E. Pilipčinec a kol._KEGA monografia 2022_č.j. 07UVLVF-4-2021

podmienkach a na podporu rýchleho expandujúceho pohybu kolónií po nových povrchoch počas vegetatívneho rastu v podmienkach bohatých na živiny267,268. Väčšina baktérií má viacero pilusov, ktoré podstupujú nezávislé cykly elongácie a retrakcie. U tyčinkovitých baktérií, ako je P. aeruginosa, sú pilusy umiestnené na póloch. U kokovitých baktérií, ako je N. gonorrhoeae, majú pilusy tendenciu byť rozložené rovnomerne. Medzi pilusmi, ktoré sú orientované rôznymi smermi, nastáva pnutie. Nerovnováha ťahových síl v rôznych smeroch je zosilnená odtrhnutím tých pilusov, ktoré sú vystavené veľkej sile, čo vedie k riadenému pohybu. Uvoľnenie jedného pilusu, zatiaľ čo ostatné pilusy sú stále napnuté, má za následok náhlu zmenu orientácie a bunka „vystrelí“ do novej polohy. Na rozdiel od napr. M. xanthus, kde pilusy typu IV umožňujú riadený chemotaktický pohyb, u N. gonorrhoeae zášklbový pohyb by mohol byť riadený v určitých smeroch pomocou záchytných bodov na povrchu, ktoré modulujú silu adhézie. Napríklad sa ukázalo, že tekutosť povrchu ovplyvňuje perzistenciu pohybu, pričom sa tekutosť povrchu hostiteľských buniek môže meniť. Na strane baktérií môže byť pohyblivosť regulovaná mechanizmami, ktoré modulujú buď počet pilusov, napr. transkripčnou reguláciou promótora pilínu, alebo silu adhézie, napr. posttranslačnými úpravami povrchu pilusu. Tieto kontrolné mechanizmy môžu hrať úlohu počas infekcie alebo počas tvorby biofilmu269,270. P. aeruginosa môže tiež stáť vzpriamene na povrchu a ‚chodiť‘, pričom využíva zášklbové pohyby na efektívne skúmanie svojho 2D prostredia271. Nedávna práca ukázala, že polárne umiestnenie motorov, poháňajúcich zášklbový pohyb buniek P. aeruginosa, je regulované mechanickým vstupom vytvoreným pilusom T4P, čo vedie k pozitívnej spätnej väzbe, ktorá bunke umožňuje efektívne vykonávať mechanotaxiu272. Pilus T4P je špirálovitý polymér, ktorý obsahuje majoritné pilínové podjednotky, ale aj niektoré minoritné pilíny. Predpokladá sa, že minoritné pilíny s nízkym výskytom tvoria komplex, ktorý iniciuje zostavenie majoritných pilínov T4P a sú lokalizované na špičke pilusu273. Niektoré T4P majú ďalšie menšie pilíny, ktoré sa zdajú byť súčasťou celého pilusu a modulujú jeho dynamiku a funkcie274,275. Jedinečná štruktúra pilínov a ich usporiadanie v piluse vedie k vláknam, ktoré majú dĺžku niekoľko mikrometrov, ale priemer iba 5 – 8 nm, sú flexibilné a elastické, s dĺžkou perzistencie 5 μm a s ťažnou silou >100 pN. Pilínové monoméry sú zabudované vo vnútornej membráne prostredníctvom konzervovaných hydrofóbnych amino-terminálnych α- helixov276,277. Globulárna oblasť, ktorá je väčšia a menej konzervovaná, je uložená pred polymerizáciou v periplazmatickom priestore a po nej sa nachádza na vonkajšej strane vlákna153. Monoméry sa vkladajú do polyméru pilusu alebo sa z neho odstraňujú aktivitou 201

cytoplazmatických ATPáz elongácie a retrakcie, ktoré sú ukotvené na cytoplazmatickom prstenci vzájomne sa vylučujúcim spôsobom a interagujú s platformovým proteínom278. Na základe pilínových podjednotiek možno rozdeliť bakteriálne T4P na podtypy: pilusy typu IVa (T4aP), pilusy typu IVb (T4bP) a Tad pilusy (Tigh adherence), ktoré už boli premenované na pilusy typu IVc (T4cP). Pre T4aP je typická PilT retrakčná ATPáza, ktorá práve sťahuje pilus za vyvinutia pomerne veľkej mechanickej sily a nakoniec teda aj pohybu. Tieto pilusy sú typické pre rôzne ľudské patogény. PilT väčšinou u T4bP chýba, miesto nej však býva prítomná iná ATPáza, a teda aj mechanizmus retrakcie sa líši. Podobne je to aj u Vibrio cholerae, ktoré pravdepodobne využíva retrakciu menšieho pilínu. T4bP sú bežné najmä pre enterobaktérie. Tad pilusy sú tvorené menšími pilínovými podjednotkami ako u T4aP a taktiež u nich chýba PilT263,279. Štruktúry a funkcie mnohých prvkov zapojených do zášklbového pohybu sú známe. Pilusy sa vysúvajú a sťahujú pomocou mechanizmu T4P, ktorého architektúru odhalila kryoelektrónová tomografia280,281. T4P využíva komplexný proteínový mechanizmus na presun pilínových podjednotiek zo zásobníka vo vnútornej membráne do rastúceho pilusu, aby sa pilus postupne vytlačil cez periplazmu a vonkajšiu membránu na povrch baktérie a naopak na obrátenie tohto procesu, aby sa pilus stiahol. Najjednoduchší mechanizmus T4P, prítomný u baktérií ako napr. V. cholerae, enterotoxigénne E. coli (ETEC) a Caulobacter crescentus, sa skladá len z desiatich polypeptidov kódovaných v jednom operóne. Komplexnejší mechanizmus T4P, napr. u P. aeruginosa a Neisseria spp., využíva ďalšie proteíny, ktoré sú kódované v génových klastroch distribuovaných v celom genóme282. Jadro mechanizmu T4P obsahuje štyri komponenty (Obr. 5.5): cytoplazmatickú ATPázu, ktorá poháňa polymerizáciu; platformový proteín vnútornej membrány, ktorý prenáša chemickú energiu z väzby a hydrolýzy ATP na mechanickú energiu potrebnú na vytlačenie pilusu; sekretínový kanál vonkajšej membrány; a pilusové vlákno, ktoré je zostavené z pilínových podjednotiek ukotvených vo vnútornej membráne a rastie cez periplazmu a cez sekretínový kanál vonkajšej membrány283. Komplexné systémy T4P majú druhú „retrakčnú“ ATPázu, ktorá katalyzuje depolymerizáciu pilusu. Tento zložitý mechanizmus je stabilizovaný zoskupeným komplexom podobným klietke, ktorý je tvorený cytoplazmatickými a periplazmatickými proteínmi, ktoré spájajú cytoplazmatické ATPázy so sekretínovým kanálom vonkajšej membrány. U Gram-negatívnych baktérií je otvor kanálu zatvorený v neprítomnosti pilusu, aby sa zabránilo úniku molekúl z bunky. U Gram-pozitívnych baktérií sekretínový kanál nie je, keďže pilus môže priamo prejsť peptidoglykánovou vrstvou263. 202

Obr. 5.5 Architektúra mechanizmu T4P (Craig a kol. 2019; upravené)287. Mechanizmus elongácie a retrakcie T4P sa skladá z viacerých proteínových komponentov. Všetky systémy T4P využívajú cytoplazmatickú elongačnú ATPázu (zelená) na riadenie polymerizácie a rastu pilusu z vnútornej cytoplazmatickej membrány (IM), naprieč periplazmou a cez kanál vonkajšej membrány tvorený sekretínom (OM) (fialová). Väčšina T4P má druhú retrakčnú ATPázu (červená) na riadenie depolymerizácie pilusu. Obe ATPázy pravdepodobne interagujú s cytoplazmatickými doménami platformového proteínu vnútornej membrány (oranžová) a sú stabilizované skupinou zoskupených proteínov (sivá). ATP väzbou a hydrolýzou indukované konformačné zmeny ATPáz sú prenášané cez platformový proteín, aby sa postupne vytlačil pilus po každom pridaní pilínovej podjednotky v prípade elongačnej ATPázy alebo aby sa uvoľnili pilíny späť do ich membránového zásobníka v prípade retrakčnej ATPázy. Názvy jednotlivých proteínov sú uvedené pre komplexné T4P systémy Pseudomonas aeruginosa, Neisseria gonorrhoeae a Myxococcus xanthus a jednoduchý T4P systém Vibrio cholerae. Ako ATPázy elongácie a retrakcie riadia polymerizáciu a depolymerizáciu pilusu je v súčasnosti neznáme, avšak uvažuje sa o dvoch protikladných modeloch284. V prvom modeli, hydrolýza ATP ATPázou elongácie poháňa rotáciu proteínu platformy, čo vedie k inkorporácii pilínových monomérov jeden po druhom z vnútornej membrány do základne pilusu285,286. Rastúci pilus je potom postupne vytláčaný cez periplazmatické prstence a odtiaľ cez pór vonkajšej membrány. Retrakčná ATPáza otáča platformový proteín v opačnom smere, čím sa obráti proces opísaný vyššie. V druhom modeli, platformový proteín tvorí oligomérny prstenec 203

okolo základne pilusu a postupné otváranie a zatváranie otvoru v jeho štruktúre (poháňanej ATPázami) umožňuje vstup pilínových monomérov, po ktorých nasleduje polymerizácia a vytlačenie287. Tieto modely poskytujú vhodnú pôdu pre budúce štúdie zamerané na testovanie konkurenčných hypotéz pomocou molekulárnych a biofyzikálnych prístupov. 5.3.1.3 Kĺzavý pohyb (Gliding) Niektoré baktérie sa hladko pohybujú po povrchoch bez pomoci bičíkov alebo pilusov. Tento typ pohybu, známy ako kĺzavý pohyb, umožňujú adhezíny, ktoré sa prichytia k substrátu a pohybujú sa po celej dĺžke bunky. Niekoľko skupín fylogeneticky odlišných baktérií, vrátane myxobaktérií, cyanobaktérií a flavobaktérií, používa pohyb pomocou kĺzania s odlišnými molekulárnymi mechanizmami288. Flavobacterium johnsoniae, zástupca kmeňa Bacteroidetes, sa pohybuje po povrchoch tak, že poháňa adhezíny po dráhach fixovaných na povrchu bunky (Obr. 5.6). Obr. 5.6 Model kĺzavého pohybu Flavobacterium johnsoniae (McBride a Nakane 2015; upravené)289. Gld proteíny v bunkovej stene bakteriálnej bunky, ako sú SprB a RemA, tvoria motory, ktoré poháňajú adhezíny pozdĺž slučkových špirálových dráh na povrchu bunky. Pôsobenie motorov na adhezíny, ktoré sú pripojené k substrátu, má za následok pohyb vpred a rotáciu bunky. Tieto dráhy tvoria špirálové uzavreté slučky, takže bunky sa pri pohybe otáčajú okolo svojich dlhých osí a adhezíny sa oddeľujú od povrchu, keď dosiahnu zadný koniec bunky a sú recyklované späť do prednej časti bunky. Keď sa adhezíny prichytia k povrchu, poháňajú bunku dopredu289,290. Predpokladá sa, že pohyb buniek je výsledkom pôsobenia kĺzavého motora zloženého z proteínov Gld na adhezín SprB na bunkovom povrchu291. Bunky, ktorým chýbal 204

SprB, však boli len čiastočne defektné v pohybe292. Transpozónová mutagenéza mutantu sprB viedla k identifikácii génu remA, ktorý kóduje adhezín RemA. Bunky bez SprB a RemA mali závažnejšie defekty v pohybe ako bunky, ktorým chýbal len SprB. RemA sa pohybuje po povrchu bunky rýchlosťou 1 až 2 μm/s, podobne ako SprB. Obsahuje lektínovú doménu, ktorá mu umožňuje interagovať s exopolysacharidmi vylučovanými bunkami, čo uľahčuje pohyb buniek po niektorých povrchoch293. Zistilo sa, že komponenty kĺzavého mechanizmu sú úzko spojené so sekrečným systémom typu IX (T9SS). T9SS sa nachádza u všetkých bakteroidov, schopných kĺzania, a u mnohých nekĺzacich bakteroidov, ako je napríklad periodontálny patogén Porphyromonas gingivalis. Avšak zjavne sa nenachádza mimo kmeňa Bacteroidetes294. Bolo dokázané, že proteíny bakteriálneho T9SS ako sú GldN, SprE, SprT, GldK, GldL, GldM a SprA sa podieľajú na sekrécii adhezínov SprB a RemA295,296. Okrem T9SS proteínov sú na kĺzanie potrebné aj proteíny GldA, GldB, GldD, GldF, GldG, GldH, GldI a GldJ297,298. Tieto proteíny sa môžu podieľať na pohybe SprB a RemA a interagovať s T9SS. Mutácie v génoch, kódujúcich ktorýkoľvek z týchto proteínov, viedli k zjavnej nestabilite T9SS proteínu GldK, a tým k strate funkcie T9SS. Zdá sa, že proteíny kĺzavého pohybu a T9SS F. johnsoniae sú vzájomne prepojené. Boli izolované kmene produkujúce skrátené proteíny GldJ, ktoré mali normálnu funkciu T9SS, ale boli defektné v pohyblivosti299. Podobne ako rotácia bičíkov u E. coli, je pohyb adhezínov poháňaný protónovou hybnou silou ako zdrojom energie300. Už v roku 1979 Pate a Chang301 tvrdili, že kĺzanie môže byť poháňané rotačným motorom. Keď boli bunky F. johnsoniae „ostrihané“, aby sa znížil počet a dĺžka vlákien SprB a potom pripevnené na sklo pomocou anti-SprB protilátok, otáčali sa okolo pevného bodu konštantnou uhlovou rýchlosťou ~ 1 – 3 Hz väčšinou proti smeru hodinových ručičiek, čo potvrdzuje, že kĺzanie je poháňané rotačným motorom302. Krútiace momenty potrebné na udržanie tejto rýchlosti boli porovnateľné s tými, ktoré vytvára bičíkový rotačný motor. Zistilo sa však, že kĺzavý motor beží skôr konštantnou rýchlosťou než konštantným krútiacim momentom. Existujúce dôkazy podporujú model, v ktorom protónom poháňaný kĺzavý motor (GldL-GldM) poháňa rotáciu pastorka (GldKN), ktorý hýbe behúňom (GldBDHIJ), na ktorom je umiestnený adhezín SprB. SprA slúži ako hradlový kanál, cez ktorý sa proteíny spojené s kĺzaním (ako je SprB) vylučujú do vonkajšej membrány303. GldL a GldM sú jedinými komponentmi kĺzavého mechanizmu, ktorý pokrýva cytoplazmatickú membránu, čo naznačuje ich účasť na prenose energie304. V súlade s tým nedávna kryo-EM štúdia naznačuje zaradenie GldL a GldM do vnútornej membrány, pričom päť kópií GldL obklopuje dve kópie GldM, podobne ako je to u statorovej jednotky E. coli305. Autori tejto 205

štúdie navrhujú model, v ktorom GldL zostáva stacionárny vo vnútornej membráne, zatiaľ čo GldM rotuje v periplazmatickom priestore. GldM kontaktuje veľkú prstencovú štruktúru vo vonkajšej membráne zloženú z GldK a GldN, ktorá môže spájať motor GldL-GldM s behúňom, ktorý nesie adhezín SprB. Zostáva však identifikovať viacero komponentov. Doteraz neboli nájdené žiadne štruktúry, ktoré by kotvili GldL k peptidoglykánovej vrstve. Výsledky naznačujú, že SprB a RemA sú mobilné adhezíny bunkového povrchu podieľajúce sa na kĺzaní F. johnsoniae, ale zostáva veľa nezodpovedaných otázok týkajúcich sa motorov (Otáča sa prstenec GldK – GldN? Koľko motorov GldL – GldM sa spája s každým GldK – GldN prstencom? Čo udržuje nehybnosť GldL vo vnútornej membráne?), ktoré poháňajú tieto adhezíny a systému chemotaxie, ktorý bunkám umožňuje kontrolovať ich pohyby. Na rozdiel od F. johnsoniae, M. xanthus kĺže po povrchoch s oveľa nižšou rýchlosťou ~ 5 μm/min306,307. F. johnsoniae a M. xanthus nie sú blízko príbuzné. Napriek tomu existuje veľa podobností medzi ich mechanizmami kĺzania: obidva sú poháňané protónovou hnacou silou a majú adhezíny, ktoré sa pohybujú pozdĺž bunky po špirálových dráhach. Komplexy motora sa pohybujú vo vnútornej bunkovej membráne po špirálovej dráhe. Keď sa tieto motory pripoja do adhézneho komplexu, posúvajú bunku dopredu. Tok protónov cez komplex AglRQS poháňa pohyb komponentov GltG-GltJ, o ktorých sa predpokladá, že interagujú s adhezínovým komplexom GltABH zabudovaným do vonkajšej membrány. Presný mechanizmus generovania a transdukcie sily zostáva neznámy308,309. Je pozoruhodné, že kĺzavý komplex motora M. xanthus AglRQS je homológny so statorovou jednotkou E. coli MotA – MotB310, zatiaľ čo motor F. johnsoniae GldL – GldM nie je, napriek štruktúrnej podobnosti305. Hlavný rozdiel medzi týmito dvoma prípadmi je v tom, že zatiaľ čo u F. johnsoniae proteíny, ktoré poháňajú pohyb, zostávajú fixované vzhľadom na bunku303, u M. xanthus sa pohybujú po špirálovej dráhe, len občas sa lokalizujú v miestach adhézie, aby podporili pohyb311. Nedávno bol identifikovaný adhezín podobný integrínu zapojený do väzby kĺzavého mechanizmu M. xanthus so substrátom312. Otázkou týkajúcou sa kĺzavého pohybu u M. xanthus je, ako proteíny motora zabudované vo vnútornej membráne poháňajú adhezíny umiestnené na vonkajšej membráne bez narušenia integrity peptidoglykánovej vrstvy. 5.3.1.4 Iné typy pohybu Hoci pohyb poháňaný bičíkmi je prevládajúcim mechanizmom, ktorý baktérie používajú na plávanie v tekutinách, existujú príklady baktérií, ktoré sa pohybujú bez bičíkov prostredníctvom mechanizmov, ktoré v súčasnosti nie sú dostatočne preštudované313. Tieto príklady zahŕňajú 206

zástupcov rodu Synechococcus, ktorí plávajú bez bičíkov alebo pilusov, pravdepodobne šírením povrchových deformácií po tele bunky, sprostredkovaných proteínmi bunkového povrchu SwmA a SwmB314, zástupcov rodu Spiroplasma, čo sú tenké, špirálovité, bezstenné baktérie dlhé ~ 3 μm, ktoré sa môžu pohybovať viskóznym prostredím pomocou dynamického vnútorného cytoskeletu pripojeného k cytoplazmatickej membráne, ktorý vyvoláva pohyb prostredníctvom deformácií v tvare buniek315; a niektoré intracelulárne bakteriálne patogény, ako sú Listeria monocytogenes a Rickettsia spp., ktoré vstupujú do eukaryotických buniek a sú poháňané indukciou polymerizácie eukaryotického cytoskeletálneho proteínu aktínu316. Niektoré druhy rodu Mycoplasma (skupina baktérií bez bunkovej steny, ktoré patria do triedy Mollicutes) sa tiež pohybujú po povrchoch bez pomoci bičíkov alebo pilusov, a to kĺzavým spôsobom, ale používajú úplne iný mechanizmus ako zástupcovia kmeňa Bacteroidetes alebo myxobaktérie317. Mycoplasma mobile je patogén rýb dlhý ~ 1 μm, ktorý kĺže rýchlosťou ~ 2 – 4,5 μm/s na sialylovaných oligosacharidoch. Mycoplasma pneumoniae tiež kĺže po povrchoch rýchlosťou ~ 1 μm/s. Kĺzanie u M. mobile je poháňané tromi veľkými povrchovými proteínmi, ktoré fungujú ako „nohy“ a vykonávajú pohyb tam a späť, pripomínajúci chôdzu. Tieto nohy sú energizované hydrolýzou ATP vo vnútornom komplexe, ktorý obsahuje proteíny (MMOB1660 a MMOB1670), ktoré sú paralógmi α-podjednotky a β-podjednotky F-ATPázy, čo naznačuje, že kĺzanie M. mobile je tiež poháňané rotačným motorom318. Napriek tomu, že patria do rovnakého rodu, M. mobile a M. pneumoniae používajú pri pobybe rôzne molekulárne mechanizmy; kĺzavý mechanizmus u M. pneumoniae však ešte nie je detailne preštudovaný319. Od prvých pozorovaní pohybu baktérií van Leeuwenhoekom pred viac ako tromi storočiami sa naše chápanie toho, ako sa baktérie presúvajú z miesta na miesto, výrazne zlepšilo. Štúdie s použitím kryo-EM výrazne posunuli hranice vedomostí v danej oblasti a to definovaním štruktúr, ktoré poháňajú rotačný motor bičíkov a pilusov typu IV, ako aj niektorých komponentov potrebných na kĺzanie. Viacero z týchto mechanizmov sú rotačné motory poháňané tokom iónov po elektrochemických gradientoch (Tab. 5.2). Pokračujúce štúdie môžu vyplniť zostávajúce medzery vo vedomostiach; napríklad v štruktúrach, ktoré spájajú kĺzavý motor u Bacteriodetes s dráhami, ktoré nesú adhezíny, a v mechanizmoch, ktoré poháňajú pohyb u zástupcov rodu Synechococcus. Ďalšou výzvou je použitie najnovších biofyzikálnych metód na priame skúmanie rozmanitých molekulárnych motorov, ktoré poháňajú pohyb baktérií. Spolu s molekulárnymi mechanizmami je tiež dôležité pochopiť ekologické súvislosti pohybu baktérií a výhody, ktoré im poskytuje v rôznych prostrediach. 207

5.3.2 Mechanizmus bakteriálnej chemotaxie 5.3.2.1 Reakcia baktérií s bičíkovým pohybom na chemické podnety Baktérie reagujú na rôzne podnety, vrátane chemických320. Nie každý bakteriálny druh reaguje na všetky podnety. Zatiaľ čo napr. chemotaxia a termotaxia sú pravdepodobne bežné u všetkých bakteriálnych druhov schopných pohybu, magnetotaxia je obmedzená na druhy, ktoré obsahujú vnútrobunkové štruktúry magnetozómy, pozostávajúce z mikroskopických kryštálikov magnetického minerálu, zvyčajne magnetitu (Fe3O4) alebo greigitu (Fe3S4) a reotaxia sa doteraz našla iba u niektorých mykoplaziem kĺzajúcich sa vo vodnom prúde. Tab. 5.1 Rôzne stratégie pohybu baktérií pomocou bičíkov (Eisenbach 2011)320 Počet a umiestnenie bičíkov Príklad baktérií Popis pohybu Pseudomonas spp. Jeden bičík na jednom z Bičík v závislosti od smeru jeho otáčania pólov (alebo blízko pólu) tlačí alebo ťahá bunku. V dôsledku toho sa bunky. Rhodobacter sphaeroides bunka pohybuje dopredu a dozadu. Jeden bičík zhruba v strede Bičík sa otáča v smere hodinových ručičiek medzi pólmi bunky. alebo sa zastaví. V dôsledku toho bunka pláva v pomerne priamej línii a občas sa zastaví, aby sa preorientovala. Počas pauzy sa bičík uvoľní do špirálovitej formy, ktorej rotácia Zväzok bičíkov na jednom Chromatium okenii preorientuje bunku. z pólov bunky. Niektoré bunky Zväzok v závislosti od smeru jeho otáčania tlačí alebo ťahá bunku. V dôsledku toho sa Halobacterium salinarium bunka pohybuje dopredu a dozadu. Zväzok bičíkov na obidvoch Niektoré bunky Zväzky v závislosti od ich smeru otáčania póloch bunky. Holobacterium salinarium tlačia alebo ťahajú bunku. V dôsledku toho sa bunka pohybuje dopredu a dozadu alebo sa zastaví. Zväzok bičíkov na obidvoch Spirillum volutans Plávanie dopredu a dozadu sa vykonáva póloch bunky Spirillum spp. rovnakým spôsobom, len sa zväzky prevrátia, keď sa bunka obráti. Telo špirálovej bunky sa otáča v reakcii na rotáciu bičíka a táto rotácia vytvára ťah pre pohyb. Niekoľko (obyčajne 5 až 10) Escherichia coli Pohyb baktérie je zložený z dvoch režimov. bičíkov náhodne Salmonella Typhimurium Prvý je prevracanie/pády (tumbling), kedy sa rozmiestnených okolo bunky. Bacillus subtilis bičík otáča v smere chodu hodinových ručičiek a dochádza k preorientovaniu baktérie v priestore. Druhým režimom je pohyb vpred, bunka pláva v pomerne priamej línii (beh), kedy sa bičík otáča proti smeru hodinových ručičiek. Niekoľko (obyčajne 5 až 10) Sinorhizobium meliloti Väčšinu času sa bičíky otáčajú proti smeru bičíkov náhodne hodinových ručičiek a bunka pláva v pomerne rozmiestnených okolo bunky. priamej línii. Občasné zmeny rýchlosti bičíkovej rotácie spôsobujú, že sa bunka otáča (bez pádov). Zväzok dvoch bičíkov na Agrobacterium Bičíky sa otáčajú v smere hodinových ručičiek jednom póle bunky a 2 až 4 tumefaciens alebo sa zastavujú; následne bunka pláva skôr bočné bičíky. v priamej línii alebo sa otáča. 208

Nadmerný počet bičíkov E. coli, S. Typhimurium Rojenie – pohyb buniek v kolónii po povrchu. okolo bunky. Serratia marcescens Periplazmatické bičíky spôsobujú ohýbanie a Jeden bičík na jednom konci, otáčanie bunky. Bunky vykazujú hladké jeden alebo viac bičíkov Proteus mirabilis plávanie, obraty, ohýbanie a pauzovanie. Keď subterminálne na obidvoch Spirochéty sa bičíkové zväzky na oboch póloch buniek koncoch bunky. Všetky bičíky otáčajú v opačných smeroch (jeden ťahá a sa nachádzajú v druhý tlačí), bunka pláva v pomerne priamej periplazmatickom priestore. línii. Keď sa oba zväzky súčasne prepnú, bunka sa obráti. Keď sa oba zväzky otáčajú rovnakým smerom, bunka sa ohne. Chemotaxia je najviac preštudovaná pre pohyb v tekutom médiu (plávanie). Chemotaxiou sa rozumie pohyb vyvolaný chemickým stimulom (chemoefektorom). Ak je v zmysle negatívnom k takémuto stimulu, t.j. proti smeru koncentračného gradientu chemickej látky, nazýva sa chemorepelent. Ak naopak v pozitívnom zmysle, v smere koncentračného gradientu chemickej látky, je potom taká látka označovaná ako chemoatraktant. Chemoefektory pre baktérie sú rôznorodé. Ich zdrojom môže byť samotné prostredie alebo susedné bunky. Mnohé z identifikovaných chemoefektorov slúžia ako zdroje dusíka a/alebo uhlíka pre rast alebo ako akceptory elektrónov pre metabolizmus; patria sem cukry, aminokyseliny, organické kyseliny, dipeptidy, aromatické a alifatické uhľovodíky, nukleotidové bázy, polyamíny a kyslík321,322. Okrem toho boli pozorované ďalšie chemoefektory, ktoré zahŕňajú rastlinné hormóny323, anorganický fosfát324, kovové ióny325, neurotransmitery326 a signály snímania kvóra327. Tab. 5.2 Mechanizmy generovania sily bakteriálneho pohybu (Wadhwa a Berg 2022)178. Motor Bakteriálny Proteíny Typ motora Asociovaný Zdroj energie druh sekrečný systém Bičíkový motor Escherichia coli MotA-MotB Rotačný T3SS Protónová/iónová hybná sila Pilus IV typu Myxococcus PilB a PilT Rotačný T2SS ATP xanthus Bacteroidetes Flavobacterium GldL-GldM Rotačný T9SS Protónová hybná kĺzavý motor johnsoniae sila Myxobacterium Myxococcus AglRQS Rotačný Neznámy Protónová hybná sila kĺzavý motor xanthus Synechococcus Synechococcus SwmA a Pravdepodobne Neznámy Protónová hybná rotačnýa sila motor WH8102 SwmB Mycoplasma Mycoplasma MMOB1660 Pravdepodobne Neznámy ATP mobile MMOB1670 rotačnýb mobile kĺzavý motor Vysvetlivky: a Mutanty, ktorým chýba SwmA, sú nepohyblivé, ale keď sú pripevnené na sklíčko, otáčajú sa okolo bodu pripojenia. b Ako naznačuje homológia medzi proteínmi motora M. mobile a α- a β-podjednotkami rotačnej F-ATPázy. T2SS, sekrečný systém typu II; T3SS, sekrečný systém typu III; T9SS, sekrečný systém typu IX. 209

Chemoatraktanty, vnímané E. coli, sú väčšinou živiny, ako sú aminokyseliny, cukry a dipeptidy. Aminokyseliny sa môžu viazať priamo na chemoreceptory, zatiaľ čo cukry a dipeptidy sa najskôr viažu na periplazmatické väzbové proteíny. Existujú aj nemetabolizovateľné atraktanty, ako je α-metyl-D,L-aspartát (MeAsp), štruktúrny analóg L- aspartátu alebo α-aminoizobutyrát, štruktúrny analóg L-serínu. Ich použitie sa bežne využíva na skúmanie signálnej dráhy chemotaxie. Chemorepelenty sú zvyčajne pre bunku toxické, napr. ióny dvojmocných kovov Ni2+ a Co2+ u E. coli328. Niekedy môžu chemoefektory vykazovať rôzne účinky u rôznych mikroorganizmov; napr. fenol pôsobí ako chemoatraktant pre E. coli, ale je chemorepelentom pre S. Typhimurium329. Leucín, valín a tryptofán sú chemoatraktanty pre B. subtilis, ale sú chemorepelenty pre E. coli a S. Typhimurium330. Bežné chemické stimuly pre E. coli sú uvedené v Tab. 5.3. Tab. 5.3 Všeobecne známe chemické stimuly pre E. coli (Eisenbach 2011)320 Chemoatraktanty Chemorepelenty Cukry Alkoholy D-glukóza, D-galaktóza, d-ribóza, maltóza, D-manóza etanol, izopropanol Aminokyseliny L-serín, L-aspartát, L-alanín Polyalkoholy glycerol, etylénglykol Dipeptidy Hydrofóbne aminokyseliny L-prolyl-L-leucín, glycyl-L-prolín L-leucín, L-valín Energeticky viazané chemikálie Anorganické ióny kyslík ~ 0,7µmol.L-1 Co2+, Ni2+ Slabé organické zásady Energeticky viazané chemikálie trimetylamín kyslík ~ 1 mmol.L-1 Slabé organické zásady acetát, benzoát pH kyslé, alkalické Iné S2-, merkaptány (napr. 2-propántiol), indol Medzi bakteriálnymi druhmi sú pozorované rôzne reakcie na stimuly, aj keď porovnávané baktérie vykazujú rovnaký typ pohybu, napríklad bičíkový pohyb. V závislosti od rôznych stratégií bičíkového pohybu (Tab. 5.1) niektoré bakteriálne druhy reagujú na zmeny koncentrácie chemických podnetov zmenou smeru bičíkovej rotácie a iné zmenou rýchlosti plávania (chemokinéza) alebo zastavením rotácie. Niekoľko príkladov je uvedených v Tab. 5.4. Ako už bolo uvedené v predchádzajúcej časti, to, či E. coli beží alebo padá, závisí od smeru rotácie jej bičíkov. V prostredí, kde nie sú prítomné žiadne vonkajšie stimuly (Obr. 5.7a), dochádza k rovnomernému striedaniu oboch režimov a baktérie sa pohybujú s rovnakou pravdepodobnosťou vo všetkých smeroch – podstupujú tzv. náhodnú chôdzu (random walk). 210

Bakteriálna bunka strieda smer rotácie bičíkov približne každú jednu sekundu331. Rotácia bičíkov proti smeru hodinových ručičiek spôsobí pohyb (beh) v jednom smere. Rotácia v smere hodinových ručičiek naopak zastaví pohyb (pád/prevalenie) a spôsobí rotáciu. Obr. 5.7 Pohyb Escherichia coli v tekutom prostredí (Eisenbach 2011; upravené)320. (a) Náhodný pohyb E. coli v prostredí bez stimulov (b) Pohyb E. coli ovplyvnený v prostredí so stimulom (atraktant) V stimulovanom prostredí (Obr. 5.7b) E. coli reaguje na gradienty chemikálií vykonaním tzv. predpojatej náhodnej chôdze (biased random walk)332. Inými slovami, prispôsobuje svoj pohyb (beh – prevracanie/pády) takým spôsobom, že migruje smerom nahor alebo nadol po gradiente, v závislosti od toho, či je gradient chemoatraktantom alebo chemorepelentom, a to vyladením frekvencie, pri ktorej vykonáva pády. Táto frekvencia je v homogénnom prostredí zhruba 1 za sekundu a pri pohybe v smere atraktantu sa znižuje na cca 0,1 za sekundu. Keď sa bunka pohybuje smerom nahor po gradiente chemoatraktantu, častejšie sa stretáva s molekulami chemoatraktantu, snaží sa predĺžiť interval rotácie bičíkov v protismere hodinových ručičiek (beh) a naopak utlmiť rotáciu bičíkov v smere hodinových ručičiek (pád/prevalenie). Podobne pri pohybe nadol po gradiente chemorepelentu potláča pády333. Ak sa namiesto toho zníži koncentrácia chemoatraktantu (alebo ak sa zvýši koncentrácia chemorepelentu), bunka padá približne rovnakou frekvenciou ako v prípade neprítomnosti gradientu334. 211

Vnímanie chemického stimulu u E. coli je v čase, nie v priestore. Bunky reagujú na zmeny v koncentráciách, ku ktorým dochádza v priebehu času, nie na konkrétnu hodnotu koncentrácie. Viaceré štúdie skúmali smer rotácie bičíkov pripevnených buniek, ktoré boli vystavené skokovým zmenám v koncentráciách chemoatraktantov alebo chemorepelentov335,336. Takéto jednoduché pravidlá, sprostredkované chemotaxiou, umožňujú baktériám sa efektívne orientovať v ich heterogénnom prostredí. Tab. 5.4 Príklady odpovedí baktérií s bičíkovým pohybom na chemotaktické stimuly (Eisenbach 2011)320 Bakteriálny druh Odpoveď na pozitívny stimul Odpoveď na negatívny stimul E. coli, Salmonella spp. Zvýšená pravdepodobnosť rotácie Zvýšená pravdepodobnosť otáčania bičíkov CCW. V dôsledku toho sa CW a pauzy. V dôsledku toho sa bunka behy predlžujú. častejšie prevracia a preorientováva. Bacillus subtilis Zvýšená pravdepodobnosť rotácie Zvýšená pravdepodobnosť otáčania bičíkov CW. V dôsledku toho sa CCW. V dôsledku toho sa bunka behy predlžujú. častejšie prevracia a preorientováva. Sinorhizobium meliloti Zvýšená rýchlosť rotácie bičíkov. V Znížená rýchlosť rotácie bičíkov. V dôsledku toho sa behy predlžujú. dôsledku toho sa zväzok rotujúcich bičíkov rozdelí na jednotlivé vlákna rotujúce rôznou rýchlosťou a bunka sa otáča. Rhodocbater sphaeroides Zvýšená rýchlosť a zníženie Zvýšená pravdepodobnosť zastavenia. pravdepodobnosti zastavenia rotácie V dôsledku toho sa bunka preorientuje. bičíkov. V dôsledku toho sa behy predlžujú. Azospirillum brasilense Zvýšená rýchlosť a znížená Zvýšená pravdepodobnosť obrátenia pravdepodobnosť obrátenia bičíkovej bičíkovej rotácie. V dôsledku toho sa rotácie. V dôsledku toho sa behy bunka preorientuje. predlžujú. Spirochéty Bičíky sa otáčajú bez prestávky, čo Bičíky sa často zastavujú, čím narúšajú vedie ku koordinovanej rotácii dvoch koordinovanú rotáciu dvoch polárnych polárnych zväzkov. V dôsledku toho zväzkov. Následne sa bunka ohne bunka pláva v priamej línii. a zastaví. Vysvetlivky: CW (ClockWise) – v smere hodinových ručičiek CCW (Counter ClockWise) – proti smeru hodinových ručičiek 5.3.2.2 Chemotaktická signálna dráha u Escherichia coli Signálna dráha kontrolujúca chemotaxiu je medzi baktériami a dokonca archebaktériami vysoko konzervovaná. Napriek tomu bolo možné rozlíšiť niekoľko rozdielnych tried chemotaxických dráh na základe ich podrobného molekulárneho zloženia a evolučnej príbuznosti, z ktorých niektoré riadia aj iné správanie než bičíkový pohyb337. Na rozdiel od mnohých iných baktérií, genóm E. coli kóduje iba jeden systém pohybu a chemotaxie, ktorý navyše funguje s takmer minimálnym súborom chemotaktických proteínov. Takáto pomerná jednoduchosť určila E. coli za preferovaný model pre štúdium prenosu signálu pri bakteriálnej chemotaxii336. 212

Modul prenosu signálu dráhy chemotaxie patrí do väčšej rodiny dvojzložkových systémov, ktoré umožňujú snímanie prostredia u prokaryotoch a sú tiež prítomné u húb a rastlín338. Jedným z dôležitých rozdielov medzi kanonickými dvojzložkovými systémami a dráhami chemotaxie je to, že v prvom prípade sú senzorické, kinázové a fosfatázové aktivity typicky vykonávané jedným senzorickým kinázovým proteínom, zatiaľ čo pri chemotaxii tieto funkcie vykonávajú rôzne proteíny v rámci jedného stabilného komplexu337. Obr. 5.8 Signálna dráha chemotaxie pri Escherichia coli (Karmakar 2021; upravené)339. Periplazmatické snímacie domény Tsr a Tar priamo monitorujú koncentrácie chemoefektorov, ale Tap a Trg potrebujú väzbové proteíny obsadené ligandom. Plná šípka (od ligandu k chemoreceptoru) znázorňuje, že ligandy s malou molekulou sa môžu priamo viazať na receptory. Prerušovaná šípka (od ligandu k chemoreceptoru) ukazuje, že ligand sa najskôr viaže na väzbový proteín, ktorý sa potom viaže na receptor. CheA je histidínkináza, ktorá fosforyluje CheB a CheY. CheB je špecifická metylesteráza, ktorá demetyluje receptory chemotaxie, CheR je špecifická metyltransferáza, ktorá metyluje receptory, CheW je skeletový proteín, ktorý spája CheA s receptormi, CheY je kľúčový regulátor odozvy pri chemotaxii E. coli a CheZ je fosfatáza, ktorá zvyšuje spontánnu defosforyláciu CheY. Zložkami signálnej transdukčnej dráhy u E. coli (Obr. 5.8) sú transmembránové receptory resp. zoskupenia membránových chemotaktických proteínov akceptujúcich metyl (MCP), proteíny zapojené do signálnej transdukcie a adaptácie a prepínacie (switch) proteíny, ktoré určujú smer 213

bičíkovej rotácie. Switch proteíny, komplex troch proteínov – FliG, FliM a FliN – sú cieľom signálu z receptorov. Každý z týchto proteínov interaguje s ďalšími dvoma proteínmi a vytvára komplex, ktorý je spojený s MS prstencom bičíkového motora cez FliG, čím vytvára komplex prepínač-motor. Chemoreceptory sú transmembránové proteíny s N-koncovou periplazmatickou ligand viažucou doménou. Receptorové proteíny tvoria diméry, spojené do „coiled-coil“ štruktúry. Spojenie s cytoplazmatickou časťou receptora predstavuje transmembránová doména pozostavajúca z dvoch α-helixov340,341. Na transmembránovú doménu naväzuje HAMP doména. Štruktúrne konzervovaná doména HAMP spája transmembránové helixy s cytoplazmatickou signálnou doménou. Sprostredkováva prenos konformačnej zmeny (ktorá je spôsobená naviazaním ligandu na receptor) na zvyšok cytoplazmatickej časti receptoru. Jej narušenie vedie k strate signalizácie, a preto jej udržiavanie je rozhodujúce pri produkcii chimérických signálnych proteínov. Doména HAMP môže byť preto dôležitá pri regulácii „coiled-coil“ interakcií, ktoré sa zrejme podieľajú na šírení signálu342,343. C-terminálna cytoplazmatická doména obsahuje región pre metyláciu na postranných reťazcoch špecifických glutamátov a koncový región, ktorý asociuje s väzobným proteínom CheW. Zásadné pre funkciu receptora je jeho metylácia, ktorá ovplyvňuje stabilitu „coiled-coil“ štruktúry homodimérov receptorových proteínov344,345. V priemere majú chemotaktické baktérie okolo 14 chemoreceptorov346. Pozorovaný počet chemoreceptorov, ktoré jednotlivé baktérie vlastnia, sa však môže značne líšiť, od jedného až po 80 alebo aj viac347. E. coli má päť MCP alebo transmembránových chemoreceptorov. Každý z receptorových proteínov má molekulovú hmotnosť približne 60 kDa. Vysoko početné receptory, Tar a Tsr, sú zodpovedné za snímanie aspartátu a serínu. U E. coli je prítomných niekoľko tisíc molekúl receptorov Tar a Tsr. Menej početné receptory ako Tap (zodpovedné za snímanie dipeptidov), Trg (sníma glukózu, ribózu a galaktózu) a Aer (sníma dostupnosť kyslíka pomocou redoxného potenciálu) sú prítomné v rozsahu niekoľkých stoviek molekúl na bunku348,349. Špecifickosť chemotaktickej odpovede primárne závisí od ligandu, ktorý sa viaže na konkrétny chemoreceptor. Tieto ligandy sa môžu viazať buď priamo na ligand viažucu doménu receptora, alebo v komplexe s proteínmi viažucimi ligand322. Na základe toho sa rozlišujú dva druhy receptorov: receptory špecifické pre chemotaxiu a receptory s dvojitou funkciou zapojené do chemotaxie aj transportu ligandu. Receptory špecifické pre chemotaxiu (MCP), homodiméry, sú exprimované génmi aer, tap, tar, tsr a trg335. Sú usporiadané do veľkých klastrov umiestnených na póloch bunky350,351. V 214

klastroch sú chemoreceptory organizované do jednotiek tzv. „trimérov homodimérneho receptora“352. Alosterické interakcie v klastroch umožňujú zosilnenie signálu, čo baktériám umožňuje reagovať na veľmi malé zmeny koncentrácie chemoefektora353,354. MCP spolu navzájom úzko súvisia, pokiaľ ide o sekvenciu aminokyselín a štruktúru. Sú však odlišné vzhľadom na ich početnosť, sekvenciu ich periplazmatickej časti a prítomnosť väzbového miesta pre CheR v ich cytoplazmatickej časti (CheR je špecifická metyltransferáza, ktorá má úlohu pri adaptácii; väzbové miesto CheR je špecifický pentapeptid na karboxy (C)- konci MCP). Najrozšírenejšie MCP, Tsr a Tar, majú CheR väzbové miesto, a preto môže fungovať nezávisle od iných MCP. Ostatné MCP, ktoré nemajú toto väzbové miesto, závisia od prítomnosti Tsr a Tar, aby fungovali pri adaptácii. Preto, aby boli funkčné pri adaptácii, musia menej početné MCP interagovať s hlavnými MCP, čo môže byť jeden z dôvodov usporiadania receptorov v klastroch355. Receptor Aer sprostredkúva aerotaxiu. Má dva transmembránové helixy, ale chýba mu periplazmatická doména. Okrem toho nemá metylačné miesta na senzorickú adaptáciu356. Aer má N-koncovú PAS doménu, ktorá viaže FAD, a preto slúži ako senzor pre redoxný stav bunky. Zmeny stavu akceptora elektrónov sa prenášajú na kinázu CheA a menia jej aktivitu357,358. Receptory s dvojitou funkciou. Chemoatraktantové cukry sa neviažu priamo na MCP. Buď sa viažu na špecifický periplazmatický väzbový proteín, ktorý sa podieľa na chemotaxii a transporte cukru (napr. proteíny viažuce galaktózu, maltózu a ribózu), alebo sa viažu na špecifický enzým II (pre glukózu, manózu, manitol a iné) fosfoenolpyruvát-dependentného fosfotransferázového systému (PTS). Odpovede na oba typy sacharidových chemoatraktantov sú však sprostredkované MCP. Periplazmatické väzbové proteíny sa viažu na špecifický MCP (Tar alebo Trg), a tak vyvolávajú chemotaktický signál. V prípade PTS cukru, PTS enzým I moduluje kinázovú aktivitu komplexu MCP-CheW-CheA. Rovnako ako MCP, niektoré receptory s dvojitou funkciou (napr. periplazmatický proteín viažuci maltózu) sú zoskupené na póloch baktérií, pravdepodobne preto, aby sa umožnila priama interakcia s MCP320,359. Transdukcia chemického signálu z vonkajšieho prostredia začína na membráne receptorovými proteínmi MCP. Transmembránové receptory chemotaxie integrujú a zosilňujú signály prijaté väzbou ligandu na periplazmatickú doménu. Potom sa chemický signál sieťou cytoplazmatických proteínov prenáša do bičíkového motora, aby sa dosiahol chemotaktický pohyb. E. coli má šesť cytoplazmatických proteínov, menovite CheA, CheB, CheR, CheW, CheY a CheZ, ktoré sú kódované jedným operónom349. Proteín CheA má päť domén: P1 je histidínfosfotransferázová (Hpt)1 doména, ktorá obsahuje konzervovaný fosforylovateľný histidínový zvyšok360; P2 viaže regulátory odozvy a hoci to nie 215

je nevyhnutné pre fosfotransfer z domény P1 do regulátorov odozvy, urýchľuje tento proces361; P3 je dimerizačná doména; P4 je kinázová doména, ktorá viaže ATP a fosforyluje P1 doménu; je charakterizovaná konzervovanými sekvenčnými boxmi N, G1, F a G2; a P5 je regulačná doména, ktorá interaguje s CheW a chemoreceptormi362. Signalizácia je iniciovaná rozpoznaním signálov (chemoefektorov) na chemoreceptoroch, ktoré tvoria ternárny senzorický komplex so senzorovou histidínkinázou CheA a proteínom CheW. CheW reguluje aktivitu kinázy CheA. Spája receptor s kinázou CheA a sprostredkúva jej aktiváciu ako odpoveď na väzbu ligandu na receptor. Väzba signálu na chemoreceptor vytvára molekulárny stimul, ktorý moduluje autofosforyláciu CheA. CheA je schopná autofosforylácie. K fosforylácii využíva fosfát z ATP. Autofosforylačné miesto na CheA je His48. Fosforylovaná CheA prenáša fosfátovú skupinu na proteín regulátora odozvy, CheY alebo CheB349,363,364. Proteín CheY môže byť v dvoch hlavných stavoch: fosforylovaný a nefosforylovaný. Fosforylované miesto je Asp57. Pozitívna stimulácia (väzba chemoatraktantu na receptor) posúva receptor do formy, ktorá spolu s CheW inhibuje autofosforyláciu CheA, čo spôsobí defosforyláciu CheY‐P. Fosforylovaný CheY (CheY-P) sa defosforyluje spontánne alebo za určitých podmienok sa špecifická fosfatáza CheZ môže podieľať na znižovaní hladiny CheY-P. Keď je CheY nefosforylovaný, viaže sa na histidínkinázu CheA, ktorá sa viaže na MCP receptor prostredníctvom proteínu CheW. CheY je v tomto prípade súčasťou kvartérneho signálneho komplexu – receptor: CheW:CheA:CheY. Pravdepodobnosť rotácie v smere hodinových ručičiek klesá. Výsledkom tejto situácie je zníženie frekvencie pádov a bunke sa umožní hladký chod/beh v priaznivom prostredí320. Negatívny stimul (zníženie väzby atraktantu na receptor resp. väzba repelentu na receptor) posúva receptor do aktívnej formy, o ktorej sa predpokladá, že spolu s CheW stimuluje autofosforyláciu CheA. Keď CheA autofosforyluje, okamžite fosforyluje CheY. CheY môže byť tiež fosforylovaný malými fosfodonormi, ktoré sa nachádzajú v bunke (napr. acetylfosfát), ale ich príspevok je v porovnaní s CheA zanedbateľný. Fosforylovaný CheY-P disociuje z kvartérneho komplexu receptor: CheW:CheA:CheY. CheY-P má relatívne vysokú afinitu k prepínaciemu proteínu FliM a k fosfatáze CheZ. Väzba na prepínač vedie k zvýšenej pravdepodobnosti otáčania v smere hodinových ručičiek, a preto bunka často padá. Väzba na CheZ následne vedie k oligomerizácii CheZ a oneskorenej aktivácii jeho fosfatázovej aktivity. V dôsledku toho je CheY-P defosforylovaný s oneskorením a signál v smere hodinových ručičiek je ukončený. Toto ukončenie sa môže vyžadovať, aby sa predišlo zdĺhavým pádom 216

(krátky pád stačí na preorientovanie), aby sa predišlo trvalému otáčaniu v smere hodinových ručičiek (pretrvávajúce otáčanie v smere hodinových ručičiek vedie k vytvoreniu zväzku pravotočivých bičíkov, čo vedie k behu) alebo pre adaptáciu365. Vo všeobecnosti, keď je bunka vystavená množstvu chemotaktických stimulov, zdá sa, že existuje len jeden typ odozvy, čo znamená, že rôzne vstupy sú integrované. To platí aj pre prípady, v ktorých sú baktérie vystavené pôsobeniu chemoatraktantu a chemorepelentu súčasne. Keď sa však odozva analyzuje rýchlou kinetikou, odozva na chemorepelent predchádza odozvu na chemoatraktant. Baktérie dokážu vnímať podnety v širokom rozsahu koncentrácií a napriek tomu to robia s veľmi vysokou citlivosťou. Dôvodom je vysoké zosilnenie chemotaktického signálu. Existujú najmenej dva kroky amplifikácie, jeden v klastri receptorov a druhý v rámci prepínača366. Chemotaktický pohyb baktérií má značné genetické a energetické nároky. V súlade s ním musia byť udržiavané a exprimované gény pre chemoreceptor, súvisiace signálne gény a bičíkový motor. Tieto gény často predstavujú významné percento genómu. Napríklad, aj keď Borrelia burgdorferi má iba šesť chemoreceptorov, odhaduje sa, že gény umožňujúce chemotaktický pohyb predstavujú 5 % – 6 % jej genómu214. Okrem toho je chemotaxia vysoko energeticky nákladná, pretože funkcia CheA, bičíkového exportného aparátu a bičíkového motora sú poháňané hydrolýzou ATP a/alebo protónovou hybnou silou367,368. Názor, že chemotaxia je nákladný proces, podporujú aj experimentálne údaje. Napríklad kmeň Pseudomonas putida, z ktorého boli odstránené gény na zostavenie a export bičíka, vykazoval dôležité fyziologické profity, ako je rýchla adaptácia na glykolytické a glukoneogénne zdroje uhlíka, zvýšený energetický náboj a zlepšená tolerancia voči oxidačnému stresu369. Preto vzhľadom na to nie je prekvapujúce, že iba niektoré baktérie sú chemotaktické. V skutočnosti analýza 450 prokaryotických genómov ukázala, že iba 54 % z nich má chemosenzorické signálne gény370. 5.3.2.3 Adaptačný proces Adaptácia je dôležitou podmienkou pre fungovanie chemotaxie. Je to proces zotavovania sa zo stimulovaného správania, keď je stimul stále prítomný. V prípade bakteriálnej chemotaxie adaptácia umožňuje baktériám reagovať na nové stimuly v prítomnosti konštantných hladín chemoatraktantov a/alebo chemorepelentov. Funguje ako primitívna pamäť, ktorá umožňuje baktériám porovnávať súčasné a predchádzajúce podmienky371. Adaptácia závisí od stupňa reverzibilnej metylácie špecifických, konzervovaných glutamátových zvyškov v cytoplazmatickej signálnej doméne MCP. Metylácia je regulovaná 217

dvoma proteínmi – metyltransferázou CheR a metylesterázou CheB. CheR odoberá metylové skupiny z cytoplazmatického rezervoáru S-adenozylmetionínu a odovzdáva ich na postranné reťazce špecifických glutamátov na receptore. CheB odštepuje metylové skupiny z postranných reťazcov glutamátov MCP vytvorených CheR370. Cytoplazmatická doména každého MCP obsahuje 4 – 6 metylovateľných glutamátových zvyškov (metylačných miest). U E. coli receptory Tsr a Trg majú každý päť metylačných miest a Tar receptor má štyri metylačné miesta, z ktorých dve sú exprimované ako glutamíny pre všetky tri receptory. Glutamíny napodobňujú metylované glutamáty a pravdepodobne zabezpečujú, že nanovo translatované MCP sú vložené do membrány v neutrálnom signalizačnom stave. CheB je v skutočnosti enzým s dvojitou funkciou, pretože dokáže deamidovať aj demetylovať MCP. Deamidácia glutamínových zvyškov na glutamáty znamená, že všetky tieto zvyšky sa stávajú potenciálnymi cieľmi pre metyláciu pomocou CheR, a teda pre adaptáciu349,372. Keďže minoritné receptory Trg a Tap nemajú C-terminálny pentapeptid NWETF, ktorý spája CheR a CheB s chemoreceptormi, sú závislé od hlavných receptorov Tar a Tsr, ktoré im poskytujú pomoc pri adaptácii v rámci klastrov chemoreceptorov373,374. Pripevnenie k C- terminálnej pentapeptidovej sekvencii jedného hlavného chemoreceptora a flexibilita susediacej oblasti umožňuje adaptačným enzýmom preskakovať medzi metylačnými miestami rôznych dimérov chemoreceptorov a modifikovať ich374. Jedna molekula buď CheR alebo CheB, ktorá je pripevnená k pentapeptidu hlavného receptora, môže katalyzovať metyltransfer alebo metylesterifikáciu na adaptačných doménach niekoľkých susedných chemoreceptorov vrátane hlavných aj minoritných receptorových dimérov375. To naznačuje, že rôzne receptory musia byť dostatočne blízko, aby mohli interagovať in vivo. Táto adaptačná pomoc je dôsledná vzhľadom na pomer diméru chemoreceptora k enzýmu, ktorý bol stanovený ako jedna molekula CheR na každých 60 dimérov chemoreceptora a jedna molekula CheB na každých 40 dimérov chemoreceptora375. Aspartátový chemoreceptor Tar je stabilne metylovaný CheR a CheB rovnakými rýchlosťami, dokonca aj v prostredí bez gradientov atraktantov alebo repelentov. To spôsobuje stabilnú ustálenú hladinu metylácie376. Metyltransferáza CheR pozostáva z N-terminálnej helikálnej regulačnej domény a C- terminálnej α/β katalytickej domény, ktorá je zodpovedná za metyláciu chemoreceptora. CheR má vyššiu afinitu k neaktívnym chemoreceptorom ako k aktívnym. Je pripevnený k C- terminálnemu pentapeptidu NWETF hlavných chemoreceptorov tak, že je zarovnaný s 218

antiparalelným β-listom, ktorý je vložený do katalytickej domény. Táto doména prispieva hlavne k väzbe metylového donora S-adenozylmetionínu377,378. Metylesteráza CheB je alternatívny regulátor odozvy kinázy CheA, ktorý pozostáva z dvoch domén spojených sekvenciou spojky (linkera). N-terminálna helikálna regulačná doména môže byť fosforylovaná a tým odhaľuje C-terminálnu α/β katalytickú doménu a zvyšuje jej aktivitu asi 100-násobne. Miesto väzby CheB k hlavným chemoreceptorom, C-terminálny pentapeptid NWETF, sa nachádza v sekvencii siahajúcej od C-terminálnej regulačnej domény po linker. Okrem toho regulačná oblasť CheB a linker sa kvôli prenosu fosfátov viažu na P2 fragment kinázy CheA. CheB sa teda lokalizuje do chemoreceptorových klastrov dvoma rôznymi interakčnými mechanizmami, na jednej strane pripevnením k pentapeptidu hlavných chemoreceptorov a na druhej strane väzbou na CheA pre účely výmeny fosfátov. Hoci štruktúry CheR a CheB vykazujú podobnosti, ich väzbové vlastnosti k NWETF sú odlišné379,380. V podmienkach ustáleného stavu sú metylácia a demetylácia vyvážené. Väzba atraktantu na väzbové miesto ligandu na rozhraní diméru chemoreceptora vedie k inaktivácii chemoreceptorov. Dochádza k výraznému zníženiu autofosforylačnej aktivity na receptor naviazanej kinázy CheA spolu so zníženou mierou fosforylácie regulátora odozvy CheY. Menej CheY-P sa viaže na bičíkový motorový spínač, a preto je rotácia bičíka orientovaná proti smeru hodinových ručičiek, čo zodpovedá dlhšiemu priamemu behu bakteriálnej bunky381. Predpokladá sa, že molekulárnym mechanizmom je piestovitý pohyb transmembránovej špirály smerom k cytoplazme a pravouhlý pobyb k membráne341,382. Doposiaľ nie je známe, ako by táto zmena v konformácii mohla narušiť prenos signálu z chemoreceptora na kinázu CheA. Tento proces prebieha veľmi rýchlo. Súčasne sa iniciuje adaptácia prostredníctvom metylácie sprostredkovanej CheR a CheB a vracia náhle inaktivované chemoreceptory pomaly späť do ich aktívneho stavu. Tento efekt prebieha s nižšou rýchlosťou. Dlho sa predpokladalo, že metylácia chemoreceptorov sa zvyšuje po väzbe ligandu, pretože fosforylácia CheB dramaticky klesá v dôsledku zníženého fosfotransferu z CheA. Nefosforylovaný CheB má výrazne nižšiu aktivitu. V takom prípade by sa metylácia zvýšila, pretože CheR stále metyluje špecifické miesta, ktoré potom už nie sú účinne demetylované. Štúdie s mutantom CheB, ktorý sa nedá fosforylovať, však ukázali, že adaptácia môže prebiehať stále. Neskôr sa zistilo, že afinita CheR a CheB k chemoreceptorom závisí od aktivity chemoreceptorov. CheR prednostne rozpoznáva neaktívny stav receptorov a zvyšuje aktivitu receptora prostredníctvom metylácie, zatiaľ čo CheB prednostne demetyluje aktívne receptory a tým znižuje ich aktivitu. Fosforylácia CheB zosilňuje demetylačnú aktivitu, ale nie je potrebná na jej spustenie. Metyltransferáza CheR, ktorá katalyzuje túto modifikáciu, má zvýšenú afinitu k neaktívnym chemoreceptorom, afinita 219

metylesterázy CheB je najvyššia voči aktívnym chemoreceptorom. Metylácia teda stúpa a demetylácia klesá, keď sú atraktanty nanovo naviazané v porovnaní s podmienkami v rovnovážnom stave383-385. Vysoká metylácia chemoreceptora vedie ku konformačnej zmene, ktorá je v protiklade k zmene vyvolanej väzbou ligandu a spôsobí opätovnú aktiváciu receptora. V priemere sú v tomto stave obsadené dve metylačné miesta386. Bolo zistené, že k reaktivácii chemoreceptora metyláciou dochádza prostredníctvom neutralizácie štyroch negatívne nabitých glutamátových zvyškov na neutrálne metylglutamáty, čo vyvoláva konformačnú zmenu receptora387. Aktivita chemoreceptorov sa teda môže opäť obnoviť, hoci atraktant je stále prítomný. Pri stabilných koncentráciách atraktantov môžu bunky hľadať oblasti s ešte väčším množstvom živín. Keďže adaptácia je pomalý proces, jej výsledok možno vidieť len s oneskorením v porovnaní s inaktiváciou chemoreceptorov po naviazaní atraktantu na chemoreceptory. Keď sa odstráni atraktant, chemoreceptory sa okamžite hyperaktivujú v dôsledku kombinácie dvoch efektov: metyláciou a odstránením atraktantu z ligand väzbových miest receptorov. Po tomto „prekročení“ aktivity, CheB demetyluje vysokou rýchlosťou aktívny receptor, preto celková úroveň metylácie klesá, až kým sa opäť neobnovia rovnovážne podmienky. 5.3.2.4 Rozdiely v dráhach prenosu signálu u iných bakteriálnych druhov Chemosenzorická dráha E. coli tvorí základ chápania bakteriálnej chemotaxie. Avšak ukazuje sa, že chemotaxia u iných baktérií, hoci je založená na podobných princípoch, môže byť oveľa zložitejšia. Mnohé druhy baktérií majú oveľa viac chemoreceptorov ako E. coli. Niektorým z týchto receptorov chýbajú transmembránové domény a zistilo sa, že sú cytoplazmatické. Iné druhy majú tiež ďalšie chemotaktické proteíny. Hoci existujú údaje o širokom spektre bakteriálnych druhov, pre ilustráciu niektorých aspektov tejto diverzity sa zmienime o dvoch najviac preštudovaných druhoch: B. subtilis, pretože má jednu chemosenzorickú dráhu, ktorá obsahuje väčší počet rôznych typov chemosenzorických proteínov a Rhodobacter sphaeroides, pretože má niekoľko chemosenzorických dráh. Chemotaxia u Bacillus subtilis U B. subtilis zastáva chemotaxia dôležitejšiu funkciu hlavne z hľadiska ochrany bunky, čo odráža funkciu lipopolysacharidu a vonkajšej membrány Gram-negatívnych baktérií ako účinnej bariéry proti vonkajším toxínom. B. subtilis zjavne aj kvôli absencii tejto účinnej obrany je nútený sa viac spoliehať na schopnosť zaznamenať toxín v prostredí a dostať sa z miesta jeho 220

pôsobenia. Často má táto stratégia aj preventívnu funkciu a B. subtilis reaguje negatívnou chemotaxiou aj na zdanlivo neškodné látky. V porovnaní s E. coli a všeobecne Gram- negatívnymi druhmi je chemotaktická kaskáda B. subtilis pomerne zložitejšia a evolučne pôvodnejšia svojou podobou k chemotaxii Archaea388. Chemoreceptory sú väčšie ako chemoreceptory u E. coli a majú komplexnejšiu cytoplazmatickú α-helikálnu štruktúru, podobne ako u Archaea. Fosforylačné reakcie sú obrátené v porovnaní s reakciami u E. coli. Väzba atraktantu na receptor zvyšuje aktivitu CheA, a teda dochádza k zvýšeniu koncentrácie CheY-P (fosforylovaná forma) – proteínu interagujúceho s prepínacími proteínmi smeru rotácie bičíkového motora. CheY-P je u B. subtilis signál pre pohyb vpred, ako odpoveď na prítomnosť chemického stimulu, na rozdiel od E. coli. Na aktiváciu CheA sú potrebné dva proteíny CheW a CheV na rozdiel od E. coli, kde stačí iba CheW389. Taktiež proteíny sprostredkujúce adaptáciu chemotaktickej kaskády na koncentráciu stimulujúcich látok sú u B. subtilis pomerne komplikovanejšie vzhľadom na E. coli, ktorá používa iba mechanizmus metylácie a demetylácie receptora. U B. subtilis sa na adaptácii podieľajú tri mechanizmy390. Jedným z nich je špecifická metylácia receptora (na rozdiel od E. coli je známy iba mechanizmus adaptácie závislý od metylácie receptora). Metylácia jeho receptorov je vysoko špecifická a na postranných reťazcoch jednotlivých glutamátov má rozdielny efekt na aktivitu CheA kinázy. Glutamát na pozícii 371 receptora McpB (receptor asparagínu, ale aj ďalších aminokyselín ako napríklad histidínu, aspartátu a glutamínu) je demetylovaný po pridaní atraktantu a v pozícii 637 pri odobratí atraktantu, glutamát na pozícii 630 je demetylovaný v oboch prípadoch. Výsledkom demetylácie je vznik metanolu. Metylácia funguje ako adaptácia na úroveň koncentrácie vonkajšieho stimulu a bráni nasýteniu receptora. U B. subtilis je receptor rýchlo demetylovaný ako odpoveď na pridanie atraktantu, a pomaly remetylovaný, pokiaľ zostáva atraktant prítomný. Rovnaký proces prebieha, keď je atraktant odobraný391-393. Ďalším mechanizmom je CheC-CheD-CheY-P systém. CheD a CheC sú proteíny špecifické pre chemotaktickú signálnu kaskádu B. subtilis a u E. coli sa nevyskytujú. Predstavujú ďalší mechanizmus adaptácie citlivosti MCP receptorov, ktorý ale nie je úplne objasnený. CheD funguje ako receptorová deamináza, konvertuje glutamíny na glutamáty, zastáva teda funkciu, ktorú u E. coli plní metylesteráza CheB. CheC má okrem fosfatázovej aktivity aj schopnosť viazať CheY-P a CheD. Mutačné analýzy naznačujú, že práve interakcia CheC-CheD je pre mechanizmus adaptácie zásadná, nie fosfatázová aktivita CheC. Afinita CheC k CheD je zvýšená prítomnosťou CheY-P. Väzba CheC-CheD zvyšuje fosfatázovú aktivitu CheC. Na základe týchto údajov sa predpokladá model spätnoväzbovej regulácie zahŕňajúci CheY-P. Pred 221

pôsobením atraktantu je časť CheD naviazaná na receptor. Pridanie atraktantu spôsobí aktiváciu CheA, čo vedie k zvýšeniu koncentrácie CheY-P. Dochádza k interakcii CheY-P s CheC a tento komplex pravdepodobne vyväzuje CheD z väzby na receptor, a tým znižuje aktivitu CheA. Odobratie atraktantu či pridanie repelentu naopak vedie k zníženiu aktivity CheA, a tým k poklesu koncentrácie CheY-P. Úbytok CheY-P vedie k rozpadu komplexov s CheC-CheD- CheY-P, čím vzrastie množstvo voľného CheD, ktorý môže viazať receptor a reaktivovať ho. Iný model predpokladá, že aktivácia receptora spôsobuje disociáciu CheD z väzby k receptoru. Voľný CheD potom interakciou s CheC zvyšuje jeho fosfatázovú aktivitu a tým reguluje množstvo CheY-P189,394. Tretí mechanizmus využíva fosforyláciu proteínu CheV spájajúceho receptor s kinázou CheA. C-koncová regulačná doména CheV u B. subtilis obsahuje vysoko konzervované aspartáty, ktorých postranné reťazce sú fosforylované kinázou CheA. Funkčne je CheV redundantný k CheW v tom zmysle, že jednotliví nuloví mutanti sú naďalej schopní adaptácie aj vnímania gradientu, ale horšie ako divoký typ. Aktivovaná kináza CheA fosforyluje CheV, čo vedie k spätnoväzbovej inhibícii kinázovej aktivity CheA. CheV-P pravdepodobne ruší väzbu medzi ligand viažucim receptorom a CheA395. Chemotaxia u Rhodobacter sphaeroides R. sphaeroides má tri operóny (cheOp1, cheOp2, cheOp3), ktoré kódujú kompletné chemosenzorické dráhy. Dva z nich (cheOp2 a cheOp3) sú esenciálne pre chemotaxiu pri laboratórnych podmienkach396. Pri proteínoch kódovaných operónom cheOp1 nebola zistená ich úloha pri chemotaxii397. Hlavný rozdiel medzi R. sphaeroides a baktériami s jednoduchšími cestami chemotaxie je v tom, že okrem klastrov transmembránových chemoreceptorov (MCP), umiestnených na póloch bunky398, má R. sphaeroides aj cytoplazmatické klastre chemotaktických proteínov (transducer-like proteíny – Tlps) lokalizované v cytoplazme399,400. Chemotaxia u R. sphaeroides vyžaduje oba typy klastrov; ani jeden z nich nie je schopný podporovať chemotaxiu samostatne396,401. R. sphaeroides má deväť MCP a štyri Tlps402. Kľúčovou črtou cytoplazmatického klastra je, že jeho chemoreceptorom chýbajú transmembránové oblasti a sú rozpustné – na rozdiel od polárnych klastrov – čo im umožňuje snímať skôr cytoplazmatickú ako periplazmatickú koncentráciu ligandov. Identita ligandov snímaných cytoplazmatickými chemoreceptormi nie je známa. Avšak chemotaxia voči mnohým atraktantom (napríklad alanín, amoniak, glutamát a cukry) vyžaduje ich transport a metabolizmus403,404, čo naznačuje, že snímané ligandy by mohli zahŕňať bežné metabolity odvodené od týchto chemoefektorov363. To znamená, že R. sphaeroides môže reagovať 222

chemotakticky na zmeny v koncentrácii vnútrobunkových zlúčenín, ktoré môžu odrážať všeobecný metabolický stav bunky, ako aj na zlúčeniny z prostredia. R. sphaeroides vlastní dva bičíky Fla1 a Fla2. Bičíky sú kontrolované rôznymi proteínmi chemotaxie; rotačné správanie bičíka Fla1 je riadené spoločne produktmi cheOp2 a cheOp3, zatiaľ čo rotácia bičíka Fla2 je riadená produktmi cheOp1405. U R. sphaeroides boli popísané štyri proteíny CheA (z ktorých tri sú nevyhnutné pre chemotaxiu) dva CheB, tri CheR, štyri CheW, jeden CheD a šesť CheY. Zo šiestich CheY proteínov iba CheY3, CheY4 a CheY6 sú zapojené do chemotaxie, pričom CheY6 je esenciálny pre chemotaxiu. Medzi CheY3 a CheY4 je redundancia – na chemotaxiu je potrebný iba jeden z nich406. R. sphaeroides nemá fosfatázu CheZ, ale proteín CheY3 preberá jej úlohu. Okrem toho túto funkciu môže zastávať aj jeden z proteínov CheA. Zatiaľ nie je lokalizácia CheY proteínov u R. sphaeroides známa. Rovnako ako v prípade CheB, CheY môžu byť rozptýlené v cytoplazme a schopné signalizovať z niektorého zo senzorických klastrov. Alternatívne, môžu prenášať signál z jedného klastra do druhého predtým, ako finálny CheY interaguje s motorom, čím sa zabezpečí vyvážená odozva407. U R. sphaeroides je výsledok interakcie CheY-P s prepínačom odlišný v porovnaní s E. coli. Interakcia CheY-P s bičíkovým motorom spomaľuje alebo dokonca zastavuje jeho rotáciu namiesto zmeny jeho smeru (bičíky sú jednosmerné). V neprítomnosti proteínov chemotaxie sa bičíkový motor kontinuálne otáča408. CheY6-P je schopný sám zastaviť bičíkový motor, ale bez CheY3 alebo CheY4 nie je schopný podporiť chemotaxiu. Všetky tri z týchto CheY homológov môžu viazať FliM komponent Fla1bičíkového motora in vitro, ale efekt väzby CheY3-P a CheY4-P na rotáciu bičíkov nie je známy406,409. Proteíny CheA2, CheW2, CheW3, CheR2 sú kódované operónom cheOp2 a sú súčasťou klastrov nachádzajúcich sa na póloch bunky. Tieto klastre snímajú periplazmatickú koncentráciu chemoefektorov a riadia rýchlosť, ktorou kináza CheA2 autofosforyluje. CheA2- P je schopná fosforylovať všetky regulátory chemotaktickej odozvy R. sphaeroides396,410,411. Proteíny CheA3, CheA4, CheW4, CheR3, kódované operónom cheOp3, sú súčasťou klastrov nachádzajúcich sa v cytoplazme. Cytoplazmatický klaster, o ktorom sa predpokladá, že sníma metabolický stav bunky, riadi aktivitu dvoch homológov CheA – CheA3 a CheA4. Obidvom chýbajú niektoré z domén nachádzajúcich sa v klasických CheA. CheA3 obsahuje iba fosforylovateľnú P1 (Hpt) doménu a regulačnú P5 doménu. Neprítomnosť katalytického jadra histidínkinázy (domény P3 a P4) v CheA3 naznačuje, že nemá žiadnu histidínkinázovú aktivitu. CheA4 postráda doménu P1 (Hpt), ale zachováva si domény P3 (dimerizačná), P4 (kinázová) a P5 (regulačná). Obe nemajú CheY/CheB-väzbovú P2 doménu. Na rozdiel od CheA2-P, ktorá 223

môže fosforylovať všetkých osem regulátorov chemotaktickej odozvy, CheA3-P a CheA4-P fosforyluje CheY6 a CheB2, ktoré sú kódované rovnakým operónom, ako aj CheY1 z cheOp1. Okrem svojej schopnosti pôsobiť ako fosfodonor, CheA3 vykazuje špecifickú fosfatázovú aktivitu voči CheY6-P. CheA4 môže fosforylovať P1 doménu CheA3401,412. Hoci CheA2 môže prenášať fosfátovú skupinu do všetkých regulátorov chemotaktickej odozvy v in vitro podmienkach, nekompenzuje delécie CheA3 / CheA4 v in vivo podmienkach. Môže to byť spôsobené tým, že proteíny, ktoré sú kódované jednou chemosenzorickou dráhou (CheW2, CheW3, CheA2 a CheR2), sú lokalizované s MCP na póloch buniek, zatiaľ čo proteíny, ktoré sú kódované druhým operónom (CheW4, CheA3, CheA4 a CheR3), sú lokalizované s cytoplazmatickými receptormi v cytoplazme. Existencia dvoch odlišných signálnych dráh chemotaxie umožňuje R. sphaeroides zabrániť nežiaducej vzájomnej komunikácii medzi úzko súvisiacimi proteínmi v in vivo podmienkach. Na rozdiel od E. coli, homológ CheR u R. sphaeroides sa spája s každým signalizačným klastrom, zatiaľ čo homológy CheB sú v cytoplazme prevažne voľné a nesúvisia ani s polárnymi, ani s cytoplazmatickými klastrami. To by naznačovalo, že CheB interagujú len slabo s inými proteínmi chemotaxie a že môžu byť schopné riadiť adaptáciu v oboch klastroch396,402. 5.3.3 Úloha pohybu a chemotaxie v kolektívnom správaní baktérií 5.3.3.1 Expanzia populácie podmienená pohybom Kolonizácia porézneho rastového média z jedného miesta očkovania predstavuje najjednoduchší príklad chemotaktického správania na úrovni bakteriálnej populácie. Takáto expanzia bakteriálnej populácie závislá od pohybu sa typicky experimentálne študuje pomocou testu na mäkkom agare, kde baktérie rastú a množia sa z inokula umiestneného v centre nízkopercentného agarového gélu obohateného živinami. Konzistencia agaru je dostatočne voľná na to, aby bunky mohli plávať a pohybovať sa v gradientoch, takže množenie kolónií je výsledkom kombinácie rastu, pohybu a chemotaxie. Na rozdiel od tekutých médií, plávajúce bunky uviaznu v agarovej sieťke, z ktorej môžu uniknúť iba otáčaním (tumble). Hoci chemotaxia nie je striktne potrebná na šírenie v mäkkom agare, môže výrazne urýchliť rýchlosť expanzie bakteriálnych kolónií. Spotrebou živín a iných chemikálií vo vnútri kolónie vytvárajú metabolicky aktívne baktérie v médiu gradienty, ktoré môžu následne použiť na migráciu smerom von ako rozširujúce sa chemotaktické kruhy konštantnej vysokej hustoty413. Toto správanie môže byť matematicky zachytené klasickým Keller-Segelovým modelom 224

chemotaxie a jeho početnými variantmi414,415. Podobné správanie bolo pozorované aj v tekutých médiách, napríklad v sklenených kapilárach, kde populačná odpoveď na samostatne vytvorený gradient má formu putujúcich chemotaktických pásov416. Aj keď je nepravdepodobné, že by sa takéto putujúce pásy vytvorené bakteriálnou monokultúrou v prírode bežne vyskytovali, napriek tomu by mohli byť relevantné pre šírenie populácie v prirodzenom pórovitom prostredí. Okrem toho sa tieto analýzy použili ako všeobecný model na skúmanie vzájomného pôsobenia medzi rastom a riadeným pohybom v kolektívnej expanzii populácie. V tomto modeli môžu chemoatraktanty slúžiť ako aróme podobné podnety, ktoré umožňujú populácii migrovať von ešte pred vyčerpaním živín, aj keď tieto atraktanty tvoria len malú časť živín dostupných v médiu417. Kolektívne sa šíriace bakteriálne populácie sú schopné kolonizovať labyrintu podobné alebo dokonca fraktálne štruktúry, ktoré napodobňujú prostredie s komplexnou geometriou ako je napr. pôda alebo pľúca418. Skúmal sa aj význam heterogenity v jednotlivých chemotaktických odpovediach v rámci šíriacich sa populácií. Ukázalo sa, že zjavný konflikt medzi medzibunkovou variabilitou a koherentným pohybom ako skupinou populácie možno vyriešiť stratifikáciou jednotlivcov v samovytvorenom chemickom gradiente podľa ich individuálnych charakteristík419. Pohyblivosť a chemotaxia v poréznom médiu zohrávajú dôležitú úlohu, keď niekoľko populácií súťaží o rovnaký biotop. Kompromis medzi rastom a rýchlosťou expanzie môže v tomto prípade viesť k fenotypovej segregácii, kde rýchlo plávajúce, ale pomaly rastúce bunky obsadzujú vonkajšie okraje, zatiaľ čo rýchlo rastúce, ale pomaly plávajúce bunky sa držia v strede a hrozí im, že budú vystavené riziku globálnej konkurencie na celej platni420. V pôvodne klonovej populácii existuje selekcia mutácií, ktoré uprednostňujú rýchlosť plávania na úkor rastu na vonkajšom okraji rozširujúcej sa kolónie, zatiaľ čo mutácie uprednostňujúce rast pred rýchlosťou sa selektujú blízko stredu kolónie421. Pozorované kompromisy medzi rastom a pohyblivosťou teda pravdepodobne hrajú dôležitú úlohu pri tvorbe a vývoji bakteriálnych ník v štruktúrovaných prostrediach. Časopriestorové štruktúrovanie multidruhových bakteriálnych kolónií môže byť ďalej výrazne ovplyvnené buď antagonistickými alebo kooperatívnymi regulačnými interakciami medzi bakteriálnymi druhmi422. 5.3.3.2 Autoagregácia chemotaktických baktérií Okrem týchto dynamických pohyblivých pásov, ktoré sa spoliehajú na tvorbu a formovanie gradientu živín šíriacou sa bakteriálnou populáciou, sa môžu chemotaktické pásy tvoriť aj prostredníctvom niekoľkých ďalších mechanizmov. Na úrovniach jednotlivých baktérií možno 225

pozorovať akumuláciu smerom k špecifickému miestu, keď bunky reagujú na odlišné gradienty chemikálií, ako aj v reakcii na kyslík423, pH 424 alebo teplotu425, pri ktorých sa chemotaktická odpoveď mení z repelentu na atraktant v závislosti od úrovne stimulácie. Pri tomto scenári dve protichodné chemotaktické „sily“ poháňajú baktérie, aby sa hromadili v intermediálnej oblasti, kde je čistá chemotaktická rýchlosť nulová426. Predpokladá sa, že obojsmerné snímanie mnohých fyzikálnych a chemických stimulov (napr. pH alebo teploty) chemotaktickými baktériami vo všeobecnosti zohráva dôležitú úlohu pri vyhľadávaní fyziologicky optimálnych ník v chemicky zložitých prostrediach. Tvorba zložitejších modelov, ktoré sa môžu vyskytnúť aj v pôvodne uniformných prostrediach, sa zvyčajne spolieha na taktické odpovede vyvolané chemickými interakciami medzi baktériami, hoci k tomu môžu prispieť aj iné mechanizmy, ako napríklad regulácia rýchlosti plávania422. Okrem generovania a snímania gradientov chemikálií, baktérie uvoľňujú chemikálie, ktoré vyvolávajú chemotaktické reakcie u ich rovesníkov, čo môže viesť k chemotaktickej sebapríťažlivosti a generovať agregačné procesy. Napríklad E. coli tvorí na mäkkých agarových platniach pravidelné mriežky milimetrových škvŕn s vysokou hustotou, čo by sa dalo vysvetliť chemotaktickou odpoveďou na vlastný gradient aspartátu427. Chemotaxia na atraktanty vlastnej produkcie môže ďalej viesť k hromadeniu baktérií v malých submilimetrových dutinách v mikrofluidných zariadeniach428. Hoci vo vyššie uvedených príkladoch tvorba klastrov nevyžaduje žiadne fyzické interakcie medzi baktériami, vlastná príťažlivosť môže tiež zvýšiť bakteriálnu agregáciu, ktorá je sprostredkovaná rôznymi povrchovými adhezínmi429. Chemotaktická odpoveď na quorum- sensing molekulu autoinduktor 2 (AI-2), vylučovanú bunkovými agregátmi, môže skutočne do značnej miery zvýšiť autoagregáciu u E. coli, sprostredkovanú buď adhezínovým antigénom 43 alebo curli vláknami430. AI-2 je medzidruhový komunikačný signál produkovaný širokou škálou baktérií. Chemoatrakcia k AI-2 môže mať potenciálnu úlohu aj pri vytváraní medzidruhových interakcií v rámci komplexných mikrobiálnych spoločenstiev, a môže sprostredkovať spoločnú agregáciu rôznych druhov pričom sa neobmedzuje len na baktérie produkujúce AI-2431. Okrem AI-2 môžu aj iné signály quorum-sensing sprostredkovať reakcie bakteriálnej samopríťažlivosti, napríklad signál S u Vibrio parahaemolyticus432. Chemotaxia môže tiež sprostredkovať sebaodpudzovanie. Napríklad chemotaxická dráha Azospirillum brasilense má negatívny vplyv na zhlukovanie buniek433. Komplexná chemotaktická odozva E. coli na produkovaný indol môže slúžiť obom funkciám, sprostredkovať sebaodpudzovanie pri nízkych hladinách vylučovaného indolu, ale viesť k sebapríťažlivosti, keď sú hladiny vysoké434. Vzhľadom na veľkú rozmanitosť autoinduktorových signálov, produkovaných baktériami, je 226

pravdepodobné, že všetky tieto rôzne scenáre vnútrodruhovej a medzidruhovej príťažlivosti a odpudzovania možno nájsť v prirodzených mikrobiálnych spoločenstvách, kde by mohli vytvárať komplex kolektívneho správania435. 5.3.3.3 Fyzikálne interakcie medzi pohyblivými bunkami Okrem chemických a adhezívnych interakcií vedie samotné plávanie buniek pri vyšších hustotách k fyzikálnym interakciám medzi baktériami, a to k priamym, keď sa bunky zrazia (sterické interakcie), ako aj prostredníctvom tekutiny, ktorú vytláčajú (hydrodynamické interakcie). Keď sa hustota buniek zvyšuje, hydrodynamické interakcie prispievajú k vzniku vírivého kolektívneho pohybu vytvoreného prerušovanými prúdmi a vírmi stoviek buniek436,437. Tieto sú pozorované u mnohých bakteriálnych druhov v prednej časti rojov plávajúcich baktérií množiacich sa na povrchu polotuhých agarových gélov438 alebo blízko rozhrania vzduch- voda439. Je zaujímavé, že tieto fyzikálne interakcie silne modifikujú chemotaktickú odozvu, a to v dvoj- aj trojrozmernej geometrii. Aj keď je odozva mierne zvýšená pri strednej hustote buniek, vznik kolektívneho pohybu ničí schopnosť E. coli sledovať chemické gradienty440 v dôsledku rýchlej randomizácie smeru pohybu plávajúcich baktérií, spôsobenej kolektívnym pohybom, ktorý bráni snímaniu gradientu prostredníctvom časových porovnaní. Preto existuje fyzikálna horná hranica hustoty, pri ktorej sa môžu baktérie chemotakticky akumulovať v blízkosti zdroja atraktantu alebo v putujúcom chemotaktickom páse. Takáto redukcia chemosenzovania pri vysokej hustote ovplyvňuje aj bakteriálne roje, kde kolektívny pohyb vzniká v hustej kvázi monovrstve plávajúcich buniek za okrajom kolónie235. V súlade s tým nie je pre rojenie potrebná chemotaxia441. Napriek tomu nedávna správa naznačila, že roj E. coli môže byť schopný ovplyvniť svoj pohyb smerom k vyšším koncentráciám atraktantu442, čo vyžaduje špecifické mechanizmy na potlačenie fyzikálne podmienenej straty chemotaxie. Tie by mohli zahŕňať výrazne zníženú rýchlosť pádov, ktorá sa pozoruje nielen pri E. coli, ale aj pri iných rojacich sa baktériách 248 ako aj predlžovanie buniek242 a modifikované toky tekutín v roji v porovnaní so suspenziami235. Tieto výsledky platia len pre baktérie poháňané bičíkmi. Na rozdiel od toho, chemotaktická schopnosť baktérií, ktoré sa pohybujú pri vysokej hustote na polopevných povrchoch pomocou zášklbov alebo kĺzania, je nedostatočne preštudovaná, hoci bola pozorovaná ich kolektívna migrácia po chemických gradientoch306,443. 227

5.3.3.4 Úloha bičíka, pohybu a chemotaxie pri tvorbe biofilmu Vytvorením biofilmu pripojeného k povrchu si baktérie osvojujú sesilný spôsob života, ktorý poskytuje baktériám ochranu pred nepriaznivým prostredím a umožňuje deľbu práce v bakteriálnych komunitách. Tvorba submerzných biofilmov na rozhraniach kvapalina-pevná látka zvyčajne má niekoľko fáz, vrátane povrchového prichytenia, rastu a dozrievania komunít zabudovaných do matrice a nakoniec disperzie biofilmu444. Tieto biofilmové spoločenstvá sú vnímané v protiklade k pohyblivej planktonickej forme baktérií. Gény potrebné na produkciu matrice biofilmu a gény pre pohyb sú u E. coli a iných baktérií antagonisticky regulované, vrátane ich vzájomne sa vylučujúcej expresie445. Hlavným signálom riadiacim tento prechod medzi profilmi génovej expresie, charakteristickými pre pohyblivé a sesilné stavy, je cyklický diguanozínmonofosfát (c-di-GMP), ktorý vo všeobecnosti podporuje tvorbu biofilmu a znižuje pohyb. Okrem toho, že vedie k represii expresie bičíkového génu, c-di-GMP môže tiež znížiť pohyb na post-translačnej úrovni446, napr. aktiváciou zlomového proteínu YcgR motora bičíka u E. coli447. Napriek tejto všeobecne antagonistickej regulácii čoraz viac dôkazov naznačuje, že bičíky, pohyb a chemotaxia hrajú dôležitú úlohu vo všetkých štádiách tvorby biofilmu. Kmene E. coli s poruchou pohybu tvoria tenšie a redšie submerzné biofilmy448. Podobné fenotypy boli pozorované u nepohyblivých mutant rôznych baktérií, vrátane zástupcov rodov Pseudomonas, Shewanella, Agrobacterium a Bacillus439,449. Bičíkový pohyb skutočne silne podporuje počiatočné pripojenie k povrchu450. Prichytenie môže byť ďalej posilnené silnou chemoatraktívnou reakciou, ktorá potláča pády, čím podporuje akumuláciu plávajúcich baktérií na povrchu a zvyšuje ich šance na prichytenie451. Pohyb a chemotaxia môžu ďalej poháňať baktérie smerom k vhodnému miestu pre prichytenie a/alebo tvorbu biofilmu, ak je biofilm chemoatraktívny, napr. rozhranie vzduch-voda452, povrch črevného epitelu453 alebo koreň rastliny454. Okrem zvýšenia akumulácie a prichytenia k povrchom, chemotaxia k atraktantu AI- 2 podporuje tvorbu väčších a štruktúrovanejších submerzných biofilmov u E. coli455. Keďže AI-2 je produkovaný mnohými baktériami a sprostredkúva medzidruhové chemické interakcie129, chemoatrakcia k AI-2 môže tiež uprednostňovať ko-agregáciu a zmiešanú tvorbu biofilmu, ako sa skutočne pozorovalo pri kokultúrach E. coli a E. faecalis456. Navyše, môže bičík ako adhezín priamo podporovať prichytenie k povrchu457. V zrelom biofilme je pohyb potlačený, ale bičík môže slúžiť ako dôležitý štruktúrny prvok matrice biofilmu445. Nakoniec, reaktivácia pohybu môže byť dôležitá v štádiu disperzie biofilmu444, čo môže byť ďalej posilnené chemotaktickým sebaodpudzovaním. Zaujímavé je, 228

že u Helicobacter pylori je toto sebaodpudzovanie sprostredkované AI-2458, na rozdiel od jeho úlohy ako atraktantu pri podpore biofilmu u E. coli. 5.3.4 Úloha chemotaxie pri interakciách hostiteľ-mikroorganizmus Bičíkový pohyb a chemotaxia sú bežné medzi bakteriálnymi patogénmi a sú zvyčajne dôležité pre úspešnú kolonizáciu hostiteľa a pre infekciu459,460. Pohyb môže mať niekoľko funkcií v interakciách medzi hostiteľom a mikroorganizmami a môže byť obzvlášť dôležitý v gastrointestinálnom (GI) trakte, kde sa nachádza väčšina mikrobioty461. Úspešná kolonizácia GI traktu črevnými baktériami väčšinou závisí od ich schopnosti preniknúť cez vrstvu viskózneho hlienu, aby sa dostali na priaznivé miesto. Dôležitosť hlienovej bariéry pri udržiavaní homeostázy čreva podčiarkujú štúdie, ktoré poukazujú na to, že myši s deficitom MUC2 sú náchylné na spontánny zápal462 a menej odolné voči bakteriálnej infekcii463. Bičíkový pohyb umožňuje baktériám adherovať na povrch hlienu453 a preniknúť do slizničnej vrstvy464,465. Adherencia môže byť ďalej podporená aj molekulami produkovanými črevným epitelom, ako sú mucíny a ich degradačné produkty466 alebo potencionálne imitátormi AI-2467, teda látkami, ktoré sú uvoľňované do lúmenu endokrinným a imunitným systémom hostiteľa pri modulácii interakcií medzi hostiteľom a mikroorganizmami počas kolonizácie čreva468,469. Je pravdepodobné, že niektoré z týchto molekúl sprostredkúvajú aj chemotaktické odpovede. Konkrétne sa ukázalo, že E. coli vníma niektoré ľudské hormóny, vrátane norepinefrínu, kyseliny 3,4-dihydroxymandľovej, dopamínu, melatonínu, ako aj iné chemikálie, ktoré môžu byť vylučované do lúmenu čreva hostiteľom a/alebo mikrobiotou, ako je spermidín a indol326,470-472. Je zaujímavé, že reakcie na niektoré z týchto zlúčenín sprostredkované dvomi hlavnými chemoreceptormi E. coli, Tar a Tsr, sú protichodné434. Takéto protichodné odpovede by mohli viesť k akumulácii baktérií v intermediálnom bode v rámci gradientu, ktorý by mohol byť v určitej vzdialenosti od povrchu črevného epitelu, čo by prípadne umožnilo baktériám E. coli uniknúť antimikrobiálnym aktivitám slizničnej vrstvy, pričom by zostali v blízkosti epitelu 471. Alternatívne by bimodálna odpoveď mohla viesť k vyhnutiu sa intermediálnym koncentráciám, ako sa zdá v prípade indolovej odpovede u E. coli434. V skutočnosti chemotaxia smerom k hormónom alebo odpudzovanie od indolu boli využité na zvýšenie adherencie E. coli k HeLa bunkám470,473. Účasť bakteriálneho pohybu a chemotaxie na vzniku a udržiavaní infekcie je dobre zdokumentovaná pre množstvo ľudských patogénov. Komplexný prehľad o tejto problematike poskytuje práca autorov Matilla a Krell460. Medzi najlepšie preskúmané príklady chemotaxie u 229

pohyblivých patogénnych baktérií patrí Helicobacter pylori, Campylobacter jejuni, S. Typhimurium, Vibrio cholerae a Pseudomonas aeruginosa. Všetky tieto patogény vykazujú chemotaktické odpovede na niektoré bežné metabolity, ako sú aminokyseliny, cukry a organické kyseliny. Chemoreceptory pctA, pctB a pctC u P. aeruginosa, ktoré snímajú L‐aminokyseliny, sú zodpovedné za imobilizáciu buniek v blízkosti rán474. Receptory TlpA, TlpB, TlpC a TlpD u H. pylori sú zodpovedné za kolonizáciu žalúdka475,476. TlpA sníma Arg a TlpA, a TlpC pôsobí ako senzor bikarbonátovej kyseliny477. TlpB a TlpD sú zodpovedné za snímanie pH, repelentnú odozvu a tiež energetickú taxiu478,479. Receptor TlpB sníma gradient močoviny a vykazuje pozitívnu chemotaxiu480. Receptory Tlp1‐10 u Campylobacter jejuni sú zodpovedné za kolonizáciu sliznice jejuna481. Receptor Mlp24 u V. cholerae, ktorý sníma L‐aminokyseliny, je zodpovedný za produkciu choleratoxínu482. Mcp mutant u Cronobacter sakazakii nie je schopný napadnúť ľudské epitelové bunky a adherovať k nim174. Spomedzi týchto patogénnych baktérií, najšpecializovanejšie spektrum chemoefektorových metabolitov je charakteristické pre H. pylori, ktorý infikuje epitel žalúdka, a preto je prispôsobený vysoko špecifickej ekologickej nike, zatiaľ čo najširšie spektrum metabolitov rozpoznáva oportunistický a vysoko všestranný patogén P. aeruginosa. Napriek tomu sa zdá, že mnohé taktické reakcie patogénov slúžia primárne alebo výlučne ako orientačné signály v rámci ich hostiteľov, čo umožňuje baktériám lokalizovať miesta infekcie. Patrí sem taxia k močovine, pH a bikarbonátu u H. pylori475,480,483, k deoxycholátu u C. jejuni481 k histamínu, gama-aminobutyrátu a anorganickému fosfátu u P. aeruginosa484-486, ako aj aerotaxie a energetické taxie vykazované väčšinou patogénov487-490. Stojí za zmienku, že schopnosť niektorých bakteriálnych patogénov profitovať z chemotaxie počas infekcie závisí od prostredia. Napríklad úloha chemotaxie pri infekcii S. Typhimurium sa stáva zjavnou až s rozvojom črevného zápalu491. Vzhľadom na to, že veľa z chemickej komunikácie medzi hostiteľom a jeho mikrobiotou zostáva ešte nepreštudované, vyššie uvedené hostiteľsko- špecifické taktické odpovede pravdepodobne predstavujú len zlomok podnetov a signálov vnímaných patogénnymi, ako aj nepatogénnymi pohyblivými baktériami. 230

ZOZNAM SKRATIEK AI Autoinduktory AI-2 AI-3 Autoinduktor 2 AIP AHL Autoinduktor 3 CAI-1 Autoinduktorový peptid c-di-GMP N-acyl-homoserínové laktóny CPS CCW Autoinduktor cholery 1 CW Bis-(3'-5')-cyklický dimérny guanozínmonofosfát Doména Capsular Polysaccharides Kapsulárne polysacharidy) DSF Counter ClockWise (Proti smeru hodinových ručičiek) EPS ClockWise (V smere hodinových ručičiek) FAD PAS – doména Per-Arnt-Sim HBB Difúzny signálny faktor HAMP Exopolysacharidy Kryo-EM Flavin Adenine Dinucleotide (Flavínadeníndinukleotid) LAB Hook-and-Basal-Body (Hák-bazálne teliesko) LuxP Doména histidínkináza, adenylylcykláza, metyl-akceptujúci chemotaktický MBR proteín a fosfatáza (histidine kinase, adenylyl cyclase, methylaccepting MCPs chemotaxis protein, and phosphatase) NGS Kryoelektrónová mikroskopia PIA Lactic Acid Bacteria (Baktérie mliečneho kvasenia) pN Periplazmatický väzbový proteín QQ Membránový bioreaktor QS Methyl-accepting Chemotaxis Proteins (Metyl-akceptujúce chemotaktické QSI proteíny) SAM Next Generetion Sequencing (Sekvenovanie novej generácie) T3SS Polysacharidový intercelulárny adhezín Pikonewton Enzýmy zhášania kvóra Quorum Sensing Inhibítory quorum sensing S-adenozylmetionin Sekrečný systém typu III 231

LITERATÚRA 1. Sharmaa, S. S. P. I. n.-B. A. Chapter 5 – Biofilms: Development and molecular interaction of microbiome in the human oral cavity. 61-75 (2020). 2. Donlan, R. M. Emerg Infect Dis 8, 881-90, (2002) 3. McCarty S., W. E., et. al. . Chapter Nine - Biofilms: From Concept to Reality. 143-163 (2014). 4. Flemming, H. C. & Wingender, J. Nat Rev Microbiol 8, 623-33, (2010) 5. Verderosa, A. D. et al. Front Chem 7, 824, (2019) 6. Harrison, J. J. et al. Nat Rev Microbiol 5, 928-38, (2007) 7. Hostacka, A. et al. Folia Microbiol (Praha) 55, 75-8, (2010) 8. Kim, L. H. & Chong, T. H. Environ Sci Technol 51, 1249-58, (2017) 9. Marsden, A. E. et al. PLoS One 12, e0169521, (2017) 10. Hathroubi, S. et al. Microb Drug Resist 23, 147-56, (2017) 11. Yuan, L. et al. Crit Rev Food Sci Nutr 60, 2277-93, (2020) 12. Stewart, P. S. & Franklin, M. J. Nat Rev Microbiol 6, 199-210, (2008) 13. Soumya Satpathy, S. K. S., Smaranika Pattanaik, Sangeeta Raut: Biocatalysis and Agricultural Biotechnology 7, 56-66, (2016) 14. Costerton, W. et al. J Clin Invest 112, 1466-77, (2003) 15. Costerton, J. W. et al. Annu Rev Microbiol 49, 711-45, (1995) 16. R.J. Palmer, R. D., R.J. Lamont, B. Nyvad, R.P. Teles: Human oral bacterial biofilms: composition, dynamics, and pathogenesis (2010). 17. P. Kolenbrander, J. P. Human oral bacterial biofilms (2004). 18. Sanderson, A. R. et al. Laryngoscope 116, 1121-6, (2006) 19. Hall-Stoodley, L. et al. JAMA 296, 202-11, (2006) 20. Bjarnsholt, T. et al. Pediatr Pulmonol 44, 547-58, (2009) 21. Skandamis, P. N. et al. Food Microbiol 26, 112-9, (2009) 22. Hoiby, N. et al. Annu Rev Microbiol 40, 29-53, (1986) 23. Bach, H. et al. Appl Environ Microbiol 69, 2608-15, (2003) 24. Dalton, H. M., Goodman, A. E., Marshall, K. C. J. Indust. Microbiol. Biotechnol. 17, 228-34, (1996) 25. Heydorn, A. et al. Microbiology (Reading) 146 ( Pt 10), 2395-407, (2000) 26. Tolker-Nielsen, T. et al. J Bacteriol 182, 6482-9, (2000) 27. Davey, M. E. & O'Toole G, A. Microbiol Mol Biol Rev 64, 847-67, (2000) 28. Vazquez-Sánches D., R.-L. P. BiofilmFormation of Staphylococcusaureus. 87-103 ( 2018;). 29. Mcdougald D, R. S., Barraud N, Steinberg PD, Kjelleberg S Nat Rev Microbiol 10, 39-50., ( 2012) 30. Verstraeten, N. et al. Trends Microbiol 16, 496-506, (2008) 31. Balan, S. S. et al. Enzyme Microb Technol 120, 1-7, (2019) 32. Banat, I. M. et al. Appl Microbiol Biotechnol 87, 427-44, (2010) 33. Schindler, J. Mikrobiológie. 1. Vydanie. (2010.). 34. Holá, V. Živa 6, 271, (2012) 35. Characklis, W. G. Biofilm processes., 195-231 (1990). 36. Moormeier, D. E. & Bayles, K. W. Mol Microbiol 104, 365-76, (2017) 37. Stoodley, P. e. a. Annual Review of Microbiology 56, 187-209, (2002) 38. Gupta, P. et al. Arch Microbiol 198, 1-15, (2016) 39. Harrison, J. e. a. American Scientist 93, (2005) 40. Donlan, R. M. Clin Infect Dis 33, 1387-92, (2001) 41. Brading, M. G., Jass, J., Lappin-Scott, H. M., Lappin-Scott, H. M., Costerton, J. W.: Dynamics of bacterial biofilm formation. 310 (1995). 42. Davies, D. G. et al. Science 280, 295-8, (1998) 43. Hall-Stoodley, L. et al. Nat Rev Microbiol 2, 95-108, (2004) 44. O'Toole G. A., K. H., Kolter R. . Annu. Rev. Microbiol, 49-79, ( 2000;) 45. Romling, U. et al. Microbiol Mol Biol Rev 77, 1-52, (2013) 46. Goller, C. C. & Romeo, T. Curr Top Microbiol Immunol 322, 37-66, (2008) 47. Marsh, P. D. & Zaura, E. J Clin Periodontol 44 Suppl 18, S12-S22, (2017) 48. Wade, W. G. Pharmacol Res 69, 137-43, (2013) 49. Grenier, D. Infect Immun 60, 5298-301, (1992) 50. Saini, R. et al. Ind Psychiatry J 19, 66-7, (2010) 51. Bjarnsholt, T. et al. Wound Repair Regen 16, 2-10, (2008) 52. Percival, S. L. et al. Adv Wound Care (New Rochelle) 4, 373-81, (2015) 53. Zhu, Z. et al. J Clin Lab Anal 34, e23274, (2020) 54. McConoughey, S. J. et al. Future Microbiol 9, 987-1007, (2014) 232

55. Costerton, J. W. et al. Int J Artif Organs 28, 1062-8, (2005) 56. Pelling, H. et al. Lett Appl Microbiol 68, 277-93, (2019) 57. Warren, J. W. Int J Antimicrob Agents 17, 299-303, (2001) 58. Nicodemo, A. C. et al. Braz J Infect Dis 18, 561-4, (2014) 59. Cahill, T. J. & Prendergast, B. D. Lancet 387, 882-93, (2016) 60. Lerche, C. J. et al. Front Cell Dev Biol 9, 643335, (2021) 61. Yang, L. et al. FEMS Immunol Med Microbiol 65, 146-57, (2012) 62. Meiron, T. S. & Saguy, I. S. J Food Sci 72, E485-91, (2007) 63. Jansen, B. & Kohnen, W. J Ind Microbiol 15, 391-6, (1995) 64. Pothakamury U.R., B.-C. G. V., Swanson G. . Food Technol. 47, 85-93, (1993) 65. Qian, Z. et al. Ann Biomed Eng 25, 69-76, (1997) 66. Davis, C. P. et al. Antimicrob Agents Chemother 35, 2131-4, (1991) 67. Jass, J. & Lappin-Scott, H. M. J Antimicrob Chemother 38, 987-1000, (1996) 68. Ma, Y. et al. Antimicrob Agents Chemother 56, 5923-37, (2012) 69. Privett, B. J. et al. Langmuir 27, 9597-601, (2011) 70. Bordi, C. & de Bentzmann, S. Ann Intensive Care 1, 19, (2011) 71. Moreau-Marquis, S. et al. Am J Respir Cell Mol Biol 41, 305-13, (2009) 72. Shanks, R. M. et al. Nephrol Dial Transplant 21, 2247-55, (2006) 73. Holah J.T., B. R. P., Thorpe R.H. . Int. Biodeteriorat 25, 147-53, (1989) 74. Juven, B. J. & Pierson, M. D. J Food Prot 59, 1233-41, (1996) 75. Cargill, K. L. et al. Can J Microbiol 38, 423-9, (1992) 76. W.G., C. Microbial biofouling control. 585-633 (1989). 77. Perez-Giraldo, C. et al. J Antimicrob Chemother 39, 643-6, (1997) 78. Somrani, M. et al. Foods 9, (2020) 79. Shan, B. et al. Int J Food Microbiol 117, 112-9, (2007) 80. Zhou, L. et al. Biotechnol Lett 35, 631-7, (2013) 81. Bakkiyaraj, D. et al. Biofouling 29, 929-37, (2013) 82. Kuzma, L. et al. Phytomedicine 14, 31-5, (2007) 83. Cho, H. S. et al. J Agric Food Chem 61, 7120-6, (2013) 84. Tsang, P. W. et al. PLoS One 7, e50866, (2012) 85. Indira, M. et al. 3 Biotech 9, 306, (2019) 86. Karpiński TM, S., AK. . Bacteriocins. 312-319 (2016). 87. al., P. G. e. Bacteriocins and Its Use for Multidrug-Resistant Bacteria Control Kon K, Rai M. edn, 329-349 (2016) 88. Benitez-Chao, D. F. et al. Front Microbiol 12, 630695, (2021) 89. Hols, P. et al. Trends Microbiol 27, 690-702, (2019) 90. Fuchs, S. W. et al. Appl Environ Microbiol 77, 1698-707, (2011) 91. Shekhar S, S. A., et. al. . Critical Reviews in Environmental Science and Technology 45, 1522-54, (2015) 92. Satpute, S. K. et al. J Basic Microbiol 56, 1140-58, (2016) 93. al., S. H. e. Biosurfactants: Classification, Properties and Environmental Applications., Vol. 11 212 (2014). 94. De Giani, A. et al. Front Microbiol 12, 655150, (2021) 95. Shokouhfard, M. et al. Iran J Basic Med Sci 18, 1001-7, (2015) 96. Sambanthamoorthy, K. et al. BMC Microbiol 14, 197, (2014) 97. Abdalla, A. K. et al. Front Microbiol 12, 664395, (2021) 98. Nataraj, B. H. et al. Microb Cell Fact 19, 168, (2020) 99. Kim, Y. et al. Biochem Biophys Res Commun 379, 324-9, (2009) 100. Barzegari, A. et al. Infect Drug Resist 13, 659-72, (2020) 101. Salas-Jara, M. J. et al. Microorganisms 4, (2016) 102. Gamarra, N. N. et al. Appl Microbiol Biotechnol 87, 545-51, (2010) 103. Frey-Klett, P. et al. Microbiol Mol Biol Rev 75, 583-609, (2011) 104. Mohini Prabha Singh, P. S., Hai-Bi Li, Qi-Qi Song, Rajesh Kumar Singh: Chapter 10 - Microbial biofilms: Development, structure, and their social assemblage for beneficial applications. 125-138 (2020). 105. Barriuso, J. AIMS Microbiol 1, 37-47, (2015) 106. Hogan, D. A. Curr Biol 16, R457-8, (2006) 107. T.R., J. Microbially enhanced oil recovery. (1985). 108. Min, B. & Logan, B. E. Environ Sci Technol 38, 5809-14, (2004) 109. Fangzhou D., Z. L., Shaoqiang Y., Beizhen X., Hong L. . Acta Astronaut., 68 1537-47, (2015) 110. Rodriguez-Navarro, C. et al. Appl Environ Microbiol 78, 4017-29, (2012) 111. Sutherland, I. W. Trends Microbiol 9, 222-7, (2001) 233

112. Branda, S. S. et al. Trends Microbiol 13, 20-6, (2005) 113. Costerton, J. W. et al. J Bacteriol 176, 2137-42, (1994) 114. Lewis, K. Antimicrob Agents Chemother 45, 999-1007, (2001) 115. Waters, C. M. & Bassler, B. L. Annu Rev Cell Dev Biol 21, 319-46, (2005) 116. Nag, M., Lahiri, D., Ghosh, A., Das, D., Ray, R.R. . Quorum Sensing. (2021). 117. Solano, C. et al. Curr Opin Microbiol 18, 96-104, (2014) 118. Zhou, L. et al. Front Microbiol 11, 589640, (2020) 119. Pereira, C. S. et al. Mol Microbiol 84, 93-104, (2012) 120. Ng, W. L. & Bassler, B. L. Annu Rev Genet 43, 197-222, (2009) 121. Surette, M. G. & Bassler, B. L. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 7046-50, (1998) 122. Papenfort, K. & Bassler, B. L. Nat Rev Microbiol 14, 576-88, (2016) 123. Wu, K. et al. Microb Pathog 162, 105334, (2022) 124. Wu, L. & Luo, Y. Front Microbiol 12, 611413, (2021) 125. Sturme, M. H. et al. Antonie Van Leeuwenhoek 81, 233-43, (2002) 126. Painter, K. L. et al. Trends Microbiol 22, 676-85, (2014) 127. Bassler, B. L. et al. J Bacteriol 179, 4043-5, (1997) 128. Roy, V. et al. Enzyme Microb Technol 49, 113-23, (2011) 129. Pereira, C. S. et al. FEMS Microbiol Rev 37, 156-81, (2013) 130. Miller, S. T. et al. Mol Cell 15, 677-87, (2004) 131. Pereira, C. S. et al. J Bacteriol 191, 6975-87, (2009) 132. Armbruster, C. E. et al. Mol Microbiol 82, 836-50, (2011) 133. Lee, J. H. & Lee, J. FEMS Microbiol Rev 34, 426-44, (2010) 134. Gong, F. & Yanofsky, C. J Biol Chem 277, 17095-100, (2002) 135. Chang, Y. et al. Eur J Pharm Sci 140, 105058, (2019) 136. Yang, S. et al. Bioorg Med Chem 22, 1313-7, (2014) 137. Wang, J. et al. Mar Drugs 17, (2019) 138. Koch, G. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 111, 1568-73, (2014) 139. Ahmed, S. et al. Appl Microbiol Biotechnol 103, 3521-35, (2019) 140. Imperi, F. et al. Antimicrob Agents Chemother 57, 996-1005, (2013) 141. D'Angelo, F. et al. Antimicrob Agents Chemother 62, (2018) 142. Singh, S. & Bhatia, S. Bioimpacts 8, 201-09, (2018) 143. Khan, F. et al. Microb Pathog 146, 104249, (2020) 144. Khan, F. et al. Appl Microbiol Biotechnol 104, 1955-76, (2020) 145. Utari, P. D. et al. Front Cell Infect Microbiol 8, 119, (2018) 146. Ozcelik, B. et al. ACS Biomater Sci Eng 3, 78-87, (2017) 147. Cheng, W. J. et al. Appl Microbiol Biotechnol 104, 5025-37, (2020) 148. Shi X. M., Z. X. N. Trends Food Sci. Technol. 20, 407-13, (2009) 149. Bai A. J., V. R. R. Food Biotechnol. , 269-92. , (2014) 150. Kose-Mutlu B., E.-C. T., Koyuncu I., Lee C. H. Environ. Eng. Res. 24, 543-58, (2019) 151. Adler, J. Science 153, 708-16, (1966) 152. Milne, J. L. et al. FEBS J 280, 28-45, (2013) 153. Egelman, E. H. Curr Opin Struct Biol 46, 31-37, (2017) 154. Kato, T. et al. Nat Commun 10, 5295, (2019) 155. Minamino, T. & Imada, K. Trends Microbiol 23, 267-74, (2015) 156. Nakamura, S. & Minamino, T. Biomolecules 9, (2019) 157. Chen, S. et al. EMBO J 30, 2972-81, (2011) 158. Aizawa, S.-I. Chapter 7—Flagella. 125-146 (2015). 159. Beeby, M. et al. FEMS Microbiol Rev 44, 253-304, (2020) 160. Armitage, J. P. & Macnab, R. M. J Bacteriol 169, 514-8, (1987) 161. Horvath, P. et al. Biomolecules 9, (2019) 162. Sporing, I. et al. PLoS Biol 16, e2006989, (2018) 163. Minamino, T. & Namba, K. J Mol Microbiol Biotechnol 7, 5-17, (2004) 164. Lam, K. H. et al. J Biol Chem 293, 13961-73, (2018) 165. Imada, K. Biophys Rev 10, 559-70, (2018) 166. Minamino, T. et al. J Bacteriol 182, 3029-36, (2000) 167. Fujii, T. et al. Nat Commun 8, 14276, (2017) 168. Beatson, S. A. et al. Trends Microbiol 14, 151-5, (2006) 169. Faulds-Pain, A. et al. J Bacteriol 193, 2695-707, (2011) 170. Inoue, T. et al. Microbiology (Reading) 164, 740-50, (2018) 171. Kuhn, M. J. et al. Nat Commun 9, 5369, (2018) 234

172. Wang, F. et al. Nat Commun 8, 960, (2017) 173. Postel, S. et al. Elife 5, (2016) 174. Choi, Y. et al. Infect Immun 83, 197-204, (2015) 175. Chevance, F. F. & Hughes, K. T. Methods Mol Biol 1593, 47-71, (2017) 176. Fukumura, T. et al. PLoS Biol 15, e2002281, (2017) 177. Osterman, I. A. et al. Biochemistry (Mosc) 80, 1447-56, (2015) 178. Wadhwa, N. & Berg, H. C. Nat Rev Microbiol 20, 161-73, (2022) 179. Berg, H. C. E. coli in Motion. ( 2004). 180. Macnab, R. M. Proc Natl Acad Sci U S A 74, 221-5, (1977) 181. Darnton, N. C. et al. J Bacteriol 189, 1756-64, (2007) 182. Turner, L. et al. J Bacteriol 182, 2793-801, (2000) 183. Son, K., Guasto, J. S. & Stocker, R. . Nat. Phys., 494-98, (2013) 184. Attmannspacher, U. et al. Mol Microbiol 56, 708-18, (2005) 185. Sowa, Y. & Berry, R. M. Q Rev Biophys 41, 103-32, (2008) 186. Lynch, M. J. et al. Structure 25, 317-28, (2017) 187. Park, S. Y. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 11886-91, (2006) 188. Minamino, T. et al. Comput Struct Biotechnol J 17, 1075-81, (2019) 189. Szurmant, H. et al. J Biol Chem 279, 21787-92, (2004) 190. Tan, J. et al. Cell 184, 2665-79 e19, (2021) 191. Johnson, S. et al. Nat Microbiol 6, 712-21, (2021) 192. Yamaguchi, T. et al. Nat Commun 12, 4469, (2021) 193. Halte, M. & Erhardt, M. Biomolecules 11, (2021) 194. Yakushi, T. et al. J Bacteriol 188, 1466-72, (2006) 195. Takekawa, N. et al. Trends Microbiol 28, 719-31, (2020) 196. Santiveri, M. et al. Cell 183, 244-57 e16, (2020) 197. Deme, J. C. et al. Nat Microbiol 5, 1553-64, (2020) 198. Hu, H. et al. Trends Biochem Sci 47, 160-72, (2022) 199. Al-Otaibi, N. S. & Bergeron, J. R. C. Nat Microbiol 5, 1455-56, (2020) 200. Chang, Y. et al. Nat Struct Mol Biol 27, 1041-47, (2020) 201. Yuan, J. et al. Nature 484, 233-6, (2012) 202. Lele, P. P. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 109, 20018-22, (2012) 203. Nord, A. L. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 114, 12952-57, (2017) 204. Wadhwa, N. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 116, 11764-69, (2019) 205. Wadhwa, N. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 118, (2021) 206. Krieg, N. R., Tomelty, J. P. & Wells, J. S. Jr. . J. Bacteriol 94,, 1431-36, (1967) 207. Krieg, N. R. Bacteriol Rev 40, 55-115, (1976) 208. Winet, H. & Keller, S. R. J Exp Biol 65, 577-602, (1976) 209. Ramia, M. Biophys J 60, 1057-78, (1991) 210. Nakamura, S. Biomolecules 10, (2020) 211. Murphy, G. E. et al. Mol Microbiol 67, 1184-95, (2008) 212. Goldstein, S. F. & Charon, N. W. Cell Motil Cytoskeleton 9, 101-10, (1988) 213. Tahara, H. et al. Sci Adv 4, eaar7975, (2018) 214. Charon, N. W. et al. Annu Rev Microbiol 66, 349-70, (2012) 215. Berg, H. C. & Turner, L. Nature 278, 349-51, (1979) 216. Vicsek T, Z. A. C. m. Phys Rep 517, 71-140, (2012) 217. Berg, H. C. Curr Biol 15, R599-600, (2005) 218. Kearns, D. B. Nat Rev Microbiol 8, 634-44, (2010) 219. Sokolov, A. et al. Phys Rev Lett 98, 158102, (2007) 220. Copeland, M. F. & Weibel, D. B. Soft Matter 5, 1174-87, (2009) 221. Overhage, J. et al. J Bacteriol 190, 2671-9, (2008) 222. Cisneros, L. H., Cortez, R., Dombrowski, C., Goldstein, R. E. & Kessler, J. O.: Exp. Fluids. 43,, 737-53, (2007) 223. Cisneros, L. H., Kessler, J. O., Ganguly, S. & Goldstein, R. E. . Phys. Rev. E. 83, 061907 (2011) 224. Williams, F. D. & Schwarzhoff, R. H. Annu Rev Microbiol 32, 101-22, (1978) 225. Harshey, R. M. & Matsuyama, T. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 8631-5, (1994) 226. Kearns, D. B. & Losick, R. Mol Microbiol 49, 581-90, (2003) 227. McCarter, L. J Mol Microbiol Biotechnol 1, 51-7, (1999) 228. Kohler, T. et al. J Bacteriol 182, 5990-6, (2000) 229. Alberti, L. & Harshey, R. M. J Bacteriol 172, 4322-8, (1990) 230. Ingham, C. J. & Ben Jacob, E. BMC Microbiol 8, 36, (2008) 235

231. Jones, B. V. et al. Infect Immun 72, 3941-50, (2004) 232. Rather, P. N. Environ Microbiol 7, 1065-73, (2005) 233. Tuson, H. H. et al. J Bacteriol 195, 368-77, (2013) 234. Darnton, N. C. et al. Biophys J 98, 2082-90, (2010) 235. Jeckel, H. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 116, 1489-94, (2019) 236. Ping, L. et al. Biophys J 107, 871-8, (2014) 237. Daniels, R. et al. FEMS Microbiol Rev 28, 261-89, (2004) 238. Partridge, J. D. & Harshey, R. M. J Bacteriol 195, 919-29, (2013) 239. Belas, R. Trends Microbiol 22, 517-27, (2014) 240. Laventie, B. J. & Jenal, U. Annu Rev Microbiol 74, 735-60, (2020) 241. Chawla, R. et al. J Mol Biol 432, 523-33, (2020) 242. Ilkanaiv, B. et al. Phys Rev Lett 118, 158002, (2017) 243. Be’er, A. e. a. Commun. Phys 3, 66, (2020) 244. Wensink, H. H. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 109, 14308-13, (2012) 245. Zhang, H. P. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 107, 13626-30, (2010) 246. Turner, L. et al. J Bacteriol 192, 3259-67, (2010) 247. Ford, K. M. et al. Front Microbiol 9, 2197, (2018) 248. Partridge, J. D. et al. mBio 11, (2020) 249. Mariconda, S. et al. Mol Microbiol 60, 1590-602, (2006) 250. Jarrell, K. F. & Albers, S. V. Trends Microbiol 20, 307-12, (2012) 251. Berry, J. L. & Pelicic, V. FEMS Microbiol Rev 39, 134-54, (2015) 252. Craig, L. et al. Nat Rev Microbiol 2, 363-78, (2004) 253. Piepenbrink, K. H. Front Mol Biosci 6, 1, (2019) 254. Evans, K. J. et al. J Bacteriol 189, 4850-9, (2007) 255. Persat, A. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 112, 7563-8, (2015) 256. Nakane, D. & Nishizaka, T. Proc Natl Acad Sci U S A 114, 6593-98, (2017) 257. Oliveira, N. M. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 113, 6532-7, (2016) 258. Snyder, R. A. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 117, 17984-91, (2020) 259. Korotkov, K. V. et al. Nat Rev Microbiol 10, 336-51, (2012) 260. Beaussart, A. et al. ACS Nano 8, 10723-33, (2014) 261. Maier, B. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 16012-7, (2002) 262. Mauriello, E. M. et al. Microbiol Mol Biol Rev 74, 229-49, (2010) 263. Ligthart, K. et al. Trends Microbiol 28, 340-48, (2020) 264. Aguilo-Ferretjans, M. D. M. et al. Nat Commun 12, 1857, (2021) 265. Semmler, A. B. et al. Microbiology (Reading) 145 ( Pt 10), 2863-73, (1999) 266. Merz, A. J. et al. Nature 407, 98-102, (2000) 267. O'Toole, G. A. & Kolter, R. Mol Microbiol 30, 295-304, (1998) 268. Ward, M. J. & Zusman, D. R. Curr Opin Microbiol 2, 624-9, (1999) 269. Marathe, R. et al. Nat Commun 5, 3759, (2014) 270. Jin, F. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 12617-22, (2011) 271. Gibiansky, M. L. e. a. Science 330, 197, ((2010)) 272. Kuhn, M. J. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 118, (2021) 273. Nguyen, Y. et al. J Biol Chem 290, 601-11, (2015) 274. Giltner, C. L. et al. J Mol Biol 398, 444-61, (2010) 275. Helaine, S. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 15888-93, (2007) 276. Craig, L. et al. Mol Cell 23, 651-62, (2006) 277. Treuner-Lange, A. et al. Nat Commun 11, 5054, (2020) 278. Koch, M. D. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 118, (2021) 279. Li, J. et al. J Mol Biol 418, 47-64, (2012) 280. Chang, Y. W. et al. Science 351, aad2001, (2016) 281. Gold, V. A. et al. Elife 4, (2015) 282. Pelicic, V. Mol Microbiol 68, 827-37, (2008) 283. Ayers, M. et al. Future Microbiol 5, 1203-18, (2010) 284. McCallum, M. et al. Microbiol Spectr 7, (2019) 285. McCallum, M. et al. Nat Commun 8, 15091, (2017) 286. Mancl, J. M. et al. Structure 24, 1886-97, (2016) 287. Craig, L. et al. Nat Rev Microbiol 17, 429-40, (2019) 288. McBride, M. J. Annu Rev Microbiol 55, 49-75, (2001) 289. McBride, M. J. & Nakane, D. Curr Opin Microbiol 28, 72-7, (2015) 290. Nan, B., McBride, M. J., Chen, J., Zusman, D. R. & Oster, G. . Curr. Biol 24, R169-R73 (2014) 236

291. Shrivastava, A. et al. Biophys J 111, 1008-13, (2016) 292. Nelson, S. S., Bollampalli, S., and McBride, M.J. J Bacteriol 190, 2851-57, (2008) 293. Shrivastava, A., R. G. Rhodes, S. Pochiraju, D. Nakane, and M. J. McBride. J. Bacteriol 194, 3678-88, (2012) 294. McBride, M. J. & Zhu, Y. J Bacteriol 195, 270-8, (2013) 295. Sato, K. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 107, 276-81, (2010) 296. Lauber, F. et al. Nature 564, 77-82, (2018) 297. Braun, T. F. et al. J Bacteriol 187, 6943-52, (2005) 298. Braun, T. F. & McBride, M. J. J Bacteriol 187, 2628-37, (2005) 299. Johnston, J. J. et al. J Bacteriol 200, (2018) 300. Nakane, D. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 110, 11145-50, (2013) 301. Pate, J. L. C., L.-Y. E. . Curr. Microbiol. 2, 59-64, (1979) 302. Shrivastava, A. et al. Curr Biol 25, 338-41, (2015) 303. Shrivastava, A. & Berg, H. C. Sci Adv 6, eaay6616, (2020) 304. Shrivastava, A. et al. J Bacteriol 195, 3201-12, (2013) 305. Hennell James, R. et al. Nat Microbiol 6, 221-33, (2021) 306. Islam, S. T. & Mignot, T. Semin Cell Dev Biol 46, 143-54, (2015) 307. Nan, B. & Zusman, D. R. Mol Microbiol 101, 186-93, (2016) 308. Sun, M. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 7559-64, (2011) 309. Nan, B. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 2498-503, (2011) 310. Fu, G. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 115, 2484-89, (2018) 311. Faure, L. M. et al. Nature 539, 530-35, (2016) 312. Islam, S. T. e. a. Preprint at bioRxiv (2020) 313. Jarrell, K. F. & McBride, M. J. Nat Rev Microbiol 6, 466-76, (2008) 314. Ehlers, K. & Oster, G. PLoS One 7, e36081, (2012) 315. Shaevitz, J. W. et al. Cell 122, 941-5, (2005) 316. Lamason, R. L. & Welch, M. D. Curr Opin Microbiol 35, 48-57, (2017) 317. Miyata, M. et al. Genes Cells 25, 6-21, (2020) 318. Miyata, M. & Hamaguchi, T. Curr Opin Microbiol 29, 15-21, (2016) 319. Miyata, M. & Hamaguchi, T. Front Microbiol 7, 960, (2016) 320. Eisenbach, M. Bacterial Chemotaxis. (2011). 321. Parales, R. E. et al. Curr Opin Biotechnol 33, 318-26, (2015) 322. Matilla, M. A. & Krell, T. Curr Opin Biotechnol 45, 8-14, (2017) 323. Antunez-Lamas, M. et al. Mol Microbiol 74, 662-71, (2009) 324. Wu, H. et al. J Bacteriol 182, 3400-4, (2000) 325. Englert, D. L. et al. J Bacteriol 192, 2633-7, (2010) 326. Pasupuleti, S. et al. J Bacteriol 196, 3992-4000, (2014) 327. Hegde, M. et al. J Bacteriol 193, 768-73, (2011) 328. Neumann, S. et al. EMBO J 29, 3484-95, (2010) 329. Imae, Y. et al. J Bacteriol 169, 371-9, (1987) 330. Eisenbach, M. Mol Microbiol 20, 903-10, (1996) 331. Godany, M. et al. PLoS One 12, e0179111, (2017) 332. Berg, H. C. & Brown, D. A. Nature 239, 500-4, (1972) 333. Karmakar, R. et al. Appl Environ Microbiol 82, 1205-14, (2016) 334. Brown, D. A. & Berg, H. C. Proc Natl Acad Sci U S A 71, 1388-92, (1974) 335. Hazelbauer, G. L. et al. Trends Biochem Sci 33, 9-19, (2008) 336. Bi, S. & Sourjik, V. Curr Opin Microbiol 45, 22-29, (2018) 337. Gumerov, V. M. et al. Curr Opin Microbiol 61, 42-50, (2021) 338. Stock, A. M. et al. Annu Rev Biochem 69, 183-215, (2000) 339. Karmakar, R. J Basic Microbiol 61, 366-79, (2021) 340. Yeh, J. I. et al. J Mol Biol 262, 186-201, (1996) 341. Falke, J. J. & Hazelbauer, G. L. Trends Biochem Sci 26, 257-65, (2001) 342. Appleman, J. A. et al. J Bacteriol 185, 4872-82, (2003) 343. Aravind, L. & Ponting, C. P. FEMS Microbiol Lett 176, 111-6, (1999) 344. Kim, K. K. et al. Nature 400, 787-92, (1999) 345. Kim, C. et al. J Mol Biol 307, 119-35, (2001) 346. Lacal, J. et al. Environ Microbiol 12, 2873-84, (2010) 347. Alexandre, G. et al. FEMS Microbiol Rev 28, 113-26, (2004) 348. Parkinson, J. S. et al. Curr Opin Microbiol 8, 116-21, (2005) 349. Parkinson, J. S. et al. Trends Microbiol 23, 257-66, (2015) 237

350. Maddock, J. R. & Shapiro, L. Science 259, 1717-23, (1993) 351. Briegel, A. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 17181-6, (2009) 352. Li, M. & Hazelbauer, G. L. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 9390-5, (2011) 353. Bray, D. et al. Nature 393, 85-8, (1998) 354. Goldman, J. P. et al. Mol Biosyst 5, 1853-9, (2009) 355. Bi, S. & Lai, L. Cell Mol Life Sci 72, 691-708, (2015) 356. Bibikov, S. I. et al. J Bacteriol 186, 3730-7, (2004) 357. Repik, A. et al. Mol Microbiol 36, 806-16, (2000) 358. Taylor, B. L. Mol Microbiol 65, 1415-24, (2007) 359. Huang, Z. et al. Microbiol Res 219, 40-48, (2019) 360. Swanson, R. V. et al. Biochemistry 32, 7623-9, (1993) 361. Stewart, R. C. et al. Biochemistry 39, 13157-65, (2000) 362. Bourret, R. B. et al. J Bacteriol 175, 2097-101, (1993) 363. Porter, S. L. et al. Nat Rev Microbiol 9, 153-65, (2011) 364. Sourjik, V. & Wingreen, N. S. Curr Opin Cell Biol 24, 262-8, (2012) 365. Sarkar, M. K. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 107, 9370-5, (2010) 366. Sourjik, V. Trends Microbiol 12, 569-76, (2004) 367. Paul, K. et al. Nature 451, 489-92, (2008) 368. Zhao, X. et al. Biochemistry 53, 4323-33, (2014) 369. Martinez-Garcia, E. et al. Environ Microbiol 16, 291-303, (2014) 370. Wuichet, K. & Zhulin, I. B. Sci Signal 3, ra50, (2010) 371. Vladimirov, N. S., V. Biol. Chem. 390, 1097-104, (2009) 372. Kehry, M. R. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 80, 3599-603, (1983) 373. Barnakov, A. N. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 10667-72, (1999) 374. Muppirala, U. K. et al. Protein Sci 18, 1702-14, (2009) 375. Li, M. & Hazelbauer, G. L. Mol Microbiol 56, 1617-26, (2005) 376. Barkai, N. & Leibler, S. Nature 387, 913-7, (1997) 377. Djordjevic, S. & Stock, A. M. Structure 5, 545-58, (1997) 378. Djordjevic, S. & Stock, A. M. J Struct Biol 124, 189-200, (1998) 379. Barnakov, A. N. et al. J Biol Chem 276, 32984-9, (2001) 380. Banno, S. et al. Mol Microbiol 53, 1051-63, (2004) 381. Chervitz, S. A. & Falke, J. J. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 2545-50, (1996) 382. Ottemann, K. M. et al. Science 285, 1751-4, (1999) 383. Amin, D. N. & Hazelbauer, G. L. J Bacteriol 192, 1193-200, (2010) 384. Lovdok, L. et al. PLoS Biol 7, e1000171, (2009) 385. Antommattei, F. M. et al. J Bacteriol 186, 7556-63, (2004) 386. Terwilliger, T. C. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 83, 6707-10, (1986) 387. Le Moual, H. et al. Biochemistry 37, 14852-9, (1998) 388. Szurmant, H. & Ordal, G. W. Microbiol Mol Biol Rev 68, 301-19, (2004) 389. Bischoff, D. S. et al. Biochemistry 32, 9256-61, (1993) 390. Rao, C. V. et al. Trends Microbiol 16, 480-7, (2008) 391. Zimmer, M. A. et al. J Biol Chem 275, 24264-72, (2000) 392. Kirby, J. R. et al. Mol Microbiol 24, 869-78, (1997) 393. Kirby, J. R. et al. J Biol Chem 274, 11092-100, (1999) 394. Muff, T. J. & Ordal, G. W. J Biol Chem 282, 34120-8, (2007) 395. Karatan, E. et al. J Biol Chem 276, 43618-26, (2001) 396. Porter, S. L. & Armitage, J. P. J Mol Biol 324, 35-45, (2002) 397. Ward, M. J. et al. Mol Microbiol 17, 357-66, (1995) 398. Wadhams, G. H. et al. Mol Microbiol 36, 1222-33, (2000) 399. Wadhams, G. H. et al. Mol Microbiol 46, 1211-21, (2002) 400. Porter, S. L. et al. Methods Enzymol 423, 392-413, (2007) 401. Porter, S. L. & Armitage, J. P. J Biol Chem 279, 54573-80, (2004) 402. Wadhams, G. H. et al. Mol Microbiol 50, 763-70, (2003) 403. Jeziore-Sassoon, Y. et al. Microbiology (Reading) 144 ( Pt 1), 229-39, (1998) 404. Poole, P. S. et al. J Bacteriol 175, 291-4, (1993) 405. del Campo, A. M. et al. J Bacteriol 189, 8397-401, (2007) 406. Porter, S. L. et al. J Biol Chem 281, 32694-704, (2006) 407. Porter, S. L. et al. Mol Microbiol 46, 1081-94, (2002) 408. Pilizota, T. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 11582-7, (2009) 409. Ferre, A. et al. J Bacteriol 186, 5172-7, (2004) 238

410. Martin, A. C. et al. Mol Microbiol 40, 1261-72, (2001) 411. Wadhams, G. H. et al. Mol Microbiol 58, 895-902, (2005) 412. Porter, S. L. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 105, 18531-6, (2008) 413. Koster, D. A. et al. J Mol Biol 424, 180-91, (2012) 414. Keller, E. F. & Segel, L. A. J Theor Biol 30, 225-34, (1971) 415. Tindall, M. J. et al. Bull Math Biol 70, 1525-69, (2008) 416. Saragosti, J. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 16235-40, (2011) 417. Cremer, J. et al. Nature 575, 658-63, (2019) 418. Phan TV, M. R., Black ME et al. . Phys Rev X, 10:031017, ( 2020) 419. Fu, X. et al. Nat Commun 9, 2177, (2018) 420. Gude, S. et al. Nature 578, 588-92, (2020) 421. Liu, W. et al. Nature 575, 664-68, (2019) 422. Curatolo AI, Z. N., Zhao Y et al. . Nat Phys 16, 1152, (2020) 423. Alexandre, G. et al. J Bacteriol 182, 6042-8, (2000) 424. Yang, Y. & Sourjik, V. Mol Microbiol 86, 1482-9, (2012) 425. Paulick, A. et al. Elife 6, (2017) 426. Zhang, X. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 116, 2253-58, (2019) 427. Budrene, E. O. & Berg, H. C. Nature 376, 49-53, (1995) 428. Park, S. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 13910-5, (2003) 429. T., Defoirdt. ISME J 5, 569-70, (2011) 430. Song, S. & Wood, T. K. Microorganisms 9, (2021) 431. Zhang, L. et al. Nat Commun 11, 5371, (2020) 432. Lamb, E. et al. Mol Microbiol 112, 99-113, (2019) 433. Bible, A. N. et al. J Bacteriol 190, 6365-75, (2008) 434. Yang, J. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 117, 6114-20, (2020) 435. Grauer, J. et al. Sci Rep 10, 5594, (2020) 436. Dunkel, J. et al. Phys Rev Lett 110, 228102, (2013) 437. Koch DL, S. G. Annu Rev Fluid Mech 43, 637-59, (2011) 438. Be'er, A. & Ariel, G. Mov Ecol 7, 9, (2019) 439. Holscher, T. et al. J Mol Biol 427, 3695-708, (2015) 440. Colin, R. et al. Nat Commun 10, 5329, (2019) 441. Ariel G, S. M., Ryan SD et al. . Phys Rev E 98, 032415, (2018) 442. Tian, M. et al. Biophys J 120, 1615-24, (2021) 443. Guzzo, M. et al. Nat Microbiol 3, 948-59, (2018) 444. Rumbaugh, K. P. & Sauer, K. Nat Rev Microbiol 18, 571-86, (2020) 445. Besharova, O. et al. Front Microbiol 7, 1568, (2016) 446. Guttenplan, S. B. & Kearns, D. B. FEMS Microbiol Rev 37, 849-71, (2013) 447. Boehm, A. et al. Cell 141, 107-16, (2010) 448. Wood, T. K. et al. Appl Microbiol Biotechnol 72, 361-7, (2006) 449. Merritt, P. M. et al. J Bacteriol 189, 8005-14, (2007) 450. Elgeti J, G. G. Europhys Lett, 101:48003, (2013) 451. Suchanek, V. M. et al. Mol Microbiol 113, 728-39, (2020) 452. Ardre, M. et al. Phys Biol 12, 066015, (2015) 453. Misselwitz, B. et al. PLoS Pathog 8, e1002810, (2012) 454. Scharf, B. E. et al. Plant Mol Biol 90, 549-59, (2016) 455. Jani, S. et al. Microbiology (Reading) 163, 1778-90, (2017) 456. Laganenka, L. & Sourjik, V. Appl Environ Microbiol 84, (2018) 457. Friedlander, R. S. et al. Langmuir 31, 6137-44, (2015) 458. Sweeney, E. G. et al. mSphere 4, (2019) 459. Erhardt, M. Curr Top Microbiol Immunol 398, 185-205, (2016) 460. Matilla, M. A. & Krell, T. FEMS Microbiol Rev 42, (2018) 461. Fan, Y. & Pedersen, O. Nat Rev Microbiol 19, 55-71, (2021) 462. Van der Sluis, M. et al. Gastroenterology 131, 117-29, (2006) 463. Zarepour, M. et al. Infect Immun 81, 3672-83, (2013) 464. Pichon, C. et al. Cell Microbiol 11, 616-28, (2009) 465. Tamar, E. et al. Sci Rep 6, 19616, (2016) 466. Nelson, J. W. et al. Infect Immun 58, 1489-95, (1990) 467. Ismail, A. S. et al. Cell Host Microbe 19, 470-80, (2016) 468. Neuman, H. et al. FEMS Microbiol Rev 39, 509-21, (2015) 469. Pacheco, A. R. & Sperandio, V. Curr Opin Microbiol 12, 192-8, (2009) 239

470. Bansal, T. et al. Infect Immun 75, 4597-607, (2007) 471. Lopes, J. G. & Sourjik, V. ISME J 12, 2736-47, (2018) 472. Sule, N. et al. Infect Immun 85, (2017) 473. Bansal, T. et al. Appl Microbiol Biotechnol 78, 811-9, (2008) 474. Schwarzer, C. et al. PLoS One 11, e0150109, (2016) 475. Huang, J. Y. et al. PLoS Pathog 13, e1006118, (2017) 476. McGee, D. J. et al. Infect Immun 73, 1820-7, (2005) 477. Andermann, T. M. et al. Infect Immun 70, 5877-81, (2002) 478. Croxen, M. A. et al. J Bacteriol 188, 2656-65, (2006) 479. Rolig, A. S. et al. Infect Immun 80, 3713-20, (2012) 480. Huang, J. Y. et al. Cell Host Microbe 18, 147-56, (2015) 481. Li, Z. et al. J Med Microbiol 63, 343-54, (2014) 482. Nishiyama, S. et al. Infect Immun 80, 3170-8, (2012) 483. Cerda, O. et al. FEMS Microbiol Lett 224, 175-81, (2003) 484. Corral-Lugo, A. et al. mBio 9, (2018) 485. Reyes-Darias, J. A. et al. Mol Microbiol 97, 488-501, (2015) 486. Rico-Jimenez, M. et al. Sci Rep 6, 28967, (2016) 487. Behrens, W. et al. Infect Immun 81, 3534-51, (2013) 488. Horne, S. M. et al. Antonie Van Leeuwenhoek 95, 149-58, (2009) 489. Rivera-Chavez, F. et al. PLoS Pathog 9, e1003267, (2013) 490. Vegge, C. S. et al. Appl Environ Microbiol 75, 5308-14, (2009) 491. Stecher, B. et al. Cell Microbiol 10, 1166-80, (2008) 240

VI. VÝZNAMNÉ BAKTERIÁLNE PATOGÉNY ČLOVEKA A ZVIERAT A ICH FAKTORY PATOGENITY A VIRULENCIE Emil Pilipčinec 6.1 VÝZNAMNÉ BAKTERIÁLNE PATOGÉNY ČLOVEKA 6.1.1 A ZVIERAT ...................................................................................... 242 6.1.2 Pôvodcovia nových a znovuobjavujúcich sa bakteriálnych nákaz .... 243 6.1.3 Pôvodcovia rezistentných foriem nákaz ............................................ 246 Pôvodcovia nákaz vyvolaných bakteriálnymi kmeňmi s novými 247 faktormi virulencie ............................................................................. 6.1.4 Pôvodcovia bakteriálnych zoonóz – chorôb prenosných zo zvierat 248 na človeka .......................................................................................... 248 6.1.4.1 Pôvodcovia bakteriálnych alimentárnych nákaz, alimentárnych 252 253 intoxikácií alebo alimentárnych toxoinfekcií zoonotického 254 charakteru .......................................................................................... 6.1.4.2 Pôvodcovia bakteriálnych zoonóz prenášaní vektormi ..................... 256 6.1.4.3 Nákazy s prírodnou ohniskovosťou ................................................... 257 6.1.4.4 Pôvodcovia bakteriálnych zoonóz prenášaní kontaktom 259 261 alebo aerogénnou cestou .................................................................... 6.1.4.5 Pôvodcovia bakteriálnych zoonóz z poškrabania 262 alebo pohryznutia psom, mačkou alebo iným zvieraťom .................. 262 6.1.5 Pôvodcovia nozokomiálnych infekcií ................................................ 6.1.6 Pôvodcovia nákaz ako súčasť biologickej hrozby (bioterorizmu) ..... 264 6.1.7 Pôvodcovia ostatných významných infekcií človeka ........................ 266 6.2. TAXONOMICKÉ ZATRIEDENIE VÝZNAMNÝCH 266 6.2.1 BAKTERIÁLNYCH PATOGÉNOV ČLOVEKA A ZVIERAT ...... 271 6.2.2 Taxonomické zatriedenie významných Gram-negatívnych 279 bakteriálnych patogénov .................................................................... 283 Taxonomické zatriedenie významných Gram-pozitívnych 287 bakteriálnych patogénov .................................................................... 294 303 6.3 FAKTORY VIRULENCIE VÝZNAMNÝCH 311 GRAM-NEGATÍVNYCH BAKTERIÁLNYCH PATOGÉNOV 321 ČLOVEKA A ZVIERAT .................................................................. 324 329 6.3.1 Rod Borrelia ...................................................................................... 336 6.3.2 Rod Campylobacter ........................................................................... 339 6.3.3 Rod Helicobacter ............................................................................... 6.3.4 Rod Bartonella ................................................................................... 6.3.5 Rod Brucella ...................................................................................... 6.3.6 Rod Bordetella ................................................................................... 6.3.7 Rod Burkholderia ............................................................................... 6.3.8 Rod Neisseria ..................................................................................... 6.3.9 Rod Legionella ................................................................................... 6.2.10 Rod Pseudomonas .............................................................................. 6.3.11 Rod Francisella .................................................................................. 6.3.12 Rod Aeromonas .................................................................................. 6.3.13 Rod Escherichia ................................................................................. 241

6.3.14 Rod Salmonella .................................................................................. 364 6.3.15 Rod Shigella ....................................................................................... 375 6.3.16 Rod Yersinia ....................................................................................... 381 6.3.17 Rod Haemophilus ............................................................................... 398 6.3.18 Rod Vibrio .......................................................................................... 402 6.4 FAKTORY VIRULENCIE VÝZNAMNÝCH 408 GRAM-POZITÍVNYCH BAKTERIÁLNYCH PATOGÉNOV 408 6.4.1 ČLOVEKA A ZVIERAT ................................................................... 415 6.4.2 Rod Staphylococcus ........................................................................... 418 6.4.3 Rod Enterococcus .............................................................................. 427 6.4.4 Rod Streptococcus ............................................................................. 433 6.4.5 Rod Bacillus ....................................................................................... 436 6.4.6 Rod Listeria ....................................................................................... 438 6.4.7 Rod Erysipelothrix ............................................................................. 455 6.4.8 Rod Clostridium ................................................................................. 466 6.4.9 Rod Clostridioides ............................................................................. Rod Corynebacterium ........................................................................ 6.1 VÝZNAMNÉ BAKTERIÁLNE PATOGÉNY ČLOVEKA A ZVIERAT Do skupiny významných bakteriálnych patogénov človeka a zvierat sú zahrnutí predovšetkým pôvodcovia: a) nových a znovuobjavujúcich sa nákaz (Tab. 6.1); b) rezistentných foriem nákaz vyvolaných multirezistentnými, resp. polyrezistentnými bakteriálnymi kmeňmi (Tab. 6.1); c) nákaz vyvolaných bakteriálnymi kmeňmi s novými faktormi virulencie (Tab. 6.1); d) zoonóz, chorôb prenosných zo zvierat na človeka (Tab. 6.2, 6.4 – 6.6); e) alimentárnych nákaz, ktoré nemajú charakter zoonóz (Tab. 6.3); f) nozokomiálnych infekcií (Tab. 6.7); g) nákaz, ktoré sú súčasťou tzv. biologickej hrozby (bioterorizmu) (Tab. 6.8) a h) ostatných významných infekcií (Tab. 6.9). Osobitnú skupinu tvoria nepochybne choroby, ktoré nie sú vyvolané jedným bakteriálnym druhom, ako je to uvedené pri hore uvedených skupinách nákaz, ale sú výsledkom zmeny bakteriálnej populácie v niektorej časti organizmu. Choroby tohto typu nemajú nateraz svoje názvy a v angličtine sa všeobecne označujú ako „microbiota shift diseases“. Jedným z príkladov takejto choroby je aj bakteriálna vaginóza. Inou, nie menej zaujímavou skupinou chorôb, sú choroby, pri ktorých sa predpokladal, resp. stále sa predpokladá ich bakteriálny pôvod. Prípadne, pracuje sa s hypotézou, že baktérie môžu 242

byť ich spúšťačom. Príkladom sú peptické vredy a karcinóm žalúdka, kde sa predpokladal bakteriálny pôvod týchto chorôb a nakoniec bol objavený Helicobacter pylori. Ďalším príkladom sú periodontálne choroby, ktoré sú u ľudí širokou nozologickou jednotkou, súčasťou ktorej sú ochorenia mäkkých tkanív, čeľustnej kosti a cementu. Nakoniec na základe prijatej hypotézy bolo potvrdené, že sa na nich podieľa skupina tzv. parodontálnych patogénov, predovšetkým Aggregalibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Tannerella forsythia a Treponema denticola1,2. Na základe epidemiologických údajov a experimentálnych výsledkov sa predpokladá, že Chlamydia pneumoniae je prinajmenšom rizikovým faktorom pri ateroskleróze, Borreliella burgdorferi, črevné anaeróbne baktérie a mykoplazmy môžu byť spúšťačmi vzniku reumatoidnej artritídy3- 5. Nuž a nakoniec Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, pôvodca chronického granulomatozného zápalu čreva hovädzieho dobytka (paratuberkulózy hovädzieho dobytka), sa dáva do spojitosti s Crohnovou chorobou človeka6,7. 6.1.1 Pôvodcovia nových a znovuobjavujúcich sa bakteriálnych nákaz I keď za ostatné desaťročia došlo k eradikácii viacerých bakteriálnych infekcií, objavili sa však i nové, resp. narástol význam doposiaľ existujúcich bakteriálnych pôvodcov infekčných chorôb zmenou ich faktorov virulencie. Prípadne niektoré bakteriálne druhy považované pôvodne za nepatogénne sa stali virulentnými, k čomu im dopomohlo prevzatie ďalších, resp. nových faktorov virulencie (Tab. 6.1). Medzi nových bakteriálnych patogénov patrí nepochybne Legionella pneumophila, pôvodca Legionárskej choroby, ktorá mala svoj dramatický začiatok v júli v roku 1976 pri stretnutí viac ako 2000 členov Asociácie amerických vojnových veteránov (American Legion) v hoteli Bellevue Stratford vo Filadelfii (USA) pri príležitosti 200-ročného výročia podpísania Deklarácie nezávislosti (United States Bicentennial)8. V roku 1982 bola americkým vedcom Wilhelmom Burgdorferom objavená Borrelia burgdorferi, pôvodca boreliózy človeka zvierat9. Ďalším novým bakteriálnym patogénom je Helicobacter pylori, ktorý je u človeka pôvodcom chronickej gastritídy, peptických vredov (žalúdočných alebo duodenálnych), adenokarcinómu žalúdka a MALT lymfómu, ktorý je pomaly rastúcim, tzv. indolentným typom lymfómu. Barry J. Marshall a J. Robin Warren výsledky svojej práce o H. pylori prezentovali prvýkrát v Bruseli v roku 1983 na II. medzinárodnom pracovnom zasadnutí o kampylobakterových infekciách. 243

Neskôr, v roku 2005 obidvaja získali „za ich objav baktérie Helicobacter pylori a jej úlohy pri zápale žalúdka a žalúdočnom vrede“ Nobelovu cenu za fyziológiu alebo medicínu10,11. Tab. 6.1 Príklady nových, resp. existujúcich bakteriálnych pôvodcov infekčných chorôb človeka s novými, resp. ďalšími faktormi virulencie zaznamenané od 2. polovice 70-tych rokov Patogén Choroba Legionella pneumophila Legionárska choroba Salmonella enterica subsp. enterica Salmonelóza sérovar Typhimurium fagotyp DT 104 Borreliella burgdorferi sensu lato komplex Lymská choroba (borelióza) Escherichia coli O157:H7 Hemoragická kolitída; hemolyticko-uremický syndróm; trombocytopenická purpura Helicobacter pylori Chronická gastritída; peptické vredy (žalúdočné alebo Ehrlichia chaffeensis duodenálne); adenokarcinóm žalúdka a MALT (Mucosa Associated Lymphoid Tissue) lymfóm Humánna monocytárna ehrlichióza Vibrio cholerae O139 Cholera Staphylococcus aureus Stafylokokový syndróm toxického šoku Streptococcus pyogenes Streptokokový syndróm toxického šoku Clostridioides difficile Postantibiotická kolitída; pseudomembranózna kolitída; toxický megakolón Meticilín rezistentné kmene Nozokomiálne a komunitné infekcie Staphylococcus aureus (MRSA = Methicilin Resistant S. aureus) Nozokomiálne infekcie Vankomycín rezistentné kmene enterokokov (VRE = Vankomycin Resistant Enterococci), najmä kmene Enterococcus faecalis a Enterococcus faecium) Rezistentné formy tuberkulózy Multirezistentné kmene Mycobacterium tuberculosis Nozokomiálne infekcie Linezolid rezistentné kmene enterokokov Linezolid je účinný pri infekciách, ktoré sú vyvolané Gram- (najmä kmene Enterococcus faecalis pozitívnymi baktériami, vrátane MRSA, VRE a penicilín- rezistentných kmeňov Streptococcus pneumoniae. Až do a Enterococcus faecium) výskytu linezolid rezistentných enterokokov sa považoval za tzv. rezervné antibiotikum. Kmene Klebsiella pneumoniae a Bronchopneumónie; uroinfekcie; bakteriálne infekcie krvného Escherichia coli produkujúce laktamázy so riečiska (septikémia) vyvolané Klebsiella pneumoniae širokým spektrom účinku (ESBL = ESBL kmene Escherichia coli sú v 80 % prípadoch pôvodcami Extended Spectrum Beta Lactamases); infekcií močového traktu; pri ESBL kmeňoch E. coli existuje aj kmene rezistentné na cefalosporíny tretej nebezpečenstvo fluorochinolónovej rezistencie, pričom sa jedná generácie a ostatné betalaktámové zväčša o multirezistentné kmene antibiotiká Kmene Neisseria gonorrhoeae rezistentné Kvapavka na cefalosporíny tretej generácie a ostatné antibiotiká Multirezistentné kmene Pseudomonas Nozokomiálne infekcie aeruginosa a Acinetobacter baumannii Je pravdou, že H. pylori je novo objavenou baktériou, avšak chronickú gastritídu i peptické vredy nemôžeme považovať za nové choroby v tom pravom zmysle slova, nakoľko boli známe a študovali sa už dávno predtým12. Prevládalo však dlho presvedčenie, že žiadna baktéria 244

nemôže kolonizovať žalúdok a navyše, akékoľvek pokusy izolovať zo žalúdka baktérie sa míňali účinku, nakoľko použité izolačné postupy i kultivačné metódy neboli vhodné. V roku 1987 bol v USA popísaný prvý prípad monocytárnej ehrlichiózy človeka. Jej pôvodcom bola Ehrlichia canis13. Neskôr, v roku 1990, bola z krvi bývalého vojaka z Fort Chaffeer (vojenské výcvikové centrum v Arkansase, USA) izolovaná Ehrlichia chaffeensis14. Pôvodcom monocytárnej ehrlichiózy človeka môže byť aj E. muris15. V októbri roku 1992 vzplanula epidémia cholery v Bengálsku (názov historickej oblasti a etno- lingvistického regiónu, ktorý sa rozprestiera na území Bangladéša a indického štátu Západné Bengálsko), ktorá bola vyvolaná novým sérotypom označeným ako O139. Vibrio cholerae O139 je zároveň aj prvým non O1 vibriom, ktoré je schopné vyvolať choleru16. I napriek veľkému počtu sérotypov Vibrio cholerae, iba V. cholerae sérotypu O1 a V. cholerae non O1 sérotypu O139 sú primárne spojené s klinickými prípadmi cholery, ktoré majú schopnosť vyvolávať pandémie. Klasickým príkladom znovuobjavujúcej sa nákazy je tuberkulóza. Z celosvetového hľadiska sa tuberkulóza radí na 3. miesto najrozšírenejších infekcií človeka, ihneď za maláriou a leprou a patrí medzi jednu z Top10 príčin úmrtí človeka. Odhaduje sa, že za ostatných 100 rokov zomrelo na tuberkulózu asi 100 miliónov ľudí. V roku 2015 bolo vo svete zaznamenaných 10,4 milióna nových prípadov tuberkulózy človeka. Takmer 2 milióny z nich zomrelo. Z uvedených 10,4 milióna nových prípadov bolo 1,2 milióna prípadov tuberkulózy (11 %) u HIV pozitívnych pacientov žijúcich väčšinou (až 60 % prípadov) v Indii, Indonézii, Číne, Pakistane a štátoch južnej a strednej Afriky. Obdobná situácia s výskytom nových prípadov tuberkulózy sa zopakovala aj v roku 2016, pričom v obidvoch uvedených rokoch sa na vzniku tuberkulózy v 0,5 milióna prípadoch podieľali multirezistentné kmene M. tuberculosis. Pre porovnanie, na Slovensku je každoročne hlásených 5 – 6 nových prípadov tuberkulózy na 100 000 obyvateľov (v rámci Slovenska je to ročne okolo 250 – 320 nových prípadov tuberkulózy), v krajinách EU/EEA je to 11 nových prípadov tuberkulózy na 100 000 obyvateľov ročne s relatívne veľkými regionálnymi rozdielmi (2,5/100 000 na Islande, 5,45/100 000 na Slovensku a 79,7/100 000 v Rumunsku za rok 2016), v Indii, Pakistane, Mongolsku, Kazachstane a v krajinách juhovýchodnej Ázie bola v roku 2015 celková miera notifikácie 200 – 299/100 000, v Číne a štátoch strednej a južnej Afriky bolo 300 a viacej nových prípadov tuberkulózy na 100 000 obyvateľov17,18. 245

V krajinách s vysokou incidenciou tuberkulózy sa vo viac ako 85 % vyskytuje pľúcna forma tuberkulózy a v krajinách s nízkou incidenciou je viac mimopľúcnej formy, najmä u HIV pozitívnych pacientov a imigrantov z endemických oblastí výskytu tuberkulózy. Kým v krajinách Európskej únie je od roku 2005 zaznamenaný pomalý a nepretržitý klesajúci trend výskytu tuberkulózy, na celosvetovej úrovni je od roku 2013 zaznamenaný jej vzostup. Súvisí to nielen s nárastom počtu HIV pacientov a ich následnou infekciou komplexom Mycobacterium tuberculosis, ale súvisí to aj s nárastom počtu rezistentných kmeňov M. tuberculosis voči používaným antituberkulotikám19,20. V ostatnom desaťročí narastá počet infekcií vyvolaných Brucella canis medzi chudobnými a sociálne veľmi slabými vrstvami obyvateľstva, žijúcimi v mestských slumoch, v ktorých sa pohybuje veľké množstvo túlavých psov. Jej prejavom býva najčastejšie endokarditída a peritonitída21. Inou špecifickou skupinou ľudí vnímavých voči infekcii Brucella canis sú imunosupresívni jedinci, ľudia s metabolickými poruchami alebo chronickými zápalovými procesmi (napr. pri infekcii HIV, Gaucherovej chorobe, Guillain-Barrého syndróme, endokarditíde a pod.)22. Do skupiny nových a znovuobjavujúcich sa ochorení rátame aj infekcie vyvolané bartonelami, tzv. bartonelózy23,24 . 6.1.2 Pôvodcovia rezistentných foriem nákaz Medzi príklady doposiaľ existujúcich bakteriálnych pôvodcov infekčných chorôb, ktorí nadobudli význam zmenou svojich faktorov virulencie, patria najmä viaceré skupiny baktérií, ktoré sa stali rezistentnými voči rôznym antibiotikám. Medzi najdôležitejšie z nich patria meticilín rezistentné kmene Staphylococcus aureus, vankomycín rezistentné enterokoky, ESBL kmene Escherichia coli a Klebsiella pneumoniae, multirezistentné kmene Mycobacterium tuberculosis, kmene Neisseria gonorrhoeae rezistentné na cefalosporíny tretej generácie a ostatné antibiotiká, prípadne ďalšie (Tab. 6.1). Najčastejšie sa vyskytujúce multirezistentné patogény sa označujú tiež ako „ESKAPE“, akronym odvodený od: Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa a Enterobacter spp.25. Veľký význam sledovaniu rezistencie na antiinfekčné liečivá prikladá aj Svetová zdravotnícka organizácia, pričom za najzávažnejšie problémy rezistencie v komunite považuje rezistenciu: a) Streptococcus pneumoniae na penicilín a ostatné antibiotiká (tzv. multidrug rezistentné pneumokoky); b) Staphylococcus aureus na meticilín (v našich podmienkach oxacilín); 246

c) Mycobacteriium tuberculosis na antituberkulotiká; cefalosporíny, d) Neisseria gonorrhoeae na betalaktámy a chinolóny; e) Escherichia coli na fluorované chinolóny, betalaktamázostabilné aminopenicilíny a kotrimoxazol; f) Haemaphilus influenzae na nechránené aminopenicilíny a g) Streptococcus pyogenes na makrolidové antibiotiká. 6.1.3 Pôvodcovia nákaz vyvolaných bakteriálnymi kmeňmi s novými faktormi virulencie Príkladom infekcií, keď existujúci patogén, resp. potenciálny patogén si priberie ďalšie faktory virulencie a stane sa hrozbou, sú pôvodcovia stafylokokového a streptokokového syndrómu toxického šoku. Stafylokokový syndróm toxického šoku bol pôvodne popísaný v USA v roku 1978 u siedmich detí a tínedžerov vo veku od 8 do 17 rokov26 . Príčinou stafylokokového syndrómu toxického šoku sú kmene Staphylococcus aureus, ktoré produkujú buď toxín syndrómu toxického šoku 1 (TSST-1 = Toxic Shock Syndrome Toxin 1) alebo stafylokokový enterotoxín A, B a C, výnimočne D alebo E27. Streptokokový syndróm toxického šoku (STSS = Streptococcal Toxic Shock Syndrome) bol prvýkrát popísaný v roku 1987 v USA u dvoch pacientov28. STSS je závažným ochorením spojeným s invazívnou alebo neinvazívnou infekciou streptokokov skupiny A (Streptococcus pyogenes) a môže sa rozvinúť na akomkoľvek mieste organizmu. Najčastejšie je však spojený s infekciou kože. Príčinou streptokokového syndrómu toxického šoku sú kmene Streptococcus pyogenes, ktoré produkujú streptokokový pyrogénny exotoxín A, B, C a mitogénny exotoxín. Ďalším príkladom patogéna s novými faktormi virulencie je Salmonella Typhimurium fagotyp DT 104 a enterohemoragická Escherichia coli O157:H729. Salmonella enterica subsp. enterica sérovar Typhimurium fagotyp DT 104 bola izolovaná z hovädzieho dobytka v Anglicku začiatkom roka 1980. V 90-tych rokoch minulého storočia došlo k rýchlemu rozšíreniu tohto zoonotického fagotypu salmonely do ostatných krajín Európy, najmä Nemecka, Francúzska a USA30-32. Význam fagotypu DT 104 nespočíva iba v jeho schopnosti prenášať sa z viacerých druhov hospodárskych zvierat (najmä z hovädzieho dobytka, ošípaných, oviec a hydiny) na človeka, ale aj v jeho rezistencii voči klinicky 247

významným skupinám antibiotík zo skupiny chinolónov a cefalosporínov a voči sulfónamidom29. V roku 1982 bola prvýkrát potvrdená aj Escherichia coli O157:H7 ako patogén kontaminujúci potraviny pri infekcii ľudí v štáte Michigan a Oregon (USA), ktorí sa infikovali v zariadení rýchleho občerstvenia konzumáciou nedostatočne tepelne opracovaného hamburgera33. Následne sa objavovali a boli identifikované nové epidémie na území USA a Európy, neskôr i na všetkých ostaných kontinentoch34,35. Príkladom bakteriálneho druhu, ktorý bol pôvodne považovaný za nepatogénny, ale stal sa virulentným po prevzatí nových faktorov virulencie, je nepochybne Clostridioides difficile. C. difficile bolo prvýkrát izolované už v roku 1935 zo stolice novonarodených detí pri štúdiu denných zmien ich bakteriálnej mikroflóry36. Ešte v 60-tych i 70-tych rokoch minulého storočia bolo C. difficile stále považované za normálnu súčasť intestinálnej mikroflóry človeka, i napriek tomu, že bolo izolované pri viacerých, najmä nemocničných infekciách37. V roku 1978 boli však už publikované prvé tri štúdie pseudomembranóznej kolitídy dávané do súvislosti s infekciou C. difficile. Od konca 70-tych do začiatku 80-tych rokov minulého storočia bolo preukázané, že pôvodcom pseudomembranóznej kolitídy je C. difficile, najmä u pacientov po predchádzajúcej antibiotickej liečbe a jej príčinou sú dva toxíny. Jeden vykazoval enterotoxickú (TcdA) a druhý cytotoxickú aktivitu (TcdB)38,39. 6.1.4 Pôvodcovia bakteriálnych zoonóz – chorôb prenosných zo zvierat na človeka Medzi ďalšiu významnú skupinu bakteriálnych patogénov môžeme zaradiť pôvodcov zoonóz, chorôb prenosných zo zvierat na človeka40. Odhaduje sa, že 60 % známych infekčných chorôb a až 75 % nových alebo novoobjavujúcich sa infekčných chorôb je zoonotického pôvodu41,42. Značná časť zoonóz patrí k zoonózam bakteriálneho pôvodu. 6.1.4.1 Pôvodcovia bakteriálnych alimentárnych nákaz, alimentárnych intoxikácií alebo alimentárnych toxoinfekcií zoonotického charakteru K významným zoonózam patria aj niektoré choroby z potravín (z angl. „foodborne diseases“), ktoré môžu mať charakter alimentárnej nákazy, alimentárnej intoxikácie alebo alimentárnej toxoinfekcie (Tab. 6.2). V rámci Európskej únie medzi najvýznamnejšie alimentárne nákazy, ktoré majú zoonotický charakter, patrí kampylobakterióza, salmonelóza, infekcie vyvolané Shiga toxín produkujúcimi kmeňmi Escherichia coli, yersinióza a listerióza43,44. 248

Tab. 6.2 Významní pôvodcovia bakteriálnych alimentárnych nákaz, alimentárnych intoxikácií alebo alimentárnych toxoinfekcií Pôvodca Cesta/Prameň infekcie Choroba Alimentárne nákazy Camplylobacter jejuni subsp. Najčastejšie konzumáciou kontaminovanej Kampylobakterióza a tepelne neupravenej alebo nedostatočne (gastroenteritída, septikémia, jejuni a Camplylobacter coli tepelne upravenej potravy, nepasterizovaného (90 % infekcií človeka)a polyneuropatie) Salmonella Enteritidis mlieka alebo kontaminovanej vody Salmonelóza (salmonelová a Salmonella Typhimuriumb gastroenteritída) Najčastejšie konzumáciou kontaminovanej a tepelne neupravenej alebo nedostatočne tepelne upravenej potravy živočíšneho pôvodu; fekálne kontaminovaná voda a zelenina; priamy kontakt s plazmi, obojživelníkmi a hydinou a ďalšími zvieratami Salmonella Choleraesuis Extraintestinálna forma salmonelózy vzniká ako Extraintestinálna forma a Salmonella Dublinc dôsledok salmonelovej bakteriémie salmonelózy (bakteriémia s fokálnymi léziami, najčastejšie sa jedná o endokarditídu alebo septickú tromboflebitídu) Yersinia enterocoliticad Najčastejšie konzumáciou nedostatočne tepelne Enterokolitída; lymfadenitída upraveného kontaminovaného mäsa, mezenteriálnych lymfatických Yersisnia pseudotuberculosis nepasterizovaného mlieka, mliečnych výrobkov uzlín (pseudoapendicitída); a zeleninových šalátov najčastejšie u detí. Najčastejšie konzumáciou potravín alebo vody, Lymfadenitída mezenteriálnych ktoré boli kontaminované féces latentne lymfatických uzlín; infikovaných nosičov, najčastejšie hlodavcov enterokolitída (akútna ileitída); Escherichia coli O157:H7e a voľne žijúcich vtákov vzácne septikémia Najčastejšie konzumáciou kontaminovaných Široké spektrum ochorení a tepelne nedostatočne opracovaných potravín človeka od nekomplikovanej živočíšneho pôvodu, najmä hovädzieho mäsa, vodnatej hnačky, cez hnačku nepasterizovaného mlieka a výrobkov z neho; s prímesou krvi, až po taktiež konzumáciou kontaminovaných potravín hemoragickú kolitídu, rastlinného pôvodu, ktoré neboli dostatočne hemolyticko-uremický syndróm umyté alebo tepelne opracované ako aj pitie a trombocytopenickú purpuru kontaminovanej pitnej vody a kúpanie sa vo vodných zdrojoch kontaminovaných zvieracím Listeria monocytogenes trusom Gastroenteritída; meningitída, K infekcii dochádza najčastejšie ingesciou resp. meningoencefalitída; býva spojená so septikémiou; L. monocytogenes kontaminovanou potravou u gravidných žien môže infekcia prebiehať ako chrípke podobné Bacillus cereus Konzumáciou jedla dochádza aj k ingescii ochorenie s infekciou plodu vegetatívnych foriem alebo spór B. cereus, Gastroenteritída ktoré v tenkom čreve vyklíčia, produkujú termolabilné enterotoxíny a vyvolajú gastroenteritídu Plesiomonas shigelloides Najčastejšie požitím kontaminovej vody alebo Gastroenteritída konzumáciou surových rýb, ustríc, prípadne a extraintestinálne infekcie, ďalších morských mäkkýšov kontaminovaných najmä u novonarodených detí, imunosupresívnych pacientov a P. shigelloides pacientov s hepatobiliárnou Aeromonas hydrophila Pitím, resp. konzumáciou kontaminovanej vody, chorobou potravín, najmä rýb, morských produktov, mäsa, Gastroenteritída mlieka, mliečnych výrobkov a čerstvej zeleniny Vibrio parahaemolyticus Po konzumácii surových alebo tepelne Vibriózy – gastroenteritídy V. vulnificus, V. mimicus nedostatočne opracovaných morských kôrovcov človeka V. fluvialis a V. furnissii 249

(krevety, homáre, kraby a raky), prípadne iných morských živočíchov, vrátane rýb Arcobacter butzleri Pravdepodobne konzumáciou kontaminovaných Gastroenteritída potravín alebo vody Streptobacillus moniliformis Najčastejšie konzumáciou kravského mlieka Haverhillská horúčkaf kontaminovaného močom hlodavcov Ďalšie zoonózy prenosné aj alimentárnou cestou Brucella abortus Najčastejšie konzumáciou nepasterizovaného Brucelóza Brucella melitensis mlieka alebo mliečnych výrobkov z neho vyrobených Leptospira spp. Po vypití kontaminovanej vody; prípadne Leptospiróza konzumáciou mlieka od zvieraťa (najčastejšie Coxiella burnetii krava, ovca) pri akútnej infekcii Q-horúčka Po konzumácii nepasterizovaného mlieka alebo mliečnych výrobkov z neho vyrobených Mycobacterium bovis Po konzumácii nepasterizovaného mlieka alebo Tuberkulóza (tzv. mimopľúcna Mycobacterium avium subsp. mliečnych výrobkov z neho vyrobených; forma tuberkulózy) paratuberculosis pri zoonotickej tuberkulóze prevláda orálna cesta infekcie i nález je obyčajne mimopľúcny Orofaryngeálna alebo Francisella tularensis intestinálna forma tularémie h subsp. tularensisg Po požití kontaminovanej potravy (vrátane Francisella tularensis surového kontaminovaného mlieka) alebo vody, prípadne zanesením špinavými rukami do úst subsp. holoarctica Po ingescii pôvodcu nákazy Melioidóza (Pseudomalleus) Bulkholderia pseudomallei Gastrointestinálna forma Bacillus anthracis Po ingescii pôvodcu nákazy, najčastejšie po konzumácii kontaminovaných a tepelne antraxu; predstavuje asi 5 % neupravených alebo nedostatočne tepelne výskytu antraxu u ľudí upravených produktov (najmä mäso, mlieko) živočíšneho pôvodu získaných z infikovaných alebo na antrax chorých zvierat Alimentárne intoxikácie Staphylococcus aureus Po požití jedného alebo viacerých Stafylokoková enterotoxikóza stafylokokových enterotoxínov, ktoré sú už Bacillus cereus naprodukované v jedle Alimentárna intoxikácia Clostridium botulinum (otrava z potravín) Alimentárne toxoinfekcie Po požití emetického toxínu (cereulid) Alimentárny botulizmus B. cereus, ktorý je už naprodukovaný v jedle Po požití botulotoxínu s potravou Clostridium perfringens typ Ai Konzumáciou jedla dochádza aj k ingescii Klostrídiová enterotoxikóza vysporulovaných, vegetatívnych foriem C. perfringens typu A, ktoré následne v čreve opäť za anaeróbnych podmienok sporulujú, pričom pri rozpade materských buniek a uvoľnení spór dochádza aj k uvoľňovaniu enterotoxínu a vzniku enterotoxikózy Clostridium botulinumi K intestinálnemu botulizmu dochádza po Intestinálny botulizmus: konzumácii potravy, ktorá je kontaminovaná - dojčenský botulizmus spórami (menej pravdepodobne vegetatívnymi (orálna toxoinfekcia do formami) C. botulinum, C. butyricum alebo veku 9 – 12 mesiacov)j, C. baratii. Následne dochádza v intestinálnom - intestinálny botulizmus trakte ku germinácii spór a k produkcii dospelých botulínového neurotoxínu in situ (na pôvodnom mieste) a = Menej závažné intestinálne infekcie človeka vyvoláva a určité potenciálne riziko predstavuje Campylobacter fetus subsp. fetus, C. fetus subsp. testudinum, C. upsaliensis, C. lari subsp. lari, C. sputorum, C. concisus, C. hyointestinalis subsp. hyointestinalis, C. hyointestinalis subsp. lawsonii a C. insulaenigrae. Kampylobakterióza je najčastejšie hlásenou gastrointestinálnou infekciou bakteriálneho pôvodu v EÚ od roku 2005 a od roku 2011 i na Slovensku. 250