sa uvoľňujú do extracelulárneho priestoru. Pre transport látok vo vnútri bakteriálnej bunky sa používa všeobecne pojem sekrécia. Iné produkty však môžu byť transportované špecializovanými molekulárnymi komplexmi priamo do cytoplazmy eukaryotickej bunky, prípadne susedných bakteriálnych buniek. Pre tento typ transportu, v ktorom sa uplatňujú sekrečné systémy typu III, IV a VI, používame pojem translokácia a takto prenášané molekuly sa nazývajú efektory. Situácia je pomerne jednoduchá u Gram-pozitívnych baktérií, kde v ceste stojí len jedna membrána. Naopak, Gram-negatívne baktérie musia pri sekrécii svojich produktov naviac prekonávať periplazmatický priestor a druhú vonkajšiu membránu, a preto si vytvorili mnoho značne sofistikovaných štruktúr, ktoré majú často priamy vzťah k virulencii a zasluhujú si viac pozornosti. Väčšina Gram-pozitívnych baktérií si vystačí s jednoduchými univerzálnymi systémami. Výnimku tvoria mykobaktérie, ktorých silná voskovitá bunková stena predstavuje obtiažnu prekážku. Mykobaktérie si vytvorili zvláštny, doposiaľ nepresne charakterizovaný sekrečný systém typu VII (T7SS). Gram-negatívne aj Gram-pozitívne baktérie, ale aj Archaea a eukaryoty zdieľajú dva univerzálne systémy sekrécie: tzv. sec (general secretion) a tat (two- arginine translocation). Zatiaľ čo u Gram-pozitívnych baktérií slúžia tieto systémy k sekrécii cez ich jedinú membránu, u Gram-negatívnych baktérií končia takto transportované molekuly v periplazmatickom priestore. Rozdiely medzi týmito systémami nie sú zásadne významné; sec systém transportuje proteíny v rozpustnom stave za súčasnej hydrolýzy ATP a protónového gradientu, tat systémom sa prenášajú proteíny priestorovo usporiadané s využitím len protónového gradientu. Líšia sa tiež špecifickou N-terminálnou signálnou peptidovou sekvenciou. Dôležité však je, že ak sa u Gram-negatívnych baktérií, má proteín dostať von z bunky, musí v tejto fáze nadväzovať iný systém (tzv. sec-dependentný) alebo musí byť primárne využitý iný systém, prekonávajúci vnútornú aj vonkajšiu membránu a periplazmatický priestor. 3.2 SEKREČNÉ SYSTÉMY GRAM-NEGATÍVNYCH BAKTÉRIÍ Množstvo Gram-negatívnych baktérií sa pri sekrécii proteínov ako faktorov virulencie spolieha výhradne na určité sekrečné systémy, ktoré zabezpečujú transport proteínov von z bunky alebo v niektorých prípadoch priamo do cytoplazmy eukaryotickej alebo prokaryotickej cieľovej bunky. Extracelulárna sekrécia proteínov pre Gram-negatívne baktérie je pomerne zložitým procesom, keďže tieto vylučované proteíny musia prechádzať cez dve (a v niektorých prípadoch cez tri) fosfolipidové membrány, aby dosiahli cieľové miesto svojho určenia (Obr. 51
3.1). Niektoré secernované proteíny v Gram-negatívnych baktériách prechádzajú týmito membránami v dvoch samostatných krokoch, kde sa najprv dostávajú do periplazmy cez sekrečný systém Sec alebo Tat a potom sú prenesené cez vonkajšiu membránu a druhý transportný systém. Tento proces je známy ako Sec- alebo Tat-závislá sekrécia proteínov. Okrem toho sa mnohé ďalšie proteíny vylučujú cez kanály, ktoré obsiahnu vnútorné aj vonkajšie bakteriálne membrány prostredníctvom procesu známeho ako Sec- alebo Tat- nezávislá sekrécia proteínov. Najčastejšie sú Gram-negatívnymi baktériami využívané sekrečné systémy typu I až VI, pričom každý systém transportuje špecifickú podskupinu proteínov. Tieto všetky systémy sa spoliehajú na β-barelové (doménové) kanály, ktoré vo vonkajšej membráne bakteriálnej bunky tvoria kruh, ale zvyčajne vykazujú značnú štrukturálnu či funkčnú rozmanitosť1. Obr. 3.1 V súčasnosti známe a popísané sekrečné systémy baktérií (Trivedi a kol. 2022; upravené)27. Grafické znázornenie v súčasnosti známych a popísaných systémov sekrécie bakteriálnych proteínov od typu 1 po typ 11 a ich lokalizácia vo vonkajšej membráne – „outer membrane“ (OM) a cytoplazmatickej membráne (CM). Okrem T7SS (využívaného pri Gram-pozitívnych baktériách) sa všetky vyššie uvedené sekrečné systémy nachádzajú pri Gram-negatívnych baktériách. Sekrécia proteínov pomocou T7SS sa nachádza napríklad u niektorých zástupcov kmeňa Actinobacteria, ktoré majú vonkajšiu lipidovú vrstvu. 3.2.1 Sekrécia cez cytoplazmatickú membránu Sekrečné systémy sú využívané predovšetkým na transport proteínov z bakteriálnej bunky do prostredia alebo do recipientnej bunky. Avšak proteíny môžu byť sekretované aj z bakteriálneho cytoplazmatického kompartmentu do iných kompartmentov bunky, najmä do- alebo cez cytoplazmatickú membránu. Dráha všeobecnej sekrécie (Sec) a dvojitá translokačná dráha arginínu (Tat) sú najčastejšie používanými bakteriálnymi sekrečnými systémami pre 52
transport proteínov cez cytoplazmatickú membránu6. Sec a Tat dráhy sú najkonzervovanejšie mechanizmy sekrécie proteínov a boli identifikované vo všetkých oblastiach života (baktérie, archaea a eukaryota)7,8. Obidve dráhy sú spoločným prvým krokom pre všetky dvojkrokové sekrečné mechanizmy2. Väčšina bielkovín transportovaných dráhami Sec a Tat zostáva vo vnútri bunky, buď v periplazme resp. vnútornej membráne. Avšak, u Gram-negatívnych baktérií sú proteíny transportované do cytoplazmatickej membrány alebo periplazmy bunky dráhami Sec alebo Tat a môžu zostať v týchto miestach alebo môžu byť transportované mimo bunky pomocou iného sekrečného systému. Aj keď systémy Sec a Tat majú niekoľko spoločných prvkov, prenášajú proteíny zásadne odlišnými mechanizmami. 3.2.1.1 Sekrečná dráha Sec Dráha Sec sa nazýva aj ako všeobecná dráha sekrécie proteínov (GSP = General Secretion of Proteins) a primárne translokuje proteíny v ich rozvinutom stave. Primárne je zodpovedná za sekréciu väčšiny proteínov cez cytoplazmatickú membránu alebo ich integráciu do bunkovej membrány. Tento systém pozostáva z troch častí: zložky zameranej na proteín, motorického proteínu a membránovo-integrovaného vodivého kanálu, nazývaného SecYEG translokáza7. Navyše, množstvo Gram-pozitívnych baktérií produkuje tiež doplnkové proteíny Sec, ktoré zohrávajú dôležitú úlohu pri sekrécii špecifických bielkovín. Zatiaľ čo proteíny vylučované aparátom Sec môžu plniť viaceré úlohy, množstvo proteínov, ktoré podporujú virulenciu bakteriálnych patogénov, je transportovaných práve touto dráhou. Patogény, ktoré využívajú sekréciu závislú od Sec na transport faktorov virulencie cez cytoplazmatickú membránu zahŕňajú Gram-negatívne baktérie ako Vibrio cholerae, Klebsiella pneumoniae a Yersinia enterocolitica9. Príklady Gram-pozitívnych patogénov, ktoré využívajú doplnkové systémy Sec, zahŕňajú Staphylococcus aureus alebo Listeria monocytogenes10. Export dráhou Sec závisí od hydrofóbnej signálnej sekvencie na N-konci sekretovaného proteínu, ktorý má zvyčajne dĺžku 20 aminokyselín a obsahuje 3 oblasti: kladne nabitý amino koniec, hydrofóbne jadro a polárny karboxylový koniec7. Proteíny, ktoré budú vylučované do periplazmy alebo mimo bunky dráhou Sec obsahujú SecB-špecifické signálne sekvencie, zatiaľ čo proteíny, ktoré majú zostať vo vnútornej membráne, obsahujú špecifickú signálnu sekvenciu, tzv. časticu rozpoznávajúcu signál (SRP = Signal Recognition Particle). 53
Dráha SecB U mnohých Gram-negatívnych baktérií proteíny, určené na transport do periplazmy alebo von z bunky, obsahujú odstrániteľnú signálnu sekvenciu rozpoznávanú proteínom SecB (Obr. 3.2 A). Tento proteín slúži ako chaperón, viaže sa na predsekrečné proteíny a bráni ich skladaniu11. SecB potom dodáva svoje substráty do SecA, multifunkčného proteínu a spoločne vedú proteíny do kanála SecYEG, a tiež slúžia ako ATPáza, ktorá poskytuje energiu na translokáciu proteínov12. Pred transportom cez kanál proteázový proteín odštiepi signálnu sekvenciu SecB z proteínu a sekretovaný proteín sa potom pri doručení do periplazmy nachádza v zloženej forme13. Zatiaľ čo mnohé proteíny doručované SecB systémom zostávajú v periplazme, niektoré sa nakoniec stanú extracelulárnymi. Ak sú raz tieto proteíny dopravené do periplazmy, môžu byť transportované cez vonkajšiu membránu pomocou sekrečných systémov typu II alebo typu V. Dráha SRP Systém Sec môže tiež transportovať proteíny, ktoré majú zostať vo vnútornej membráne prostredníctvom dráhy SRP, čo znamená častica rozpoznávajúca signál (SRP = Signal Recognotion Particle) (Obr. 3.2 B). Obr. 3.2 Sekrécia proteínov sekrečnou dráhou Sec (Green a Mecsas 2016; upravené)1. Pri baktériách dráha Sec transportuje proteíny v rozvinutom stave (jednoduché proteíny) cez cytoplazmatickú membránu. Proteíny vylučované touto cestou sa uvoľnia do periplazmy (A) alebo môžu byť zabudované do vnútornej membrány (B). 54
Transmembránové proteíny často obsahujú hydrofóbne domény, a preto sú nestabilné, keď sú cytoplazmatické. Z tohto dôvodu sekrécia SRP dráhou využíva kotranslačný mechanizmus exportu, ktorý spája transláciu proteínu na ribozóme so sekréciou cez kanál SecYEG. Dráha SRP záleží na častici SRP, ktorá obsahuje malú 4,5S RNA naviazanú na proteín nazývaný Ffh14. Počas sekrécie proteínu touto cestou sa SRP najskôr viaže na transmembránovú doménu proteínov, keď sa uvoľňujú z ribozómu15. SRP potom viaže tzv. dokovací proteín FtsY, ktorý dopraví komplex ribozóm-proteín do kanála SecYEG7. Translácia proteínu potom riadi sekréciu vznikajúceho proteínu cez kanál. Počas tohto procesu transmembránová doména proteínu uniká cez stranu (pozdĺž) kanálu do membrány, kde zostáva pripojená16. Mechanizmus tohto posledného kroku zatiaľ nie je známy. 3.2.1.2 Sekrečná dráha Tat Na rozdiel od dráhy Sec, dráha Tat primárne vylučuje zložené proteíny a jej skratka je odvodená od anglického označenia Twin arginine translocation (Dvojitá arginínová translokácia)8 (Obr. 3.3). Obr. 3.3 Sekrécia proteínov sekrečnou dráhou Tat (Green a Mecsas 2016; upravené)1. Baktérie vylučujú zložené proteíny cez cytoplazmatickú membránu pomocou sekrečnej dráhy Tat. Táto dráha pozostáva z dvoch alebo troch zložiek (TatA, TatB a TatC). Zložené proteíny sú potom translokované cez kanál a do periplazmy. Táto dráha je rozhodujúca, pretože nie všetky proteíny môžu byť sekretované v ich rozloženom stave, ako napr. určité proteíny, ktoré obsahujú posttranslačné modifikácie, ku ktorým patria napríklad redoxné faktory syntetizované v cytoplazme17. Materiály, potrebné na tieto modifikácie, by neboli dostupné extracelulárne alebo v periplazme, a preto musia byť tieto proteíny poskladané a modifikované v cytoplazme ešte pred sekréciou v ich trojrozmernom stave. Dráha sekrécie proteínu Tat pozostáva z 2-3 podjednotiek: TatA, TatB a TatC (pri Gram- pozitívnych baktériách, sú podjednotky TatA a TatB spojené do jedného multifunkčného 55
proteínu)18,19. Pri Escherichia coli sa TatB a TatC viažu na signálny peptid proteínov sekretovaných Tat a potom získavajú TatA, ktorý tvorí kanál preklenujúci membránu. Sekvencia signálu Tat obsahuje pár „dvojitých“ arginínov v motíve S-R-R na N-konci zloženého proteínu20. Zatiaľ čo väčšina proteínov vylučovaných Tat systémom pri Gram- pozitívnych baktériách sa uvoľňuje extracelulárne, proteíny vylučované rovnakým spôsobom pri Gram-negatívnych baktériách môžu buď zostať periplazmatickými alebo sú transportované von z bunky sekrečným systémom typu II. Kým sekrečná dráha Tat je dôležitá pre fyziológiu a prežitie patogénnych aj nepatogénnych baktérií, množstvo patogénnych baktérií, vrátane Pseudomonas aeruginosa21, Yersinia pseudotuberculosis22 alebo Escherichia coli O157:H723 vyžaduje funkčnú Tat dráhu pre zabezpečenie plnej virulencie pri animálnych infekčných modeloch. Enzýmy ako fosfolipázy C sú pozoruhodným príkladom proteínov vylučovaných dráhou Tat a slúžia ako faktory virulencie pre mnoho patogénov vrátane Pseudomonas aeruginosa21, Legionella pneumophila24 a Mycobacterium tuberculosis25. Tab. 3.1 Prehľad sekrečných systémov (Green a Mecsas 2016)1 Sekrečný Sekrečný signál Počet krokov Zložené substráty Počet Skupina membrán baktérií systém počas sekrécie (proteíny) 1 G+ aj G- 1 G+ aj G- Sec N-koniec 1 Nie 2 G- Tat N-koniec 1 Áno 1 G- 2–3 G- T1SS C-koniec 1 Nie 2–3 G- T2SS N-koniec Áno 1 G- T3SS N-koniec 2 2–3 G- 1–2 Nie 1 G+ 1 G+ T4SS C-koniec 1 Nie 1 G+ T5SS N-koniec 2 Nie 1–3 G+ T6SS Neznáme Neznámy sek. signál 1 SecA2 N-koniec 1 Nie Sortáza N-koniec (Sec) 2 Áno Injektozóm C-koniec (cws) 2 Áno T7SS N-koniec 1 Áno C-koniec Tieto enzýmy, štiepiace fosfolipidy, poskytujú patogénnym baktériám množstvo funkcií počas infekčného procesu, vrátane inhibície aktivity imunitných buniek a podpory intracelulárneho prežívania26. 3.2.2 Sekrečný systém typu I Sekrečné systémy typu I (T1SS) boli popísané u mnohých Gram-negatívnych baktérií, vrátane patogénov rastlín a živočíchov, kam transportujú svoje substráty jednokrokovým procesom (Obr. 3.1) cez vnútornú aj vonkajšiu bakteriálnu membránu28. Na rozdiel od iných proteínových 56
transportných systémov nachádzajúcich sa pri Gram-negatívnych baktériách, T1SS sa veľmi podobajú veľkej rodine ATP-viažucej kazety (ABC) transportérov (tzv. efluxné pumpy), ktoré exportujú malé molekuly, ako sú antibiotiká a toxíny von z bunky29. Tým prispievajú k rezistencii baktérií voči antibiotikám30. Niektoré baktérie môžu mať niekoľko T1SS, z ktorých každý je určený na transport jedného alebo niekoľkých jednoduchých (rozvinutých) bielkovinových substrátov31. Tieto substráty majú rôzne funkcie a zahŕňajú tráviace enzýmy, ako sú proteázy a lipázy, ale aj adhezíny, viažuce hém proteíny a proteíny s tzv. repeats-in- toxins (RTX) motívmi. Substráty T1SS sú všeobecne Sec-nezávislé a zvyčajne, ale nie vždy, obsahujú C-koncovú signálnu sekvenciu, ktorá je rozpoznaná T1SS systémom a zostáva nerozštiepená. T1SS má tri základné štruktúrlne zložky: ABC transportný proteín vo vnútornej membráne, membránový fúzny proteín (MFP), ktorý prechádza cez vnútornú membránu a premosťuje na faktor vonkajšej membrány (OMF) vo vonkajšej membráne28. Zložka ABC transportéra spojená s T1SS má niekoľko dôležitých funkcií – katalyzuje ATP pre poskytovanie energie na transport substrátu, interaguje s MFP a zúčastňuje sa na rozpoznávaní substrátu32. MFP sa spája s transportérom ABC vo vnútornej membráne a prekleňuje periplazmu, aby sa spojila s OMF33,34,35. Okrem toho, predpokladá sa, že cytoplazmaticky lokalizovaný N-koniec MFP zohráva úlohu vo výbere substrátu34,36. OMF vytvára pór vo vonkajšej membráne, cez ktorý proteínový substrát prechádza v rozloženom (rozvinutom) stave. ABC transportéry T1SS sú ďalej rozdelené do troch skupín na základe ich N-koncových sekvencií32. Jedna trieda ABC transportérov obsahuje C39 peptidázovú doménu, ktorá patrí do štruktúrnej nadčeľade papaínového motívu. C39 ABC transportéry, obsahujúce peptidázu, sú rozhodujúce pre rozpoznávanie a štiepenie N-koncov substrátov. Príkladom substrátu T1SS s C39 peptidázovou doménou je kolicín V produkovaný Escherichia coli37. Ďalšia trieda ABC transportérov obsahuje C39-podobnú peptidázovú doménu (CLD), ktorá nemá proteolytickú aktivitu, a preto neštiepi určené substráty38. Substráty ABC transportérov, obsahujúcich CLD, vo všeobecnosti obsahujú RTX motívy a sú oveľa väčšie ako tie, ktoré vylučuje peptidáza ABC obsahujúca C39 transportér. Je zaujímavé, že motívy RTX sa viažu na vápnik extracelulárne, ale nie na intracelulárnej úrovni. Pretože väzba vápnika podporuje skladanie týchto proteínov, tieto veľké substráty sú schopné zostať nezložené vo vnútri bunky39. Tretia trieda T1SS je zaujímavá tým, že ABC transportérom chýbajú akékoľvek ďalšie sekvencie v N-terminálnej doméne. Ich substráty môžu alebo nemusia obsahovať motívy RTX, ale majú menšiu veľkosť ako substráty transportované ABC transportérmi, obsahujúcimi CLD a na svojich C-koncoch obsahujú sekrečné signály31. 57
Substráty T1SS prispievajú k virulencii u rôznych bakteriálnych patogénov, vrátane Vibrio cholerae, ktorý používa svoj T1SS na vylučovanie toxínu MARTX (MARTX = Multifunctional Autoprocessing Repeats-in-Toxin)40 a Serratia marcescens, ktorá vylučuje hemofor HasA cestou T1SS33. Jeden z najlepšie preštudovaných substrátov T1SS je hemolyzínový proteín HlyA uropatogénnych Escherichia coli41,42,43. Tento toxín rodiny RTX sa vkladá do membrán erytrocytov aj jadrových eukaryotických buniek a spôsobuje ich lýzu41. Lýza (prasknutie) hostiteľských buniek pomocou HlyA môže byť baktériám nápomocná pri prechode slizničnými bariérami a navyše môže poškodiť efektorové imunitné bunky, čo bráni eliminácii infekcie. 3.2.3 Sekrečný systém typu II Sekrečné systémy typu II (T2SS) sú u väčšiny Gram-negatívnych baktérií konzervované, pričom transportujú zložené proteíny z periplazmy do extracelulárneho prostredia. Sú využívané rôznymi patogénnymi aj nepatogénnymi baktériami. Keďže kanál T2SS sa nachádza iba vo vonkajšej membráne (Obr. 3.1), proteíny, ktoré sú vylučované cez tento aparát, sa musia najskôr dostať do periplazmy využitím Sec alebo Tat dráhy, čo sú sekrečné systémy prenášajúce proteínové substráty cez vnútornú membránu. Tento sekrečný systém sa pôvodne nazýval hlavnou terminálnou vetvou Sec sekrečnej dráhy vzhľadom na jeho schopnosť exportovať proteíny transportované cez vnútornú membránu sekrečným systémom Sec9. Tento názov bol však odvtedy aktualizovaný na T2SS, čo odráža schopnosť týchto sekrečných systémov transportovať aj Tat-sekretované bielkoviny44. Pretože proteíny určené na sekréciu systémom T2SS musia najskôr prejsť cez Sec alebo Tat vnútorné membránové transportéry, T2SS substráty musia obsahovať štiepiteľnú signálnu sekvenciu typu Sec alebo Tat na ich N- koncoch9. Navyše, keďže T2SS vylučuje zložené substráty, proteíny transportované cez cytoplazmatickú membránu dráhou Sec musia byť zložené v periplazme ešte pred samotným exportom cez T2SS sekrečný systém. T2SS systémy sa vyznačujú vysokou špecifickosťou a sú schopné vylučovať rôznorodú škálu substrátov mimo bakteriálnej bunky, z ktorých niektoré prispievajú k virulencii bakteriálnych patogénov9. U niektorých druhov baktérií je T2SS potrebný na sekréciu viacerých substrátov, zatiaľ čo pri iných sa využíva iba na transport jedného proteínu45. Tieto vylučované proteíny majú celý rad biologických funkcií, ale vo všeobecnosti sú to enzýmy ako proteázy, lipázy a fosfatázy, ako aj niekoľko proteínov, ktoré spracovávajú sacharidy. T2SS sú komplexné a pozostávajú až z 15 rôznych proteínov, ktoré sa dajú rozdeliť do štyroch kompartmentov: 58
komplex vonkajšej membrány, platforma vnútornej membrány, sekrécia ATPázy a tzv. pseudopilus9. Ako už názov napovedá, komplex vonkajšej membrány sa nachádza vo vonkajšej membráne, kde slúži ako kanál, cez ktorý sú translokované zložené periplazmatické T2SS substráty. Tento kanál sa skladá z proteínu, nazývaného sekretín. Sekretín má dlhý N koniec, o ktorom sa predpokladá, že sa predlžuje celou dráhou až do periplazmy, aby nadviazal kontakt s ďalšími T2SS proteínmi vo vnútornej membráne46. Vnútorná membránová platforma, ktorá sa skladá z viacerých kópií najmenej štyroch proteínov, je uložená vo vnútornej membráne a zasahuje do periplazmy, kde kontaktuje sekretín. Táto platforma zohráva kľúčovú úlohu v procese sekrécie, a to komunikáciou so sekretínom, pseudopilusom a ATPázou na koordináciu exportu substrátov9. ATPáza sa nachádza v cytoplazme a poskytuje energiu na „poháňanie“ systému. Ako už názov napovedá, T2SS pseudopilus je evolučne príbuzný a štruktúrne podobný proteínom, ktoré obsahujú pilusy typu IV na povrchu bakteriálnych buniek, ako aj niektoré bakteriálne kompetenčné systémy47. Preto jeden model sekrécie cez T2SS kanál umožňuje, aby sa tieto pseudopilusy zmrštili (dochádza k ich retrakcii) a dôjde k pretlačeniu zloženého T2SS substrátu cez vonkajší membránový kanál. V tomto „piestovom“ modeli „sekrečno-kompetentné“ proteíny v periplazme kontaktujú periplazmatickú doménu sekretínu. Predpokladá sa, že táto interakcia stimuluje cytoplazmatickú ATPázu na riadenie retrakcie T2SS pseudopilusov, ktoré pretláčajú proteíny cez sekretínový kanál48,49. Sekrečný systém T2SS využíva množstvo bakteriálnych patogénov na transport faktorov virulencie mimo bunky. Príklady substrátov T2SS, ktoré sú dôležité pre virulenciu u cicavčieho hostiteľa, zahŕňajú cholerový toxín Vibrio cholerae50, ktorý spôsobuje vodnaté hnačky vyskytujúce sa pri ochorení cholera a exotoxín A, ktorý produkuje Pseudomonas aeruginosa51. Tento toxín blokuje proteosyntézu v hostiteľských bunkách, čo vedie k letálnej infekcii buniek touto baktériou. Napriek tomu, iné patogény používajú svoje T2SS sekrečné systémy na vylučovanie enzýmov, ktoré im pomáhajú prispôsobiť sa ich prostrediu, čo môže zahŕňať rastlinných a živočíšnych hostiteľov. Medzi tieto patogény patrí Legionella pneumophila52, enterotoxigénne a enterohemoragické Escherichia coli (ETEC a EHEC)53,54,55, Klebsiella pneumoniae56 alebo Aeromonas hydrophila57. 3.2.4 Sekrečný systém typu III Sekrečné systémy typu III (T3SS) sa nachádzajú u mnohých Gram-negatívnych baktérií, patogénov aj symbionto58. T3SS boli opísané ako „injektozómy“ a zariadenia podobné „ihle a striekačke“ kvôli ich typickej štruktúre (Obr. 3.4). Vylučujú širokú škálu proteínových 59
substrátov naprieč vnútornou aj vonkajšou membránou baktérie. Okrem toho, väčšina T3SS transportuje zároveň rôzne substráty do cieľovej membrány eukaryotickej bunky, a preto sa dá povedať, že v skutočnosti sú proteíny transportované cez tri membrány. Vylučovanie substrátov T3SS sa vo všeobecnosti považuje za jednokrokový proces, hoci nedávno bola táto predstava spochybnená u yersínií. T3SS substráty sa všeobecne nazývajú efektorové proteíny. Patogény môžu vylučovať len niekoľko efektorových proteínov, ako v prípade Pseudomonas spp. a Yersinia spp., alebo niekoľko desiatok, ako napr. v prípade Shigella spp. a EHEC. Sekrečné signály sú vložené do N-koncov T3SS substrátov a nie sú štiepené. Mnohé, ale nie všetky efektory T3SS obsahujú chaperóny, ktoré ich orientujú smerom k báze T3SS, kde sú vylučované v rozloženom stave závislom od ATP. T3SS má deväť tzv. core alebo „jadrových“ proteínov, ktoré sú medzi všetkými známymi systémami vysoko konzervovan59,60. Zdieľajú 8 z týchto proteínov s bičíkovým aparátom nachádzajúcim sa u mnohých baktérií a evolučne sú príbuzné flagelínu5. Okrem týchto 9 core proteínov, T3SS majú ďalších 10 až 20 proteínov, ktoré zohrávajú buď esenciálne alebo prinajmenšom dôležité úlohy vo svojej funkcii. Štruktúrne komponenty T3SS sú zvyčajne kódované v niekoľkých operónoch, ktoré možno nájsť buď na ostrovoch patogenity v bakteriálnom chromozóme alebo na plazmidoch. Keďže T3SS sú zvyčajne získané horizontálne, baktérie, ktoré sú evolučne odlišné, môžu mať úzko súvisiace systémy a naopak. Napríklad genómy Shigella spp. a E. coli sú vysoko homológne, ale T3SS systém šigel je viac podobný systému T3SS u Salmonella spp. v porovnaní so sekrečnými systémami vyskytujúcimi sa u patogénnych Escherichia coli pri porovnaní kmeňov EHEC a EPEC. Na základe homológie extracelulárne vypracovaných ihiel, hrotov a translokónov bolo v rámci sekrečných systémov T3SS navrhnutých primárne sedem rodín5. T3SS možno rozdeliť na tri hlavné zložky: základný komplex alebo bazálne telo, ihlový komponent a translokón59. Základný komplex obsahuje cytoplazmatické zložky a prekleňuje vnútornú a vonkajšiu membránu, čím vytvára štruktúru podobnú objímke pozostávajúcej z niekoľkých krúžkov so stredovou tyčou61. Vo väčšine systémov sa skladá minimálne z 15 proteínov59,60. Obklopené a vystupujúce z tejto objímky a tyčovej štruktúry je vlákno nazývané ihla, ktoré sa tiahne cez sekretín až do extracelulárneho priestoru61. Ihla T3SS systému obsahuje vnútorné duté jadro, ktoré je dostatočne široké, aby umožňovalo prechod bielkovinovým efektorom v rozvinutom stave62,63. Nedávna štúdia zaznamenala a pomocou kryo-EM (elektrónovej mikroskopie) vizualizovala „uväznenie“ efektorového proteínu a analýzu jednotlivých častíc, čo podporuje model prestupu bielkovinových substrátov cez ihlu64,65. Komplex hrotu T3SS, ktorý sa nachádza na vonkajšom konci ihly, je rozhodujúcim pre 60
snímanie kontaktu s hostiteľskými bunkami a reguláciu sekrécie efektorov66,67. Je tiež potrebným pre vloženie translokónu do membrán hostiteľskej bunky67,68. Translokón T3SS je nevyhnutný na prechod efektorov cez membrány hostiteľských buniek, ale nie na sekréciu efektorov mimo baktérie69,70. Translokóny zohrávajú úlohu najmä pri kontakte s hostiteľskými bunkami a tvoria póry, ktoré sú nevyhnutné na doručenie efektorov68. Efektory dokážu v hostiteľských bunkách modulovať niektoré špecifické bunkové funkcie, čo patogénom umožní invadovanie dovnútra buniek alebo kolonizáciu na ich povrchoch71. Nedávno bol navrhnutý alternatívny dvojkrokový model translokácie efektorov typu 3, kde efektory a zložky translokónu sú vylučované ešte pred kontaktom s hostiteľskou bunkou a zostávajú spojené s baktériami, predpokladá sa, že v lipidových vezikulách72,73. Po kontakte s hostiteľskými bunkami a zachytením tohto procesu cez ihlu, translokón a proteínový hrot ihly vytvoria pór, ktorým efektory dokážu prechádzať. Na určenie mechanizmu, ktorým dochádza k translokácii efektorov, sú určite potrebné ďalšie experimenty. Obr. 3.4 Štruktúra T3SS (Pendergrass a May 2019; upravené)74. Translokácia efektorov T3SS do hostiteľských buniek je nevyhnutná pre virulenciu mnohých patogénov, vrátane patogénnych druhov z rodov Yersinia, Salmonella a Shigella58. Za ostatných 30 rokov sa množstvo prác zameralo na pochopenie funkcie T3SS efektorových proteínov. Ich funkcie sa medzi rôznymi patogénmi značne líšia a ako napokon pôsobia komplexne na hostiteľské bunky sa ďalšími štúdiami stále objasňuje75,76. Mnohé z týchto efektorov napríklad 61
remodelujú normálne bunkové funkcie, aby umožnili patogénom vytvoriť infekčnú niku buď v hostiteľskej bunke alebo v tkanivách cicavcov. Štúdie týchto efektorov poskytli základný pohľad na množstvo rôznych aspektov biológie eukaryotických buniek. 3.2.5 Sekrečný systém typu IV Sekrečné systémy typu IV (T4SS) sú evolučne príbuzné systému horizontálneho prenosu bakteriálnej DNA počas konjugácie a môžu vylučovať rôzne substráty, vrátane jednoduchých proteínov ako aj DNA-proteínových komplexov77. T4SS vylučujú substráty do širokého spektra cieľových buniek, vrátane iných baktérií (rovnakého alebo odlišného druhu) a eukaryotických buniek. Tieto makromolekulárne komplexy sa vo veľkej miere nachádzajú u Gram-negatívnych baktérií, kde sú substráty transportované cez vnútornú aj vonkajšiu membránu (Obr. 3.1). Rovnako ako T3SS systémy, aj T4SS môžu preklenúť ďalšiu membránu hostiteľskej bunky, čo umožňuje priamy prenos substrátov do cytoplazmy recipientnej bunky. Pretože T4SS sú schopné prenášať DNA aj proteíny, môžu plniť rôzne funkcie, vrátane prenosu DNA prostredníctvom konjugácie, DNA absorpcie a uvoľňovania a translokácie efektorových proteínov alebo komplexov DNA/proteín priamo do buniek príjemcu. Schopnosť translokácie DNA činí z T4SS unikátny sekrečný systém, keďže ostatné systémy sa touto schopnosťou nevyznačujú. Keďže sú schopné sprostredkovať konjugáciu plazmidovej DNA, prispievajú aj k šíreniu génov rezistencie, ktoré sú kódované extrachromozomálne na plazmidoch78. Napriek rôznorodosti ich substrátov a funkcií sú všetky T4SS evolučne príbuzné, majú spoločné komponenty a fungujú podobným spôsobom79. Proces sekrécie substrátu cez aparát T4SS je stále predmetom výskumu. V súčasnosti napríklad nie je známe, akú úlohu zohráva pilus T4SS v procese sekrécie. Niektorí veria, že pilus môže slúžiť len ako prídavné zariadenie, ktoré umožňuje baktériám prísť do tesného kontaktu s cieľovými bunkami80. Iní však tvrdia, že pilus môže skutočne slúžiť ako kanál na translokáciu substrátu, najmä do cieľových buniek81. T4SS zohrávajú kľúčovú úlohu v patogenéze širokého spektra baktérií. Pozoruhodnými príkladmi bakteriálnych patogénov, ktoré využívajú T4SS na podporu virulencie, sú Neisseria gonorrhoeae, ktorá využíva svoj T4SS na sprostredkovanie vychytávania DNA (ktoré podporuje získanie génu virulencie)82 a Legionella pneumophila, Brucella suis alebo Helicobacter pylori, ktoré používajú svoje T4SS systémy na translokáciu efektorových proteínov do hostiteľských buniek počas infekcie, aby sa narušili ich obranné stratégie83. Tieto efektorové proteíny majú široké spektrum funkcií. Napríklad intracelulárne patogény Legionella pneumophila využívajú T4SS systém na translokáciu viac ako 200 efektorových 62
proteínov do hostiteľskej bunky, kde zohrávajú dôležitú úlohu pri prestavbe architektúry hostiteľskej bunky, aby sa vytvorila vakuola vhodná na replikáciu baktérií84. Hlavné zameranie pri štúdiu T4SS sekrečného systému je momentálne pochopenie úloh, ktorými tieto efektorové proteíny ovplyvňujú funkcie hostiteľských buniek. Okrem toho, že tieto štúdie zlepšili naše chápanie interakcií hostiteľ-patogén viedli tiež k novým poznatkom v biológii eukaryotických buniek. 3.2.6 Sekrečný systém typu V Substráty sekrečného systému typu V (T5SS) sú jedinečné v tom, že na rozdiel od iných sekretovaných substrátov, ktoré prechádzajú cez bakteriálnu membránu pomocou určitého sekrečného aparátu alebo membránovým kanálom, sa vylučujú samy, a preto sa niekedy T5SS systém nazýva ako autotransportérový. Tieto proteíny alebo skupiny proteínov obsahujú svoju vlastnú β-barelovú doménu, ktorá sa vkladá do vonkajšej membrány a tvorí kanál, cez ktorý je transportovaný buď zvyšok proteínu alebo samotný proteín85,86. Pretože sekrécia proteínov pomocou T5SS sa vyskytuje iba vo vonkajšej membráne, tieto proteíny musia byť najskôr translokované cez vnútornú membránu a do periplazmy v rozloženom (rozvinutom) stave pomocou dráhy Sec (Obr. 3.1). Preto T5SS proteíny obsahujú N-terminálnu Sec signálnu sekvenciu, ktorá sa pri prechode do periplazmy odštiepi87. Najznámejšími substrátmi T5SS sú virulentné proteíny, ktoré slúžia ako toxíny a proteíny viažuce receptor. Okrem sekrécie faktorov virulencie sa T5SS systém podieľa aj na adhézii buniek navzájom a tým na formovaní biofilmu88. K typickým predstaviteľom T5SS substrátov, ktoré zohrávajú dôležitú úlohu v patogenéze infekcií, patrí imunoglobulín A proteáza Neisseria gonorrhoeae, ktorá štiepi hostiteľské protilátky85, IcsA proteín Shigella flexneri89, ktorý podporuje intracelulárnu motilitu založenú na aktíne a tiež slúži ako adhezín90 u Yersinia enterocolitica91. T5SS je možné rozdeliť do troch tried v závislosti od počtu proteínov zapojených do procesu sekrécie. Tieto triedy zahŕňajú sekréciu autotransportéra, sekréciu pomocou dvoch partnerských zložiek a chaperónmi vedenú (umožnenú) sekréciu86. 3.2.6.1 Sekrécia autotransportéra Najjednoduchšia forma sekrécie typu V je známa ako systém autotransportéra. Ako z jeho názvu vyplýva, autotransportéry obsahujú komponenty, ktoré im umožňujú vylučovať sa nezávisle od iných mechanizmov. Autotransportéry obsahujú 3 – 4 domény: translokátorovú 63
doménu na C-konci, ktorá tvorí vonkajší membránový kanál, spojovaciu doménu, prechodovú (pasážovú) doménu, ktorá obsahuje funkčnú časť autotransportérového proteínu a niekedy proteázovú doménu, ktorá oddeľuje doménu pasažiera, keď prejde (pasážuje) kanálom86. Po sekrécii rozloženého (rozvinutého) autotransportérového proteínu cez vnútornú membránu, sa translokátorová doména koncentruje vo vonkajšej membráne a vytvára 12-vláknový β-barel, zvyčajne s pomocou množstva prídavných faktorov, vrátane periplazmatického chaperónu Skp a komplexu Bam92,93. Spojovacia flexibilná doména potom orientuje pasážovú doménu cez kanál smerom von z bunky. Akonáhle sa doména transportéra dostane von z bunky, buď sa uvoľní vlastnou proteázovou doménou, alebo zostáva pripojená k translokátorovej doméne a vyčnieva mimo bunky86. 3.2.6.2 Sekrécia pomocou dvoch partnerských zložiek Zatiaľ čo sa väčšina substrátov T5SS vylučuje mechanizmom autotransportéra, niekoľko z nich sa pri transporte mimo bunky spolieha na rôzne polypeptidy. V procese nazývanom sekrécia dvoch partnerských zložiek sa na procese sekrécie zúčastňuje pár proteínov, z ktorých jeden partner nesie β-barelovú doménu, zatiaľ čo druhý partner slúži ako secernovaný proteín. Vylučovanie dvoch partnerov bolo pozorované u veľkého množstva Gram-negatívnych baktérií a je primárne zodpovedné za transport veľkých virulentných proteínov, akými sú filamentózny hemaglutinín u Bordetella pertussis alebo vysokomolekulárne adhezíny HMW1 a HMW2 (HMW = High Molecular Weight adhesins) u Haemophilus influenzae94,95. 3.2.6.3 Sekrécia pomocou vodiacej bielkoviny a chaperónov Chaperóny sú špeciálne proteíny, ktoré pomáhajú skladať bielkoviny do ich správneho priestorového usporiadania. Tretia podkategória T5SS zahŕňa proteíny vylučované pomocou dvoch ďalších proteínov: vodiaci proteín, ktorý tvorí β-barelový kanál vo vonkajšej membráne, a chaperón, periplazmatický proteín, ktorý uľahčuje skladanie vylučovaného proteínu pred jeho dopravením do kanála. Tento systém sekrécie je používaný napríklad na zostavenie pilínov na povrchu Gram-negatívnych baktérií, ku ktorým patrí aj P pilus uropatogénnych Escherichia coli96. Fimbrie (pilusy) slúžia na rozpoznanie hostiteľských buniek a priľnutie baktérií k ich povrchom, čím prispievajú k patogenite a napríklad aj k formovaniu biofilmov97. 64
3.2.7 Sekrečný systém typu VI Sekrečné systémy typu VI (T6SS) sú jedny z posledných objavených bakteriálnych sekrečných systémov98, a preto štúdium o ich štruktúre a funkciách ešte pokračuje. Čo je ale známe, T6SS sekrečné systémy, rovnako ako ostatné, translokujú proteíny do rôznych recipientných buniek, vrátane eukaryotických buniek a častejšie iných baktérií99. Tieto systémy sú pomerne dobre konzervované pre široké spektrum rôznych druhov Gram-negatívnych baktérií s takmer štvrtinou sekvenovaných genómov obsahujúcich gény pre zložky systému T6SS. Na rozdiel od mnohých iných charakterizovaných sekrečných systémov Gram-negatívnych baktérií, sú T6SS schopné transportovať efektorové proteíny z jednej baktérie na základe kontakt-vyžadujúcich mechanizmov, ktoré, zdá sa, zohrávajú dôležitú úlohu v bakteriálnej komunikácii ako aj v interakcii baktérií s okolitým prostredím99. T6SS sekrečné systémy sú veľmi veľké, obsahujú až 21 proteínov kódovaných v súvislom génovom klastri100. Zdá sa, že trinásť z týchto proteínov je konzervovaných vo všetkých T6SS a predpokladá sa, že v tomto sekrečnom aparáte zohrávajú štruktúrnu úlohu. Zaujímavosťou tohto sekrečného systému je, že T6SS majú štruktúrnu homológiu s fágovými chvostami a predpokladá sa, že T6SS by mohli pochádzať z invertovaných fágových chvostov, ktoré vypudzujú proteíny mimo bakteriálnu bunku namiesto toho, aby ich injikovali dovnútra bunky (Obr. 3.1)101. Ďalej sa predpokladá, že niektoré štruktúrne komponenty systému T6SS môžu tiež slúžiť ako efektorové proteíny, hoci boli identifikované tiež iné efektorové proteíny slúžiace danému účelu. Tieto efektory majú množstvo foriem a funkcií, pričom mnohé sú namierené voči bakteriálnej bunkovej stene a membráne, čo podporuje úlohu tohto sekrečného aparátu v podpore medzidruhovej bakteriálnej konkurencie99,100. Podľa hypotézy je mnoho efektorov T6SS kódovaných vedľa génu, ktorý poskytuje imunitu voči efektoru, čím sa zabráni samointoxikácii100. Predpokladá sa, že T6SS prispievajú k virulencii niektorých bakteriálnych patogénov poskytovaním proteínových substrátov do hostiteľských buniek a vylučovaním substrátov do susedných baktérií, ktoré môžu súťažiť o využitie špecifického miesta hostiteľa. Kým vieme, že mnohé bakteriálne patogény vrátane Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae a Serratia marcescens sú schopné využívať svoje T6SS sekrečné systémy v laboratórnych podmienkach99,101,102, mechanizmy, ktorými tieto sekrečné systémy prispievajú k prežitiu v prostredí (a pri infekcii cicavcov), zatiaľ ešte neboli exaktne dokázané. Existujú ale štúdie, ktoré potvrdzujú translokáciu proteínových toxínov, čím prispievajú k patogenéze infekcie ako aj k bakteriálnej kompetícii103. 65
3.2.8 Sekrečné systémy typu VII – XI Ďalšími, doteraz objavenými a popísanými sekrečnými systémami, sú sekrečný systém T7SS, ktorý je využívaný u Gram-pozitívnych baktérií a bude bližšie špecifikovaný v kapitole zaoberajúcej sa sekrečnými systémami u Gram-pozitívnych baktérií. T8SS sekrečný systém T8SS sekrečný systém, nazývaný aj ako extracelulárny nukleačno-precipitačný systém, bol popísaný u Gram-negatívnych baktérií Escherichia coli a slúži na syntézu tzv. „curli“ (kučeravých) extracelulárnych vlákien, čo sú amyloidogénne proteíny a slúžia na ochranu baktérií pred nepriaznivými podmienkami okolia, ale prispievajú tiež k tvorbe biofilmov a umožňujú interakcie s hostiteľským imunitným systémom104. Ich biogenéza je riadená dvoma divergentne transkribovanými operónmi, csgBAC a csgDEFG. Operón csbBAC kóduje štruktúrne podjednotky CsgA a CsgB, spolu s proteínom podobným chaperónu, CsgC. Operón csgDEFG kóduje prídavné proteíny potrebné na účinnú transkripciu, sekréciu a zloženie „curli“ vlákna. CsgA a CsgB sú vylučované ako prevažne neštruktúrované proteíny a prechádzajú do štruktúr bohatých na β-domény, ktoré sa agregujú do pravidelných vlákien na bunkovom povrchu Escherichia coli105. T9SS sekrečný systém Sekrečný systém T9SS je špecifický pre kmeň Bacteroidetes. Do tohto kmeňa patria baktérie, ktoré sa bežne nachádzajú v tráviacom trakte zvierat aj ľudí a sú tiež rozšírené v životnom prostredí. Z baktérií, ktoré využívajú T9SS pre transport proteínov, možno spomenúť Porphyromonas gingivalis, patogénnu baktériu a pôvodcu parodontitídy u ľudí106. T9SS sa podieľa na sekrécii najmenej 30 proteínov, vrátane hlavných virulentných faktorov P. gingivalis nazývaných gingipaíny (Kgp, RgpA, RgpB)107. Porphyromonas gingivalis je tiež pôvodcom ochorení vtákov a rýb. Niektoré baktérie, ako napr. Flavobacterium johnsoniae, využívajú tento typ sekrečného systému na zabezpečenie špecifického, tzv. kĺzavého pohybu a spomínaná baktéria sa používa ako modelový organizmus na štúdium tohto druhu pohybu108. SprB a RemA, hlavné motilitné adhezíny, ktoré sú potrebné pre kĺzavý typ pohybu u F. johnsoniae, sú dodávané na bunkový povrch pomocou systému T9SS109. Mnohé baktérie využívajúce T9SS sekrečný systém ho využívajú na sekréciu rôznych efektorových proteínov, ku ktorým patria proteázy, adhezíny, celulázy, chitín alebo povrchové proteíny baktérií. Celková organizácia a molekulárny mechanizmus fungovania T9SS zatiaľ ale nie je úplne objasnený. 66
T10SS sekrečný systém Sekrečný systém T10SS sa vyskytuje u Gram-negatívnych baktérií, patrí k dvojkrokovým dráham a pri sekrécii efektorových proteínov cez vonkajšiu membránu je závislá na holíne a peptidoglykánhydroláze. Holíny sú skupinou malých proteínov produkovaných bakteriofágmi a sú dôležité pre kontrolu degradácie hostiteľských bunkových stien na konci lytického cyklu. Tvoria póry v bunkovej membráne hostiteľa, čo umožňuje lyzínom dosiahnuť a degradovať peptidoglykán, zložku bakteriálnych bunkových stien. Systém sekrécie proteínov využíva proteín holínovej membrány v tandeme s enzýmom upravujúcim bunkovú stenu na sprostredkovanie sekrécie substrátových proteínov z periplazmy do vonkajšieho priestoru mimo bunku. Genomická analýza naznačuje, že táto dráha je konzervovaná a podieľa sa na sekrécii hydrolytických enzýmov a toxínov pre celý rad baktérií110. T11SS sekrečný systém Na základe posledných štúdií sa objavujú informácie aj o sekrečnom systéme 11 (T11SS), je ale vysoko pravdepodobné, že existujú aj ďalšie mechanizmy, ktoré sprostredkovávajú sekréciu proteínov, ktoré treba ešte objaviť. Zatiaľ sa ako sekrečné systémy typu 11 nazývajú tie, ktoré zahŕňajú proteíny DUF560 (DUF = Domain of Unknown Function 560)111. 3.3 SEKREČNÉ SYSTÉMY GRAM-POZITÍVNYCH BAKTÉRIÍ Základnou zložkou bunkovej steny baktérií je vrstva peptidoglykánu (mureínu). Peptidoglykán sa skladá z vrstiev polysacharidových reťazcov pospájaných naprieč krátkymi peptidmi, obsahuje striedavo dva cukry – kyselinu N-acetylmurámovú a N-acetylglukózamín. Zvyšky kyseliny N-acetylmurámovej vytvárajú vzájomné prepojenie reťazcov pomocou krátkych peptidov (tetrapeptidy) – tetrapeptid, D/L alanín, kyselina G-glutámová, L-lyzín. Proces tohto spojenia sa nazýva transpeptidácia a je katalyzovaná transpeptidázami. Bunkovú stenu Gram- pozitívnych baktérií tvorí hrubá vrstva peptidoglykánu, v ktorej sú polysacharidové reťazce uložené v mnohých vrstvách nad sebou. U Gram-pozitívnych baktérií sú takmer všetky zvyšky kyseliny N-acetylmurámovej spojené peptidovými mostíkmi. Kolmo na povrch bunky prechádzajú peptidoglykánovou vrstvou reťazce kyseliny teichoovej (kyslý polysacharid), ktoré pozostávajú z opakujúcich sa podjednotiek glycerolu a ribitolu a majú funkciu hlavného povrchového antigénu. Viažu na seba katióny horčíka a vápnika, ktoré sú nevyhnutné pre integritu bunkovej steny a membrány. Až na výnimky, bunková stena (mykobaktérie, korynebaktérie, nokardie) neobsahuje lipidy112,113. Cytoplazmatická membrána je tvorená 67
fosfolipidovou dvojvrstvou, do ktorej sú vnorené rôzne bielkoviny. Je lokalizovaná medzi bunkovou stenou a cytoplazmou a jej hlavnou úlohou je tvoriť selektívnu permeabilnú bariéru, ktorá reguluje vstup a výstup látok do a z bunky. Cytoplazmatická membrána je priepustná pre vodu a malé hydrofóbne molekuly, ktoré prechádzajú cez membránu pasívne difúziou. Ostatné látky prestupujú cez membránu aktívnym transportom pomocou proteínových transportných systémov. Transportné systémy sú veľmi špecifické, niektoré sú schopné prenášať len jeden typ molekuly, iné používa bunka na prenos viacerých príbuzných molekúl. Syntéza a aktivita transportných systémov je prísne regulovaná, bunka ich tvorí len vtedy, ak potrebuje danú látku prijať (živiny) alebo odstrániť zo svojho vnútorného prostredia (toxické látky, antibiotiká). Pre baktérie je tiež dôležité zabezpečiť translokáciu sekretovaných alebo periplazmatických proteínov cez cytoplazmatickú membránu a na to slúži základný sekrečný systém114 baktérií. Jednou zo základných funkcií prokaryotickej bunky je sekrécia proteínov, transport proteínov z cytoplazmy do iných častí bunky, prostredia alebo iných baktérií alebo eukaryotických buniek. Sekrečné systémy baktérií sú využívané mnohými bakteriálnymi patogénmi na interakciu s eukaryotickými hostiteľskými bunkami. Prokaryoty si vyvinuli množstvo transportných proteínov, ktoré napomáhajú transportovať a vpravovať efektorové molekuly do hostiteľských buniek, buď pri ich priamom kontakte, prípadne tieto molekuly uvoľňujú v ich bezprostrednej blízkosti alebo k ich uvoľneniu dochádza v intracelulárnom prostredí hostiteľskej bunky. Tiež sa podieľajú na medzibunkovej komunikácii. Vzhľadom na rozdielnu skladbu bunkovej steny Gram-negatívnych a Gram-pozitívnych baktérií je zrejmé, že mechanizmy extracelulárnej sekrécie proteínov sa líšia1,115. Gram-pozitívne a Gram-negatívne baktérie využívajú dva univerzálne systémy sekrécie proteínov cez cytoplazmatickú membránu: dráhu Sec (Secretion route) a dráhu Tat (Twin-arginine translocation). Okrem základných sekrečných systémov, Gram-pozitívne baktérie využívajú sekrečné systémy typu: SecA2, sortáza, injektozóm a sekrečný systém typu 7 (T7SS). Sec sekrečný systém Sec systém sekrécie proteínov katalyzuje transmembránovú sekréciu proteínov v ich rozvinutej konformácii, následne sa zmenia do svojej pôvodnej štruktúry. Sec sekrečný systém pozostáva z troch častí: z cieľových proteínových zložiek, motorického proteínu a integrovaného membránového vodivého kanála nazývaného SecYEG translokáza. Tá pozostáva z troch integrálnych membránových kanálových proteínov – SecY, SecE a SecG a periférne viazanej ATPázy – SecA, ktorá je transportérom sekretovaných proteínov cez membránu116. Kanálové podjednotky SecY a SecE a transportér SecA sú esenciálne komponenty Sec translokázy. Je to 68
enzým prítomný v cytoplazmatickej membráne všetkých baktérií a je nevyhnutný pre ich život. Je zodpovedný za sekréciu väčšiny extracelulárnych proteínov, ktoré plnia dôležitú úlohu v metabolizme, sú zodpovedné za príjem a vylučovanie látok, pri syntéze bunkových obalov ako aj pri medzibunkovej komunikácii117. Tat sekrečný systém Tat sekrečný systém je funkčný systém dvojitej arginínovej translokácie a využívajú ho Gram- pozitívne aj Gram-negatívne baktérie na sekréciu proteínov. Tat systémom na rozdiel od Sec systému sa prenášajú priestorovo proteíny v zloženom stave s využitím len protónového gradientu, bez hydrolýzy ATP. Od Sec systému sa líšia aj špecifickou N-terminálnou signálnou peptidovou sekvenciou. Tat translokázy Gram-pozitívnych baktérií pozostávajú z integrovaných membránových podjednotiek – TatA, TatB a TatC, pričom TatA a TatB sú spojené do jedného multifunkčného proteínu19. Proteíny vylučované Tat dráhou sú uvoľňované extracelulárne a majú rôzne funkcie. Potláčajú aktivitu imunitných buniek a slúžia na podporu intracelulárneho prežitia, sú dôležité pri transporte látok zabezpečujúcich fyziologické funkcie a prežitie patogénnych a nepatogénnych baktérií. Tat sekrečným systémom baktérie vylučujú napríklad fosfolipázu C, enzým, ktorý je významným faktorom virulencie väčšiny patogénnych baktérií (Mycobacterium tuberculosis)25. Tieto hydrolytické enzýmy sú schopné integrovať s eukaryotickými bunkovými membránami a hydrolyzovať fosfatidylcholín a sfingomyelín, čo vedie k destabilizácii bunkovej membrány a nakoniec k lýze buniek. 3.3.1 SecA2 SecA2 sekrečný systém u Gram-pozitívnych baktérií zohráva dôležitú úlohu pri sekrécii špecifických malých proteínov. Gram-pozitívne baktérie ako Listeria monocytogenes, Bacillus subtilis, Clostridioides difficile, Mycobacterium tuberculosis, Corynebacterium glutamicum majú dva SecA sekrečné systémy, SecA1 a SecA2. SecA1 je hlavný sekrečný systém, ktorý zabezpečuje sekréciu základných proteínov, SecA2 baktérie využívajú na transport špecifických proteínov pri stresových podmienkach, pri modifikáciách bunkovej steny, jej obnove a pri metabolizme a je spojený s virulenciou baktérií. Nie je dostatok informácií o využívaní sekrečného systému SecA2 u rôznych druhov baktérií, pretože baktérie väčšinou využívajú na sekréciu proteínov prednostne SecYEG. Taktiež nie je dostatok informácií o prenose substrátu prostredníctvom SecA alebo SecA2. Niektoré streptokoky a stafylokoky využívajú na transport proteínov druhý sekrečný systém Sec nazývaný aSec alebo SecA2- 69
SecY2. Tento sekrečný systém okrem SecA2 pozostáva zo SecY a ešte najmenej z troch ďalších Sec transportných proteínov, ktoré sú nevyhnutné pre sekréciu glykoproteínov. Všetky tieto proteíny sú lokalizované v membráne a cytosóle, tvoria póry a podieľajú sa na úplnej glykozylácii týchto substrátov. aSec sekrečný systém využívajú baktérie na transport veľkých vysoko glykolyzovaných proteínov bunkovej steny, ktoré sú bohaté na serín118. Tieto proteíny majú funkciu adhezínov a sú faktorom virulencie streptokokov a stafylokokov. 3.3.2 Sortázy Sortázy sú enzýmy Gram-pozitívnych baktérií. Vo väčšine prípadov nestačí len transport proteínov na miesto určenia, pretože niektoré proteíny musia byť zabudované do bunkovej steny baktérií, aby zostali na ich vonkajšom povrchu. Gram-pozitívne baktérie exprimujú na svojom povrchu proteíny, ktoré im pomáhajú prežiť a prekonať imunitný systém hostiteľa počas infekcie. Pretože Gram-pozitívnym baktériám chýba vonkajšia membrána, tieto proteíny musia byť pevne včlenené do bunkovej steny. Túto funkciu zabezpečujú enzýmy z triedy hydroláz (EC 3) a podtriedy peptidáz (EC 3.4) nazývané sortázy, ktoré sekretované proteíny po ich prechode cez cytoplazmatickú membránu kovalentne viažu k bunkovej stene. Veľa Gram- pozitívnych baktérií produkuje sortázy, ktoré sa líšia vo svojej špecifickosti. Napríklad, tzv. upratovacie sortázy (SrtA), môžu pripojiť až 40 proteínov k bunkovej stene, zatiaľ čo iné sortázy sú špecifické iba pre jeden alebo dva proteíny119. Sortázy kovalentne viažu proteíny k bunkovej stene v procese transpeptidácie (Obr. 3.5). Sekretované proteíny majú na N- terminálnom konci rozpoznávaciu sekvenciu, ktorá daný proteín navedie do transportéra a zabezpečí tak správnu lokalizáciu. Proteíny určené na prichytenie v bunkovej stene sú najprv transportované cez membránu prostredníctvom Sec transportného systému. Cieľovým miestom pôsobenia SrtA je N-terminálny koniec signálneho peptidu ako aj 30 – 40 rezíduí C terminálneho konca CWS (CWS = Cell Wall Sorting signal), ktorý je zložený z pentapeptidového nabitého konca, z motívu LPXTG a C-terminálnej hydrofóbnej domény. Následne triediace signály týchto proteínov sú spracované sortázou SrtA, ktorá pôsobí medzi zvyškami treonínu a glycínu na ich LPXTG mieste. Karboxylová skupina treonínu sa kovalentne viaže k cysteínovému zvyšku C konca pomocou sortázy a efektívne sa odštiepi C koniec pôvodného proteínu. Ihneď sa kovalentne pripojí aminoskupina k Lipidu II, ktorý je prekurzorom bunkovej steny. Takto modifikovaný Lipid II je včlenený do peptidoglykánu počas syntézy bunkovej steny, pričom SrtA efektívne vkladá tieto substráty do bunkovej steny119,120. Iné druhy sortáz prichytávajú substráty pomocou podobných katalytických reakcií, 70
ale sú špecifické pre rôzne LPXTG motívy a amino skupiny. Fimbrie (pilusy) sú typickým príkladom bunkového povrchového proteínu Gram-pozitívnych baktérií. Tieto štruktúry sú dôležité pre prežívanie baktérií v rôznych prostrediach, umožňujú väzbu na abiotické povrchy v prostredí alebo vytvárajú medzibunkové väzby v bakteriálnej kolónii a v biofilme. Pevná adhézia k povrchom v organizme hostiteľa pomáha baktériám odolávať odstraňovaniu zo slizníc a fimbrie sú tiež dôležitým faktorom virulencie114. Pozostávajú z hlavnej podjednotky nazývanej pilín a jednej alebo viacerých menších podjednotiek, ktoré sú tvorené špecifickými sortázami. Z patogénnych baktérií, ktoré dokážu využívať fimbrie počas infekcie, možno spomenúť Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus a ďalšie119. Obr. 3.5 Znázornenie transpeptidačnej reakcie prostredníctvom sortázy A u Staphylococcus aureus (Lee a kol. 2001; upravené)117. 1) Syntetizovaný proteín sa z cytoplazmy premiestni sekrečným systémom a ukotví sa na bunkovej membráne. 2) Sortáza A rozpoznáva C-koniec triediaceho motívu LPXTG a štiepi väzbu medzi treonínom a glycínom. 3) Sortáza A vytvorí proteínový komplex pričom využíva nukleofilnú reakciu z molekuly Lipidu II. 4) Komplex Lipid II-proteín sa následne ukotví v bunkovej stene prostredníctvom transpeptidačnej reakcie. 3.3.3 Extracelulárna sekrécia proteínov Nie všetky syntetizované proteíny ostávajú zabudované v bunkovej stene Gram-pozitívnych baktérií. Veľa proteínov je exportovaných cez cytoplazmatickú membránu dráhami Sec a Tat a následne sú uvoľnené do extracelulárneho prostredia, často pasívnou difúziou cez peptidoglykánovú vrstvu. Niektoré Gram-pozitívne baktérie využívajú na export určitých proteínov cez cytoplazmatickú membránu a aj cez bunkovú stenu samostatný sekrečný systém nazývaný T7SS. Niektoré sekretované proteíny sú včlenené do cytoplazmatických štruktúr 71
eukaryotických hostiteľských buniek. Gram-pozitívne baktérie využívajú rôzne spôsoby, ktorými sa efektorové proteíny dostanú do cytoplazmy eukaryotických buniek (Obr. 3.6)1,121. Obr. 3.6 Sekrečné systémy Gram-pozitívnych baktérií (Green a Mecsas 2016; upravené)1. Gram-pozitívne baktérie obsahujú cytoplazmatickú membránu obklopenú veľmi hrubou bunkovou stenou. Gram- pozitívne baktérie môžu vylučovať proteíny cez membránu pomocou sekrečných systémov Tat a Sec. Na rozdiel od Gram-negatívnych baktérií, mnohé Gram-pozitívne baktérie využívajú ďalší spôsob sekrécie Sec menšej podskupiny proteínov nazývaný SecA2. Okrem toho existujú dôkazy, že niektoré Gram-pozitívne baktérie môžu používať špeciálne sekrečné systémy nazývané „injektozómy“ na transport proteínov z bakteriálnej cytoplazmy do cytoplazmy hostiteľskej bunky v 2-krokovom procese. 3.3.3.1 Injektozóm Injektozóm je ďalší zo sekrečných systémov, ktorý využívajú Gram-pozitívne baktérie na transport proteínov. Je funkčne podobný sekrečnému systému T4SS a T3SS Gram-negatívnych baktérií, ale je štruktúrne odlišný. Streptococcus pyogenes využíva tento typ sekrečného systému na translokáciu významného faktora virulencie NAD+ glykohydrolázy (SPN = Streptococcus pyogenes NAD+ glycohydrolase) do cytoplazmy keratinocytov122. Injektozóm S. pyogenes pozostáva z dvoch zložiek: SLO (SLO = Streptolyzín O) a sekrečnej dráhy závislej od Sec. V kombinácii sú nevyhnutné na vytvorenie kanála potrebného pre translokáciu SPN do cytoplazmy keratinocytov. SLO patrí do skupiny toxínov nazývaných cytolyzíny závislé od cholesterolu (CDC = Cholesterol-Dependent Cytolysins). CDC sú vysoko rozpustné proteíny a po uvoľnení zo sekrečného systému bakteriálnej bunky prechádzajú zmenou z rozpustných molekúl na supramolekulový membránový komplex, viažu cholesterol na povrch eukaryotických buniek a prenášajú ho do membrán, čím vytvárajú póry123. Následne po vytvorení pórov pomocou SLO, SPN je translokovaná cez cytoplazmatickú membránu 72
pomocou Sec do eukaryotických buniek cez vytvorený pór121. V cytoplazme hostiteľských buniek SPN štiepi glykozidickú väzbu v β-NAD+, ktorý je nevyhnutný pre syntézu nikotínamidu a ADP-ribózy, čím sa naruší fyziologická funkcia bunky122. 3.3.3.2 Sekrečný systém T7SS T7SS sekrečný systém využívajú baktérie, ktorých bunková stena obsahuje lipidy, predovšetkým zástupcovia rodov Mycobacterium a Corynebacterium. Lipidy prítomné v bunkovej stene vytvárajú silnú voskovitú hydrofóbnu vrstvu nazývanú mykomembrána, ktorá slúži ako účinná bariéra pred pôsobením antimikrobiálnych látok a negatívnych vplyvov vonkajšieho prostredia (Obr. 3.7). Preto je pre tieto baktérie transport proteínov cez bunkovú stenu náročnejší a na sekréciu a transport proteínov využívajú jedinečný spôsob sekrécie nazývaný sekrečný systém typu VII (T7SS)124. Po prvýkrát bol T7SS opísaný u M. tuberculosis a nazýva sa systém ESX (ESX = Early Secretory antigenic target /ESAT6/ secretion system)125. Neskôr bol T7SS identifikovaný aj u mnohých baktérií z radu Corynebacteriales, dokonca aj u baktérií, ktoré nemajú mykomembránu, ako Staphylococcus aureus, Bacillus anthracis a Listeria monocytogenes. Hlavné štruktúrne zložky T7SS a ich substráty sú kódované na spojených klastroch124. V týchto génových klastroch sa najčastejšie objavuje päť jadrových štruktúnych proteínov. Tieto základné zložky ESX nazývané EccB, EccC, EccD, EccE a MycP sú všetko membránové proteíny126. Všetky okrem EccD majú hydrofóbne domény, teda všetky môžu interagovať s rôznymi ďalšími zložkami v cytoplazme alebo v peptidoglykánovej vrstve, ako sú chaperóny alebo cytosólický proteín EccA, ktoré môžu byť zdrojom energie pri transporte substrátu127. Piata zložka, MycP sa nazýva mykozín alebo subtilizínu podobná proteáza. Úloha MycP pri translokácii proteínu cez T7SS nie je zatiaľ úplne objasnená, predpokladá sa, že zohráva dôležitú úlohu pri regulácii sekrécie proteínov128. T7SS obsahuje aj premenlivý počet pomocných proteínov, ktoré zohrávajú dôležitú úlohu napríklad pri získavaní energie z cytosólického proteínu EccA – ATPázy spojenej s rôznymi bunkovými funkciami. EccA je dôležitou zložkou T7SS, je nevyhnutný pri transporte faktorov virulencie u patogénnych mykobaktérií127. Prechod substrátov cez mykomembránu prostredníctvom sekrečného systému T7SS nie je dostatočne objasnený. Na základe štúdií pomocou elektrónovej mikroskopie sa mykomembrána prirovnáva k vonkajšej membráne Gram-negatívnych baktérií, takže sa predpokladá, že existujú rôzne faktory potrebné na prechod cez túto membránu129. T7SS zohráva dôležitú úlohu pri zabezpečovaní fyziologických funkcií ako aj v patogenéze baktérií. Prvý identifikovaný systém, ESX-1 je hlavným faktorom virulencie Mycobacterium 73
tuberculosis130. V súčasnosti je u mykobaktérií identifikovaných päť T7SS nazývaných ESX-1 až ESX-5, u všetkých mykobaktérií je prítomný ESX-3 a ESX-4, ale nie všetky mykobaktérie majú všetkých päť systémov131. Aj keď funkcia sekrečného systému T7SS sa spája s virulenciou a so sekréciou substrátov, u listérií nie je nevyhnutný pre virulenciu132. Pre virulenciu M. tuberculosis je nevyhnutný ESX-1, je prítomný aj u nepatogénnej M. smegmatis, u ktorej zohráva dôležitú úlohu pri konjugácii DNA substrátov a pripomína sekrečný systém T4SS133. U M. tuberculosis sú prostredníctvom ESX-3 vylučované substráty rozhodujúce pri získavaní železa a raste in vitro134, zatiaľ čo ESX-1 a ESX-5 sú nevyhnutné pre virulenciu a nie pre rast na živných médiách135. Pravdepodobne jednotlivé sekrečné systémy zohrávajú rôzne úlohy v závislosti od druhu mykobaktérií. Obr. 3.7 Sekrečný systém T7SS (Green a Mecsas 2016; upravené)1. Niektoré Gram-pozitívne baktérie, vrátane zástupcov rodu Mycobacterium, obsahujú vrstvu bunkovej steny, ktorá je silne modifikovaná lipidmi nazývaná mykomembrána. Tieto baktérie využívajú odlišný proteínový sekrečný systém nazývaný T7SS. T7SS obsahuje niekoľko jadrových proteínov vnútornej membrány, ktoré interagujú s cytosólickými chaperónmi a tvoria kanál, cez ktorý sa proteíny vylučujú. 3.4 HOSTITEĽSKÉ IMUNITNÉ ROZPOZNANIE SYSTÉMOV BAKTERIÁLNEJ SEKRÉCIE Jedným zo spôsobov, ako rozpoznáva vrodený imunitný systém patogény v prostredí, je prostredníctvom využitia špecifických receptorov a proteínov imunitných buniek, ktoré vnímajú mechanizmy alebo vzory bakteriálnej patogenity. Toto je v protiklade s jednoduchosťou senzorických (vnímavých) molekúl vyskytujúcich sa tak u patogénov ako aj 74
komenzálov, ako je napríklad lipopolysacharid (LPS) alebo peptidoglykán. Na základe informácií o štruktúre a funkciách sekrečných systémov možno konštatovať, že jedným z charakteristických znakov bakteriálnej infekcie pre mnohé patogény je použitie výhradných proteínových sekrečných systémov, ktoré slúžia na priame dopravenie/transport efektorových proteínov alebo toxínov do miest v tkanivách cicavcov a/alebo hostiteľských buniek. Z tohto dôvodu, si vrodený imunitný systém cicavcov vyvinul stratégie na detekciu použitia bakteriálnych sekrečných systémov a/alebo ich vylučovaných substrátov počas infekcie136. Pretože bakteriálna sekrécia virulentných proteínov môže prebiehať mnohými rôznymi mechanizmami, hostiteľský imunitný systém vyvinul viacero spôsobov snímania týchto procesov (Obr. 3.8). Obr. 3.8 Mechanizmy vrodeného imunitného rozpoznávania sekrečných systémov baktérií (Green a Mecsas 2016; upravené)1. Na rozlíšenie medzi patogénnymi a komenzálnymi baktériami vrodený imunitný systém využíva rôzne metódy na priame rozpoznanie vzorov jedinečných pre bakteriálne patogény, ku ktorým patria aj systémy sekrécie proteínov. Imunitný systém dokáže zachytiť niekoľko aspektov sekrécie bakteriálnych proteínov. Tieto zahŕňajú tvorbu pórov sekrečnými systémami alebo sekretovanými proteínmi, aberantnú translokáciu bakteriálnych molekúl do cytosólu, prítomnosť efektorových proteínov a/alebo ich aktivity, ako aj samotné zložky sekrečných systémov. Jedným z mechanizmov, ktorým dokáže vrodená imunitná odpoveď detegovať bakteriálne sekrečné systémy, je vnímaním dostupnosti bakteriálnych produktov v cytosóle, teda vnútornom obsahu bakteriálnej bunky. Týmito produktmi sú často malé molekuly, ako je peptidoglykán, flagelín a LPS, ktoré môžu byť aberantne translokované do bakteriálnej cytoplazmy prostredníctvom bakteriálnych sekrečných systémov. Pretože tieto receptory sú obmedzené na bakteriálny cytosól, ich aktivácia by naznačovala špecifické použitie sekrečných systémov invadujúcim patogénom. 75
Jedným z takých príkladov je rodina cytoplazmatických receptorov nazývaných Nod-like receptory (NLR), ktoré môžu priamo snímať molekuly v cytosóle, vrátane LPS a flagelínu136. Aktivácia týchto receptorov vedie ku kaskáde signalizácií, ktorá v konečnom dôsledku indukuje produkciu zápalových cytokínov. Okrem toho, imunitný systém vyvinul metódy na priame vnímanie translokácie sekretovaných efektorov. Nedávne štúdie ukázali, že makrofágy dokážu vnímať manipuláciu Rho GTPáz efektorom Yersinia T3SS YopE137. Následne detekcia tohto signálu (prostredníctvom neznámeho mechanizmu) vyvoláva odpoveď makrofágov, čo v konečnom dôsledku vedie k odstráneniu intracelulárnych baktérií. Vrodený imunitný systém cicavcov môže takisto detegovať narušenie celistvosti bunkových membrán póry-tvoriacimi proteínmi, ku ktorým patria translokóny systému T3SS alebo CDC Gram-pozitívnych patogénov, ktoré sú často vylučované alebo inzertované bakteriálnymi sekrečnými systémami, ktoré priamo doručujú efektorové proteíny do cieľových buniek. Napríklad sa ukázalo, že tvorba pórov pomocou SLO u Streptococcus pyogenes aktivuje receptor NLRP3 rodiny NLR138. Táto aktivácia nakoniec stimuluje produkciu zápalových cytokínov, ktoré pomáhajú hostiteľovi reagovať na infekciu a odstrániť ju. Nakoniec existujú určité dôkazy, že imunitný systém hostiteľa dokáže detegovať zložky sekrečných kanálov, ktoré vyčnievajú z bakteriálnej membrány, ako je ihla T3SS alebo komponenty translokónu. Nedávno bolo dokázané, že rozpoznanie niekoľkých T3SS ihlových proteínov, vrátane YscF u Yersinia spp. a MxiH u Shigella spp., môžu vyvolať produkciu prozápalových cytokínov v hostiteľských bunkách139. Záverom môžeme povedať, že bakteriálne patogény majú a využívajú viaceré možnosti pri invázii svojich hostiteľov, resp. pri poškodzovaní ich tkanív alebo orgánov a zabránení efektívnej imunitnej odpovedi. Jednou z takýchto možností je aj sekrécia bakteriálnych proteínov cez fosfolipidové bunkové membrány. V závislosti na ich spôsobe života sa u nich vyvinuli aj viaceré sekrečné systémy, pomocou ktorých sa tieto proteíny injikujú, buď priamo do hostiteľských buniek alebo do ich bezprostredného okolia tak, aby v patogenéze danej infekcie mohli plniť svoju funkciu a prispieť k virulencii patogénu. Z tohto dôvodu štúdium systémov sekrécie proteínov bakteriálnymi patogénmi zostáva i naďalej dôležitou oblasťou štúdia patogenézy bakteriálnych infekcií. 76
ZOZNAM SKRATIEK ADP Adenozíndifosfát ATP Adenozíntrifosfát CDC Cholesterol-Dependent Cytolysins (Cytolyzíny závislé od cholesterolu) CLD C39-podobná peptidázová doména DNA Deoxyribonukleová kyselina DUF Domain of Unknown Function (Doména s neznámou funkciou) EccB-EccE Membránové proteíny EHEC Enterohemoragické kmene Escherichia coli EPEC Enteropatogénne kmene Escherichia coli ESX Mycobacterial 6-kDa Early Secreted antigenic target (ESAT-6) system ETEC (ESX) (Sekrečný systém T7SS Mycobaterium tuberculosis) GSP Enterotoxigénne kmene Escherichia coli General Secretion of Proteins (Všeobecná dráha sekrécie proteínov); HlyA tiež označovaná ako Sec HMW 1, HMW2 Hemolyzín A High Molecular Weight adhesins 1, 2 (Adhezíny vysokej molekulovej kryo-EM LPS hmotnosti) MARTX Kryogénna elektrónová mikroskopia MFP MycP Lipopolysacharid NAD+ NLR Multifunctional Autoprocessing Repeats-in-Toxin OMF Membránový fúzny proteín RNA Membránový proteín RTX Nikotínamidadeníndinukleotid Sec SecA Nod-like receptory SecA2-SecY2 Outer Membrane Factor (Faktor vonkajšej membrány) SecA1, SecA2 Ribonukleová kyselina SecY, SecE, SecG Repeats in toxin proteín SLO Secretion (Všeobecná dráha sekrécie proteínov) Periférne viazaná ATP-áza SPN Typ sekrečného systému, tiež označovaný ako aSec Sekrečný systém u Gram-pozitívnych baktérií SrtA Integrálne membránové kanálové proteíny SRP Cholesterol-dependent cytolysin Streptolysin O (Streptolyzín O – T1SS – T11SS Cytolyzín) Tat Streptococcus pyogenes NAD+ glycohydrolase (NAD+ glykohydroláza Streptococcus pyogenes) Sortáza A Signal Recognition Particle (Špecifická signálna sekvencia) Type 1 – 11 Secretion System (Sekrečný systém typu I – XI) Twin-arginine translocation 77
LITERATÚRA 1. Green, E. R. & Mecsas, J. Microbiol Spectr 4, (2016) 2. Burdette, L. A. et al. Microb Cell Fact 17, 196, (2018) 3. Hurych, J. e. a. Lékařská mikrobiologie Repetitorium. (2020). 4. Shea, J. E. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 2593-7, (1996) 5. Troisfontaines, P. & Cornelis, G. R. Physiology (Bethesda) 20, 326-39, (2005) 6. Natale, P. et al. Biochim Biophys Acta 1778, 1735-56, (2008) 7. Papanikou, E. et al. Nat Rev Microbiol 5, 839-51, (2007) 8. Robinson, C. & Bolhuis, A. Biochim Biophys Acta 1694, 135-47, (2004) 9. Korotkov, K. V. et al. Nat Rev Microbiol 10, 336-51, (2012) 10. Lenz, L. L. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 12432-7, (2003) 11. Randall, L. L. & Hardy, S. J. Cell Mol Life Sci 59, 1617-23, (2002) 12. Hartl, F. U. et al. Cell 63, 269-79, (1990) 13. Mogensen, J. E. & Otzen, D. E. Mol Microbiol 57, 326-46, (2005) 14. Luirink, J. & Sinning, I. Biochim Biophys Acta 1694, 17-35, (2004) 15. Sijbrandi, R. et al. J Biol Chem 278, 4654-9, (2003) 16. Paetzel, M. et al. Chem Rev 102, 4549-80, (2002) 17. Berks, B. C. et al. Curr Opin Microbiol 8, 174-81, (2005) 18. Sargent, F. et al. J Biol Chem 274, 36073-82, (1999) 19. Pop, O. et al. J Biol Chem 277, 3268-73, (2002) 20. Muller, M. Res Microbiol 156, 131-6, (2005) 21. Ochsner, U. A. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 8312-7, (2002) 22. Lavander, M. et al. Infect Immun 74, 1768-76, (2006) 23. Pradel, N. et al. Infect Immun 71, 4908-16, (2003) 24. Rossier, O. & Cianciotto, N. P. Infect Immun 73, 2020-32, (2005) 25. McDonough, J. A. et al. J Bacteriol 190, 6428-38, (2008) 26. Songer, J. G. Trends Microbiol 5, 156-61, (1997) 27. Trivedi, A. et al. Front Microbiol 13, 845563, (2022) 28. Thomas, S. et al. Biochim Biophys Acta 1843, 1629-41, (2014) 29. Symmons, M. F. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 7173-8, (2009) 30. Piddock, L. J. Nat Rev Microbiol 4, 629-36, (2006) 31. Delepelaire, P. Biochim Biophys Acta 1694, 149-61, (2004) 32. Kanonenberg, K. et al. Res Microbiol 164, 596-604, (2013) 33. Letoffe, S. et al. EMBO J 15, 5804-11, (1996) 34. Pimenta, A. L. et al. Mol Gen Genet 261, 122-32, (1999) 35. Lee, M. et al. PLoS One 7, e40460, (2012) 36. Balakrishnan, L. et al. J Mol Biol 313, 501-10, (2001) 37. Wu, K. H. & Tai, P. C. J Biol Chem 279, 901-9, (2004) 38. Lecher, J. et al. Structure 20, 1778-87, (2012) 39. Linhartova, I. et al. FEMS Microbiol Rev 34, 1076-112, (2010) 40. Dolores, J. S. et al. Mol Microbiol 95, 590-604, (2015) 41. Welch, R. A. et al. Nature 294, 665-7, (1981) 42. Hughes, C. et al. Toxicon 20, 247-52, (1982) 43. Mackman, N. & Holland, I. B. Mol Gen Genet 196, 129-34, (1984) 44. Voulhoux, R. et al. EMBO J 20, 6735-41, (2001) 45. Cianciotto, N. P. Trends Microbiol 13, 581-8, (2005) 46. Korotkov, K. V. et al. Trends Biochem Sci 36, 433-43, (2011) 47. Sauvonnet, N. et al. EMBO J 19, 2221-8, (2000) 48. Hobbs, M. & Mattick, J. S. Mol Microbiol 10, 233-43, (1993) 49. Shevchik, V. E. et al. EMBO J 16, 3007-16, (1997) 50. Sandkvist, M. et al. J Bacteriol 179, 6994-7003, (1997) 51. Lu, H. M. & Lory, S. EMBO J 15, 429-36, (1996) 52. Cianciotto, N. P. Curr Top Microbiol Immunol 376, 81-102, (2013) 53. Kulkarni, R. et al. PLoS One 4, e4752, (2009) 54. Tauschek, M. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 7066-71, (2002) 55. Lathem, W. W. et al. Mol Microbiol 45, 277-88, (2002) 56. Pugsley, A. P. et al. J Bacteriol 166, 1083-8, (1986) 57. Jiang, B. & Howard, S. P. Mol Microbiol 6, 1351-61, (1992) 58. Buttner, D. Microbiol Mol Biol Rev 76, 262-310, (2012) 78
59. Abrusci, P. et al. Curr Opin Struct Biol 25, 111-7, (2014) 60. Burkinshaw, B. J. & Strynadka, N. C. Biochim Biophys Acta 1843, 1649-63, (2014) 61. Kubori, T. et al. Science 280, 602-5, (1998) 62. Deane, J. E. et al. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun 62, 302-5, (2006) 63. Demers, J. P. et al. Nat Commun 5, 4976, (2014) 64. Dohlich, K. et al. PLoS Pathog 10, e1003881, (2014) 65. Radics, J. et al. Nat Struct Mol Biol 21, 82-7, (2014) 66. Price, S. B. et al. J Bacteriol 173, 2649-57, (1991) 67. Picking, W. L. et al. Infect Immun 73, 1432-40, (2005) 68. Holmstrom, A. et al. Mol Microbiol 39, 620-32, (2001) 69. Hakansson, S. et al. Infect Immun 61, 71-80, (1993) 70. Hakansson, S. et al. EMBO J 15, 5812-23, (1996) 71. Cornelis, G. R. Nat Rev Microbiol 4, 811-25, (2006) 72. Akopyan, K. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 1639-44, (2011) 73. Edgren, T. et al. PLoS Pathog 8, e1002669, (2012) 74. Pendergrass, H. A. & May, A. E. Antibiotics (Basel) 8, (2019) 75. Angot, A. et al. PLoS Pathog 3, e3, (2007) 76. Tosi, T. et al. Res Microbiol 164, 605-19, (2013) 77. Cascales, E. & Christie, P. J. Nat Rev Microbiol 1, 137-49, (2003) 78. Costa, T. R. et al. Nat Rev Microbiol 13, 343-59, (2015) 79. Lessl, M. & Lanka, E. Cell 77, 321-4, (1994) 80. Fronzes, R. et al. Nat Rev Microbiol 7, 703-14, (2009) 81. Babic, A. et al. Science 319, 1533-6, (2008) 82. Hamilton, H. L. & Dillard, J. P. Mol Microbiol 59, 376-85, (2006) 83. Backert, S. & Meyer, T. F. Curr Opin Microbiol 9, 207-17, (2006) 84. Isberg, R. R. et al. Nat Rev Microbiol 7, 13-24, (2009) 85. Pohlner, J. et al. Nature 325, 458-62, (1987) 86. Leyton, D. L. et al. Nat Rev Microbiol 10, 213-25, (2012) 87. van Ulsen, P. et al. Biochim Biophys Acta 1843, 1592-611, (2014) 88. Leo, J. C. et al. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 367, 1088-101, (2012) 89. Brandon, L. D. et al. Mol Microbiol 50, 45-60, (2003) 90. Brotcke Zumsteg, A. et al. Cell Host Microbe 15, 435-45, (2014) 91. Roggenkamp, A. et al. J Bacteriol 185, 3735-44, (2003) 92. Wagner, J. K. et al. J Bacteriol 191, 815-21, (2009) 93. Ruiz-Perez, F. et al. J Bacteriol 191, 6571-83, (2009) 94. Lambert-Buisine, C. et al. Mol Microbiol 28, 1283-93, (1998) 95. McCann, J. R. & St Geme, J. W., 3rd. PLoS Pathog 10, e1003977, (2014) 96. Waksman, G. & Hultgren, S. J. Nat Rev Microbiol 7, 765-74, (2009) 97. Wright, K. J. et al. Cell Microbiol 9, 2230-41, (2007) 98. Mougous, J. D. et al. Science 312, 1526-30, (2006) 99. Russell, A. B. et al. Nature 475, 343-7, (2011) 100. Russell, A. B. et al. Nat Rev Microbiol 12, 137-48, (2014) 101. Pukatzki, S. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 15508-13, (2007) 102. English, G. et al. Mol Microbiol 86, 921-36, (2012) 103. Ho, B. T. et al. Cell Host Microbe 15, 9-21, (2014) 104. Hammar, M. et al. Mol Microbiol 18, 661-70, (1995) 105. Bhoite, S. et al. EcoSal Plus 8, (2019) 106. Gorasia, D. G. et al. Microorganisms 8, (2020) 107. Sato, K. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 107, 276-81, (2010) 108. McBride, M. J. Microbiol Spectr 7, (2019) 109. McBride, M. J. & Nakane, D. Curr Opin Microbiol 28, 72-7, (2015) 110. Palmer, T. et al. Mol Microbiol 115, 345-55, (2021) 111. Grossman, A. S. et al. mBio 12, e0195621, (2021) 112. Votava M. et al. Lekárska mikrobiologie obecná. (2005). 113. Bednář, M., et al. Lékařská mikrobiologie : bakteriologie, virologie, parazitologie., 558 (1996.) 114. Liptáková, A. Lekárska mikrobiológia. 8 edn, 916 (2019). 115. Pilipčinec, E. Gram-negatívne baktérie. 384 (2018). 116. de Keyzer, J. et al. Cell Mol Life Sci 60, 2034-52, (2003) 117. Lee, V. T. & Schneewind, O. Genes Dev 15, 1725-52, (2001) 118. Mistou, M. Y. et al. J Bacteriol 191, 4195-206, (2009) 79
119. Hendrickx, A. P. et al. Nat Rev Microbiol 9, 166-76, (2011) 120. Mazmanian, S. K. et al. Science 285, 760-3, (1999) 121. Madden, J. C. et al. Cell 104, 143-52, (2001) 122. Ghosh, J. & Caparon, M. G. Mol Microbiol 62, 1203-14, (2006) 123. Tweten, R. K. Infect Immun 73, 6199-209, (2005) 124. Houben, E. N. et al. Biochim Biophys Acta 1843, 1707-16, (2014) 125. Stanley, S. A. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 13001-6, (2003) 126. Houben, E. N. et al. Mol Microbiol 86, 472-84, (2012) 127. Luthra, A. et al. J Biol Chem 283, 36532-41, (2008) 128. Ohol, Y. M. et al. Cell Host Microbe 7, 210-20, (2010) 129. Zuber, B. et al. J Bacteriol 190, 5672-80, (2008) 130. Lewis, K. N. et al. J Infect Dis 187, 117-23, (2003) 131. Gey Van Pittius, N. C. et al. Genome Biol 2, RESEARCH0044, (2001) 132. Way, S. S. & Wilson, C. B. Infect Immun 73, 6151-3, (2005) 133. Coros, A. et al. Mol Microbiol 69, 794-808, (2008) 134. Siegrist, M. S. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 18792-7, (2009) 135. Ekiert, D. C. & Cox, J. S. Proc Natl Acad Sci U S A 111, 14758-63, (2014) 136. Vance, R. E. et al. Cell Host Microbe 6, 10-21, (2009) 137. Wang, X. et al. PLoS Pathog 10, e1004346, (2014) 138. Harder, J. et al. J Immunol 183, 5823-9, (2009) 139. Osei-Owusu, P. et al. Infect Immun 83, 1507-22, (2015) 80
IV. EVAZIVITA A JEJ MECHANIZMY Ľudmila Tkáčiková, Mangesh Bhide, Evelína Mochnáčová 4.1 ODPOVEĎ IMUNITNÉHO SYSTÉMU NA BAKTERIÁLNU 82 INFEKCIU ......................................................................................... 88 4.2 ÚNIKOVÉ STRATÉGIE BAKTÉRIÍ PRED VRODENOU 88 IMUNITNOU ODPOVEĎOU .......................................................... 89 89 4.2.1 Únikové stratégie využívané na ochranu pred pôsobením 93 antimikrobiálnych peptidov ............................................................... 94 95 4.2.1.1 Klasifikácia AMP .............................................................................. 95 4.2.1.2 Mechanizmus účinku AMP ............................................................... 96 4.2.1.3 Mechanizmy zabezpečujúce rezistenciu baktérií voči AMP ............. 97 4.2.1.3.1 Modifikácia povrchu baktérií ......................................................... 98 99 4.2.1.3.2 Tvorba kapsuly ............................................................................... 4.2.1.3.3 Alterácia štruktúry cytoplazmatickej membrány ........................... 100 4.2.1.3.4 Extracelulárne proteíny baktérií ..................................................... 100 4.2.1.3.5 Biofilm a exopolyméry .................................................................. 108 4.2.1.3.6 Efluxné pumpy ............................................................................... 4.2.1.3.7 Systémy identifikujúce antimikrobiálne peptidy ............................ 109 4.2.2 Únikové stratégie využívané na ochranu pred pôsobením 110 komplementu ..................................................................................... 4.2.2.1 Komplementový systém .................................................................... 113 4.2.2.2 Bakteriálne únikové stratégie pred komplementovým systémom ..... 4.2.2.2.1 Cielené zneškodnenie komplementu v klasickej (KC) a 120 122 lektínovej ceste (LC): naviazanie C1-inh ....................................... 124 4.2.2.2.2 Cielené zneškodnenie komplementu v C3 konvertáze 125 126 klasickej (KC) a lektínovej cesty (LC): naviazanie C4BP ............. 127 4.2.2.2.3 Inhibícia alternatívnej cesty (AC): Faktor H a Faktor H-like 132 133 proteín ................................................................................................ 135 4.2.2.2.4 Inhibícia cesty tvorby terminálneho komplexu: naviazanie 138 140 vitronektínu (Vn) a klusterínu ......................................................... 142 4.2.3 Únikové stratégie využívané na prežitie vo fagocytoch .................... 4.2.3.1 Extravazácia a migrácie fagocytov .................................................... 143 4.2.3.1.1 Ovplyvnenie migrácie fagocytov .................................................... 4.2.3.2 Rozpoznanie mikrobiálnych patogénov ............................................ 4.2.3.2.1 Únik pred rozpoznaním .................................................................. 4.2.3.3 Pohltenie a tvorba fagolyzozómu ...................................................... 4.2.3.3.1 Ovplyvnenie tvorby fagolyzozómu ................................................ 4.2.3.4 Deštrukcia .......................................................................................... 4.2.3.4.1 Únik pred deštrukciou .................................................................... 4.2.3.5 Autofágia ........................................................................................... 4.2.3.6 Extracelulárne pasce .......................................................................... 4.3 ÚNIKOVÉ STRATÉGIE BAKTÉRIÍ PRED ADAPTÍVNOU IMUNITNOU ODPOVEĎOU .......................................................... 81
4.1 ODPOVEĎ IMUNITNÉHO SYSTÉMU NA BAKTERIÁLNU INFEKCIU Invadujúce mikroorganizmy musia pri vstupe do organizmu prekonať fyzickú bariéru, ktorú predstavuje neporušená koža alebo slizničný epitel, a zároveň aj odolať pôsobeniu antimikrobiálnych látok, ako je napr. lyzozým, nachádzajúcich sa na týchto povrchoch. V prípade gastrointestinálnych infekcií musí patogén odolávať aj kyslému pH žalúdka a pôsobeniu žlčových solí. Ak invadujúce baktérie prekročia tieto epitelové bariéry, potom je úlohou zložiek vrodenej imunity, aby ich rozpoznali a zničili. V mnohých prípadoch je aktivácia vrodeného imunitného systému dostatočná na odstránenie invadérov, avšak ak to nestačí, aktivujú sa zložky adaptívneho (špecifického) imunitného systému, ktoré sa budú podieľať na ich odstránení. Vrodený imunitný systém Pri invázii do tkanív a telesných tekutín musí patogén prežiť útok vopred vytvorených antimikrobiálnych peptidov (AMP = Antimicrobial Peptides), ako sú defenzíny a katelicidíny vylučované epitelovými bunkami kože a slizničných povrchov1. Avšak najdôležitejšou antimikrobiálnou zložkou vrodeného imunitného systému je komplementový systém, ktorý tvorí viac ako 30 molekúl. Aktivácia komplementu môže viesť nielen k priamemu usmrteniu baktérií, vďaka komplementom indukovanej tvorbe dier v bakteriálnych membránach, ale aj k opsonizácií baktérií a k aktivácii lokálnej zápalovej reakcie2. Ak patogén prežije tento chemický útok, epitelové bunky, stromálne bunky, endotelové bunky a lokálne tkanivové makrofágy začnú produkovať množstvo cytokínov potrebných na aktiváciu buniek vrodeného imunitného systému, ktorých úlohou je pohltiť – fagocytovať prítomné invadéry3. Tieto bunky sú priťahované do ohniska infekcie chemoatraktantmi, procesom nazývaným chemotaxia. Prvými bunkami, pritiahnutými do ohniska infekcie, sú polymorfonukleárne neutrofily. Neutrofily sú bunky s krátkou životnosťou, ktoré sa v cirkulujúcej krvi nachádzajú vo veľkom počte a ktoré môžu v priebehu niekoľkých minút reagovať na prítomnosť invadérov. Druhou subpopuláciou fagocytov, aktivovanou v mieste zápalu, sú tkanivové makrofágy, ktoré sa v tkanivách diferencujú z cirkulujúcich monocytov3. Akonáhle sa neutrofily a makrofágy nahromadia v mieste infekcie, pohlcujú invadéry procesom fagocytózy. Pohltený patogén sa vo fagocyte nachádza vo vakuole známej ako fagozóm. Fagozóm následne fúzuje s intracelulárnymi vezikulami, lyzozómami, čím sa vytvorí fagolyzozóm3. V lyzozómoch sa nachádzajú rôzne hydrolytické enzýmy, proteázy a antimikrobiálne peptidy, ktoré sú nápomocné pri likvidácii patogéna4. Súčasne sa aktivuje 82
NADPH-oxidázový komplex (NOX), ktorý produkuje superoxidový aniónový radikál, silné baktericídne činidlo. Superoxid tvorí aj východiskový bod pre produkciu ďalších baktericídne pôsobiacich reaktívnych foriem kyslíka (ROS = Reactive Oxygen Species), ako je peroxid vodíka a hydroxylové radikály5. V makrofágoch je navyše aktivovaná aj cytoplazmatická syntáza oxidu dusnatého (iNOS = Inducible NOS), vďaka čomu v nich vznikajú aj reaktívne formy dusíka (RNS = Reactive Nitrogen Species), ktoré taktiež prispievajú k usmrcovaniu pohltených baktérií. Fagocyty sú aktivované, ak tieto bunky rozpoznali prítomnosť cudzieho alebo poškodeného materiálu. Toto rozpoznanie zabezpečujú tzv. receptory na rozpoznávanie vzorov (PRR = Pattern Recognition Receptor), ktoré rozpoznávajú charakteristické štruktúry mikroorganizmov, tzv. molekulové vzory spojené s mikróbmi (MAMP = Microbe-Associated Molecular Patterns). Medzi PRR, ktoré aktivujú fagocytózu, patria napr. lektínové receptory typu C (CLRs = C-type Lectin Receptors), ktoré rozpoznávajú neobvyklé sacharidové skupiny a tzv. upratovacie (scavenger) receptory typu A, ktoré rozpoznávajú zložky bakteriálnej bunkovej steny6. Hlavnou skupinou molekúl, zodpovedných za rozpoznávanie mikroorganizmov, je skupina tzv. Toll-like receptorov (TLR = Toll-like receptor). Existuje najmenej 10 rôznych TLR, lokalizovaných buď na bunkovom povrchu alebo v intracelulárnych membránach, pričom každý slúži ako receptor pre jednu alebo viac špecifických MAMP molekúl7. Aktivácia TLR-sprostredkovaných signálnych dráh vedie k expresii množstva pro- zápalových cytokínov, ako sú IL-1, TNF-, IL-6 a interferóny typu 18. Ďalšími dôležitými PRR sú v cytosóle lokalizované NOD-like receptory (NLR), ktoré tvoria multimolekulové komplexy, tzv. inflamazómy, ktorých aktivácia vedie v aktivácii kaspáz a produkcii pro- zápalových cytokínov9. V cytosóle sa nachádzajú aj RIG-I like receptory (RLRs = Retinoic acid-inducible gene I ), ktoré rozpoznávajú vírusové RNA10. Tretím typom fagocytov, nachádzajúcich sa v tkanivách, sú dendritové bunky (DC = Dendritic Cells). Tieto bunky patria medzi profesionálne antigén prezentujúce bunky (APC = Antigen presentig cell), keďže vedia pohltené antigény invadérov spracovať a následne prezentovať v komplexoch s molekulami hlavného histokompatibilného systému (MHC = Major Histocompatibility Complex) na povrchu bunky11. DC migrujú z tkanív do lymfatických uzlín, kde tieto antigénne peptidy prezentujú T-lymfocytom, vďaka čomu sa DC významnou mierou podieľajú na aktivácii adaptívnej imunitnej odpovede12. Ďalšími bunkami, podieľajúcimi sa na vzniku zápalu pri aktivácii vrodenej imunitnej odpovede, sú mastocyty (žírne bunky) a bazofily. Aktivácia týchto buniek vedie k ich rýchlej degranulácii 83
a uvoľneniu množstva bioaktívnych molekúl, ako sú histamín, prostaglandíny, leukotriény a TNF-, ktoré iniciujú lokálnu zápalovú odpoveď13. Dôležitú úlohu pri obrane pred intracelulárnymi patogénmi, ako sú vírusy, majú majú priroddené zabíjačské bunky (NK = Natural Killer cells). Tieto bunky rozpoznávajú infikované bunky na základe zníženej expresie MHC molekúl triedy I, rozpoznania prítomnosti neklasických MHC molekúl MICA (MHC I Chain-related protein A) alebo MICB (MHC I Chain-related protein B) alebo ich opsonizácie IgG protilátkami. Aktivácia NK buniek vedie k ich degranulácii a uvoľneniu obsahu ich cytotoxických granúl, ktoré aktivujú apoptózu infikovanej bunky14. Adaptívny imunitný systém Vrodená imunitná odpoveď napomáha odstrániť väčšinu infekcií skôr, ako dôjde k poškodeniu organizmu, avšak ak tento systém nie je schopný vyrovnať sa s prítomnými patogénmi, potom je potrebná aktivácia adaptívneho imunitného systému. Hlavnú úlohu v adaptívnom imunitnom systéme majú T- a B-lymfocyty (Obr. 4.1). Obr. 4.1 Úloha T- a B-lymfocytov v adaptívnej imunitnej odpovedi (Brady, J. a kol. 2020 upravené)17. Prvým krokom pri aktivácii adaptívneho imunitného systému je transport antigénov a buniek prezentujúcich antigén (APC) do lymfatických uzlín, kde tieto bunky prezentujú antigénne 84
peptidy T-lymfocytom. Tieto antigény sú spracované, v závislosti od ich pôvodu, dvoma odlišnými mechanizmami a následne sú prezentované v komplexe s jednou z dvoch tried MHC molekúl15,16. Molekuly MHC triedy I sú exprimované prakticky na všetkých bunkách s jadrom, zatiaľ čo molekuly MHC triedy II sú exprimované iba na profesionálnych APC: dendritových bunkách, makrofágoch a B-lymfocytoch. T-lymfocyty dozrievajú v týmuse, kde sa môžu diferencovať na CD4+ pomocné T-bunky (Th = T helper) alebo CD8+ cytotoxické T-bunky (Tc = T cytotoxic) s αβ TCR (T-Cell Receptor). Profesionálne antigén prezentujúce bunky (APC) prezentujúce spracované antigénne peptidy z pohltených extracelulárnych patogénov (napr. baktérií a húb) v komplexe s MHC molekulami triedy II18. Takto prezentované antigény aktivujú CD4+ pomocné Th-lymfocyty, ktorých úlohou je tvoriť cytokíny – molekuly, ktorými je následne riadená imunitná odpoveď na prítomné invadéry. Naivné CD4+ Th-lymfocyty sa po stimulácii a aktivácii diferencujú na Th1, Th2, Th17 alebo Tfh a Treg bunky, ktoré majú rôzne efektorové funkcie (Obr. 4.1)19. Th1-lymfocyty sa vďaka tvorbe interferónu gama (IFN-γ), ktorý aktivuje makrofágy, NK bunky a CD8+ T-lymfocyty, podieľajú na eliminácii intracelulárnych patogénov, a to aj tých, ktoré môžu prežiť vo vnútri fagocytov, ako sú napr. mykobaktérie. Th-bunky zohrávajú dôležitú úlohu aj pri tvorbe protilátok. Na tejto úlohe sa podieľajú dve subpopulácie Th-buniek: Th2 bunky, ktoré interakciou s B-lymfocytmi a produkciou cytokínov (interleukíny: IL-4, IL-5 a IL-13) indukujú diferenciáciu B-lymfocytov na protilátky, produkujúce plazmatické bunky a pamäťové B-lymfocyty a subpopuláciu folikulárnych Th- lymfocytov (Tfh). Th2 bunky fungujú na periférii, zatiaľ čo Tfh bunky sú v germinálnych centrách lymfoidných folikulov. Proces, ktorým Tfh bunky regulujú dozrievanie a diferenciáciu B-buniek, stále nie je úplne objasnený, avšak aj tieto bunky vylučujú cytokíny (IL-4, IL-6, IL- 10, IL-21), ktoré zabezpečujú diferenciáciu plazmatických buniek20. Th17 bunky produkujú IL-17, ktorý stimuluje fibroblasty a epitelové bunky k vylučovaniu chemokínov a ďalších cytokínov (ako napr. TNF-), čo vedie k pritiahnutiu neutrofilov a makrofágov do miesta ich aktivácie21. Th17 bunky produkujú aj IL-22, ktorý v spojení s IL-17 pomáha podporovať lokálne vrodené obranné reakcie, napríklad produkciu antimikrobiálnych molekúl, ako sú defenzíny v epitelových bunkách a proteínov akútnej fázy v pečeni. Th17 bunky sa svojimi cytokínmi podieľajú aj na vzniku autoimunitných ochorení22. Ďalšia subpopulácia CD4+ buniek – regulačné T bunky (Treg = Regulatory T cells) – sa podieľa, vďaka produkcii cytokínov (transformujúci rastový faktor beta, TGF-β a IL-10), na potlačení imunitnej odpovede23 . 85
CD8+ cytotoxické T-lymfocyty komplexom CD8 molekuly s T-bunkovým receptorom (TCR) rozpoznávajú peptid vzniknutý po spracovaní intracelulárnych antigénov (napr. vírusových peptidov) naviazaných na MHC molekuly triedy I, čo vedie k tomu, že cytotoxické T- lymfocyty zabíjajú takto rozpoznanú cieľovú bunku. Keďže MHC molekuly I. triedy sú exprimované prakticky na všetkých bunkách s jadrom, tieto interakcie sú základným mechanizmom obrany pri vírusovej infekcii24. Na rozdiel od klasických αβ T-lymfocytov, ktoré rozpoznávajú široké spektrum peptidových antigénov prezentovaných v komplexe s molekulami MHC triedy I alebo triedy II, neklasické T bunky majú obmedzenejší repertoár a rozpoznávajú nepeptidové antigény prezentované nepolymorfnými molekulami podobnými MHC molekulám triedy I. Príkladom týchto lymfocytov sú: invariantné prirodzené zabíjačské T-lymfocyty (iNKT = invariant Natural Killer T Cell), ktoré detegujú glykolipidové antigény prezentované CD1d25 a invariantné T- lymfocyty spojené so sliznicou (MAIT = Mucosal-Associated Invariant T Cell), ktoré rýchlo reagujú a uvoľňujú cytokíny ako odpoveď na infekciu. MAIT bunky exprimujú MHC I- podobnú molekulu MR1 (Major histocompatibility complex class I-related gene protein), ktorá viaže metabolity riboflavínu baktérií a húb. Keďže u cicavcov chýbajú anabolické dráhy syntézy riboflavínu, MAIT bunky môžu rozpoznávať tieto metabolické medziprodukty ako cudzie (non-self)26. γδ T-lymfocyty taktiež nevyžadujú prezentáciu antigénov v klasických MHC molekulách. Ligandy pre väčšinu γδ TCR nie sú presne charakterizované, aj keď pravdepodobnými antigénmi, ktoré tieto bunky rozpoznávajú, sú proteíny tepelného šoku (HSP = Heat Shock Proteins), MHC molekuly triedy Ib a možno nukleotidy a fosfolipidy27. Na adaptívnej imunitnej odpovedi sa okrem T-lymfocytov podieľajú aj B-lymfocyty, z ktorých sa diferencujú protilátky produkujúce plazmatické bunky (Obr. 4.1). B lymfocyty delia sa na dve subpopulácie označené ako B-1 a B-2. B-1 lymfocyty môžu reagovať na polysacharidové alebo fosfolipidové antigény nezávisle od pomoci Th-lymfocytov. Plazmatické bunky, vzniknuté z B-1 lymfocytov, sekretujú polyreaktívne IgM alebo IgA protilátky (pomenované aj ako tzv. prirodzené protilátky), avšak nediferencujú sa z nich pamäťové bunky28. Subpopulácia B-2 lymfocytov je aktivovaná kombináciou väzby antigénu na B-bunkový receptor a interakciou s Tfh-lymfocytom rozpoznávajúcim rovnaký antigén. Táto interakcia vedie k stimulácii proliferácie a klonálnej expanzii B-lymfocytov28. Počas tohto antigénom riadeného proliferačného procesu, B-lymfocyty migrujú do primárneho lymfoidného folikulu za vzniku germinálneho centra. Tu dochádza k viacnásobným bodovým mutáciám v génovom lokuse kódujúcom tvorbu protilátky, ktoré majú viesť k tvorbe protilátok s vysokou afinitou pre 86
daný antigén (afinitnej maturácii). Ako prvé sú tvorené IgM protilátky, avšak pri následnej expozícii rovnakému antigénu a pod vplyvom priamej interakcie a cytokínov Tfh lymfocytov dochádza v B-lymfocytoch k rýchlemu preskupenia génov v lokuse kódujúcom izotyp protilátky, vďaka čomu dôjde k zmene triedy (izotypovému prepnutiu) sekrétovaných protilátok z IgM na IgG, IgA alebo IgE . Nakoniec sa B-lymfocyty diferencujú na plazmatické bunky. Existuje aj tretia subpopulácia B-lymfocytov pomenovaná ako Breg (Regulatory B-cells) lymfocyty. Regulačná funkcia týchto lymfocytov je pripisovaná ich produkcii IL-10, ktorým tieto bunky potláčajú zápalovú reakciu a autoimunitné reakcie29. Protilátky – imunoglobulíny (Ig) sú antigén viažuce proteíny. Všetky protilátky sú tvorené z rovnakej základnej jednotky (monoméru) obsahujúcej dva identické ťažké (H) reťazce a dva identické ľahké (L) reťazce spojené disulfidovými väzbami (Obr. 4.2 A). Každý reťazec má dve časti: variabilná oblasť, ktorá má variabilné aminokyselinové zloženie a konštantná oblasť, ktorá má konštantné aminokyselinové zloženie. Každá protilátka má dve časti oddelené pántovou oblasťou: Fab koniec, ktorý viaže antigén a Fc koniec, ktorý určuje efektorovú funkciu protilátky, napr. to, ako sa protilátka viaže na špecifické bunkové receptory alebo iné obranné proteíny30. Obr. 4.2 Štruktúra protilátok. Stavba monoméru (A) a jednotlivých tried protilátok (B) (vlastný obrázok). Protilátky sú rozdelené do piatich tried (IgM, IgG, IgA, IgE a IgD) (Obr. 4.2 B), pričom každá trieda má špecifické funkcie spojené s elimináciou patogénov (Tab. 4.1)30. Protilátky cirkulujúce v krvi sú efektorovými molekulami humorálnej imunity; ich úlohou je (1) neutralizácia – blokovanie vírusov, baktérií alebo bakteriálnych toxínov; (2) opsonizácia bakteriálnych povrchov na zlepšenie fagocytózy; a (3) aktivácia komplementu. 87
Typickým prejavom adaptívnej imunitnej odpovede je imunologická pamäť. Ako bolo opísané vyššie, antigén-špecifické T- a B-lymfocyty sú aktivované počas prvej expozície s invadérom a väčšina týchto buniek sa diferencuje na efektorové bunky, úlohou ktorých je kontrolovať infekciu. Z malej časti týchto buniek sa na konci primárnej imunitnej odpovede diferencujú dlho žijúce pamäťové T- a B-lymfocyty31,32. Tieto pamäťové bunky sú pri sekundárnej imunitnej odpovedi rýchlo aktivované, čo vedie k oveľa rýchlejšej a agresívnejšej imunitnej odpovedi na invadéry, s ktorými sa už imunitný systém raz stretol. Tab. 4.1 Charakteristika jednotlivých tried protilátok (Schroeder a Cavacini 2010)30 Charakteristika Ig IgM IgG IgA IgE IgD δ Typ H reťazca μ γ α Ε Monomér Štruktúra Pentamér Monomér Monomér Monomér Slezina alebo dimér a lymfatické uzliny Slezina Slezina Črevný Črevný - a respiračný a respiračný - Hlavné miesto tvorby a lymfatické a lymfatické - - Aktivácia komplementu uzliny uzliny trakt trakt Opsonizácia +++ + - - - Neutralizácia + +++ + - + + + - - Prechod cez placentu - + - - Ďalšie funkcie Primárna Sekundárna Ochrana Obrana pred Podtriedy imunitná imunitná slizníc parazitmi odpoveď odpoveď alergia IgA1, IgA2 - - IgG1 až IgG41 FcR - FcR, FcR FcR 1 V závislosti od živočíšneho druhu. (CD64, CD32, (CD89) (CD23) CD16) 4.2 ÚNIKOVÉ STRATÉGIE BAKTÉRIÍ PRED VRODENOU IMUNITNOU ODPOVEĎOU 4.2.1 Únikové stratégie využívané na ochranu pred pôsobením antimikrobiálnych peptidov Antimikrobiálne peptidy (AMP) sa nachádzajú vo všetkých formách života, od baktérií po rastliny, stavovce či bezstavovce. AMP pôsobia voči širokému spektru baktérií, húb, prvokov, vírusov a dokonca aj rakovinových buniek33,34. AMP, ako súčasť vrodenej imunity, sú u cicavcov produkované nielen epitelovými bunkami, ale aj bunkami imunitného systému (napr. fagocytmi). Gramicidín bol prvý antimikrobiálny peptid izolovaný z pôdnej baktérie Bacillus brevis v roku 1939 a defenzíny boli prvé živočíšne AMP izolované z leukocytov králika35. 88
V súčasnosti je v databáze antimikrobiálnych peptidov (APD3 = Antimicrobial Peptide Database 3, jún 2022) opísaných viac ako 3324 AMP, z ktorých 2446 pochádza zo živočíchov. 4.2.1.1 Klasifikácia AMP AMP majú rôznorodú štruktúru, funkciu a pôvod, a preto môžu byť klasifikované na základe rôznych kritérií. Na základe biologického zdroja sa rozlišujú AMP pochádzajúce z ľudských a cicavčích zdrojov34. Avšak AMP majú aj obojživelníci36, ryby37, hmyz38 a rastliny39 (Tab. 4.2). Na základe biologických účinkov delíme AMP na antibakteriálne, antivírusové, antifungálne, antiparazitárne peptidy. Na základe celkového náboja AMP sa delia na AMP s kladným nábojom (88 %), AMP bez náboja (6 %) a AMP so záporným nábojom (6 %)40. Ďalšie delenie je založené na biochemických vlastnostiach AMP (aminokyselinové zloženie, dĺžka, hydrofóbnosť), kde konformácia a štruktúra tiež slúžia ako kritérium klasifikácie34. Napriek svojej diverzite majú AMP niekoľko spoločných vlastností: AMP sú krátke peptidy s počtom aminokyselín (AA = Amino Acids) v ich reťazci v rozmedzí 10 až 60 (priemer: 33,27). Takmer všetky AMP majú pri neutrálnom pH kladný náboj (CAMP = Cationic Antimicrobial Peptides) (priemerný čistý náboj: 3,32), vďaka čomu sú elektrostaticky priťahované na negatívne nabité bakteriálne membrány40. AMP sú amfipatické peptidy, čo znamená, že ich aminokyseliny sú usporiadané do špirály, pričom bočné reťazce hydrofóbnych aminokyselín sú orientované na jednu stranu a bočné reťazce polárnych aminokyselín na druhú stranu34. 4.2.1.2 Mechanizmus účinku AMP AMP pôsobia mechanizmom, ktorý im umožňuje pôsobiť iba na mikroorganizmy a zároveň nepoškodiť živočíšne bunky. Táto selektivita je daná rozdielmi v stavbe buniek. Bakteriálne bunky majú membrány zložené zo záporne nabitých fosfolipidov (fosfatidylglycerol, PG = Phosphatidylglycerol, fosfatidylserín, PS = Phosphatidylserine a difosfatidylglycerol, DPG = Diphosphatidylglycerol, tiež nazývaný kardiolipín), ktoré spoločne s ďalšími povrchovými štruktúrami dávajú bakteriálnym bunkám celkovo negatívny náboj, vďaka čomu elektrostaticky priťahujú AMP s kladným nábojom. Živočíšne bunky majú vo svojich membránach skôr neutrálne fosfolipidy (sfingolipidy a fosfatidylcholín, PC). 89
Bunkové membrány cicavcov tiež obsahujú záporne nabité fosfolipidy ako fosfatidylserín (PS), tie sa však väčšinou nachádzajú v cytosólovom liste fosfolipidovej dvojvrstvy40. Na rozdiel od bakteriálnych membrán obsahujú membrány cicavcov aj steroid cholesterol. Tab. 4.2 Delenie antimikrobiálnych peptidov na základe ich vlastností (https://aps.unmc.edu) Kritérium Označenie (charakteristika) Príklad hodnotenia AMP s kladným nábojom (88 %) Defenzíny, katelicidíny AMP bez náboja (6 %) Temporíny Celkový AMP so záporným nábojom (6 %) SAAP, chromacín, TAP, elektrický náboj peptid B (enkelytín), kapacíny, dermicidín Kovalentné Trieda I (UCL1L) Lineárne jednoreťazcové peptidy LL-37 a magainíny väzby Enterocín L50 Dva lineárne peptidy, ktoré nie sú spojené kovalentnou väzbou Trieda II (UCSS) Peptidy spojené s bočným reťazcom Defenzíny obsahujúce Spojenie bočný reťazec – bočný reťazec sa môže vyskytovať v rámci jedného disulfid alebo peptidového reťazca alebo medzi dvoma lantibiotiká obsahujúce tioéterovú väzbu rôznymi peptidovými reťazcami. Trieda III (UCSB) Polypeptidové reťazce so spojením Microcín J25, lariatiny, bočného reťazca s hlavným reťazcom fusaricidíny 3D štruktúra Trieda IV(UCBB) Kruhové polypeptidy s peptidovou väzbou -defenzíny, Skupina α medzi N- a C-koncom (t. j. spojenie entericín AS-58 Skupina β základného reťazca) AMP s α-helixovou štruktúrou Cekropín, dermicidín, magainín a katelicidín AMP s β-štruktúrou LL-37 Humánne α-defenzíny (HNP-1, HNP-4, HD-5), laktofericín B Skupina αβ AMP s α-helixovou a β-štruktúrou Humánne β-defenzíny, drozomycín Skupina non-αβ AMP, ktoré nemajú α-helixovú ani β- štruktúru Nizíny, indolicidín, drozocín Molekulový Peptidy zamerané bunkovú stenu/sacharidy, Nizíny a temporíny cieľ na bunkový lipidy/membrány, proteíny/receptory povrch Peptidy bohaté na prolín (Pro) Peptidy zamerané Proteíny na vnútrobunkové DNA prostredie RNA SAAP: Surfactant-Associated Anionic Peptides; TAP: Trypsinogen Activation Peptides; UCL: Universal Classification System; HNP: Human Neutrophil Peptide; APD3: Antimicrobial Peptide Database 3 (https://aps.unmc.edu/database); PDB: Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/) 90
AMP môžu pôsobiť extracelulárne alebo intracelulárne. Pri extracelulárnom pôsobení AMP interagujú s bakteriálnou membránou, vnárajú sa do nej svojou hydrofóbnou časťou a vytvárajú v nej póry (alebo inak narúšajú jej integritu), čo vedie k úniku životne dôležitých látok z bunky von a k jej zániku (Obr. 4.3). Obr. 4.3 Schematické znázornenie antibakteriálneho pôsobenia obranných peptidov s kladným nábojom (CHDP = Cationic Host Defence Peptides)/AMP (Mookherjee a kol. 2020; upravené)41 AMP môžu pôsobiť intracelulárne alebo extracelulárne. Ak AMP pôsobia intracelulárne, prechádzajú cez cytoplazmatickú membránu a zameriavajú sa na bunkové procesy nevyhnutné pre prežitie patogénu. Pri extracelulárnom pôsobení AMP interagujú s bakteriálnou membránou, vnárajú sa do nej svojou hydrofóbnou časťou a vytvárajú v nej póry (alebo inak narúšajú jej integritu), čo vedie k zániku bunky. AMP po vsunutí do membrány nasmerujú svoje hydrofóbne oblasti smerom k lipidovému jadru dvojvrstvy, čím vytvárajú transmembránový „sudovitý“ kanál. Ak sa AMP hromadia paralelne s povrchom membrány, vytvárajú „koberec“. Pri určitej koncentrácii peptidu sa dvojvrstvy narušia a vytvoria micely, čím sa naruší štruktúra membrány. Ak sa AMP vsunú kolmo do membrány prostredníctvom interakcií medzi lipidovou dvojvrstvou a hydrofilnou oblasťou peptidov, membrána sa deformuje a vytvára „toroidný pór“ (Obr. 4.3). Existuje však aj skupina antimikrobiálnych peptidov, ktoré pôsobia intracelulárne, prechádzajú cez cytoplazmatickú membránu a zameriavajú sa na bunkové procesy nevyhnutné pre prežitie patogénu42. 91
Tab. 4.3 Prehľad mechanizmov bakteriálnej rezistencie voči antimikrobiálnym peptidom (Joo a kol. 2016)48 Mechanizmus Gram-pozitívne baktérie Gram-negatívne baktérie Extracelulárne proteíny Proteolytická degradácia Proteolytická degradácia Sekvestrácia Exopolyméry PIA, PGA Alginát, kyselina polysialová Modifikácia povrchov Odpudzovanie D-alanyláciou TA Odpudzovanie modifikáciou fosfátu Sterická zábrana L-ramnozyláciou lipidu A WTA Zvýšená pevnosť OM acyláciou lipidu A Modifikácia lipidu II O-antigén LPS Alterácia cytolazmatickej Odpudzovanie náboja Zvýšená pevnosť IM acyláciou PG membrány aminoacyláciou PG Efluxné pumpy Export ABC transportérmi Export efluxnými pumpami z rodiny RND PIA (Polysaccharide Intercellular Adhesin): Polysacharidový intercelulárny adhezín; PGA (Poly--Glutamic Acid): Kyselina poly--glutámová; WTA (Wall Teichoic Acid): Kyselina teichová bunkovej steny; PG (Peptidoglycan): Peptidoglykán; TA (Teichoic Acid): Kyselina teichová; OM (Outer Membrane): Vonkajšia membrána; IM (Inner Membrane): Vnútorná membrána; RND: Resistance/Nodulation/cell Division (Rodina transportérov) Prvým cieľom pri intracelulárnom pôsobení AMP je ovplyvnenie tvorby peptidoglykánu (PGN) alebo lipopolysacharidu (LPS) (Gram-negatívne baktérie) ako hlavných zložiek ich bunkovej steny a vonkajšej membrány (OM = Outer Membrane). AMP sa pritom neviažu na enzýmy potrebné na tvorbu PGN, ale na prekurzory PGN, vďaka čomu stericky bránia aktivite enzýmov. Príkladom je lantibiotikum (AMP produkované baktériami mliečneho kvasenia) mersacidín, ktoré sa viaže na lipid II, dôležitý prekurzor PGN43. Lantibiotikum nizín zase ovplyvňuje biosyntézu kyseliny teichovej (TA = Teichoic Acid) a kyseliny lipoteichovej (LTA = Lipoteichoic Acid) prostredníctvom väzby na lipidy III a IV44. Ďalším intracelulárnym mechanizmom, ktorý AMP využívajú na usmrtenie baktérií, je inhibícia syntézy nukleových kyselín. Napríklad buforín II (AMP izolovaný zo žalúdka ropuchy ázijskej, Bufo bufo garagrizans) prechádza membránou E. coli bez vytvorenia pórov a hromadí sa v cytoplazme; následne sa viaže na nukleové kyseliny, čím blokuje ich činnosť45. Väčšina cytoplazmaticky účinných AMP je zameraná na procesy závislé od ATP, čo naznačuje, že tieto kladne nabité molekuly interagujú s vysoko záporne nabitým ATP46. AMP majú okrem antimikrobiálnych aktivít aj imunomodulačné aktivity, ktoré sú nevyhnutné pri zápalovej reakcii a podpore vzniku adaptívnej imunity, ako napr. indukcia tvorby prozápalových cytokínov, zlepšenie fagocytózy, pritiahnutie monocytov a makrofágov, podpora diferenciácie dendritových buniek či podpora hojenia47. 92
4.2.1.3 Mechanizmy zabezpečujúce rezistenciu baktérií voči AMP Antimikrobiálne peptidy sú kľúčovou zložkou vrodeného imunitného systému hostiteľa. Hrajú rozhodujúcu úlohu pri znižovaní mikrobiálnej záťaže na začiatku infekcie a pri spájaní vrodenej a adaptívnej imunity. Pre úspešné prežitie a kolonizáciu hostiteľa majú baktérie vytvorené mechanizmy zasahujúce do aktivity AMP, pričom rezistencia na AMP je úzko spojená s virulenciou bakteriálnych patogénov48. Mechanizmy rezistencie baktérií voči AMP zahŕňajú remodeláciu povrchu, produkciu AMP sekvestrujúcich proteínov, syntézu kapsúl, tvorbu biofilmu a expresiu efluxných púmp (Tab. 4.3, Obr. 4.4)35,40. Obr. 4.4 Schematické znázornenie mechanizmov, ktorými sa baktérie vyhýbajú pôsobeniu AMP (Cardoso a kol. 2021; upravené )35 Gram-pozitívne baktérie majú v bunkovej stene hrubú vrstvu peptidoglykánu, zatiaľ čo Gram-negatívne baktérie majú iba tenkú peptidoglykánovú vrstvu, ale majú dodatočnú vonkajšiu membránu. (1) Proteolytická degradácia extracelulárnymi proteázami; (2) sekvestrácia extracelulárnymi proteínmi alebo extracelulárnou matricou; (3) elektrostatické odpudzovanie alanylovanými teichovými kyselinami (TA); (4) elektrostatické odpudzovanie aminoacylovaným PG; (5) únik AMP viažucich lipid II vďaka zmene pentapeptidu; (6), export AMP pomocou efluxných púmp; (7) proteolytické štiepenie proteázou vonkajšej membrány alebo cytosólovou proteázou po absorpcii transportérmi; (8) sekvestrácia alebo sterická zábrana O-antigénom lipopolysacharidu (LPS); (9) elektrostatické odpudzovanie lipidom A s pridanou amínovou zlúčeninou; (10) zvýšená pevnosť vďaka acylácii lipidu A. 93
4.2.1.3.1 Modifikácia povrchu baktérií Väčšina AMP funguje tak, že sa viaže na bakteriálne membrány a následne ich poškodzuje. Kľúčovým mechanizmom rezistencie baktérií je preto chemická a štruktúrna zmena priepustnosti a tekutosti ich membrán, ktorá má zabrániť interakcii s AMP. Gram-pozitívne a Gram-negatívne baktérie majú rozdielnu stavbu bunkovej steny, a preto uplatňujú aj rôzne stratégie na úpravu svojho bunkového povrchu potrebnú k tomu, aby odolávali AMP. Kľúčovými molekulami sú tu aniónové polyméry – kyselina teichová v bunkovej stene Gram- pozitívnych a lipopolysacharid (LPS) v bunkovej stene Gram-negatívnych baktérií. Alterácia kyseliny teichovej Kyselina teichová (TA = Teichoic Acid) tvorí viac ako 60 % celkovej hmoty bunkovej steny Gram-pozitívnych baktérií49. Podľa miesta ukotvenia TA k povrchu bunky rozlišujeme kyselinu teichovú bunkovej steny (WTA = Wall Teichoic Acid) a kyselinu lipoteichovú (LTA = Lipoteichoic Acid). Teichové kyseliny (WTA a LTA) spolu s peptidoglykánom sú zodpovedné za negatívne nabitý povrch väčšiny gram-pozitívnych baktérií50. Gram-pozitívne baktérie s dlt operónom podporujú D-alanyláciu TA, vďaka čomu znižujú negatívne nabitie ich povrchu, a preto znižuje aj ich príťažlivosť pre CAMP 51. D-alanyláciu TA, ako stratégiu rezistencie na AMP, využívajú napr. baktérie rodu Staphylococcus, Streptococcus a Bacillus51-53. Nedávno bolo zistené, že aj L-ramnozylácia WTA54 ako aj glykozylácia WTA55 v bunkovej stene L. monocytogenes znižuje jej priepustnosť pre AMP, čím bráni ich prístupu a nežiaducej interakcii s plazmatickou membránou. To poukazuje aj na ďalšie mechanizmy rezistencie súvisiacej s úpravou TA. Alterácia lipidu A V bunkovej stene Gram-negatívnych baktérií sa nachádza vonkajšia membrána (OM), ktorá udržiava integritu bunky pri zmenách prostredia a kontroluje prenikanie nežiaducich molekúl do bunky. Vonkajšia membrána je asymetricky usporiadaná dvojvrstvová membrána, ktorá má vnútornú vrstvu zloženú z fosfolipidov a proteínov, zatiaľ čo hlavnou zložkou vonkajšej vrstvy je LPS. LPS je komplexný glykolipid, ktorý sa skladá z troch častí: lipidu A, oligosacharidového jadra a polysacharidu obsahujúceho opakujúce sa cukry (O-antigén). Lipid A (endotoxín) ukotvuje LPS k vonkajšej membráne. Záporný náboj lipidu A je zodpovedný za negatívne nabitý povrch Gram-negatívnych baktérií56. 94
Ak Gram-negatívne baktérie včlenia do lipidu A kladné náboje, znížia tým záporný náboj bunkového obalu, čím sa znižuje jeho afinita k AMP s kladným nábojom57,58. Túto modifikáciu lipidu navodzuje vsunutie aspoň jedného z nasledujúcich substituentov, ktoré sa vyskytujú na 1´- alebo 4´-fosfátových skupinách: palmitát, fosfoetanolamín (PEA = Phosphoethanolamine) a 4-amino-4-deoxy-L-arabinóza (4-aminoarabinóza). Vysoký stupeň modifikácií lipidov A s týmito substituentmi súvisí s rezistenciou voči CAMP a virulenciou baktérií50. Tieto tri modifikácie lipidu A riadi dvojzložkový regulačný systém PhoP-PhoQ (PhoPQ)59,60. P. aeruginosa a S. Typhimurium pripájajú aminoarabinózu k fosfátovej skupine v lipide A 57,61. Acinetobacter baumannii, Francisella novicida a bordetely modifikujú fosfát v lipide A galaktozamínom alebo glukozamínom62-64. Okrem toho Gram-negatívne baktérie používajú PEA na zníženie aniónových vlastností LPS, napr. A. baumannii pripájajú PEA na fosfáty v lipide A62. Vibrio cholerae importuje glycíny do acylových reťazcov lipidu A, vďaka čomu zvyšuje svoj kladný náboj a znižuje príťažlivosť pre CAMP65. N. meningitidis konštitutívne exprimuje lipid A pripojený k aminoarabinóze a k PEA, vďaka čomu majú tieto neisérie vrodenú vyššiu odolnosť voči CAMP ako iné baktérie66. Ďalším mechanizmom, zvyšujúcim rezistenciu voči CAMP v Gram-negatívnych baktériách, je pridávanie extra acylových reťazcov do lipidu A67, čo bolo pozorované napr. u V. cholerae 68. 4.2.1.3.2 Tvorba kapsuly Významnú úlohu pri ochrane pred pôsobením AMP zohrávajú aj extracelulárne kapsuly baktérií, ktoré vytvárajú nielen štruktúrnu prekážku, ale aj elektrostaticky zachytávajú CAMP. Príkladom sú záporne nabité kapsulové exopolysacharidy Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae alebo P. aeruginosa69 kapsula tvorená kyselinou hyalurónovou ako aj M proteín streptokokov skupiny A70,71, či kapsula N. meningitidis72. Kapsulu tvorí aj kyselina poly--glutámová (PGA = -Polyglutamic Acid), ktorá chráni baktérie nielen pred fagocytózou73, ale aj pred pôsobením AMP. PGA majú iba Gram-pozitívne baktérie, a to hlavne druhy rodu Bacillus a koaguláza-negatívne stafylokoky vrátane S. epidermidis74. 4.2.1.3.3 Alterácia štruktúry cytoplazmatickej membrány Po prechode cez všetky vonkajšie bariéry na bakteriálnom povrchu sa AMP konečne dostávajú do kontaktu s cytoplazmatickou membránou. Pretože toto je hlavný cieľ pre AMP, baktérie často modifikujú cytoplazmatickú membránu spôsobom, ktorý znižuje jej príťažlivosť pre 95
AMP a inzerciu AMP. V bakteriálnych membránach sú hojne zastúpené fosfolipidy ako fosfatidylglycerol (PG) a difosfatidylglycerol (DPG, tiež nazývaný kardiolipín), ktoré majú záporný náboj priťahujúci CAMP. Táto príťažlivosť môže byť narušená napríklad aminoacyláciou PG, ktorá maskuje fosfáty so záporným nábojom kladne nabitými primárnymi amínmi. Membránový proteín MprF (Multipeptide resistance Factor), pôvodne opísaný v S. aureus, je zodpovedný za aminoacyláciu PG s lyzínom, čo vedie k rezistencii na AMP elektrostatickým odpudzovaním75. C-terminálna syntázová doména MprF proteínu využíva PG a aminoacyl-tRNA ako substráty. Syntetizovaný aminoacyl-PG je translokovaný do vonkajšej vrstvy cytoplazmatickej membrány N-terminálnou flipázovou doménou vo MprF proteíne (flipáza je membránový transportný enzým pracujúci ako translokáza, ktorý umožňuje prešmyk fosfolipidov z jedného listu lipidovej dvojvrstvy do druhej)76. MprF proteíny rôznych baktérií používajú rôzne aminokyselinové a fosfolipidové substráty77. 4.2.1.3.4 Extracelulárne proteíny baktérií Vylučované bakteriálne proteíny, ako sú proteázy, patria k prvým obranným mechanizmom baktérií, s ktorými sa AMP stretávajú pri interakcii s baktériami. Proteolytická degradácia AMP extracelulárnymi enzýmami predstavuje jednoduchý, ale účinný spôsob rezistencie baktérií voči AMP. Príkladom takýchto enzýmov sú rôzne proteázy sekrétované stafylokokmi, napr. metaloproteázy, ako je aureolyzín a SepA, a serínové endopeptidázy, ako je V8 proteáza, o ktorých je známe, že degradujú lineárne CAMP, napr. ľudský katelicidín LL-3778. Streptokoky skupiny A (GAS = Group A Streptococci) produkujú cysteínovú proteázu nazývanú SpeB (Streptococcal pyrogenic exotoxin B), ktorá degraduje mnohé hostiteľské AMP, vrátane katelicidínu LL-37 a beta-defenzínov79. Pritom hostiteľské proteíny môže zintenzívniť proteolytickú aktivitu SpeB. Konkrétne, interakcia SpeB s GRAB (G-Related 2- macroglobulin-Binding) proteínom v bunkovej stene baktérií viažucom 2-makroglobulín (proteázový inhibítor), vedie k vychytávaniu SpeB na bakteriálny povrch a následnému štiepeniu AMP80,81. K rezistencii GAS voči katelicidínu LL-37 prispieva aj ďalší mechanizmus – extracelulárna pasca, ktorou je M1 proteín na ich povrchu. Tento proteín zachytáva a inaktivuje katelicidín ešte predtým než dosiahne cieľ svojho pôsobenia v bunkovej membráne82,83. 96
Extracelulárne proteinázy P. aeruginosa, Enterococcus faecalis a S. pyogenes degradáciou hostiteľských proteoglykánov uvoľňujú dermatansulfát, ktorý neutralizuje ľudský alfa-defenzín HNP-1 (Human Neutrophil Peptide 1)84. Jednou z najintenzívnejšie študovaných skupín proteáz Gram-negatívnych baktérií sú omptíny, skupina aspartátových proteáz nachádzajúcich sa vo vonkajšej membráne E. coli, S. enterica a Y. pestis, ktoré sa môžu taktiež podieľať na inaktivácii AMP85. Pri obrane Gram-negatívnych baktérií voči AMP majú okrem omptínov dôležitú úlohu aj ich bakteriálne metaloproteázy. Napríklad metaloproteáza ZapA produkovaná P. mirabilis neutralizuje viaceré ciele, vrátane AMP86 a metaloproteázy ZmpA a ZmpB z Burkholderia cenocepacia môžu taktiež degradovať rôzne CAMP87. Niektoré Gram-negatívne baktérie degradujú AMP aj v intracelulárnom prostredí po ich importe špecifickými transportnými proteínmi. Napríklad S. Typhimurium a Haemophilus influenzae produkujú ABC (ATP-Binding Cassette) transportér kódovaný operónom sapABCDFZ, ktorý prenáša CAMP do cytosólu, kde dochádza k ich intracelulárnej proteolytickej degradácii88. Pri vzniku rezistencie na AMP má dôležitú úlohu aj sekvestrácia AMP sprostredkovaná extracelulárnymi proteínmi ako napr. stafylokinázou (Sak) produkovanou S. aureus, ktorá sa viaže na AMP a tým ich inaktivuje89,90. Streptokoky skupiny A tvoria streptokinázu (Ska), ktorá má okrem iných účinkov aj schopnosť deštrukcie katelicidínu LL-3791. Ďalší dobre známy streptokokový sekvester, streptokokový inhibítor komplementu (SIC = Streptococcal Inhibitor of Complement), chráni S. pyogenes nielen pred komplementovým komplexom atakujúcim membránu, ale aj pred defenzínmi a katelicidínom LL-3792,93. 4.2.1.3.5 Biofilm a exopolyméry Schopnosť vytvárať biofilm je dôležitým obranným mechanizmom baktérií voči pôsobeniu AMP. Pri tvorbe biofilmu sú autonómne bakteriálne bunky obalené extracelulárných matrixom, čím sa upevňujú povrchové spojenia baktérií. Matrix biofilmu tvoria najmä extracelulárne proteíny, extracelulárna DNA a exopolysacharidy (EPS = Exopolysaccharides)94. Matrix zohráva ústrednú úlohu v mechanizme odolnosti biofilmu na antibiotiká95, keďže je to v podstate difúzna bariéra, ktorá spomaľuje alebo zabraňuje interakcii antimikrobiálnych látok s bakteriálnymi bunkami. Extracelulárna DNA (eDNA = Extracellular DNA) je hlavnou zložkou biofilmu mnohých patogénnych druhov baktérií a húb. Pochádza najmä z lyzovaných buniek. eDNA môže pôsobiť 97
ako medzibunková spojka, ktorá stabilizuje a udržiava architektúru biofilmu. eDNA zohráva aj dôležitú úlohu pri vychytávaní a neutralizácii AMP s kladným nábojom. Avšak eDNA môže mať aj nepriamy účinok na AMP, napr. bolo zistené, že schopnosť DNA viazať a sekvestrovať katióny vrátane horčíka v okolitom prostredí indukuje u P. aeruginosa dvojzložkový systém PhoPQ/PmrAB96. Podobná eDNA sprostredkovaná indukcia tohto systému bola preukázaná aj u S. Typhimurium60. PhoPQ/PmrAB systémy regulujú cam operón (rezistencia na CAMP), ktorého indukcia vedie k expresii génov zapojených do modifikácií LPS (pridanie aminoarabinózy k lipidu A), ktoré následne znižujú priepustnosť vonkajšej membrány pre CAMP. Exopolysacharidy sú ďalšou dôležitou zložkou biofilmového matrixu. Môžu to byť homopolysacharidy alebo častejšie heteropolysacharidy94. K patogénnym baktériám, ktoré tvoria EPS patrí P. aeruginosa (alginát), Burkholderia cepacia complex (cepacián) alebo K. pneumoniae (kapsulárny polysacharid K40). Väčšina známych exopolysacharidov je polyaniónová, ale existujú aj pozitívne nabité exopolysacharidy (napr. stafylokokový polysacharidový intercelulárny adhezín, PIA = Polysaccharide Intercellular Adhesin). EPS môže zachytiť AMP skôr, ako sa dostanú k svojmu bakteriálnemu cieľu97. Pri tvorbe stafylokokového biofilmu zohráva dôležitú úlohu agregácia buniek, za ktorú je zodpovedný polysacharidový intercelulárny adhezín PIA (tiež známy ako poly-N- acetylglukozamín)98. Biosyntéza PIA je regulovaná ica (medzibunkový adhezín) operónom99. PIA svojím kladným nábojom zvyšuje odpudzovanie CAMP100. Podobné systémy boli pozorované aj u iných patogénnych mikroorganizmov tvoriacich biofilm, ako je napríklad E. coli, Yersinia pestis a Bordetella pertussis101. 4.2.1.3.6 Efluxné pumpy Aj keď sa AMP dokáže vyhnúť vyššie opísaným mechanizmom rezistencie a dostane sa do bakteriálnej membrány alebo cytoplazmy, môže byť ešte z bunky odstránený membránovými transportnými systémami (alebo efluxnými pumpami). Medzi najdôležitejšie efluxné pumpy Gram-negatívnych baktérií patria transportéry rodiny RND (Resistance/Nodulation/cell Division). Typický člen tejto rodiny sa skladá z troch zložiek: transportného (efluxného) proteínu vo vnútornej membráne (napr. AcrB), periplazmatického podporného proteínu (napr. AcrA) a proteínu vonkajšieho membránového kanálu (napr. TolC), ktorý je označovaný ako vonkajší membránový proteín (OMP = Outer Membrane Protein) alebo ako vonkajší membránový faktor (Obr. 4.5)103. 98
Obr. 4. 5 Štruktúra efluxnej pumpy RND (Alvarez-Ortega a kol. 2013; upravené)102 Na obrázku je znázornená schéma štruktúry systému AcrAB-TolC E. coli. Tento systém je trojčlenný komplex tvorený proteínom vnútornej membrány AcrB, proteínom vonkajšej membrány TolC a membránovým fúznym proteínom AcrA. Aktivita proteínu AcrB RND je spojená s protónovým gradientom. Tieto efluxné pumpy môžu vytláčať rôzne zlúčeniny z bakteriálnej cytoplazmy a periplazmatického priestoru. MFP: Membrane Fusion Protein Takéto efluxné pumpy zabezpečujú napr. u N. gonorrhoeae a N. meningitidis rezistenciu na LL-37 a protegrín-166,104, u V. cholerae rezistenciu na polymyxín B105 a u K. pneumoniae rezistenciu na polymyxín B, ako aj na ľudské defenzíny106. Aj Gram-pozitívne baktérie majú efluxné pumpy exportujúce AMP dvojzložkovými ABC transportérmi, napr. BceAB (BaCitracin Efflux) skupina ABC transportérov je zodpovedná za rezistenciu voči rôznym AMP (lantibiotiká, cyklické AMP, glykopeptidy, katelicidíny a defenzíny)107,108. Okrem expresie efluxných púmp, ktoré môžu exportovať neendogénne AMP, baktérie zvyčajne exprimujú efluxné pumpy schopné exportovať AMP produkované intracelulárne ako súčasť ich vlastnej obrannej stratégie, aby sa vyhli ich škodlivým účinkom107. Napríklad NisT u Lactococcus lactis exportuje novosyntetizovaný nizín109. 4.2.1.3.7 Systémy identifikujúce antimikrobiálne peptidy Hoci niektoré mechanizmy rezistencie baktérií voči AMP, ako napríklad modifikácia lipidu II, predstavujú konštitutívne zmeny, väčšina z nich je prísne regulovaná dvojzložkovými bakteriálnymi senzormi/regulátormi (TCS = Two-Component regulatory Systems). Tým sa pravdepodobne minimalizuje kolísanie aniónovej homeostázy a expresia energeticky 99
náročných mechanizmov rezistencie v čase, keď nie sú potrebné48. Väčšina TCS má dve hlavné zložky: (1) histidínkinázový senzorový proteín umiestnený v bunkovej membráne a (2) regulátor odpovede v cytoplazme. Jedným z regulačných dôsledkov TCS snímania CAMP je indukcia génov zapojených do rezistencie voči CAMP. Ďalšie mechanizmy rezistencie zahŕňajú chemické modifikácie štruktúr v bunkovom obale110. Ústredným regulátorom rezistencie voči CAMP u Gram-negatívnych baktérií je dvojzložkový systém PhoPQ, ktorý bol prvýkrát identifikovaný u S. Typhimurium111,112. PhoQ je histidínkinázový senzor umiestnený v cytoplazmatickej membráne a PhoP je zodpovedajúci regulátor odpovede viažuci sa na DNA. PhoPQ a ďalší dvojzložkový systém regulovaný PhoPQ, PmrAB, spolupracujú pri regulácii väčšiny modifikácií lipidu A, ktoré sa podieľajú na rezistencii voči CAMP, medzi ktoré patrí palmitoylácia sprostredkovaná PagP, pridávanie aminozlúčenín k fosfátom a zmena stupňa fosforylácie v lipide A113-115. PhoPQ-homológne systémy pre rezistenciu voči CAMP sa nachádzajú v rôznych Gram-negatívnych baktériách vrátane S. Typhimurium, Y. pestis a Shigella flexneri116-118. Podobne aj rezistencia na CAMP u Gram-pozitívnych baktérií súvisí s modifikáciami lipidov, ktoré menia ich čistý povrchový náboj. Stafylokoky snímajú CAMP trojzložkovým regulačným systémom známym ako ApsRSX. Tento senzor tvoria tri zložky: membránovo viazaná histidínkináza snímajúca CAMP (ApsS), regulátor odpovede viažuci sa na DNA (ApsR) a tretia zložka (ApsX) so zatiaľ neznámou funkciou, pričom všetky sú nevyhnutné pre reguláciu génov závislých od CAMP. Systém Aps reguluje expresiu génov zapojených do hlavných mechanizmov rezistencie voči AMP, ako je napríklad operón dlt pre alanyláciu TA, gén mprF pre lyzinyláciu PG a gén transportéra ABC vraFG119. Aps-homológne systémy sa nachádzajú u viacerých Gram-pozitívnych patogénov vrátane S. pneumoniae, L. monocytogenes, B. anthracis, C. difficile a Staphylococcus haemolyticus120. 4.2.2 Únikové stratégie využívané na ochranu pred pôsobením komplementu 4.2.2.1 Komplementový systém Komplementový systém predstavuje dôležitý obranný mechanizmus. Jeho hlavnou úlohou je obrana proti patogénnym mikroorganizmom a cudzorodým bunkám, vrátane nádorových buniek, účasť pri zápalových reakciách a pri regulácii imunitnej odpovede. Medzi hlavné biologické aktivity komplementu patria cytotoxické a cytolytické reakcie, tvorba 100
Search
Read the Text Version
- 1
- 2
- 3
- 4
- 5
- 6
- 7
- 8
- 9
- 10
- 11
- 12
- 13
- 14
- 15
- 16
- 17
- 18
- 19
- 20
- 21
- 22
- 23
- 24
- 25
- 26
- 27
- 28
- 29
- 30
- 31
- 32
- 33
- 34
- 35
- 36
- 37
- 38
- 39
- 40
- 41
- 42
- 43
- 44
- 45
- 46
- 47
- 48
- 49
- 50
- 51
- 52
- 53
- 54
- 55
- 56
- 57
- 58
- 59
- 60
- 61
- 62
- 63
- 64
- 65
- 66
- 67
- 68
- 69
- 70
- 71
- 72
- 73
- 74
- 75
- 76
- 77
- 78
- 79
- 80
- 81
- 82
- 83
- 84
- 85
- 86
- 87
- 88
- 89
- 90
- 91
- 92
- 93
- 94
- 95
- 96
- 97
- 98
- 99
- 100
- 101
- 102
- 103
- 104
- 105
- 106
- 107
- 108
- 109
- 110
- 111
- 112
- 113
- 114
- 115
- 116
- 117
- 118
- 119
- 120
- 121
- 122
- 123
- 124
- 125
- 126
- 127
- 128
- 129
- 130
- 131
- 132
- 133
- 134
- 135
- 136
- 137
- 138
- 139
- 140
- 141
- 142
- 143
- 144
- 145
- 146
- 147
- 148
- 149
- 150
- 151
- 152
- 153
- 154
- 155
- 156
- 157
- 158
- 159
- 160
- 161
- 162
- 163
- 164
- 165
- 166
- 167
- 168
- 169
- 170
- 171
- 172
- 173
- 174
- 175
- 176
- 177
- 178
- 179
- 180
- 181
- 182
- 183
- 184
- 185
- 186
- 187
- 188
- 189
- 190
- 191
- 192
- 193
- 194
- 195
- 196
- 197
- 198
- 199
- 200
- 201
- 202
- 203
- 204
- 205
- 206
- 207
- 208
- 209
- 210
- 211
- 212
- 213
- 214
- 215
- 216
- 217
- 218
- 219
- 220
- 221
- 222
- 223
- 224
- 225
- 226
- 227
- 228
- 229
- 230
- 231
- 232
- 233
- 234
- 235
- 236
- 237
- 238
- 239
- 240
- 241
- 242
- 243
- 244
- 245
- 246
- 247
- 248
- 249
- 250
- 251
- 252
- 253
- 254
- 255
- 256
- 257
- 258
- 259
- 260
- 261
- 262
- 263
- 264
- 265
- 266
- 267
- 268
- 269
- 270
- 271
- 272
- 273
- 274
- 275
- 276
- 277
- 278
- 279
- 280
- 281
- 282
- 283
- 284
- 285
- 286
- 287
- 288
- 289
- 290
- 291
- 292
- 293
- 294
- 295
- 296
- 297
- 298
- 299
- 300
- 301
- 302
- 303
- 304
- 305
- 306
- 307
- 308
- 309
- 310
- 311
- 312
- 313
- 314
- 315
- 316
- 317
- 318
- 319
- 320
- 321
- 322
- 323
- 324
- 325
- 326
- 327
- 328
- 329
- 330
- 331
- 332
- 333
- 334
- 335
- 336
- 337
- 338
- 339
- 340
- 341
- 342
- 343
- 344
- 345
- 346
- 347
- 348
- 349
- 350
- 351
- 352
- 353
- 354
- 355
- 356
- 357
- 358
- 359
- 360
- 361
- 362
- 363
- 364
- 365
- 366
- 367
- 368
- 369
- 370
- 371
- 372
- 373
- 374
- 375
- 376
- 377
- 378
- 379
- 380
- 381
- 382
- 383
- 384
- 385
- 386
- 387
- 388
- 389
- 390
- 391
- 392
- 393
- 394
- 395
- 396
- 397
- 398
- 399
- 400
- 401
- 402
- 403
- 404
- 405
- 406
- 407
- 408
- 409
- 410
- 411
- 412
- 413
- 414
- 415
- 416
- 417
- 418
- 419
- 420
- 421
- 422
- 423
- 424
- 425
- 426
- 427
- 428
- 429
- 430
- 431
- 432
- 433
- 434
- 435
- 436
- 437
- 438
- 439
- 440
- 441
- 442
- 443
- 444
- 445
- 446
- 447
- 448
- 449
- 450
- 451
- 452
- 453
- 454
- 455
- 456
- 457
- 458
- 459
- 460
- 461
- 462
- 463
- 464
- 465
- 466
- 467
- 468
- 469
- 470
- 471
- 472
- 473
- 474
- 475
- 476
- 477
- 478
- 479
- 480
- 481
- 482
- 483
- 484
- 485
- 486
- 487
- 488
- 489
- 490
- 491
- 492
- 493
- 494
- 495
- 496
- 497
- 498
- 499
- 500
- 501
- 502
- 503
- 504
- 505
- 506
- 507
- 508
- 509
- 510
- 511
- 512
- 513
- 514
- 515
- 516
- 517
- 518
- 519
- 520
- 521
- 522
- 523
- 524
- 525
- 526
- 527
- 528
- 529
- 530
- 531
- 532
- 533
- 534
- 535
- 536
- 537
- 538
- 539
- 540
- 541
- 542
- 543
- 544
- 545
- 546
- 547
- 548
- 549
- 550
- 551
- 552
- 553
- 554
- 555
- 556
- 557
- 558
- 559
- 560
- 561
- 562
- 563
- 564
- 565
- 566
- 567
- 568
- 569
- 570
- 571
- 572
- 573
- 574
- 575
- 576
- 577
- 578
- 579
- 580
- 581
- 582
- 583
- 584
- 585
- 1 - 50
- 51 - 100
- 101 - 150
- 151 - 200
- 201 - 250
- 251 - 300
- 301 - 350
- 351 - 400
- 401 - 450
- 451 - 500
- 501 - 550
- 551 - 585
Pages:
