HÓA HỮU CƠ 2. GS.TSKH NGÔ THI THUẬN- ĐẶNG NHƯ TẠI

Đồng phân về mạch cacbon. Thí dụ : CH3 - C H 2 - C H - C H - COOH CH3- CH - CH2- CH - COOH 1 h 3 _L 2 CH3 n h 2 c nh Axit 2-amino-4-metylpentanoic Axit 2-amino-3-metylpentanoic (Leuxin) (Isoleuxin) b) Đồng phân quang học Hầu hết các amino axit ngoại trừ glyxin đều có một nguyên tử cacbon bất đối trong phân tử, do đó chúng có thể tồn tại dưới dạng các đồng phân quang học. Ký hiệu cấu hình D và L dùng cho monosacarit (x. mục 16.1.2) cũng được dùng cho các amino axit. Các đồng phân D và L của monosacarit và amino axit đều được xác định theo cùng một phương pháp (x. Tập 1 , mục 6.1.8). Do đó một amino axit được vẽ bằng công thức chiếu Fisơ, với nhóm cacboxyl ở trên và nhóm R ở dưới của đường thẳng đứng thì được gọi là D-amino axit nếu nhóm amino ở bên phải và được gọi là L-amino axit nếu nhóm amino ở bên trái. Không giống monosacarit, đồng phân D gặp trong thiên nhiên, hầu hết amino axit thiên nhiên lại có cấu hình L. Cho đến nay, các gốc D-amino axit chỉ gặp trong một vài peptit kháng sinh và trong một số peptit nhỏ gắn vào vách tế bào vi khuẩn. CHO CHO COOH COOH H -O H HO H H -N H ' H,N H CH2OH CH2OH R R D-Glyxeranđehit L-Glyxeranđehit D-Amino axit L-Am ino axit 17.1.3 Danh pháp Các amino axit có thẻ dược gọi tên theo danh phấp thay thế, trong đó - COOH là nhóm chức chính và được nêu lên ở dạng hậu tố -oỉc. Vị trí của nhóm amino được chỉ ra bằng chữ số Ả Rập. Một số amino axit còn được gọi tên theo danh pháp nửa hệ thống của axit tương ứng có thêm tiền tố amino- cùng với chữ cái Hy Lạp (a, p, y ...) để chỉ vị trí nhóm này. CH3 -C H -C O O H Axit 2-aminopropanoic Ln h 2 Axit a-aminopropionic H2N - [ C H 2]3 -C H -C O O H Axit 2,5-điaminopentanoic í Axit a,E-điaminovaleric nh2 H O O C - [CH2]2 -C H -C O O H Axit 2-aminopentan-l,5-đioic nh2 Axit a-aminoglutaric Tuy nhiên, để cho đơn giản, các amino axit thiên nhiên thường được gọi theo tên thường. Ngoài ra, người ta còn hay dùng tên ngắn gọn ba chữ cái đầu (thí dụ Ala là alanin) hoặc ký hiệu một chữ cái (thí dụ A là alanin). v ề danh pháp amino axit, xem bảng 17.1. 534

17.2 Tính chất vật lý Các amino axit đều là chất rắn không màu. Mặc dù amino axit có chứa trong phân tử đồng thời nhóm amino và nhóm cacboxyl H2NCH(R)COOH, nhưng nhiều tính chất vật lý và hóa học không phù hợp với công thức cấu trúc này. Khác hẳn với amin và axit cacboxylic, amino axit là những chất kết tinh không bay hơi, nóng chảy với sự phân huỷ ở nhiệt độ tương đối cao (thường trên 200°C). Chúng không tan trong các dung môi không phân cực (ete, điclometan, benzen...) nhưng lại tan nhiều trong nước và có momen lưỡng cực (|J.) lớn hơn nhiều so với amin hay axit cacboxylic. + c h 3- c h 2- c h 2- n h 2 CH3 - C H 2-C O O H h 3n - c h 2- c o o G lyxin, |a = 14 D Propylamin, n = 1,4 D Axit propionic, n = 1,7 D Bảng 17.1 trình bày một số hằng số vật lý của amino axit thiên nhiên. B ảng 17.1 Hằng số vật lý của amino axit Tên ngắn Độ tan Điểm Công thức cấu tạo Tên thường gọn ba chữ ^nc’ (g/1 0 0 g đẳng cái (ký hiệu H20 ) điện Nhóm R là H hoặc ankyl °c ỄH2N -C H -C O O H một chữ cái) pl glyxin Gly G 233 22,5 6,0 alanin Ala A 297 15,8 6,0 *valin V a l V 315 6,8 6,0 *leuxin Leu L 337 2,4 6,0 *isoleuxin Ile I 284 2,1 6,0 *phenyl- Phe F 275 2,7 5,5 alanin 535

Tên ngắn Độ tan Điểm Công thức cấu tạo Tên thường gọn ba chữ nc’ (g/lOOg đẳng H N -CH -CO O H cái (ký hiệu H20 ) điện °c một chữ cái) pl prolin Pro 299 162,0 6,3 Nhóm R có chứa OH serin Ser s 228 4,3 5,7 *threonin Thr T 253 20,5 5,6 tyrosin Tyr Y 344 0,04 5,7 R chứa nitơ không có tính bazơ asparagin Asn N 251 2,4 5,4 h 2n - c h - c o o h h 2n - c h - c o o h glutamin Gln Q 186 3,6 5,7 h 2n - c h - c o o h *tryptophan Trp w 382 1,1 5,9 Nhóm R có chứa lưu huỳnh cystein Cys c 178 tốt 5,0 h 2n - c h - c o o h c h 2- s h h 2n - c h - c o o h *methionin Met M 283 3,3 5,7 4---------------------— ----------------- c h 2- c h 2- s - c h 3 536

Tên ngắn Điểm Độ tan gọn ba chữ (g/100 g đẳng Công thức cấu tạo Tên thường tn c . h 20 ) điện cái (ký hiệu Nhóm R có tính axit °c Nhóm R có tính bazơ một chữ cái) pl h 2n - c h - c o o h axit aspatic A sp D 270 0,4 2,8 4 c h 2c h 2c h 2c h 2- n h 2 axit Glu 249 0,7 3,2 h 2n - c h - c o o h glutamic *lysin L ys K 224 tốt 9,7 *arginin Arg R 238 tốt 10,8 h 2n - c h - c o o h *histiđin His H 227 4,0 7,6 Tính chất phổ của amino axit Kết quả khảo sát bằng các phương pháp phổ cũng hoàn toàn xác nhận cấu trúc lưỡng cực của amino axit. Chẳng hạn phổ tán xạ tổ hợp của axit cacboxylic phân ly yếu trong dung dịch nước có tần sô' ở 1720 cm-1 ứng với nhóm c = o của cacboxyl. Tần số này mất đi khi thêm NaOH đến trung hoà. Trong dung dịch nước, amino axit tồn tại ở dạng ion lưỡng cực, nên không xuất hiện tần số ở 1720 c rrf1 ; nhưng khi thêm HC1 thì tần số này lại hiện ra. bởi vì khi đó tạo thành nhóm cacboxyl không bị ion hóa. Tương tự như thế, các dung dịch nước của amino axit cũng vắng mặt các dải ở 3300 - 3400 cm 1 ứng với nhóm - NH2, nhưng vạch này lại xuất hiện khi thêm NaOH. Phổ khối lượng Do các amino axit khó bay hơi, mẫu phân tích phải đặt vào buồng ion hóa của máy khối phổ ở nhiệt độ 100 - 150°c và áp suất 10 4 - 10 5 Pa. Kiểu phân mảnh chủ yếu của a-amino axit gắn liền với sự phân rã của các liên kết a-C - COOH (đứt gẫy a ) và a-C - R (đứt gãy (3). 537

pa R -C H -C O O H NH2 Khi xảy ra đứt gãy a thì COOH* là một gốc tương đối bền bị tách loại, còn khi đứt gãy p thì gốc R* là nhánh bên bị tách ra khỏi phân tử a-amino axit. Đứt gãy a : h 2n - c h - c o o h -C O O H > h 2n - c h - r <-------- -> h 2n = c h - r ĩ [M -45] R Đứt gãy p : H2N -C H -C O O H — 7> H2N -C H -C O O H 4— — > H2N = C H -C O O H R - R m/z 74 100 57 75 <<o H oN -C H -C O O H bữdO 80 § 1 <o- CH3- Ó H - 0H 1---------------- — x 5 b£ạ 60 - 45 74 IỐ M -C H 3 40- M - H 20 104 29 101 M+ 20- 119 30 ~I U-r------- 1 ——I— --- 1 -------- 1--------- 1------_-_-__--L--r 40 50 60 70 80 90 100 110 120 m/z Hình 17.1 Phổ khối lượng của threonin Những pic quan sát thấy trong phổ khối lượng của a-amino axit tương ứng với các ion bền vững chứa nitơ và điện tích được định vị chủ yếu ở nguyên tử nitơ. Sự phân mảnh tiếp theo phụ thuộc vào cấu trúc của mạch nhánh. Thí dụ trong phân tử của threonin (x. hình 17.1), ngoài những mảnh thông thường H2 N = CH - COOH (m/z 74) và H 2 N = CH - CH(OH) - CH3 (m/z 74) còn quan sát thấy hai pic (m/z 75 và 57 ) với cường 538

độ tương đối lớn, được hình thành do chuyển vị Mack - Lafferty và tham gia của nhóm hiđroxyl ở mạch nhánh. Ngoài ra trong phân tử của threonin còn xuất hiện những pic ion cường độ thấp là [M - H20 ] +‘ (m/z 101) và [M -C H 3]+ (m/z 104). r 0/ H 0 +• 00 H ,c^ 1 11 11 11>+ 1 H OH H CH3 c OH /HNHL2ể u1 /_ nh2 É m/z 1 1 9 m/z 75 0 1 / Ú \\ / ú \\ 1 +• +• /O H h 2n - c h = c = o h 2n - c h = c ^ m/z 57 OH J Phổ ^-N M R Trong phổ 'H-NMR, các tín hiệu proton ở nguyên tử cacbon của a-am ino axit nằm trong vùng 3,5 - 4,4 ppm. Theo các tín hiệu này có thể phân biệt được các amino axit. Vùng dịch chuyển hóa học các proton ở nguyên tử cacbon p nằm trong vùng trường cao hơn và được đặc trưng bởi nhiều sắc thái. Chẳng hạn các tín hiệu proton ở cacbon (3 loại amino axit mạch không vòng xuất hiện ở vùng 1, 0 đến 2, 2 ppm, còn tín hiệu proton ở cacbon p của amino axit thơm và dị vòng xuất hiện ở trường thấp hơn (từ 3,1 - 3,5 ppm). Những proton ở cacbon p của amino axit bị giải chắn mạnh do trong phân tử có chứa nhóm thu electron mạnh từ cacbon p làm cho tín hiệu của chúng bị dịch chuyển về phía trường thấp hơn : đốị với serin là 3,9 ppm, còn threonin là 4,3 ppm. Các tín hiệu proton ở cacbon (5 của axit aspactic và axit glutamic là khác biệt nhau. Trong trường hợp này quan sát thấy sự gia tăng độ dịch chuyển hóa học ở các proton bị giải chắn mạnh tại nguyên tử cacbon p của axit aspactic (2,9 ppm) so với axit glutamic (2,1 ppm). Những a-am ino axit có trên 3 nguyên tử cacbon trong mạch đựơc đặc trưng bằng các tín hiệu bổ sung là các nhóm metyl (CH3), metylen(CH2) và metyn (CH). Các tín hiệu proton nằm trong vùng 7 ppm là đặc trưng cho các amino axit thơm và dị vòng. Phổ electron Trong thực tế, dung dịch của hầu hết amino axit không hấp thụ trong vùng nhìn thấy, còn trong vùng tử ngoại, chỉ những amino axit chứa vòng thơm(phenylalani và tyrosin) hoặc nhân dị vòng(tryptophan) có hấp thụ với các đặc trưng được ghi trong bảng 17.2. Phổ tử ngoại của tyrosin trong dung dịch kiềm có dịch chuyển các cực đại hấp thụ về phía sóng dài và tăng cường độ hấp thụ là do nguyên tử oxi của nhóm hiđroxyl phenolic bị ion hóa đóng góp vào hệ liên hợp của vòng thơm. 539

Giá trị đo độ tắt phân tử (s) của tyrosin ở 275 nm là khá lớn nên được sử dụng để xác định hàm lượng của protein trong dung dịch. B ảng 17.2 Những đặc trưng phổ tử ngoại của một số amino axit (M M H C l 0,1M NaOH a-Amino axit Độ dài sóng X, Độ tắt phân tử Độ dài sóng X, Độ tắt phân tử Tryptophan nm 8, l.m or^cnT 1 nm 8, l.m o r!.cm_1 Phenylalanin 218 33,500 Không có Không có Tyrosin 278 5550 287,5 450 257,5 195 Không có Không có Một vài pic phụ trong vùng 240 và 270 nm 223 8200 240 11.050 293,5 2330 275 1340 17.3 Tính chất hóa học Amino axit tham gia nhiều phản ứng tiêu biểu của amin và axit cacboxylic. v ề điều kiện cho các phản ứng này phải được chọn lựa một cách cẩn thận sao cho nhóm amino không cản trở phản ứng của nhóm cacboxyl. 17.3.1 Tính chất axit - bazơ của amino axit. Điểm đẳng điện Amino axit có chứa trong phân tử nhóm amino ( - NH2) và nhóm cacboxyl ( - COOH) làm cho nó có tính chất lưỡng tính. Ở trạng thái rắn, amino axit tồn tại như những ìon lưỡng cực, một dạng trong đó nhóm cacboxyl có mặt như một ion cacboxylat, - COO\" và nhóm amino có mặt như là một ion amini, -N H 3 . Trong dung dịch nước tồn tại một cân bằng giữa ion lưỡng cực và dạng anion, dạng cation của một amino a x it: H3NCHCOOH HO H3NCHCOO H 30 h 2n c h c o o H ,0' I ĩ ± I R R HO R Dạng cation lon lưỡng cực Dạng anion (ưu tiên trong dung dịch (ưu tiên trong dung dịch axit mạnh, thí dụ ở pH = 0) bazơ mạnh, thí dụ ở pH = ] 4) Dạng ưu tiên của amino axit có mặt trong dung dịch phụ thuộc vào pH của dung dịch và vào bản chất của amino axit. Trong dung dịch axit mạnh, tất cả amino axit có mặt đều là các cation ; trong dung dịch bazơ mạnh, chúng có mặt như là các anion. Ở một số pH trung 540

gian, gọi là điểm đẳng điện (pl), nồng độ của ion lưỡng cực là cực đại và các nồng độ của anion và cation là bằng nhau. Mỗi một amino axit có một điểm đẳng điện riêng biệt. Bảng 17.3 dẫn ra các giá trị pKa và pl của aminoaxit. B ảng 17.3 Các giá trị pKa và pl của amino axit Amino axit PKa pKa pKa pl (X-COOH a- NH3 mạch bên Alanin 6,0 Arginin 2,34 9,69 - 10,8 Asparagin 2,17 9,04 12,48 5,4 Axit aspactic 2,02 8,84 2,8 Cystein 2,09 9,82 - 5,0 Axit glutamic 1,92 10,46 3,86 3,2 Glutamin 2,19 9,67 8,35 5,7 Glyxin 2,17 9,13 4,25 6, 0 Histiđin 2,34 9,60 7,6 Isoleuxin 1,82 9,17 — 6,0 Leuxin 2,36 9,68 - 6,0 Lysin 2,36 9,60 6,04 9,7 Methionin 2,18 8,95 - 5,7 Phenylalanin 2,28 9,21 — 5,5 Prolin 2,16 9,18 10,79 6,3 Serin 1,99 10,60 — 5,7 Threonin 2,21 9,15 - 5,6 Tryptophan 2,63 9,10 - 5,9 Tyrosin 2,38 9,39 — 5,7 Valin 2,20 9,11 - 6,0 2,32 9,62 — 10,07 — Trước hết ta xem xét trường hợp alanin, một amino axit với mạch nhánh không có chứa nhóm cacboxyl cũng như nhóm amino. Nếu alanin có mặt trong một dung dịch axit mạnh (pH = 0), nó có mặt chủ yếu ở dạng cation và pKa của nhóm cacboxyl của dạng cation là 2,3- Nó nhỏ hơn đáng kể so với pKa của axit cacboxylic tương ứng (axit propionic) và cho thấy dạng cation của alanin là axit mạnh hơn. 541

CH3CHCOOH c h 3c h 2c o o h nh2 Axit propionic pKa = 4,89 Dạng cation của alanin pKa = 2,3 Dạng ion lưỡng cực của một amino axit cũng là một axit tương lai, bởi vì nhóm + - N H3 có thể cho đi một proton. pKa của dạng ion lưỡng cực của alanin là 9,7. CH3CHCOO\" +1 NH3 pK a = 9,7 Điểm đẳng điện (pl) của môt amino axit, thí du alanin là giá tri trung bình của pK„ và PKa2- 2,3 + 9,7 ,, pl = ----------- = 6, 0 (điếm đắng điên của alanin) pH của dung dịch axit mạnh tăng lên dần dần bằng cách thêm bazơ (HO”). Mới đầu (pH = 0) (x. hình 17.2) dạng ưu tiên là dạng cation. Nhưng rồi độ axit đạt tới pH = 2,3 (pKa của dạng cation, pKa ) một nửa của dạng cation được chuyển thành ion lưỡng cực J). Bởi vì pH tăng từ pH = 2,3 đến pH = 9,7, dạng ưu tiên là ion lưỡng cực. ở pH = 6,0, pH = pl và nồng độ của ion lưỡng cực là cực đại. CH3CHCOOH 4= = » CH3CHCOO <= = ± CH3CHCOO “ +1 h 30 + ; ĩ; h ,0 + 1 nh3 nh3 nh3 Dạng cation lon lưỡng cực Dạng anion (p K a,= 2 , 3 ) (pK a2 - 9 , 7 ) Khi pH tăng đến pH = 9,7 (pKa của ion lưỡng cực), ion lưỡng cực có một nửa chuyển thành dạng ainon. Sau đó, vì pH đến gần pH = 14 dạng anion trở thành dạng ưu tiên có mặt trong dung dịch. * Phương trình Henđơxcm - Hatxenban (Henderson - Hasseìbaìch) cho thấy, đối với axit (HA) và bazơ liên [HA] hợp của nó (A ) : p K a = p H + ìog -—— . [A ] [HA] Khi có một nửa được trung hoà, [H A I - ỊA I và lo g -—3 —= 0 ; vậy p H = pK a. [A ] 542

pH Đương lượng bazơ Hình 17.2 Đường cong chuẩn độ alanin Nếu mạch nhánh của một amino axit có chứa nhóm axit hoặc bazơ nhiều hơn bình thường thì sự cân bằng là phức tạp hơn. Thí dụ ta xét trường hợp lysin, một amino axit có thêm nhóm amino - NH7 ở cacbon e. Trong dung dịch axit mạnh, lysin có mặt như một đication bởi vì cả hai nhóm amino đều bị proton hóa. Proton đầu tiên là proton của nhóm cacboxyl (pKa = 2,2) đã bị mất do pH tăng lên. Proton tiếp theo bị mất đi từ nhóm a-amini (pKa= 9,0) và proton cuối cùng là từ nhóm e-amini. + _ ____ HO- + _ ____ _ HO- + _ _____ HO- „„ - H 3N (C H 2)4C H C 0 2H<===> H 3N (C H 2)4C H C 0 2 ĩ = = » H3N (CH 2)4C H C 0 2 <===ì H 2N (C H 2)4C H C 02 +1 h 30 + .1 h 30 + ' 1 h 30 + I nh3 nh3 nh2 nh2 Dạng đication của lysin Dạng monocation lon lưỡng cực Dạng anion (pK ai = 2,2) (pK a2 = 9,0) (pK a3 = 10,5) Điểm đẳng điện của lysin là trung bình cộng của pKa2 (monocation) và pKaí (ion lưỡng c ự c ): 9,0 + 10,5 ,, pl = ------------- = 9, 8 (điếm đắng điện của lysin) Phương pháp điện di Như đã biết, các amino axit có giá trị pl khác nhau nên ở một pH xác định chúng sẽ dịch chuyển về catot hoặc anot với những vận tốc khác nhau. Dựa trên cơ sở này người ta đã xây dựng phương pháp điện di để phân tách và tinh chế các amino axit từ hỗn hợp của 3 6-H H C T 2 543

chúng. Theo phương pháp nàv, người ta nhỏ vài giọt dung dịch hỗn hợp amino axit vào giữa tờ giấy lọc hoặc vào gel. Khi tờ giấy hoặc gel được đặt vào dung dịch đệm giữa hai điện cực và một điện trường áp dụng, một amino axit với pl lớn hơn pH của dung dịch đệm sẽ có một điện tích dương toàn bộ và di chuyển về catot (điện tích âm). Một amino axit khác với pl nhỏ hơn pH của đung dịch đệm sẽ có điện tích âm toàn bộ và di chuyển về anot (điện cực dương). Nếu hai phân tử có cùng một điện tích, thì amino axit có điện tích lớn hơn sẽ di chuyển chậm hơn trong quá trình của sự điện di, bởi vì cùng một điện tích có sự di chuyển một khối lượng lớn hơn. Bởi vì các amino axit không màu, vậy bằng cách nào ta có thể nhận biết được sự tách riêng của chúng ? Khi amino axit được đun nóng với ninhyđrin, chúng tạo thành sản phẩm có màu. Sau khi phân tách các amino axit bằng phương pháp điện di, giấy lọc đưực phun ninhyđrin và sấy khô trong tủ ấm. Hầu hết amino axit tạo sản phẩm màu tím. Số lượng các loại amino axit khác nhau có trong hỗn hợp được xác định bởi các vết màu trên giây lọc (x. hình 17.3). Những amino axit riêng lẻ được nhận dạng bởi vị trí của chứng trên tờ giấy lọc và so sánh với chất chuẩn. catot 00 • 0© ÌỀ ..... Ạ- ' V NH' Ọ ọĩ x ọị I H 2N C N H C H 2C H 2C H 2C H C O o c c h 2c h c o C H 3C H C 0 +n h 3 +n h 3 +n h 3 A rginin Aspactal (pl = 10,76) A lanin (pl - 2,98) (pl = 6,02) Hình 17.3 Sự tách riêng arginin, alanin và axit aspactic bằng phương pháp điện di ở pH = 5 17.3.2 Phản ứng este hóa nhóm cacboxyl Tương tự axit cacboxylic đơn chức, amino axit được este hóa bằng cách cho phản ứng với lượng dư lớn ancol và chất xúc tác axit (thường dùng HC1 khí). Với sự có mặt của axit, nhóm amino được proton hóa (-N H 3 ) và nó không gây cản trở cho phản ứng este hóa. Ọ C 6H 5 - C H 2- O H Ọ h 2n+ - c- h - c1 - o _ + _ II HC1 h 2n - c h - c - o - c h 2c 6h 5 /\\ /\\ h 2c c h 2 h 2c c h 2 \\/ ch2 ch2 Benzyl este prolin Prolin (90%) 544

Người ta thường dùng các metyl, etyl và benzyl este để bảo vệ nhóm cacboxyl của amino axit trong một số phản ứng không mong muốn. Thủy phân este bằng dung dịch nước của axit sẽ hồi lại amino axit tự do : o o + II H30 + + II Hr CH3CH2OH > H 3N -C H -C -O H H3N - C H - C - O C H 2CH3 c1 h 2c_6h 5 1c h 2c 6h 5 Etyl este phenylalanin Phenylalanin Dùng các benzyl este làm nhóm bảo vệ là đặc biệt tiện lợi bởi vì chúng có thể được loại bỏ bằng thủy phân axit hoặc bằng hiđro phân ở môi trường trung tính (“ tách riêng ra bằng cách cộng hiđro”). Sự hiđro hóa có xúc tác đã chuyển nhóm benzyl thành toluen và amino axit tự do : oo +1 / ~ \\ H2.Pd + II + CH; r \\ H3N - C H - C - O C H 2- / — - > H3N - C H - C - 0 c h 2c 6h 5 c h 2c 6h 5 Toluen Benzyl este phenylalanin Phenylalanin 17.3.3 Axyl hóa nhóm am ino Cho amino axit phản ứng với clorua axit, với sự có mặt của dung dịch kiềm đặc ta được dẫn xuất N-axyl (phản ứng Schotten - Baumann): C6H5COCl + H2N - C H 2-C O O H ------■> C6H5C O N H -C H 2-C O O H G ly x in N-Benzoylglyxin (Axit hipuric) Dẫn xuất N-fomyl được điều chế bằng cách cho amino axit tác dụng trực tiếp với axit fomic. Do bị axyl hóa, nhóm amino mất đặc tính bazơ và các N-axylamino axit có tính axit mạnh tương tự axit cacboxylic vậy. Ngoài các tác nhân axyl hóa là clorua axit, anhiđrit axit người ta còn dùng benzyl cloíomat để axyl hóa nhóm amino đến dẫn xuất benzyloxicacbonyl dùng trong tổng hợp peptit: h 2n - c h - c o o h 1 ? zI C6H5CH20 C - C 1 „ „ II (benzyl cloíomat) CH2CH(CH3)2 c 6h 5c h 2o - c - n h - c h - c o o h Leuxin I CH2CH(CH3)2 N-Benzyloxicacbonyl leuxin (90%) Nhóm amino của dẫn xuất N-benzyloxicacbonyl leuxin được bảo vệ bằng bán amit của este cacbamat, nó bị thủy phân dễ hơn các amit khác. Hiđro phân có xúc tác N-benzyloxicacbonyl amino axit cho axit cacbamic không bền, đecacboxyl ngay để cho amino axit tự do : 545

ọH H2.Pd oH I1I1 I I „ II I c h 2- o - c - n - c h - c o o h — ỉ— ■> CH3 + H O -C -N -C H - C O O H CH2 CH2 1 1 Toluen 17.3.4 Phản ứng tạo muối Amino axit có thể dễ dàng tạo muối với các axit mạnh cũng như với bazơ mạnh. Ngoài các muối thông thường a-am ino axit còn tạo với đồng và với một số kim loại nặng khác, những muối phức nội có màu, ít tan và rất bền. Thí dụ như phức đồng với glyxin có màu xanh đậm và không bị phân huỷ bởi natri hiđroxit mà chi bị phân huỷ bởi hiđro sunfua. p-Amino axit cũng tạo phức tương tự, nhưng kém bền hơn, các y- và ô-amino axit không tạo thành những hợp chất như vậy. Tính bền và những tính chất khác của phức được thể hiện ở sự tồn tại của cấu trúc vòng với các vòng không căng, trong đó amino axit chiếm hai vị trí phối trí của kim loại, một bằng oxi của mình và một gián tiếp bằng cặp electron chưa sử dụng của nhóm amino. Coban với số phối trí 6 , tạo muối phức với ba phân tử glyxin, còn đồng tạo phức chỉ với hai phân tử. o 3 H2N —CH2—COOH + Co(OH)3 Co (ffl) glyxinat 2 H2N —CH2—COOH + Cu(OH)2 1 Cu o 546 h^ n \" no

17.3.5 Tác dụng của nhiệt Khi đun nóng, các oc-amino axit hay este của chúng được chuyển thành 2,5-đixetopiperazin : /C O ^ RCHCOOH NH2 t0 R - C H CH 1 +1 1 [ _ + 2H20 hoocchr nh c h -r nh2 co' Các ị3-amino axit dưới tác dụng của nhiệt, tách đi nhóm amino và nguyên tử hiđro a để chuyển thành axit không no : H2N - C H 2CH2COOH — CH2=CHCOOH + NH3 P-Alanin Axit acrylic Tưomg tự hiđroxiaxit, các y- và ô-amino axit dễ tách nước và đóng vòng thành lactam. Thí dụ : CH2CH2CH2 CH2CH2CH2 + H20 11 11 nh2 cooh n h -----c o Axit y-amiaobutyric y-Lactam Khi chưng khan, nhất là với sự có mặt của bari hiđroxit, amino axit bị đecacboxyl hóa và chuyển thành amin bậc m ộ t: RCH(NH2)COOH - ^ 4 RCH2NH2 + C02 Phản ứng này rất giống với phản ứng đecacboxyl hóa gây ra bởi một vài loại vi khuẩn. 17.3.6 Phản ứng màu với ninhiđrin Đun nóng a-am ino axit với ninhiđrin ta có màu tím đậm : H2N -C H -C O O H + + C 0 2t 1 + R-CHO R Ninhiđrin Màu tím Amino axit Prolin là amino axit có nhóm amino bậc hai, khi phản ứng với ninhiđrin cho hợp chất có màu da cam. Ninhiđrin được dùng rộng rãi để hiện sắc kí giấy và điện di các a-am ino axit. Cơ chế phản ứng của amino axit với ninhiđrin để tạo sản phẩm có màu là như sau : 547

v^ N -^C7I>Hs- C11 -pỌ*••:- + HoO + h 20 oo oo Màu tím 17.3.7 Phản ứng với sự quay cấu hình ở nguyên tử cacbon bất đối Khi thế một nhóm nối với nguyên tử cacbon bất đối của amino axit thường xảy ra sự quay cấu hình (Walden, 1895). Thí dụ sự chuyển hóa của L-(+)- alanin COOH NOBr COOH 1 NOBr i h 2n - c h - h B r-C H -H 1 ch3 ch3 L-(+)-Alanin Axit L-(-)-brompropionic Tnh3 COOH I COOH h -c h -n h 2 I 1 H -C H -B r ch3 CH3 D -(-)-A lan in Axit D-(+)-brompropionic Trong dãy chuyển hóa trên, sự quay cấu hình xảy ra ở giai đoạn axit brompropionic phản ứng với NH3. Như vậy, không nên cho rằng sự quay cấu hình xảy ra ở giai đoại làm đ ổ i dấu của góc quay [tức là (+)-alanin —» axit (-)-brompropionic], vì rằng các hợp chất có cấu hình giống nhau không nhất thiết phải có cùng dấu của góc quay. Sự bảo toàn câi hình trong phản ứng giữa L-(+)- alanin và nitrosyl bromua có thể do phản ứng đã xảy ra theo cơ chế đơn phân tử hoặc do hiệu ứng kề (x. Tập 1, mục 8.3. lc). Chu trinh trên là một thí dụ về hiện tượng quay cấu hình ở nguyên tử cacbon bít đối xứng. Hiện tượng đó được gọi là quay cấu hình Vanđen (hay nghịch đảo Vanđen). 548

17.4 Phương p h á p điểu chê Việc điều chế amino axit bằng cách thủy phân protein thường rẻ hơn phương pháp tổng hợp, nhưng trong một số trường hợp, khi cần dùng các amino axit không có sẩn trong thiên nhiên, người ta vẫn phải điều chế bằng con đường tổng hợp. Phương pháp thủy phân cho phép nhận được các L-a-am ino axit, còn phương pháp tổng hợp thường chỉ cho ta các DL-a-amino axit mà thôi. Dưới đây ta sẽ xem xét một số phương pháp tổng hợp. 17.4.1 Amin hóa axit a-halogencacboxylic Phản ứng Hell - Volhard - Zelinsky (x. mục 12.3.4) là một phương pháp tốt để đưa brom vào vị trí a của axit cacboxylic. Axit a-bromcacboxylic được chuyển thành DL-a-amino axit nhờ amoniac dư : . RCH2COOH \" y 3 > RCHBrCOOH 2N--L> RCHCOO NH4 2 . H 2O ị Axit cacboxylic Thí du: CH3CHC0 0 H » CH3CHCOO N H Í 1 Br r A xit a-brompropionic rNNHri2, a-Alanin (muối) (65 - 70% ) 17.4.2 Tổng hợp Gabriel - este malonic Đây là phương pháp tốt để tổng hợp amino axit nhờ kết hợp các ưu điểm của phương pháp Gabriel trong tổng hợp amin (x. mục 14.13) và phương pháp este malonic trong tổng hợp axit cacboxylic (x. mục 13.11.2). Như đã biết, tổng hợp este malonic bao gồm phản ứng ankyl hóa đietyl malonat, thủy phân este và đecacboxyl hóa để tạo thành một axit ankylaxetic. Trong tổng hợp Gabriel - este malonic, chất đầu là este N-phtalimitmalonic, và có thể xem nó như là một phân tử glyxin với nhóm amino được bảo vệ bằng một amit (ở đây là phtalimit) nhằm ngăn cản nó hoạt động như một tác nhân nucleophin. Nhóm cacboxyl được bảo vệ bằng etyl este và vị trí a được hoạt hóa mạnh hơn nhò nhóm este thứ hai (nhóm este tạm thời) của đietyl malonat. nhóm este tạm thời Ỷ COOC2H5 0Ọ nhóm amino được bảo vệ nhóm axit được bảo vệ 549

Tổng hợp este malonic cho axit axetic thế, giống như vậy, tổng hợp este N- phtalimitmalonic cho sản phẩm là axit aminoaxetic thế, thủy phân rồi đecacboxyl hóa đến a-am ino axit. nhóm este tạm thời oT 1. C2 H5OH p COOC2H5 H.cr 2 .R -X p COOC2H5 N -ẹ-R N -C H b COOC2H5 I b COOC2H5 Este N-phtalimitmalonic COOH H + co^ +1 +1 H3N - ệ - R H3N — C — R I ĩ COOH COOH DL-a-am ino axit Tổng hợp Gabriel - este malonic được dùng để tổng hợp các amino axit mà không điều chế được bằng cách amin hóa trực tiếp axit halogencacboxylic. Dưới đây dẫn ra thí dụ về tổng hợp methionin mà bằng phương pháp amin hóa trực tiếp chỉ cho hiệu suất rất thấp : p COOC2H5 J COOC2H5 N - c - CH2CH2SCH3 H-0° + > N -ỘIH l . C 2 H5ONa c o o c 2h< 1 2. C1 - CH2CH2SCH3 0 COOC2H5 > H3N - C - C H 2CH2SCH3 COOH DL-Methionin (50%) 17.4.3 Phương pháp amin hoá - khử anđehit và xeton Amin hóa khử anđehit và xeton là một phương pháp tốt để tổng hợp amin. Nó cũng được dùng tổng hợp amino axit khi đi từ chất đầu là một a-xetoaxit. Mới đầu xeton phản ứng với amoniac tạo imin, sau đó imin bị khử thành amin nhờ hiđro và xúc tác palađi. Trong những điều kiện như vậy axit cacboxylic không bị khử. R -C -C O O H N H i dư H2/Pd R -C H -C O O 0ĩ > R - C - C O O NH4+ > ĩ a-Xetoaxit N -H nh2 Imin a-Amino axit Trong thực tế, tổng hợp này được hoàn thành trong một giai đoạn nhờ chế hóa a-xetoaxit bằng amoniac, hiđro và xúc tác palađi. Sản phẩm phản ứng là a-amino axit raxemic. Thí dụ : 550

c 6h 5 - c h 2 - c - c o o h NH,, H2 lí o — Pd Axit 3-phenyl-oxopropanoic Phương pháp amin hóa khử rất giống với sinh tổng hợp các amino axit và ta có thể gọi đó là tổng hợp phỏng sinh học (“bắt chước quá trình sinh học”). Sinh tổng hợp bắt đầu với phản ứng amin hóa khử axit a-xetoglutaric (một sản phẩm trung gian trong trao đổi chất của cacbohiđrat) với việc sử dụng ion amoni làm tác nhân amin hóa và NADH (dạng khử của nicotinamide adenine dinucleotide) làm tác nhân khử. Sản phẩm của phản ứng được xúc tác bằng enzym này là axit L-glutamic tinh k h iế t: Ọ n H H II N Axit a-xetoglutaric đường NADH Axit L-glutamic o H II c - nh2 + h20 N (tường NAD+ Trong sinh tổng hợp các amino axit khác, axit L-glutamic được dùng làm nguồn nhóm amino, và phản ứng trong đó nhóm amino chuyển từ phân tử này sang phân tử khác được gọi là sự chuyển amin hóa và enzym xúc tác cho phản ứng này được gọi là transaminase. Dưới đây dẫn ra phản ứng sinh tổng hợp axit aspactic với việc dùng axit glutamic làm nguồn nitơ và sản phẩm là một đối quang tinh k h iết: + o II HOOC- c h 2c h 2- c - c o o transaminase Axit a-xetoglutaric ++ II 551

17.4.4 Tổng hợp Strechcơ (Streeker) Strechcơ (1850) tổng họp amino axit bằng cách thêm axetanđehit vào dung dịch nước của amoniac và HCN mới đầu tạo thành a-aminopropionitrin rồi phản ứng thủy phân tiếp theo dẫn tới alanin raxemic : o NH2 +n h 3 C H 3 - C - H + NH3 + HCN — > CH3- ẹ - H CH3- ẹ - H Axetanđehit 1 1 C=N COOH a-Aminopropionitrin D L-A lan in (60%) Phương pháp Strechcơ cho phép tổng hợp một số lớn a-aminoaxit từ anđehit. Cơ chế của phản ứng là như sau : Giai đoạn 1 : Anđehit phản ứng với amoniac tạo imin. Ọ H+ N -H II + :NH3 <r=± II R -C -H R - C - H + H20 Anđehit Imin Giai đoạn 2 : Imin là một tương đồng nitơ của nhóm cacbonyl và có đặc tính electrophin. Ion CN- tấn công vào imin đã proton hóa cho a-aminonitrin. h 0 :n H \\ •• / H •• N NH' R -C -H ^-11 I2 Imin R -C -H R -C -H c 1 ^ CN CN a-Aminonitrin Thủy phân a - aminonitrin ta nhận được a-am ino axit. R — -°—> R H2N - C H - C = N H3N -C H -C O O H a-Aminonitrin a-Am ino axit (dạng axit) 17.4.5 Tổng hợp (3-amino axit và y-amino axit Một số trong các phương pháp điều chế a-am ino axit mô tả ở trên, thí dụ phương pháp amin hóa trực tiếp axit halogencacboxylic có thể được dùng để tổng hợp amino axit có nhóm NH2 và COOH ở cách xa nhau. Axit p-aminopropionic (P-alanin) có thể được điều chế bằng cách cộng nucleophin amoniac vào các axit a,p-không no hay este của chúng. 552

8+ 150°c » H 2N - C H 2- C H 2- C O O H c h 2- c h - c = o + n h 3 OH p-Alanin Axit acrylic P-Alanin cũng còn được điều chế nhờ thực hiện phản ứng thoái biến Hopman đối với sucxinim it: c h 2- c o NH + NaOH + NaOBr + H70 CH2-C O Sucxinimit ■> H2N - C H 2 - C H 2 -C O O H + N aH C03 + NaBr Tương tự như vậy, nếu thực hiện phản ứng thoái biến Hopman đối với glutarimit ta được axit y-aminobutyric : CH2 ch2 ch2 ch2 CH2 CH2 + N aH C03 + NaBr I I + NaOH + NaOBr + H20 CO CO •>11 NH NH2 COOH Glutarimit Axit y-aminobutyric 17.4.6 Tổng hợp các am ino axit thơm Axit o-aminobenzoic hay còn gọi là axit antranilic có thể được điều chế từ phtalim it: r r CO COOH \\ NH + NaOBr + H20 + NaBr 4* CO2 nh2 Phtalimit Axit antranilic Các đồng phân của nó là axit /n-aminobenzoic và axit p-aminobenzoic được điều chế bằng cách khử các axit nitrobenzoic tương ứng : COOH COOH Sn + HC1 no2 nh2 A xit M-nitrobenzoic Axit wí-aminobenzoic COOH COOH Sn + HC1 no2 nh2 A xit p-nitrobenzoic Axit p-aminobenzoic 553

Ngoài ra axit /?-aminobenzoic còn được điều chế bằng cách oxi hóa N-axetyl-p-toluđin : ch3 ch3 cooh cooh (CH 3C 0 ) 20 KMnO, KMn0 4 NH2 NHCOCH3 NHCOCH3 nh2 p-Toluđin N-Axetyl p-toluđin Axit p-axetamiđobenzoic Axit />aminobenzoic 17.4.7 Sự tách riêng amino axit raxemic thành đối quang Khi các amino axit được tổng hợp trong thiên nhiên chỉ có đối quang L được tạo thành. Nhưng khi tổng hợp amino axit trong phòng thí nghiệm thì sản phẩm là một hỗn hợp raxemic của các đối quang D và L (x. Tập 1, mục 6.2.2). Nếu ta chỉ cần một đồng phân thì phải tách riêng các đối quang. Hiện nay người ta thường tách riêng bằng các phản ứng dùng xúc tác enzym. Như đã biết, enzym là bất đối xứng, nó phản ứng với các đối quang ở những tốc độ khác nhau. Chẳng hạn như aminoacylase của thận lợn là enzym chỉ xúc tác cho phản ứng thủy phân N-axetyl-L-amino axit nhưng không thủy phân các N-axetyl-D-amino axit. Bởi vậy, nếu amino axit raxemic được chuyển hóa thành đôi N-axetylamino axit hỗn hợp N-axetyl hóa được thủy phân bằng aminoacylase thận lợn, các sản phẩm phản ứng sẽ là L-amino axit và N-axetyl-D-amino axit, có thể dễ dàng tách riêng. Bởi vì sự tách riêng biến thể raxemic thành đối quang phụ thuộc vào sự khác nhau của tốc độ phản ứng của enzym với hai hợp chất N-axetyl hóa nên kỹ thuật này được gọi là phương pháp tách động học. Ọ Ọ¥ Ọ¥ oo aminoacytase 11 thận lợn h 2n c h c o h CH3COCCH3 » CH3CNHCHCOH 1 H ,0 R R D-Amino axit N-Axetyl-D-amino axit + + L-Amino axit N-Axetyl-L-am ino axit Ọ o oo 11 COH > h 2n T+ h + CH3COH + CH3CNHCHCOH L-Amino axit N-Axetyl-D-amino axit 17.5 Giới thiệu các chất tiêu biểu • Glyxin (glicocol, axit a-am ino axetic), H2NCH2COOH, là amino axit đơn giản nhất, có chứa trong nhiều protein, lần đầu tiên nhận được khi đun sôi gelatin với axit sunfuric (Braconnot, 1820). Glyxin được điều chế từ axit cloaxetic và dung dịch amoniac đậm đặc trong nước : 554

C1—c h 7—COOH - 2™ Ậ> H2N - C H 2-C O O H - NH4C1 z z Glyxin là chất rắn kết tinh ở dạng hình trụ màu trắng, tnc 233°c, có vị ngọt, cũng vì vậy nó còn có tên là glicocol, xuất phát từ chữ Hy Lạp glycos là ngọt và cola là chất keo. Nó tan trong nước nhưng không tan trong etanol và ete. Khi đun nóng glyxin với metyl iođua sẽ tạo thanh betain. Hợp chất này cũng nhận được khi tương tác trimetylamin với axit cloaxetic trong dung dịch nước : H2N - C H 2- C O O H -----3C—HiI C' H3t íL - 3HI > C H 3-N -C H 2-C O O (CH3 )3N, t° c i - c h 2- c o o h ~ ' ÌH j Betain Betain có trong thành phần nhiều cây cỏ và trong một số loài sên và giáp xác (cua). Nó được phân lập lần đầu tiên từ nước ép củ cải đỏ (Beta vulgaris). Betain là chất rắn kết tinh (tnc 300°c với sự phân huỷ). • Axit hipuric (benzoylglyxin) C6H5CONHCH2COOH, lần đầu tiên được tìm thấy trong nước tiểu ngựa (Liebig, 1829). Nó cũng được sản sinh trong cơ thể của tất cả động vật có vú. Người ta điều chế axit hipuric từ glyxin và benzoyl clorua : H2N - CH2 - COOH C6Hhc° C1 > C 0 “ NH~ CH2“ C 00H Axit hipuric V iệc tạo thành axit hipuric trong cơ thể động vật có ý nghĩa quan trọng do gắn liền với quá trình giải độc các axit thơm. A xit benzoic tạo thành khi oxi hóa mạch nhánh của phenylalanin, được khử độc nhờ chuyển hóa đến axit hipuric. Bằng con đường như vậy có thể giải độc cho trường hợp cơ thể không may bị nhiẻm axit benzoic hoặc nó được tạo thành khi oxi hóa các đồng đẳng của axit benzoic mà mạch nhánh có số lẻ nguyên tử cacbon (oxi hóa (3). A xit phenylaxetic được tạo thành khi oxi hóa bằng con đường hóa sinh các axit thơm mà mạch nhánh có số chẵn nguyên tử cacbon được đa số động vật thải loại ra ngoài qua con đường nước tiểu cũng dưới dạng hợp chất kiểu amit với glyxin. Chỉ trong cơ thể người và hắc tinh tinh axit phenylaxetic mới kết hợp với glutamin. NHCOCH2C6H5 H2 N O C C H 2 C H 2CHCO OH Trong cơ thể chim, sự giải độc axit benzoic xảy ra bằng cách kết hợp với onitin để tạo thành axit onituric (N ,N ’ -đibenzoylonitin): C6H5 CONHCH2 CH2 CH2 CH(NHOCC6H5)COOH • L-(+)-Alanin (axit a-aminopropionic, a-alanin) CH3CHNH2COOH có trong thành phần đa số protein và chiếm một tỷ lộ lớn trong lụa íibroin (25%). 555

• P-Alanin (axit P-aminopropionic) H2N - CH2 - CH2 - COOH là P-amino axit đơn giản nhất, có trong chất chiết của cơ bắp, không có trong thành phần protein nhưng là một chất xúc tác sinh học quan trọng vì p-alanin là một khâu trong cấu tạo của axit panthotenic ; axit này rất phổ biến trong thiên nhiên, thuộc vào nhóm các vitamin B và có trong thành phần coenzym A. CH3 I HO - CH2- c - CH - CO - NH -(C H 2)2- COOH CH3 OH Axit panthotenic • Axit aspactic, HOOCCH.CHCOOH và axit glutamic, HOOCCH.CHXHCOOH J h 2 1 h 2 n n thuộc nhóm các axit monoaminođicacboxylic. Hai axit này tham gia vào thành phần protein thường dưới dạng monoamit là asparagin H7N O C -C H 7 -C H -C O O H và í H2 N glutamin H2NOC - CH2 - CH2 - CH - COOH . nh2 Asparagin được phân lập từ nước ép của cây thiên môn và các cây non khác (thuộc họ hòa thảo) trong thời kỳ trưởng thành. Trong mầm của cây đậu lupin (Lupiniis ìuteus) mọc trong tối, có tới 25% asparagin tính theo khối lượng cây khô. Trong cây của những họ thực vật khác (họ tùng bách) có chứa lượng glutamin lớn hơn. Trong nước ép của cây non cũng có chứa các aminoaxit tự do khác (valin, leuxin, lysin, phenylalanin và tyrosin), lẽ đương nhiên là chúng cùng với asparagin và glutamin cấu tạo nên các protein của thực vật. Asparagin và glutamin có vai trò quan trọng là chứa các nhóm amino dự trữ dùng cho tổng hợp amino axit. Chẳng hạn, nếu mầm đậu lupin chịu đựng được ngoài ánh sáng thì asparagin sẽ bắt đầu biến mất đồng thời protein được tổng hợp nhờ nitơ của asparagin. Glutamin thực hiện chức nầng tương tự trong cơ thể động vật. A xit L-glutamic dẻ dàng phân lập từ các nguồn thiên nhiên, thí dụ từ các sản phẩm của sự thủy phân protein có trong bột thực phẩm, từ các phế liệu của công nghiệp sản xuất đường từ củ cải đô. Bằng cách này người ta có thể sản xuất một lượng lớn axit L-glutamic với giá rẻ để dùng cho công nghiệp thực phẩm vắ trong y học, điều trị một số bệnh thần kinh. Axit glutamic là a-am ino axit và cũng là y-amino axit, vì vậy khi đun nóng nó chuyển thành dẫn xuất butyrolactan, có tên là axit oc-pyroliđoncacboxylic : H2C— c h 2 /\\ OCx /C H -C O O H N H 556

• Lysin (axit a,E-điaminocaproic) H2NCH2CH 2CH 2CH 2-CH -CO O H là axit NH2 diaminocacboxylic duy nhất có trong thành phần protein. Lysin có thể được tổng hợp từ caprolactam. Như đã biết, xiclohexanonoxim dưới dạng tác dụng của H2S 0 4 sẽ đồng phân hóa mở vòng thành e-caprolactam : CH2 - C H 2- C = N -O H CH2 - C H 2 - C O ^ c h 2- c h 2- c h 2 ■» ^ N H ch 2- c h 2- c h 2 Phản ứng này được dùng để sản xuất caprolactam trong công nghiệp. Thủy phân caprolactam sẽ tạo thành axit E-aminocaproic : ch 2- c h 2- c o . c h 2 - c h 2- c o o h I / N H + H20 ch 2- c h 2- c h 2- n h 2 ch 2- c h 2- c h 2 Benzoyl hóa để bảo vệ nhóm amino : H2N - ( C H 2)5-C O O H + C6H5C0C1 NaOH » C6H5C O N H -(C H 2)5- C O O H — Dưới tác dụng của sunfuryl clorua với sự có mặt của vết iođ đã đưa được clo vào vị trí a : C6H5C O N H -(C H 2)5- C O O H C6H5C O N H -(C H 2)4 - C H - C O O H 2i Ở Sau đó halogen được thế bằng nhóm amino, còn gốc benzoyl được loại bỏ nhờ phản C6H5C O N H -(C H 2)4- C H - C O O H — Nã a > C1 > H2N -(C H 2)4 - C H - C O O H + C6H5COOH nh2 • O nitin (axit a,ô-điaminovaleric), H2N -C H 2 -C H 2 -C H 2 -C H -C O O H tham NH2 gia vào thành phần nhiều polipeptit là chất kháng sinh. Nó cũng tồn tại ở trạng thái tự do trong cơ thể động vật có vú, ở đó nó có vai trò quan trọng là tham gia vào sự tạo thành ure từ amoniac và cacbon đioxit. Onitin không có trong thành phần protein, nhưng được tạo thành khi thủy phân protein bằng kiềm do phân huỷ arginin tham gia vào thành phần protein : 557

/ N H 2 H20 —- > ^N H /N H 2 /N H 2 ^N H ^nh2 Ure Trong gan động vật có vú có enzym arginase xúc tác cho phản ứng thủy phân arginin thành onitin và ure. Đây là một giai đoạn quan trọng trong chu trình tạo thành ure. Onitin có thể được tổng hợp từ ỗ-valerolactam (giống hệt tổng hợp lysin từ E-caprolactam). Khi đecacboxyl hóa lysin và onitin, cũng như khi protein bị thối rữa tạo thành các điamin độc gọi là các ptomain. • Serin (axit Ị3-hiđroxi-a-aminopropionic) HO - CH, - CH - COOH có trong thành I NH2 phần protein, được phân lập lần đầu tiên từ các sản phẩm của sự thủy phân tơ lụa. Serin có thể bị đeamin không oxi hoá (yếm khí) bởi enzym deaminase của serin có trong gan (chỉ có giai đoạn 1 của quá trình chịu tác dụng của enzym ): COOH COOH COOH COOH c h 2o h ch2 ch3 + h 2 c> 1 ------ > Glicogen — ■> CO - NH3 I ch3 • T hreonin (axit p-hiđroxi-a-aminobutyric) CH3 - CH(OH) - CH(NH2) - COOH, có trong phân tử hai nguyên tử cacbon bất đối và do đó tạo thành bốn đối quang và hai biến thể raxemic, nhưng trong thiên nhiên người ta chỉ gặp một đối quang có cấu hình sau : COOH h 2n - c - h 1 H -C -O H CH3 • Cystein và cystin Cystin được tìm thấy lần đầu tiên trong sỏi nước tiểu năm 1810 và mãi tới năm 1899 mới phát hiện có trong sản phẩm thủy phân nhiều protein, nhưng với lượng đặc biệt lớn trong các protein của mô che phủ (sừng, lông mao, tóc, lông vũ). Từ sừng có thể phân lập được 6 - 7% cystin, từ tóc người được 13 - 14%. Cystin rất khó tan trong nước. Nhóm đisunfua của cystin dễ dàng bị khử đến nhóm sunfuhiđrin - SH (thí dụ dùng bột kẽm trong môi trường axit hoặc hiđro trên palađi) và như vậy cystin được chuyển thành cystein 558

(axit p-mecapto-a-aminopropionic). Đến lượt mình cystein dể dàng bị oxi hóa để chuyển lại thành cystin (tốt hơn cả là trong môi trường kiềm yếu có mặt vết muối sắt hay đồng). S - C H 2 -C H (N H 2) - C O O H H 2H S-C H 2-C H -C O O H I <==> 1 S - C H 2 -C H (N H 2) - C O O H nh2 0 Cystin Cystein Đặc tính tạo liên kết đisuníua cũng quan sát thấy ở các dẫn xuất cystein, thí dụ ở các peptit glutathion và oxitoxin cũng như là ở các protein. Các liên kết này có vai trò quan trọng trong cấu tạo protein. Khi oxi hóa cystein bằng nước brom, nhóm sunfuhiđrin sẽ chuyển thành nhóm sunfo và có axit cysteic. Đun nóng axit này với nước sẽ tách C 02 đi và tạo thành taurỉn : CHoSH CH2S 0 3H CH2S 0 3H 1 11 ch n h 2 — > chnh2 — >ch2nh2 + co2 COOH COOH Taurin Cystein Axit cysteic Taurin có trong sản phẩm thủy phân mật bò (tên gọi taurin xuất xứ từ tiếng La tinh, taurus là bò đực). Trong mật, taurin ở dưới dạng axừ taurocholic C24H390 4 - NH - CH2 - CH2S 0 3H. Taurin cũng có ở dạng tự do với lượng lớn trong cơ bắp của một số loại sò và giun và với lượng nhỏ hơn nhiều trong cơ bắp của động vật có xương sống. • M ethionin (axit y-metylthio-a-aminobutyric), CH3 - s - CH2 - CH2 - CH - COO H , NH2 có trong protein với lượng nhỏ, nhưng amino axit này có vai trò quan trọng trong cơ thể sống là giữ vai trò tác nhân chuyển metyl hóa, có thể nhường nhóm metyl cho chất nhận thích hợp để chuyển thành homocystein. Thí dụ sinh tổng hợp creatin từ axit guaniđinaxetic (glicoxiamin): /N H 2 sch3 ------ > HN = C ^ +1 NHCH2COOH CH2CH2CH(NH2)COOH G licoxiam in Methionin _ /N H 2 + sch3 ------ > H N = C ^ 1 CH2CH(NH2)COOH \" NCH2COOH ch3 Homocystein Creatin Homocystein lại được metyl hóa bằng nhóm metyl của cholin hay betain, có trong thức án. Methionin tham gia vào việc khử độc một số chất độc và được dùng điều trị bệnh gan. 37- HHCT2 559

Phương pháp đơn giản nhất để tổng hợp methionin là cho natri metylmecaptit tác dụng với a-amino-y-butyrolacton : CH3SNa + H2C - C H - N H 2 ■> CH3S - C H 2- C H 2-C H -C O O N a 11 I nh2 h 2c c o o Muối natri của methionin được phân huỷ bằng cách thêm axit axetic đến phản ứng trung hoà : CH3S - CH2CH2C H - COONa CH.COOH > CH3S - C H 2CH2C H -C O O H + CH3COONa NH2 NH, Các amino axit thơm • Axit aAntxriatnainlitcra(anxiliỉtcỡ(-axmitinỡo-baemniznooibc)e,nlzàoicch)ấ, tlàrắcnháctó rtăn c1ó45t°nc,1đ4ược điều chế dễ dàng từ monoamit của axit phtalic nhờ phản ứng chuyển vị Hopman : o ọ NaOCl Ọ 1 ĩ Cộ- c ONa C s ONa o nh2 c NH' 1 0 Nó còn được điều chế bằng cách nhiệt phân inđigo và cũng được dùng để tổng hợp inđigo. Metyl este của axit antranilic có trong thành phần của tinh dầu hoa nhài, hoa cam. Metyl este của axit N-metylantranilic lại có trong tinh dầu quít. Các este này được tổng hợp với lượng lớn để dùng trong sản xuất hương liệu. COOCH3 aNH2 M etyl antranilat Axit /7-aminobenzoic, có tnc 187°c được điều chế bằng cách oxi hóa p-nitrotoluen đến axit /?-nitrobenzoic rồi khử hóa tiếp theo đến axit /?-aminobenzoic : jT ~ \\ [0] ể ~ \\ COOH [H] » H2N — y— COOH > O.N OoN CH Axit />aminobenzoic Axit /?-aminobenzoic cũng còn được điều chế bằng cách oxi hóa N-axetyl-/>toluđin rồi thủy phân tiếp theo để loại bỏ nhóm axetyl. Etyl p-aminobenzoat có tên là anesthesin là một chất gây tê bộ phận tan trong dầu. Một chất gây tê khác, đặc biệt quan trọng, tan trong nước, được dùng nhiều để thay thế cho ancaloit thiên nhiên cocain và ít độc hơn cocain, 560

là một este của axit /?-aminobenzoic với đietylaminoetanol; nó dược dùng (dưới dạng muối clohiđrat) với tên gọi novocain : o H2N - ^ ^ C - o c 2h 5 Anesthesin HoN—(tỵ o c 2h 5 V C - 0 - C H 2 - C H 2- N - C 2Hs Novocain Axit /?-aminobenzoic đồng nhất với vitamin H, cần thiết cho hoạt động sống của vi sinh v ậ t; nó có trong thành phần của axit folic. Novocain được tổng hợp bằng cách axyl hóa P-đietylaminoetanol (điều chế từ etilen oxit và đietylamin) bằng p-nitrobenzoyl clorua rồi khử hóa tiếp theo : SO C l2 ff—\\ HO(CH2 )2 N (C 2 H 5 ) 2 o 2n ^ _ ^ c o o h > o 2N ^ _ y COC1 — > ° 2N^ 0 ^ 0 0 “ (CH2)2N(C2H5)2] C1- Pd H2N _0 ~ C 0 - 0 “ (CH2)2N(C2H5)2] Cl' Clohiđrat đietylaminoetyl p-aminobenzoat B. PEPTIT P eptit là tên gọi của những hợp chất mà trong phân tử có chứa nhóm peptit - CO - NH - được tạo thành từ hai đến khoảng năm mươi phân tử amino axit nhờ phản ứng trùng ngưng. Mỗi đơn vị amino axit trong peptit được gọi là một gốc amino axit. Tùy thuộc vào số gốc amino axit tham gia vào phân tử peptit, ta phân biệt đipeptit, tripeptit, tetrapeptit,... Tên gọi của các peptit xuất phát từ tên các amino axit cấu tạo nên nó theo thứ tự sắp xếp của chúng trong chuỗi polipeptit bắt đầu từ amino axit thứ nhất, nhưng amino axit nào có nhóm cacboxyl tham gia trong liên kết peptit thì đổi đuôi của nó thành “yl”. Thí dụ từ glyxin và alanin sẽ tạo thành hai đipeptit khác nhau : 561

o h 3n+ - c _ 2- _ 4;- n h -c h I - o h co -c c1 h 3 G ly xy lalan in Ọ H3N —CH—C O -rN H —CH2 —c —o 1 ch3 Alanylglyxin Với sự trùng ngưng theo kiểu này, các liên kết peptit nằm trên một mạch thẳng không phân nhánh, có hai đầu khác nhau gọi là “đầu N” (có nhóm a-amino tự do) và “đầu C” (có nhóm a-cacboxyl tự do) và đánh số thứ tự các gốc amino axit trong chuỗi peptit bắt đầu từ “đầu N”. Theo quy ước, người ta viết đầu N bên trái, còn đầu c viết bên phải. Từ ba amino axit sẽ tạo thành tripeptit: o o o H 3N+CHCI. 0 +ĩ +L + H3NCHC0 R + H3NCHCO R\" R' Ọ Ọ11 Ọ +ĩ ĩII đầu N đầu c Tripeptit Như vậy qua thí dụ trên ta thấy rằng từ các amino axit giống nhau có thể tạo thành các peptit khác nhau. Từ ba amino axit khác nhau tạo thành 6 peptit khác nhau, từ bốn amino axit khác nhau sẽ có 24 peptit khác n h au ,... Phân tử protein được cấu tạo từ 20 amino axit khác nhau, lại có số gốc amino axit lớn hơn 20 và như vậy có thể tạo thành một số rất lớn các protein khác nhau (khoảng 20 protein). Điều này giải thích tính đa dạng của protein về cấu trúc. Polipeptit là loại hợp chất có chứa nhiều gốc amino axit và thường có phân tử khối nhỏ hơn 5.000. Các protein có chứa nhiều đơn vị amino axit hơn và có phân tử khối vào khoảng từ 6.000 đến 40.000.000. Thuật ngữ oligopeptit thường dùng để chỉ các peptit có chứa từ 2 đến 10 gốc amino axit, nếu số đó lớn hơn 10 cho đến 50 ta có polipeptit, còn lớn hơn 50 là protein. 562

ỉ 7.6 Phương pháp tổng hợp peptit Việc nghiên cứu tổng hợp peptit kh ôn g những cho phép khẳng định cấu trúc các peptit thiên nhiên, điều chế ra những peptit mới mà còn mở ra con đường tổng hợp các chất thién nhiên phức tạp là các chất kháng sinh và các protein. Tổng hợp peptit là công việc phức tạp. Ta không thể tổng hợp được peptit mong muốn nhờ phản ứng trùng ngưng các amino axit khác nhau, vì sản phẩm sẽ là một hỗn hợp peptit. Thí dụ, ta muốn tổng hợp một đipeptit đơn giản alanylglyxin, Ala-Gly bằng cách cho alanin và glyxin phản ứng với nhau thì sản phẩm phản ứng không chỉ là Ala-Gly mà còn có cả Ala-Ala, Ala-Ala-Ala, Ala-A la-G ly,... Như vậy, hiệu suất phản ứng mong muốn sẽ thấp và việc tách tiêng các đipeptit, tripeptit và các peptit cao hơn là rất khó khăn. o 00 -pCH3CHCJ OL _ —1 .SOCI2-— >_ c h 3c h c1n h c_h__2_c__o-2 + C„ H3CH1CN_H__C_H__C_O_ -2 I 2 . h 3n c h 2c o 2 I I I nh3 nh3 nh3 ch3 + + + Ala Gly Ala-Gly A la -A la ỌỌ ọọ ĩ 1 ________ + c h 3c h c n h c h c n h c h c o 2 + CH3CHCNHCHCNHCH2CO2 111 11 nh3 ch3 ch3 nh3 ch3 A la -A la -A la A la -A la -G ly VI vậy, để tổng hợp một peptit có trình tự xác định các đơn vị amino axit trong phân tử, cần phải bảo vệ nhóm amino hay nhóm cacboxyl khi không cần chúng tham gia phản ứng tạo liên kết peptit. 17.6.1 Bảo vệ nhóm am ino Nhóm amino của amino axit thứ nhất cần được bảo vệ trước khi hoạt hóa và cho nó phản ứng với amino axit thứ hai. Nhóm bảo vệ phải được chọn lựa như thế nào đó để dễ dàng bị loại bỏ khi tái tạo nhóm chức mà không ảnh hưởng đến liên kết peptit mới hình thành. Nhóm amino có thể được bảo vệ bởi nhóm benzyloxicacbonyl C6H 5CH2OC - (ký 0 hiệu là Z) bằng cách cho benzyloxicacbonyl clorua tác dụng với amino axit trong môi trường bazơ. Thí dụ tổng hợp một đipeptit đơn giản Ala-Leu. Sau khi tổng hợp được peptit, nhóm bảo vệ z được loại ra khỏi phân tử peptit nhờ phản ứng khử dùng hiđro và xúc tác (H2/P d ): 563

ọ OH ___ l . ( C 2H5)3N c h 3c h c o 2 c h 3c h - c o 2h M_ 25 c -s | 2 -> ó\\ 1 2. C 1C 0 2 C 2 H 5 + C6H5CH20 C -C 1 +n h 3 nh b5 2 I A la Benzyl cloíomat c= o 1 c 6h 5c h 2o Z-Ala nh3 ọ I ọ ọ (CH,)2CHCH2C H C 02 „„ 11 „ 1 1 ____ Leu 1 1 _______ _____ Ht/Pcì -> C6H5C H - C - O C O C 2H5 ---------- —^---------> c h 3c h - c - n h c h c o 2h 1 \\ 11 NH C0 2 + C 2 H5OH NH ch c= 0 c= 0 CH I c 6h 5c h 2o I /\\ c 6h 5c h 2o h 3c c h 3 Anhiđrit hỗn tạp của Z -A la Z-Ala + Leu o + ^ ^ - ch3 + co2 — » CH3CH-C-NHCHCO2 nh3 ch2 1 CH h 3c Nc h 3 Ala + Leu Nhóm amino còn có thể được bảo vệ bởi nhóm te/-?-butoxicacbonyl (CH3)3C - O C - 0 (ký hiệu là Boc) bằng cách cho đi-/éT/-butyl đicacbonat (CHì )ì C - 0 C - 0 - C 0 -C (C H i)0 II II 00 tác dụng với amino axit. Sau khitổng hợp được peptit,nhóm bảo vệ Boc đượcloại ra khỏi phân tử peptit nhờ tác dụng của HBr hoặc CF3COOH. Nhóm cacboxyl thường được bảo vệ bằng cách este hóa và sau khi hoàn thành phản ứng nó được giải phóng trở lại bằng phản ứng thủy phân trong kiềm hay trong axit. Thường dùng nhất là este benzylic (hay este íéTí-butylic) của aminoaxit vì dễ tách gốc benzyl không những bằng thủy phân mà còn bằng hiđro hóa có xúc tác : H2N - C H - C O - N H - C H - C O O C H 2C6H5 > 11 K R— > h 2n - c h - c o - n h - c h - c o o h + C6H5CH3 11 R R' 564

Trong phản ứng tổng hợp peptit, ngoài việc bảo vệ nhóm chức amino, người ta còn hoạt hóa nhóm cacboxyl bằng cách chuyển thành axyl clorua, azit hoặc thành 4-nitrophenyl este. Để hoạt hóa nhóm cacboxyl, tác nhân ngưng tụ đixiclohexylcacbođiimit cũng rất có ưu thế. Do khả năng phản ứng cao của mình, mới đầu đixiclohexylcacbođiimit dễ dàng kết hợp với nhóm cacboxyl thành O-axylure, rồi phản ứng với a-amino axit đồng thời tách đi N,N-đixiclohexylure : C6H5CH2- 0 - C 0 - N H - C H - C 0 0 H + C6H n - N = C = N - C 6H n ------> R h 2n - c h - c o o h — > c 6h 5c h 2- o - c o - n h - c h - c \" / N H - C 6H h ---------R'---------- > I 0- < R N - C 6H n / N H - C 6Hu — > c 6h 5c h 2- o - c o - n h - c h - c o - n h - c h - c o o h + 0 = c ^ ĩĩ NH —C6Hji R R' Ta có thể lấy phản ứng tổng hợp L-alanyl-L-tyrosin làm thí dụ cho điều chế peptit có dùng nhóm bảo vệ và nhóm hoạt hóa : C6H5CH20 - C 0 C 1 + H2N -C H -C O O C H 3 ----- >C6H5CH2O C O -N H -C H -C O O C H 3 I -HC1 I ch3 ch3 Metyl este của L-alanin N 2H4 „ _________ „ HNO » C6H5CH2O C O -N H -C H -C O N H N H 2 C6H5CH2O C O -N H -C H -C O N 3 - C H 3OH D 3 z - 2H20 1 CH3 CH; H2N - CH—COOH ----- > c h 2- ( 3 - o h --------- --------->C6H5CH2- o - C O - N H - C H - C O N H - C H - COOH CH3 CH2- ^ - O H ch3 H - d > h 2n - c h - c o n h - c h - c o o h + IJ + co2 c h 3 c h 2- ^ ~ V o h L-Alanyl-L-tyrosin 565

17.6.2 Tổng hợp peptit ở pha rắn Năm 1969, Bruce Merriíìeld*' đã mô tả phương pháp có tính cách mạng trong tổng hợp peptit vì đây là còn đường rất nhanh để sản xuất peptit với hiệu suất cao. Theo phương pháp này, phản ứng tổng hợp peptit xảy ra trên bề mặt của chất mang rắn. Chất mang rắn chứa trong cột gồm các hạt nhựa copolime được điều chế từ sự đồng trùng hợp styren với vài phần trăm 4-(clometyl)-styren. + Styren CH2C1 Copolime của styren và 4-(clometyl)-styren 4-(clometyI)-styren Bước đầu tiên của phản ứng tổng hợp peptit ở pha rắn (x. hình 17.4) gồm có việc nối gốc amino axit thứ nhất đã được bảo vệ**) với hạt copolime. Sau khi bước này hoàn thành nhóm bảo vệ được loại bỏ và một phân tử amino axit thứ hai (cũng đã được bảo vệ) ngưng tụ với gốc amino axit thứ nhất với việc dùng đixiclohexylcacbođiimit (DCC) để hoạt hóa nhóm cacboxyl. Khi ấy nhóm bảo vệ của gốc thứ hai lại được loại bỏ và tổ hựp nhựa - đipeptit đã sẵn sàng cho bước phản ứng tiếp theo. Ưu thế của phương pháp này là ở chỗ việc tinh chế hạt nhựa và polipeptit nối với nó có thể được thực hiện ở mỗi bước phản ứng, đơn giản chỉ là rửa hạt nhựa với dung môi thích hợp. Các chất bẩn do không gắn với nhựa nên dễ dàng được loại bỏ bằng cách rửa. Trong phương pháp tổng hợp này, mỗi lần nối thêm một gốc amino axit chỉ cần 4 giờ. Tổng hợp protein trong cơ thể người được xúc tác bằng enzym và trực tiếp bởi ADN và ARN chỉ cần một phút để cộng thêm 150 amino axit trong một chuỗi liên tiếp. Kỹ thuật tổng hợp peptit của Merriíĩeld đã được ứng dụng có kết quả vào tổng hợp ribonuclease, một protein với 124 gốc amino axit. Toàn bộ tổng hợp gồm 369 phản ứng hóa học, và 11.931 bước trong thiết bị tự động hóa được thực hiện mà không cần tách riêng chất trung gian. Ribonuclease tổng hợp không những chỉ có các tính chất vật lý mà cả hoạt tính sinh học cũng giống hệt với enzym thiên nhiên. Hiệu suất toàn bộ là 17%, có nghĩa là hiệu suất trung bình của mỗi bước riêng biệt lớn hơn 99%. *’ R. Bruce MeiTÍfield, sinh 1921-, nhà hóa học Hoa Kỳ, giáo sư đại học Rockefelỉer. Giải thưởng Noben hóa học (1984) vê công trình tổng hợp peptit ở pha rắn. Nhóm chức amino trong amino axit được bảo vệ bằng nhóm tert-butoxicacbonyi 566

oo Copolime^)— CH2CI + HOCCHNHCOC(CH3)3 R Bước 1. Nối đầu c của gốc amino axit ị kazơ (đã được bảo vệ) với hạt copolime. Ọĩ ____ ¥ọ Bước 2. Làm sạch hạt nhựa nối với gốc amino axit bằng cách rửa. Copolime^)—CH2OCCHNHCOC(CH3)3 R | C F 3C 0 2H trong C H 2C12 Bước 3. Loại bỏ nhóm bảo vệ. Bước 4. Làm sạch bằng cách rửa. Ọ Bước 5. Cộng thêm gốc amino axit C op o lim e') — CH 9O ĩ CH NH2 (đã được bảo vệ). C Bước 6 . Làm sạch bằng cách rửa. ^1 R ỌII ỌII H O CCH N H CO C(CH 3 ) 3 R' và đixiclohexylcacbođiimt ▼ -------- --- 1 1 __Ọ_____1 1 _Ọ_____ Ọ II (^Copolimey—C H 2 0 C C H N H C C H N H C 0 C (C H 3 )3 R R' ị c F 3 C 0 2H trong C H 2 C12 Bước 7. Loại bỏ nhóm bảo vệ. L ặp lại các bước 4 - 7 Bước cuối cùng ị HHBBr trong C F 3C 0 2H ^ ^ _ Ọ¥ ____ ¥Ọ_____ĩ Ọ ....... rcopolim eV CHoBr + HOCC1 HNHCICHNHCCI HNH - vân vân R R' R' Hình 17.4 Phương pháp Merriíield tổng hợp polipeptit ở pha rắn 17.7 Tính chất Đa số peptit dễ tan trong nước, kể cả các peptit có trong thành phần những amino axit khó tan, peptit không tan trong etanol tuyệt đối. Cũng như amino axit, peptit có tính chất lưỡng tính do đó dưới tác dụng của điện trường, tùy theo pH của môi trường, peptit có thể di chuyển về anot hoặc catot. Peptit tham gia tất cả các phản ứng đặc trưng của nhóm amino và nhóm cacboxyl. Với axit và với bazơ, peptit tạo muối tan. 567

Peptit có một số tính chất của protein. Tương tự như các dung dịch của protein, dung dịch nước của các peptit có phân tử lớn dễ dàng tạo bọt. Phản ứng đặc trưng của peptit là phản ứng biure : dung dịch kiềm của peptit khi tác dụng với dung dịch CuS04 cho màu đặc trưng, do tạo thành các anion phức có chứa đồng. Khi đun nóng với axit, peptit cũng như protein bị thủy phân đến các amino axit. Lý thú là các peptit gồm từ các amino axit thiên nhiên (L-a-amino axit) cũng có thể bị thủy phân bởi các enzym phân giải protein (enzym peptiđase). Tuy vậy, protein có một số tính chất mà peptit không có. • Các polipeptỉt thiên nhiên Như đã biết, trong thiên nhiên không ngừng diễn ra các chuyển hóa protein và trong quá trình đó, một số phân tử bị phá vỡ và một số phân tử khác được tạo thành. Sự phá vỡ phân tử protein xảy ra trong cơ thể dưới tác dụng của các enzym phân giải protein dẫn tới một hỗn hợp phức tạp các polipeptit. Như vậy có thể xem polipeptit như là các mảnh của phân tử protein. Hiện nay số các peptit được phân lập từ dịch thủy phân protein có tói hàng trăm và nhiều chất trong số đó đã được xác định cấu trúc. Dưới đây ta sẽ xét một số polipeptit - hocmon. Oxitoxin và vazoprexin là hai hocmon được sinh ra trong thùy sau tuyến yên. Chúng có tác dụng kích thích co bóp cơ tử cung. Oxitoxin và vazoprescin được phân lập dưới dạng tinh khiết nhờ phương pháp chiết ngược dòng. nh2 ọ C6H4OH c 2h 5 1 1 ch2 ọ ch -ch 3 ch 2- í - I - . - ĩ h - ĩ n h - ĩ h ch c nh c c- c s1 1c = 0 _ ĩ„T ? ọ o NH 1„ ĩ I CH2 - C H - NH - c - C H - NH - c - C H - (CH2)2 - CONH2 c= 0 CH2 T conh2 CH2 - N x ọY _ Ọị I \" c h - c - n h - c h - c - n h - c h 2- c o n h 2 c h 2- c h 2 ĩ ch2 Ĩ/CH3 CH^ CH3 Oxitoxin Khối lượng phân tử của oxitoxin bằng 1007. Nhờ thủy phân oxitoxin, người ta nhận được các phân tử L-a-amino axit sau : cystin, tyrosin, isoleuxin, glutamin, asparagin, prolin, leuxin và glyxin. Nó là một nonapeptit (nếu tính cystin là hai gốc cystein). Nhờ phá vỡ 568

oxitoxin thành những peptit đơn giản hơn, người ta đã thiết lập được phương pháp nối ghép những amino axit này trong phân tử ; chúng hợp thành một mạch peptit duy nhất, có một gốc cystein ở đầu này và một gốc glyxin ở đầu kia. Các nhóm SH của hai gốc cystein được nối với nhau bởi liên kết đisunfua s - s. Liên kết này có thể bị đứt ra (khi khử hoá) và được nối lại (do bị oxi hóa bởi không khí) và khi đó hoạt tính sinh lý không bị mất đi. Ba nhóm cacboxyl của phân tử được amit hóa dưới dạng CONH2 (H. Tuppy ; du Vigneaud*1, 1955). Oxitoxin được tổng hợp bằng cách ngưng tụ hai peptit, một phân tử được bảo vệ nhóm đuôi NH2 bằng p-toluensunfo hóa, còn phân tử kia được bảo vệ ở nguyên tử s của cystein bằng cách benzyl hóa (Bz = C6H5CH2 ; Ts = p-CH3C6H4S 0 2). Ts-NH-L-isoleuxyl-L-glutaminyl-L-asparagin + + BzS- L-cysteinyl-L-prolyl-L-leuxyl-L-glyxinamit Heptapeptit nhận được, sau khi tách nhóm tosyl, cho ngưng tụ tiếp theo với N-cacbobenzyloxi-S-benzylcysteinyltyrosin. Dùng natri trong amoniac lỏng để loại bỏ các nhóm bảo vệ (cacbobenzyloxi và benzyl) khỏi sản phẩm, khi đó nonapeptit tạo thành được đóng vòng nhờ oxi hóa cả hai nhóm SH bằng không khí. Đây là công trình đầu tiên trong phòng thí nghiệm về tổng hợp hợp chất hoạt tính sinh học có cấu trúc protein (du Vigneaud, 1954). Oxitoxin điều chế theo phương pháp này được dùng trong trị liệu vì rẻ hơn sản phẩm thiên nhiên. Vazoprexin của tuyến yên lợn ứng với công thức dẫn ra dưới đây và như vậy nó khác oxitoxin ở chỗ là gốc isoleuxin của vòng được thế bằng gốc phenylalanin còn gốc leuxin của mạch nhánh được thế bằng lysin : s —Cystein—Tyrosin — Phenylalanin I s —Cystein—Asparagin — Glutamin I Prolin —Lysin —Glyxinamit Vazoprexin của lợn Vazoprexin của trâu bò lysin được thay thế bằng arginin : s —Cystein—Tyrosin —Phenylalanin I s —Cystein—Asparagin —Glutamin I Prolin —Arginin —Glyxinamit Vazoprexin của trâu bò Tác dụng sinh lý của vazoprexin khác với oxitoxin là nó làm tăng lượng đường trong máu. Vazoprexin cũng có thể được điều chế bằng con đường tổng hợp. *' Vigneaud (Vincent du Vigneaud ; 1901 - 1978), nhà khoa học Hoa Kỳ, giáo su đại học Y Cornell, nhận giải thưởng Noben hóa học (1955) về công trình tổng hợp toàn phần oxitoxin và vazoprexin. 569

• Hocmon cocticotropin (ACTH), hocmon này được sinh ra trong thùy trước của tuyến yên, có tách dụng kích thích sự phát triển lớp vỏ tuyến thượng thận. Người ta đã phân lập và nghiên cứu hocmon cocticotropin của một số loài động vật và nhận thấy chúng có cấu trúc giống nhau. Thí dụ ACTH của lợn là một mạch polipeptit gồm từ 39 gốc amino a x i t : Ser - T y r- Ser - Met - Glu - His - Phe - Arg - T rp - Gly - Lys - Pro - Val - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 -G ly - L ys - Lys - Arg - Arg - Pro - Val - Lys - Val -T y r - Pro - Asp -G ly 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 - A la -■Glu ■- Asp - Glu - Leu - A la - Glu - Ala -P h e - Pro •- Leu -G lu - Phe 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 Thực nghiệm đã chứng minh được rằng kể cả sau khi tách đi một số gốc amino axit thì hocmon cocticotropin vẫn giữ được hoạt tính sinh học. • Các xiclopeptit Nhiều vi khuẩn sản sinh ra các chất kháng sinh có cấu trúc của oligopeptit vòng (nhóm cacboxyl của đầu này được amit hóa bởi nhóm amino của đầu kia của phân tử). Thí dụ gramỉxỉđin và tiroxiđin (được sản sinh bởi Bacillus brevis), polimixin (B. polimixa), aerosporin (B. aerosporus) và baxitraxin (B. lichenỉformis). Amanitin và phaloiđin là các nhân tố độc của nấm Amanita phalloides cũng là các xiclopeptit. Dưới đây dẫn ra công thức cấu trúc của phaloiđin (T. Wieland, 1955) và gramixiđin s (G. F Grauze, 1942): HOCH2- c - CH- CHNH COCHNH — COCH—CH2 CHOH I h 3 1 N — CH2 c co NL H C1 O CH2 Cĩ H -C H 3 h 3c - ì N ộh H 11 1 co — HNCHCO C H C O -N H NXH H3C -CĩH O H Phaloiđin L-Leuxyl L-Leuxyl L -O n ityl L-Valyl L-Prolyl D-Phenylalanyl Gramixin s Như vậy, phân tử gramixin s gồm có hai nửa phân tử đối xứng ; phù hợp với giả thuyết là nó được tạo thành do kết quả của sự liên kết “đầu với đuôi” của hai pentapeptit.. Đặc trưng đối với tất cả các chất kháng sinh loại này là có mặt trong phân tử ít nihất một gốc D-amino axit, phổ biến hơn cả là D-phenylalanin như trong thí dụ dẫn ra ở trên. Baxitraxi có chứa ngoài D-amino axit, còn có axit D-aspactic, axit D-glutamic và D-onitin. 570

c. PROTEIIM Protein là polime sinh học của các a-amino axit. Chúng tham gia vào thành phần của tất cả các cơ thể động vật và thực vật, nhưng trong cơ thể động vật, vai trò của chúng đa dạng hơn. Protein có trong mọi bộ phận của cơ thể động vật và thực vật như thịt, máu, sữa, tóc, sừng, hạt... Bản thân các enzym cũng là protein. Thực vật tổng hợp protein (và các bộ phận cấu thành chúng là a-amino axit) từ C 0 2 và H20 nhờ quang hợp và hấp thụ những nguyên tố khác của protein (N, p, s, Fe, Mg, Zn, Ca, ...) từ các muối tan có trong đất. Còn động vật, chủ yếu nhận các amino axit có sẵn từ thực vật và từ đó xây dựng nên protein của cơ thể. 17.8 Phân loại protein Số lượng protein được phân lập từ các cơ quan, mô của động vật, thực vật và từ vi sinh vật là rất lớn. Mặt khác các protein phân biệt khác nhau về thành phần hóa học (các amino axit), về trình tự sắp xếp amino axit trong mạch polipeptit, về kích thước của các phân tử và cấu trúc không gian của chúng, về hoạt tính sinh học và về chức năng. Do đó việc phân loại protein gặp nhiều khó khăn. Để thuận tiện, người ta thường dựa vào thành phần hóa học để phân protein thiên nhiên thành hai nhóm lớn : - Protein đơn giản ; - Protein phức tạp hay proteit. Protein đơn giản khi thủy phân đến cùng chỉ cho amino axit. Thuộc vào nhóm này gồm có : anbumin, globulin, gliađin, histon, protamin, glutelin, prolam in,... Protein phức tạp là những phân tử gồm từ phần protein và một hợp phần khác không phải protein (hợp phần phi protein). Tùy theo bản chất hóa học của hợp phần phi protein, có thể phân thành các nhóm nhỏ như sau : Nucleoprotein có trong nhân tế bào, khi thủy phân nhẹ nhàng, chúng phân ly thành protein và axit nucleic. Cromoprotein với thành phần phi protein là các hợp chất có màu. Các cromoprotein có hoạt tính sinh học cao, tham gia trong nhiều quá trình sống quan trọng. Photphoprotein, hợp phần phi protein là axit photphoric. Có phổ biến trong cơ thể sinh vật. Thuộc nhóm này có một số enzym (photphoglucomutase, photphorilase A, ...)» cazein của sữa, vitelin của lòng đỏ trứng. Lipoprotein, hợp phần phi protein là các chất béo. Lipoprotein có vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển lipit trong cơ thể. Glicoprotein, hợp phần phi protein có thể là monosacarit, oligosacarit và dẫn xuất của chúng. Glicoprotein có trong tất cả các mô động vật, thực vật và vi sinh vật. Metaloprotein, hợp phần phi protein có chứa kim loại. Các kim loại thường gặp là Fe, Mg, Cu, Zn, Mn, Mo, ... Các metaloprotein có thể có nhiều chức năng khác nhau như vận 571

chuyến và dự trữ kim loại, trực tiếp tham gia hoạt động xúc tác của enzym, khi loại bỏ kim loại thì enzym mất hoạt tính xúc tác. Kim loại ở trong hợp phần phi protein, thí dụ sắt trong heme. 17.9 Thành phần và cấu trúc của protein Thành phần phần trăm khối lượng các nguyên tố trong phân tử protein (tính theo khối lượng khô) là như sau : cacbon : 50 - 55 ; hiđro : 6,5 - 7,3 ; oxi : 21,5 - 23,5 ; Iiitơ : 15 - 17,6 ; lưu huỳnh : 0,3 - 2,5. Ngoài ra, protein còn có thể chứa một lượng nhỏ các nguyên tỏ' khác như p, Fe, Zn, Cu, Mn, Ca, ... Cấu trúc của protein rất phức tạp, để thuận tiện cho việc nghiên cứu, người ta phân biệt cấu trúc bậc I, bậc II, bậc III và bậc IV. Cấu trúc bậc I là trình tự kết hợp của các gốc amino axit trong mạch polipeptit của phân tử protein. Cấu trúc này bền vững nhờ liên kết peptit. Để xác định cấu trúc bậc I, người ta thường sử dụng các phương pháp phân huỷ khác nhau như đã dùng trong xác định cấu trúc polipeptit. Năm 1953, lần đầu tiên F. Sanger** đã thành công trong xác định cấu trúc bậc I phân tử insulin của bò. Phân tử insulin gồm có hai chuỗi polipeptit, chuỗi A gồm có 21 gốc amino axit, chuỗi B có 30 amino axit. Hai chuỗi này được nối với nhau bằng các liên kết đisuníua s - s (x. hình 17.5). Insulin có tác dụng điều chỉnh hàm lượng đường trong máu. Đến nay đã có khoảng vài trăm protein được xác dịnh cấu trúc bậc I. Việc xác định cấu trúc bậc I là cơ sở để tổng hợp nhân tạo protein bằng phương pháp hóa học hoặc bầng con đường công nghệ sinh học. Đầu N Serx của chuỗi A y^ Leu\\ i s Cys Tyr- ^ 1 !—ĩ __, / Vai Gly h Ilc — Val— Glu — Gln- Cys Serx 10 15 G lu \\. 5 \\/ Tyrv. C y s — A la Cys— Asn ____ , \\ K > > IPhe I—Val—Asn— G ln ~ His— Leu— Cys Cys 5 G1V\\_ V XI yá'iV Gi iy,2,0 Đầu N G ly\" s e r . ./“ / của chuỗi B ỉí Ì(f '\" L e u - V a l - G l u - A l a - L e u - T y ' T LeU ỹ lu Gly \" Ars Ala - L y s - Pro - T h r - T y r^ ^ 5® Phe 30 Hình 17.5 Cấu trúc insulin của bò. Insulin của bò có một liên kết đisuníua nội phân tử, nó tạo thành một vòng trong chuỗi A và hai liên kết đisunĩua nội phân tử khác nối các chuỗi A và B với nhau. } Sanger F. (Frederick Sanger, sinh 1918), nhà hóa sinh Vương quốc Anh. H ai lấn nhận giải thưởng Noben hóa học : lần thứ nhất (1958) vê nghiên cửu cấu trúc protein và thiết lập công thức insulin ; lần thứ hai (J980) vẻ nghiên cứu A D N cùng với hai nhà khoa học Hoa Kỳ Becgơ (P. Berg) và Ginbe (W. Gilbert). 572

Insulin là protein đầu tiên được tổng hợp bằng phương pháp hóa học vào năm 1966 và ngày nay người ta đã có thể sử dụng vi khuẩn Escherichia coli để tổng hợp insulin. Cấu trúc bậc I góp phần quan trọng trong nghiên cứu bệnh lý phân tử. Các kết quả nghiên cứu cho thấy, khi thay đổi trình tự sắp xếp amino axit, kể cả thay đổi chỉ một gốc amino axit trong phân tử protein có thể làm thay đổi hoạt tính sinh học, chức năng của một cơ quan, hoặc gây những bệnh đặc trưng. Thí dụ bệnh thiếu máu hồng cầu hình lưỡi liềm thường gặp ở các nước Châu Phi. Nhờ nghiên cứu cấu trúc bậc I của hemoglobin bình thường và hemoglobin bệnh lý đã xác định được đó là do gốc amino axit duy nhất glutamin ở vị trí thứ 6 trong chuỗi p của hemoglobin A (bình thường) đã được thay thế bằng gốc amino axit valin. Cấu trú c bậc II phản ánh cấu dạng của mạch polipeptit. Nó được xác định bởi cấu trúc bậc I và được cô' định trong không gian nhờ liên kết hiđro giữa các nhóm peptit của mạch polipeptit. Trong phân tử protein các gốc amino axit kết hợp với nhau tạo thành chuỗi polipeptit; I trong mạch dài polipeptit luôn lặp lại các mảnh phân tử - c o - NH - CH Mạch bên của các amino axit không tham gia tạo thành bộ khung của mạch, mà ở bên ngoài mạch peptit. Kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học cho thấy nhóm peptit - c o - NH - là phẳng và cứng nhắc. Nguyên tử oxi của nhóm cacbonyl luôn ở vị trí trans đối với nguyên tử hiđro nối với nitơ (x. hình 17.6), nhưng nhóm peptit có cấu hình phẳng, tức là tất cả các nguyên tử tham gia trong liên kết peptit nằm trên cùng một mặt phẳng. 1,53 Ả các liên kết đơn ; có sự quay tự do xung quanh các liên kết này 1,32 Ả liên k ết này có một phần đặc tính của liên kết đ ô i; không có sự quay tự do xung quanh liên kết này m ặt phăng chứa liên kết peptit và hai nguyên tử cacbon liền kề Hình 17.6 Độ dài liên kết và góc của nhóm peptit Người ta đã xác định được khoảng cách giữa c và N trong liên kết peptit là 1,32 Ả, c - N cnghĩa là ở giữa độ dài của liên kết đơn (1,49 Ả) và độ dài của liên kết đôi - = N - (1,27 Ả). Do đó liên kết peptit có một phần đặc tính của liên kết đôi làm cản trở sự quay tự do xung quanh liên kết này. Sự tương tác cộng hưởng giữa nguyên tử nitơ và nhóm cacbonyl có thể được biểu diễn như sau : 573

Nhờ khảo sát bằng phương pháp nhiễu xạ tia X, L. Pauling và R. Corey (1951) đã chứng minh rằng các chuỗi polipeptit có thể có cấu dạng xoắn a hoặc phiến gấp nếp p. Các cấu dạng này được duy trì bền vững nhờ sự hình thành các liên kết hiđro N - H ... o = c. Dạng phổ biến nhất là xoắn a, mà mỗi một vòng xoắn có chứa 3,7 gốc a-amino axit, khoảng cách giữa các vòng xoắn vào khoảng 5,44 Â (x. hình 17.7). Trong cấu dạng xoắn a , liến kết hiđro hình thành giữa hai mắt xích của cùng một chuỗi polipeptit, còn trong cấu trúc phiến gấp nếp [3, liên kết hiđro xuất hiện giữa hai hoặc nhiều chuỗi polipeptit trên hai mặt phẳng khác nhau (x. hình 17.8). trục tưởng tượng của xoắn a trục tưởng tượng của xoắn a Q cacbon ịỳ nitơ o hiđro Q oxi Q mạch bên liên kết hiđro H ình 17.7 Xoắn a chỉ ra liên kết hiđro giữa các nhóm peptit và cấu dạng xoắn của mạch peptit (Hình vẽ này lấy từ cuốn “Organic Chemistry\" của tác giả Seyhan N. Ege. Đại học Michigan. Houghton Company, 1999)

Hình 17.8 Cấu trúc phiến gấp p của phân tửprotein C ấu trú c bậc ba là kết quả tương tác của các cấu dạng xoắn của các chuỗi polipeptit trong phân tử protein. Đó là cấu trúc không gian ba chiều đặc trưng đối với mỗi loại protein với chức năng sinh lí riêng biệt của nó. Cấu trúc bậc ba được duy trì nhờ tương tác của các nhóm chức trong các gốc amino axit của các chuỗi polipeptit. Chẳng hạn như khi các nhóm cacboxyl và nhóm amino lại gần nhau có thể tạo thành liên kết am oni; nhóm cacboxyl gặp nhóm hiđroxyl có thể tạo thành liên kết este ; các nhóm ãuníuhiđrin - SH lại gần nhau sẽ tạo thành liên kết đisunfua - s - s Liên kết đisunfua có vai trò rất quan trọng trong việc duy trì cấu trúc bậc ba. Trên cơ sở các dữ kiện của phương pháp phân tích Rơnghen và trình tự sắp xếp của các gốc amino axit, người ta đã xác định được cấu trúc không gian ba chiều của hemoglobin và mioglobin là những phân tử có khả năng giữ oxi. Cấu trúc bậc bốn của protein là một tập họp gồmhai hoặc nhiều chuỗipolipeptit riêng biệt được kết hợp với nhau (x. hình 17.9) nhờ lực hút Van de Van và liên kết hiđro giữa các nhóm nguyên tử phân bố trên bề mặt các chuỗi polipeptit. Tập họp này thường đirợc gọi là oligome và các chuỗi polipeptit được gọi là cấu trúc dưới đơn vị (subunit). Các cấu trúc dưới đơn vị của một protein oligome có thể giống hệt nhauhoặc rất khác nhau về cấu trúc bậc một, bậc hai và bậc ba của chúng. Cấu trúc bậc bốn của hemoglobin, mà nhiệm vụ của nó là phân phối oxi từ phổi đi khắp cơ thể (x. hlnh 17.9). Hemoglobin gồm hai cấu trúc dưới đơn vị cc, mà mỗi một cấu trúc này có 141 gốc amino axit và hai cấu trúc dưới đơn vị p, mỗi một có 146 gốc amino axit. Mỗi cấu trúc có chứa một nhóm heme, có trách nhiệm cho màu đỏ đặc trưng của máu và là nơi giữ một phân tử oxi. 3B- HHCT2 575

nhóm heme Hemogỉobỉn nhom heme L^ẵl chuỗi a ỉ— i chuỗi p nhóm heme H ình 17.9 Bốn chuỗi polipeptit cuộn lại, hai cấu trúc dưới đơn vị a và hai cấu trúc dưới đơn vị p tập họp lại thành cấu trúc bậc bốn của hemoglobin Các bậc cấu trúc của protein được tóm tắt ở hình 17.10. a) Cấu trúbc>.bậc hai c) d) Cấu trúc bậc một #N Cấu trúc bậc ba Cấu trúc bậc bốn ©c Oo o nhóm R •H D nhóm heme Hình 17.10 Các bậc cấu trúc của protein • Cấu trúc bậc một là trật tự sắp xếp các gốc amino axit trong phân t ử ; • Các cấu dạng phổ biến nhất xác định cấu trúc bậc hai của các polipeptit là các xoắn a và gấp 3 ; • Cấu trúc bậc ba là cấu d ạn g ba chiều của protein ; • Sự tập họp hai hay nhiều chuỗi polipeptit cuộn lại hoàn toàn tạo thành cấu trúc bậc bốn.Protein oỉigome trong thí dụ này gồm hai cấu trúc dưới đơn vị. (Hình vẽ này lấy từ cuốn “General, Organic and Biochem istry” của tác giả K.J. Denniston, J. J. Topping và R.L. Caret, nhà xuất bản Mc Graw Hill Higher Education, 2007). 576

17.10 Tính chất của protein Protein có thể tồn tại ở hai dạng chính : dạng cầu (hình hạt, hình bầu dục) và dạng sợi. Hai nhóm protein này khác nhau về một sô' tính chất. Các protein hình cầu tan trong nước hoặc dung dịch muối loãng, rất hoạt động về mặt hóa học. Nhóm này gồm hầu hết protein có hoạt tính xúc tác (enzym) : anbumin và globulin của lòng trắng trứng, của sữa, huyết thanh ; hemoglobin của máu, enzym của dịch tiêu hóa như pepxin,... Các protein hình sợi tương đối trơ về mặt hóa học, chủ yếu có chức nãng cơ học. Thí dụ colagen của da, xương, sụn, gân ; keratin của tóc, lông, sừng ; miozin của cơ, fibroin của tơ tằm... Tương tự amino axit, protein cũng là chất điện li lưỡng tính. Tùy theo pH của môi trường, điện tích của các phân tử protein cũng thay đổi. Khi tổng điện tích của protein bằng không thì pH lúc đó là điểm đẳng điện của protein. Trong điện trường không đổi, các tiểu phân protein tích điện dương đi về phía catot, các tiểu phân protein tích điện âm đi về anot. Sự đi chuyển các tiểu phân protein trong điện trường gọi là hiện tượng điện di. Phương pháp điện di cho phép xác định điểm đẳng điện của protein. Phương pháp này cũng được dùng trong tách riêng hỗn hợp protein. Thí dụ trước đây người ta cho rằng chỉ có một loại globulin của huyết thanh, nhưng thực tế có ba loại a - , (5- và Ỵ-globulin. Để phát hiện và định lượng protein, người ta thường dùng phản íừig biure là phản ứng đặc trưng cho tất cả các chất có từ 2 liên kết peptit trở lên (amino axit và đipeptit không có phản ứng biure). Trong môi trường kiềm mạnh, liên kết peptit trong phân tử protein phản ứng với CuS04 tạo phức màu tím hoặc tím đỏ. Phức màu có cực đại hấp thụ ở 540 nm. Độ nhạy của phản ứng tăng lên nhiều lần khi có thuốc thử Folin-Xiocanto (Folin-Ciocalteau). Hiện nay người ta đã cải tiến phương pháp biure, làm tăng độ nhạy của phản ứng lên hàng chục lần gọi là phản ứng micro biure. 17.11 Vai trò sinh học của protein Protein là thành phần không thể thiếu được của tất cả các cơ thể sinh vật, chức năng sinh học của protein rất đa dạng. Một số có các tính chất của hocmon, điều hòa các quá trình trao đổi chất. Thí dụ insulin điều chỉnh hàm lượng đường trong máu ; các protein khác (enzym) lại tác dụng như là các chất xúc tác cho các quá trình sinh học. Một số protein có vai trò vận chuyển các chất trong cơ thể : hemoglobin, mioglobin (ở động vật có xương sống), hemoxianin (ở động vật không xương sống) kết hợp với oxi và vận chuyển đến tất cả các mô và cơ quan trong cơ thể. Ngoài ra hemoglobin có vai trò quan trọng trong vận chuyển C 0 2, H+ và cuối cùng, nhiều protein là vật liệu xây dựng sinh học ; các protein loại này thường có dạng sợi, như selerotin có trong lớp vỏ ngoài của côn trùng, íibroin của tơ tằm, tơ nhện ; coỉagen, elastin của mô liên kết, mô xương. 577

D. ENZYM Một số lớn protein là enzym (chất xúc tác sinh học). Tùy thuộc vào các phản ứng mà enzym xúc tác, người ta phân thành 6 nhóm chính : (1) Oxidoreductase : Các enzym xúc tác cho phản ứng oxi hoá - khử. Thuộc vào nhóm này có dehidrogenase, oxidase, reductase, transhidrogenase và hidroxylase. (2) Transpherase : Các enzym xúc tác cho phản ứng chuyển vị. (3) Hidrolase : Các enzym xúc tác cho phản ứng thủy phân như esterase, glycosidase, peptidase, photphatase. (4) Liase : Các enzym xúc tác cho phản ứng phân cắt không cần nước các liên kết c - c, c - o và c - N. Thí dụ decacboxylase. (5) Isomerase : các enzym xúc tác cho phản ứng đổng phân hóa. Thí dụ raxemase, epimerase. (6 ) Ligase (synthetase): các enzym xúc tác cho quá trình kết hợp hai cơ chất. Enzym có trong mọi tế bào sống, do đó cũng được gọi là các chất xúc tác sinh học. Tuy nhiên enzym không những có thể xúc tác cho các phản ứng xảy ra trong cơ thể sống mà sau khi tách ra khỏi cơ thể sống chúng vẫn có thể xúc tác cho các phản ứng ở ngoài tế bào (ìn vitro). Như vậy có thể xem enzym là những protein cố khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hóa học. Bản chất hóa học của phần lớn enzym là protein và chỉ được xác định chắc chắn từ sau khi kết tinh được enzym. Enzym đầu tiên được điểu chế ở dạng tinh thể là urease của đậu tương (Sumner, 1926). Sau đó người ta cũng đã kết tinh được một số enzym khác và có đủ các dữ kiện thực nghiệm chứng minh rằng các tinh thể protein nhận được chính là các enzym. Vì bản chất hóa học của enzym là protein, do đó cấu trúc không gian của toàn bộ phân tử có vai trò quan trọng đối với hoạt tính xúc tác của enzym. Tuy vậy có một phần nhỏ của phân tử enzym chứa các nhóm chức trực tiếp kết hợp với cơ chất (chất có khả nãng kết hợp vào trung tâm hoạt động của enzym và bị chuyển hóa dưới tác dụng của enzym) tham gia trực tiếp trong việc hình thành, hoặc làm đứt các liên k ế t,... để tạo thành sản phẩm phản ứng, gọi là trung tâm hoạt động của enzym. Trung tâm hoạt động bao gồm nhiều nhóm chức khác nhau của amino axit, phân tử nước liên kết và trong nhiều trường hợp có cả ion kim loại, các nhóm chức của coenzym (enzym hai thành phần). Trung tâm hoạt động có cấu trúc không gian xác định, các nhóm chức của amino axit trong trung tâm hoạt động có thể ở xa nhau trong chuỗi mạch polipeptit cách nhau vài chục gốc amino axit nhưng lại gần nhau trong không gian. Giữa các nhóm chức này (và có thể có cả ion kim loại, coenzym) có sự định hướng trong không gian, cách nhau những khoảng cách nhất định (thường nhỏ hơn 3 Â) tạo thành cấu hình không gian phức tạp, được giữ vững nhờ mạng lưới liên kết hiđro. Sự tương ứng về cấu hình không gian giữa trung tâm hoạt động và cơ chất được hình thành trong quá trình enzym tiếp xúc với cơ chất. 578

So sánh với các chất xúc tác khác, enzym trơng đa sô' trường hợp có tính đặc hiệu cao ở kiểu phản ứng và ở cơ chất. Về kiểu phản ứng, mỗi enzym chỉ có khả nãng xúc tác cho sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định. Thí dụ phản ứng oxi hoá - khử, chuyển vị, thủy p h â n ,... Về cơ chất, enzym chỉ có tác dụng trên một chất nhất định và hầu như không có tác dụng với chất nào khác. Thí dụ urease chỉ có tác dụng với ure, thủy phân nó thành khí cacbonic và amoniac : H2N -C O -N H 2 + H20 - Ure- e~-> c o 2 + 2NH3 Tuy nhiên, về sau người ta nhận thấy rằng urease cũng có tác dụng đối với chất khác có cấu trúc rất gần ure (hiđroxiure) nhưng với tốc độ nhỏ hơn 12 0 lần so với khi dùng cơ chất ure. Mặt khác, nhiều enzym chỉ xúc tác một kiểu phản ứng nhất định (phản ứng đặc hiệu) như esterase phân huỷ các este, đehiđrogenase tách hiđro,... Cơ c h ế tác dụng của enzym đã được L. Michaelis và M. Menten nghiên cứu tỉ mỉ từ năm 1913. Mới đầu enzym và cơ chất tương tác với nhau tạo thành phức enzym - cơ chất, sau đó phức này bị phân huỷ thành sản phẩm phản ứng và enzym. Sự tồn tại của phức enzym - cơ chất (ES) đã được xác nhận bởi nhiều dữ kiện thực nghiệm và trong một số trường hợp đã quan sát được phức ES nhờ kính hiển vi điện tử hoặc tách được phức ES. Phức ES rất kém bền, nhanh chóng chuyển hóa giải phóng sản phẩm tạo thành và enzym tự do. Các loại liên kết chủ yếu được tạo thành giữa E và s trong phức ES là tương tác tĩnh điện, liên kết hiđro, tương tác Van de Van. Hình 17.11 dẫn ra giản đồ năng lượng của phản ứng hiđrat hóa axit fumaric thành axit malic dưới tác dụng của íumarase. H ỉnh 17.11 Giản đổ năng lượng của phản ứng hiđrat hóa axit íum aric thành axit malic dưới tác dụng của tumarase I. Fum arase ; II. Phức íumarase với axit fumaric ; III Phức hoạt động ; IV. Phức tum arase với axit malic ; V. Axit malic 579

Axit fumaric là cơ chất tạo phức với íumarase, phức này ở giai đoạn phản ứng có tốc độ xác định được chuyển thành phức của íumarase với axit malic và cuối cùng đến lượt phức này phân huỷ thành sản phẩm phản ứng và enzym ban đầu. Do đó ta có dãy phản ứng liên tiếp sau đây : Fumarase + Axit fumaric ki Phức -^=2-» Fumarase + Axit malic <- > fumarase với Sản phẩm k-1 axit fumaric (E) (P) Enzym Cơ chất (E) (S) Giữa tốc độ phản ứng và nồng độ cơ chất có sự phụ thuộc sau đây : V.max [ s ] V= K+[s] v ớ i: V - tốc độ cực đại, k_i . K = — - - hằng sô phân ly phức enzym - cơ chất (hằng sô Michaelis - Menten). Khi tăng nồng độ cơ chất, tốc độ phản ứng mới đầu tăng, sau đó giữ nguyên không thay đổi (x. hình 17.12) Với V = V-ma- ta c ó : vv_max ^ | j l ; K= 2[s]-[s] =[s] Lập luận như thế ta có thể giải thích được ảnh hưởng của các chất ức c/ỉế(inhibitor) (chất kìm hãm quá trình phản ứng) ký hiệu là I. - Các chất ức ch ế cạnh tranh ức chế thuận nghịch enzym, chúng có cấu trúc tương tự cấu trúc của cơ chất, do đó có khả năng cạnh tranh với cơ chất để tạo liên kết với trung tâm hoạt động của enzym, chiếm chỗ liên kết của cơ chất nhưng khác với cơ chất là nó không bị chuyển hóa dưới tác dụng của enzym. Sự kết hợp của I và s vào trung tâm hoạt động của enzym có tính chất loại trừ lẫn nhau. Như vậy I cạnh tranh làm giảm tốc độ phản ứng xúc tác là do làm giảm số lượng phân tử enzym có khả năng kết hợp với cơ chất. Thí dụ chất ức chế cạnh tranh của sucxinadehidrogenase là axit malonic HOOC - CH2 - COOH có cấu trúc gần giống với cơ chất của enzym là axit sucxinic HOOC - CH2 - CH2 - COOH. Do chất ức chế và cơ chất có khuynh hướng đẩy nhau ra khỏi phức với enzym cho nên khi nồng độ cơ chất rất lớn so với nồng độ chất ức chế, có thể loại trừ hoàn toàn tác dụng ức chế của nó. Giá trị của K lớn hơn khi phản ứng không có chất ức chế. 580

V V m ax V max 2 K [S] H ình 17.12 Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất s được xúc tác bởi enzym (hằng số L. Michaelis và M. Menten) 1. Tiến trình phản ứng bình thường ; 2. Sự ức chế cạnh tranh ; 3. Sự ức chê' không cạnh tranh - Các chất ức c h ế không cạnh tranh phản ứng không thuận nghịch với trung tâm hoạt động khác của enzym (không phải trung tâm bị tấn công bởi cơ chất) làm thay đổi cấu trúc không gian của enzym do đó làm giảm độ hoạt động của enzym. Tốc độ của phản ứng thấp hơn khi không có mặt chất ức c h ế ; giá trị K giữ nguyên không thay đổi. Tác dụng của thuốc chữa bệnh, của các chất độc thông thường và chất độc chiến tranh đều dựa trên cơ sở kìm hãm tác dụng của enzym. Trong công nghiệp hóa chất, cũng như trong sản xuất thuốc chữa bệnh và chế biến thực phẩm, việc sử dụng enzym làm chất xúc tác ngày càng tăng. Tuy vậy, so sánh với các chất xúc tác truyền thống, enzym chỉ được dùng trong khoảng nhiệt độ và độ axit của môi trường ở một giới hạn nghiêm ngặt. Hiện nay nhờ tạo được các chế phẩm em ym không tan bằng cách cố định enzym lên các chất mang rắn, không hoà tan như thủy tinh, xenlulozơ, n y lo n ,... mà người ta có thể sử dụng nhiều lần một lượng ênzym xấc định, E. AXIT NUCLEIC Axit nucleic là polime sinh học có trong nhân của tế bào sống. Tùy theo đặc điểm của pentozơ có trong thành phần cấu tạo, axit nucleic được phân thành hai nhóm chính : axit ribonucleic (ARN hoặc R N A ); và axit đeoxiribonucleic (ADN hoặc DNA). 17.12 Thành phần cấu tạo của axit nucleic Tương tự protein, axit nucleic là polime sinh học do các đơn vị riêng lẻ liên kết với nhau tạo thành mạch dài. Trong protein, các đơn vị riêng lẻ là amino axit, còn trong axit nucleic các đơn vị riêng lẻ là nucleotit. Enzym xúc tác cho sự phân cắt nucleotit thành nucleozit và ion photphat. Đến lượt nucleozit bị thủy phân trong môi trường axit sinh ra pentozơ và bazơ dị vòng. 581

Photphat lon photphat lon photphat Pentozơ Axit nucleic enzym Bazơ dị vòng enzym + H3ơ + + HoO h 20 Pentozơ Pentozơ y + Bazơ dị vòng Bazơ dị vòng Nucleotit Nucleozit 17.12.1 Bazơ dị vòng nitơ Các bazơ dị vòng nitơ trong ARN và ADN là các dẫn xuất của pyrimiđin và purin : 4 76 N Ni 1 < ^2 Pyrimiđin 9N 4 N I3 H Purin Trong ADN có bốn bazơ dị vòng nitơ khác nhau. Ađenin và guanin là những purin thế còn cytozin và thymin là những pyrimiđin thế. NH2 NH o H3C ^ A n / H tò Guanin Cytozin N (G) (C) I H H Ađenin Thymin (A) (T) Các dản xuất của purin có trong ADN Các dần xuất của pyrimiđin có trong ADN Chữ cái đầu tiên của tên các bazơ dị vòng được dùng làm tên rút gọn của chúng. Trong ARN cũng có bốn bazơ dị vòng khác nhau nhưng thymin được thay thế bằng uraxin, một dẫn xuất của pyrimiđin, vì vậy bốn bazơ trong ARN là ađenin, guanin, cytozin và uraxin. NH2 Ọ NH' Ọ NN N H N No N H < N ^O < I Uraxin NN H (Ư) I N N ^N H 2 H I Cytozin H (C) Ađenin (A) Guanin (G) Các dẫn xuất của purin có trong A RN Các dẫn xuất của pyrimiđin có trong ARN 582

Thành phần cấu tạo của ADN và ARN được dẫn ra trong bảng 17.4. B ảng 17.4 Thành phần cấu tạo của ADN va ARN Cấu phần Axit nucleic ADN ARN Dẫn xuất purin Ađenin Ađenin Guanin Guanin Dẫn xuất pyrimiđin Cytozin Cytozin Thymin Uraxin Đường pentozơ 2-Đeoxi-Ị3-D-ribozơ P-D-Ribozơ Liên kết photphat Nhóm photphat Nhóm photphat 17.12.2 Pentozơ Trong ARN, phần pentozơ là p-D-ribozơ, còn trong ADN, phần pentozơ là 2-đeoxi-P-D-ribozơ. Dưới đây là công thức dạng mạch hở và dạng furanozơ của ribozơ và 2 -đeoxiribozơ ; các nguyên tử cacbon của chúng được đánh số bằng các dãy số có dấu phẩy. Thí dụ : 1 \\ 2 \\ 3 ’... CHO CHO nỊ_r OH OH H— — H ĨnJ OH un OH . HO OH nTỊ r>Tĩ CH2OH P-D-Ribofuranozơ o u0 1n4 D-Ribozơ n c: h 2o h HO H 2 -Đeoxiribozơ 2-Đeoxi-Ị3-D-ribofuranozơ 17.13 Cấu trúc của nucleozit và nucleotit** Nucleozit Các nucleozit của ADN cũng như của ARN đều được cấu thành bởi một pentozơ và một bazơ dị vòng nối với nhau bằng liên kết N-[3-glycozit giữa nguyên tử C - l’ của pentozơ và nguyên tử N 1 của vòng pyrimiđin hoặc N9 của vòng purin. Hình 17.13 dẫn ra một số nucleozit trong ADN. *>TođơA.R. (Alexander Robertus Todd ; 1907 - 1997), nhà hóa sinh Vương quốc Anh ; nghiên cứii cấu trúc và tổng hợp nucleotit, nucleo iit và các coeniym nucleotit. Tođơ cũng nghiên cứu cấu trúc và tông hợp vitamin B ị , vitamin E và các ancaloit có trong cây cần sa và cây gai dầu. 583