky významných bakteriálnych patogénov. doc. MVDr. Mangesh Bhide, PhD. Ostatných pätnásť rokov pôsobí v oblasti výskumu neuroinfekcií a interakcií hostiteľ-patogén. V roku 2007 ukončil postdoktorandský výskum (postdoktorandské štipendium Marie-Curie) v oblasti interakcií hostiteľ-borélia. Od roku 2008 vedie Laboratórium biomedicínskej mikrobiológie a imunológie (LBMI) Univerzity veterinárskeho lekárstva a farmácie v Košiciach. LBMI je jedno zo špičkových laboratórií infekčných chorôb na Slovensku. 578

Publikoval 81 prác v recenzovaných časopisoch s celkovým počtom 1666 citácií (h index – 24), 8 kapitol v knihách medzinárodných vydavateľstiev a 2 knihy v oblasti bioinformatiky (In silico veritas I a II). Úspešne ukončil 16 výskumných projektov (6 financovaných národnými agentúrami), viedol 2 bilaterálne projekty (medzi Slovenskom a Portugalskom, Ruskom a Francúzskom). Bol aktívne zapojený do 4 projektov COST financovaných Európskou vedeckou nadáciou ESF (FA1002, TD1303, TN1301, CM1307). Bol vedúcim „sekcie proteomiky“ v centre excelentnosti INFEKTOZOON a v projekte Medipark (oba financované zo štrukturálnych fondov EÚ pre Slovensko). V rokoch 2015 – 2017 zastával funkciu ERA Chair Holder v oblasti proteomiky na Univerzite v Záhrebe. Doposiaľ bol školiteľom 8 postdoktorandov (4 zo Slovenska, po jednom z Indie, Maďarska, Španielska, Mexika) a 8 doktorandov. Je vedúcim WP a PI v projekte H2020-H2020-MSCA-ITN-2017 (ID projektu – 765423) a vedúcim WP projektu financovaného úradom EFSA (Obermics). prof. MVDr. Ľudmila Tkáčiková, PhD. Vysokoškolská profesorka na Katedre mikrobiológie a imunológie Univerzity veterinárskeho lekárstva a farmácie v Košiciach. V rámci pedagogickej činnosti je zodpovedná za uskutočňovanie, rozvoj a kvalitu študijného programu imunológia v spojenom 1. a 2.stupni ako aj v 3. stupni vysokoškolského štúdia. V rámci svojich vedecko-výskumných aktivít sa zaoberala využitím metód molekulovej biológie na epidemiologické a epizootologické štúdie mikroorganizmov a to hlavne streptokokov, stafylokokov, listérií a kandíd. Zaoberala sa aj štúdiom prítomnosti mutácií v priónovom géne oviec, kôz a hovädzieho dobytka. V ostatných rokoch sa zaoberá štúdiom vplyvu probiotických laktobacilov a ich produktov (exopolysacharidov) na slizničný imunitný systém, ako aj štúdiom antibakteriálnych účinkov nanočastíc striebra. Bola zodpovednou riešiteľkou piatich VEGA grantov a riešiteľkou ďalších 28 projektov (AV, APVV, VEGA, KEGA, INFEKTOZOON, Neurovedy, Probiotech a MediPark) ako aj dvoch zahraničných projektov (Copernicus, Nórsky a EHP finančný mechanizmus). Je autorkou a spoluautorkou kapitol v 4 vedeckých monografiách a v 10 vysokoškolských učebniciach vydaných v domácich vydavateľstvách, 67 vedeckých článkov publikovaných v zahraničných karentovaných časopisoch, 32 publikácií v nekarentovaných zahraničných a domácich časopisoch. V databázach Scopus a Web of Science boli jej práce citované v 613 publikáciách publikovaných v impaktovaných časopisoch. Ako školiteľka sa podieľala na vedeckej výchove 5 doktorandov. 579

doc. MVDr. Jana Koščová, PhD. Je absolventkou Univerzity veterinárskeho lekárstva v Košiciach, odbor všeobecné veterinárske lekárstvo. Od roku 2002 pracuje na Katedre mikrobiológie a imunológie Univerzity veterinárskeho lekárstva a farmácie v Košiciach. V rámci pedagogickej činnosti garantuje predmet mikrobiológia pre bakalársky študijný program bezpečnosť krmív a potravín. Vedie prednášky a praktické cvičenia z mikrobiológie pre bakalárske, magisterské a doktorské študijné programy. Je spoluautorkou 6 vysokoškolských učebníc a 2 učebných skrípt. Doposiaľ bola školiteľkou a školiteľkou-konzultantkou vyše 50 úspešne obhájených záverečných prác v slovenskom aj v anglickom jazyku a v súčasnosti vedie dvoch doktorandov. Vo vedecko- výskumnej sfére sa venuje oblasti naturálnych substancií, predovšetkým probiotických baktérií a rastlinných éterických olejov a optimalizácii intestinálnej mikrobioty, ale aj problematike výskytu rezistentných baktérií u zvierat a v prostredí. V súvislosti s danou témou rieši rôzne výskumné úlohy a granty a zúčastňuje sa domácich aj medzinárodných vedeckých konferencií. V pozícii spoluriešiteľa aktívne participovala na zahraničných projektoch, projektoch hradených zo štrukturálnych fondov EÚ a domácich projektoch (APVV, VEGA, KEGA), v súčasnosti je zodpovedným riešiteľom projektu VEGA. Je autorkou alebo spoluautorkou 24 publikácií v CC časopisoch ako aj ďalších publikácií vo vedeckých a odborných časopisoch a desiatok publikácií v zborníkoch. Výsledky jej vedeckej a publikačnej činnosti boli v rámci citačnej databázy SCI doposiaľ citované vyše 440-krát. doc. MVDr. Radomíra Nemcová, PhD. Pracuje na Katedre mikrobiológie a imunológie UVLF ako vysokoškolský pedagóg. Už viac ako 25 rokov sa venuje výskumu probiotík. Špecializuje sa v oblasti: probiotický výskum – selekcia a charakterizácia probiotických baktérií a ich bioaktívnych produktov, štúdium biologických a technologických vlastností prospešných baktérií, mikrobiálna črevná aktivita, laboratórna fermentácia, germ-free a gnotobiologické techniky a postupy, klinické overovanie probiotických a naturálnych prípravkov. Bola a je zodpovednou riešiteľkou resp. spoluriešiteľkou 22 domácich projektov (VEGA, APVV, ŠF EÚ) a dvoch zahraničných 580

projektov (Rámcový program EÚ, Nórsky a EHP finančný mechanizmus). Je autorkou a spoluautorkou 7 kapitol vo vedeckých monografiách vydaných v renomovaných zahraničných a v domácich vydavateľstvách a 72 vedeckých článkov publikovaných v CC a impaktovaných časopisoch (Scopus). V databázach Scopus a Web of Science boli jej práce citované v 880 publikáciách publikovaných v impaktovaných časopisoch a podľa databázy Scopus je hodnotená H-indexom 16. Ako školiteľka sa podieľala na vedeckej výchove 8 doktorandov. Je spoluautorkou 5 úžitkových vzorov a patentov. Bola jej udelená Cena za transfer technológií na Slovensku 2016 v kategórii „Inovácia s najväčším potenciálom pre uplatnenie v praxi“ (CVTI Bratislava). Je členkou špičkového tímu Lactovir UVLF v Košiciach, ktorý bol ocenený v roku 2017 Ministerstvom školstva, vedy, výskumu a športu SR Cenou za vedu a techniku za významný prínos pri štúdiu vírusových agensov a vývoj laktobacilových prípravkov na ochranu zdravia zvierat a produkciu kvalitných a bezpečných potravín živočíšneho pôvodu. doc. MVDr. Tomáš Csank, PhD. Vysokoškolské vzdelanie získal v roku 2007 na Univerzite veterinárskeho lekárstva a farmácie v Košiciach v odbore všeobecné veterinárske lekárstvo. Na Katedre mikrobiológie a imunológie UVLF v Košiciach absolvoval doktorandské štúdium so zámerom na prasací cirkovírus. Od úspešného získania titulu „Philosophiae doctor“ v študijnom progame virológia pôsobí na Katedre mikrobiológie a imunológie UVLF v Košiciach ako vedecko-pedagogický pracovník. Bol školiteľom, respektíve školiteľom konzultantom 20 diplomových prác a dvoch dizertačných prác. Je spoluautorom učebných textov Veterinárna virológia v slovenskom a v anglickom jazyku a skrípt Praktické cvičenia z mikrobiológie v slovenskom a v anglickom jazyku vydaných na UVLF v Košiciach. Absolvoval niekoľko výskumných pobytov. V roku 2009 sa pod vedením profesora Gordona Allana zúčastnil dvojtýždňovej stáže vo virologickom laboratóriu Inštitútu poľnohospodárskych, potravinárskych a biologických vied (Agri-Food and Biosciences Institute) v Belfaste v Severnom Írsku. V máji toho istého roku absolvoval trojmesačný výskumný pobyt vo virologickom laboratóriu na Veterinárskej fakulte v Merelbeke (University Ghent, Belgicko) pod vedením profesora Hansa Nauwyncka. Počas oboch pobytov získal neoceniteľné vedomosti a skúsenosti v oblasti virologických a sérologických metód. V roku 2014 sa zúčastnil workshopu pod vedením profesora Manfreda Weidmanna vo virologickom laboratóriu na Univerzite v Göttingene (Nemecko), ktorého zámerom bola práca v laboratóriu pre biologické faktory 3. a 4. skupiny. Získané vedomosti využil počas výskumnej stáže v roku 2016 u docenta Tamása Bakonyiho (Katedra mikrobiológie a infekčných chorôb, Univerzita veterinárskej medicíny v Budapešti), kde sa v laboratóriu pre biologické faktory 3. (Miklós Gyuranecz, Veterinársky výskumný ústav, Maďarská akadémia vied) zaoberal štandardizáciou mikrotitračného neutralizačného testu pre simultánne vyšetrenie vzoriek sér na prítomnosť špecifických protilátok voči West Nile vírusu, Usutu vírusu a vírusu kliešťovej encefalitídy u vtákov, koní a ľudí na Slovensku. 581

V súčasnosti sa venuje biologickej charakteristike článkonožcami prenášaných vírusov, tzv. arbovírusov a vývoju metód pre ich detekciu. Okrem toho sa zaoberá druhovou diverzitou, genetickou a biologickou charakteristikou arbovírusov. V rámci týchto cieľov sa so spolupracovníkmi venuje výskytu arbovírusov vo vektoroch, replikačným vlastnostiam izolátov arbovírusov v bunkových kultúrach a ich interakciou s vrodenou imunitnou odpoveďou. V pozícii vedúceho projektu alebo člena riešiteľského kolektívu participoval na projektoch Agentúry MŠVVaŠ SR pre štrukturálne fondy Európskej únie, Agentúry na podporu výskumu a vývoja (APVV), projektoch Vedeckej grantovej agentúry (VEGA) MŠVVaŠ SR a SAV a na Medzinárodnom Višegradskom projekte. V roku 2017 získal ocenenie „Mladý mikrobiológ 2016“ udelené Československou spoločnosťou mikrobiologickou. MVDr. Vanda Hajdučková, PhD. Je absolventkou Univerzity veterinárskeho lekárstva v Košiciach, odbor hygiena potravín. Doktoradské štúdium ukončila v roku 2010 v študijnom programe mikrobiológia. Od roku 2018 pracuje na Katedre mikrobiológie a imunológie Univerzity veterinárskeho lekárstva a farmácie v Košiciach. V rámci pedagogickej činnosti spolugarantuje predmet základy mikrobiológie, parazitológie a imunológie pre bakalársky študijný program veterinárna sestra. Vedie praktické cvičenia z mikrobiológie pre bakalárske, magisterské a doktorské študijné programy. Je spoluautorkou 1 učebných skrípt. Doposiaľ bola školiteľkou 5 úspešne obhájených záverečných prác v slovenskom jazyku a v súčasnosti vedie 4 diplomantov. Vo vedecko-výskumnej sfére sa venuje problematike probiotických baktérií, ich selekcii a charakterizácii ich bioaktívnych produktov, štúdiu prevencie a terapie črevných zápalových ochorení s využitím gnotobiotických laboratórnych zvierat asociovaných s humánnou mikrobiotou, cielenou moduláciou črevnej mikrobioty a jej transplantáciou, ale aj problematike výskytu rezistentných baktérií u zvierat a v prostredí. V súvislosti s danou témou rieši rôzne výskumné úlohy a granty a zúčastňuje sa domácich aj medzinárodných vedeckých konferencií. V pozícii spoluriešiteľa aktívne participovala a naďalej participuje na domácich projektoch (APVV, VEGA, KEGA). 582

RNDr. Ján Király, PhD. Je absolventom Prírodovedeckej fakulty UPJŠ v Košiciach. Doktorát získal na Virologickom ústave SAV v Bratislave v roku 2011 v študijnom odbore virológia so zameraním na prípravu rekombinantného vírusu chrípky ako vektora pre indukciu biologicky aktívnych protilátok. V súčasnosti pracuje ako vedecko-výskumný pracovník na Katedre mikrobiológie a imunológie UVLF v Košiciach. Využívajúc metódy molekulárnej biológie sa podieľa na riešení vedeckých projektov podporovaných grantovými agentúrami VEGA, KEGA, APVV. MVDr. Marián Maďar, PhD. Pôsobí ako vysokoškolský pedagóg na Katedre mikrobiológie a imunológie Univerzity veterinárskeho lekárstva a farmácie v Košiciach. Počas doktorandského štúdia študoval imunoproteomické aspekty vybraných kliešťom prenosných chorôb, pričom využíval molekulovo-biologické a proteomické metódy. Neskôr od roku 2012 do 2022 pracoval ako vedecko-výskumný pracovník v Laboratóriu gnotobiológie na Katedre mikrobiológie a imunológie UVLF, kde zaviedol mnohé molekulárne metódy v oblasti genomiky, proteomiky, imunológie a mikrobiológie. V spolupráci s Poľskou akadémiou vied zaviedol metódu FISH na polykarbonátových filtroch a rozvinul ju o variácie Multicolor FISH, HISTO- FISH a VFQTOPF. V spolupráci s Českou akadémiou vied zaviedol na pracovisku NGS sekvenovanie amplikónov pre účel charakterizácie zloženia bakteriálneho mikrobiómu. Ako prvý na univerzite sekvenoval DNA pomocou Minisekvenátora MinION Oxford Nanapore 583

Technology, pričom výsledky prezentoval na konferencii v EMBL v Heidelbergu. Už siedmy rok sa venuje výskumu dentálnych biofilmov, probiotických baktérií a ich bioaktívnych látok v rámci humánnej a veterinárnej medicíny. Ako spoluriešiteľ sa podieľal na úspešnom dokončení 11 projektov (APVV, INFEKTOZOON, MediPark, Probiotech a VEGA). Je autorom a spoluautorom 26 vedeckých článkov publikovaných v CC a impaktovaných časopisoch, viac ako 60 odborných článkov a príspevkov z domácich a zahraničných konferencií. Jeho práce boli citované vo viac ako 140 publikáciách publikovaných vo významných impaktovaných časopisoch a podľa databázy Scopus je hodnotený H-indexom 8. Je autorom a spoluautorom 5 kapitol vo vedeckých monografiách vydaných v zahraničných a v domácich vydavateľstvách. Vedie praktické cvičenia z predmetov mikrobiológie a imunológie. Zabezpečuje tiež školenie v rámci III. stupňa vysokoškolského vzdelánia v predmete mikrobiológia. Doposiaľ bol školiteľom 2 ukončených doktorandov a aktuálne vedie 2 doktorandov v dennej forme štúdia. MVDr. Evelína Mochnáčová, PhD. Pracuje ako vedecký pracovník v Laboratóriu biomedicínskej mikrobiológie a imunológie na Univerzite veterinárskeho lekárstva a farmácie v Košiciach. V roku 2015 promovala na UVLF v odbore všeobecné veterinárske lekárstvo, kde následne získala doktorát v študijnom programe neurovedy. V rámci svojej práce sa venuje štúdiu proteínových interakcií medzi hostiteľskými bunkami a neuropatogénmi. Aktuálne sa zaoberá dizajnom nových antimikrobiálnych liečiv proti neuroinvazívnej Borrelia garinii. 584

Autori: prof. MVDr. Emil Pilipčinec, PhD. prof. MVDr. Mangesh Bhide, PhD. prof. MVDr. Ľudmila Tkáčiková, PhD. doc. MVDr. Jana Koščová, PhD. doc. MVDr. Radomíra Nemcová, PhD. doc. MVDr. Tomáš Csank, PhD. MVDr. Vanda Hajdučková, PhD. RNDr. Ján Király, PhD. MVDr. Marián Maďar, PhD. MVDr. Evelína Mochnáčová, PhD. Recenzenti: prof. MUDr. Erik Dorko, PhD. doc. MVDr. Monika Pipová, PhD. BIOINFORMATICKÉ A MOLEKULOVOBIOLOGICKÉ NÁSTROJE PRI ŠTÚDIU FAKTOROV PATOGENITY A VIRULENCIE MEDICÍNSKY VÝZNAMNÝCH BAKTERIÁLNYCH PATOGÉNOV Vydavateľ: Univerzita veterinárskeho lekárstva a farmácie v Košiciach, Komenského 73, 041 81 Košice Tlač: Univerzitná knižnica a edičné stredisko UVLF v Košiciach Rok vydania: 2022 (elektronická forma) Počet strán: 585 Náklad: Elektronická forma Vydanie: Prvé ISBN 978 – 80 – 8077 – 768 – 5 585