E. Pilipčinec a kol._KEGA monografia 2022_č.j. 07UVLVF-4-2021

UNIVERZITA VETERINÁRSKEHO LEKÁRSTVA A FARMÁCIE V KOŠICIACH BIOINFORMATICKÉ A MOLEKULOVOBIOLOGICKÉ NÁSTROJE PRI ŠTÚDIU FAKTOROV PATOGENITY A VIRULENCIE MEDICÍNSKY VÝZNAMNÝCH BAKTERIÁLNYCH PATOGÉNOV Emil Pilipčinec, Mangesh Bhide, Ľudmila Tkáčiková, Jana Koščová, Radomíra Nemcová, Tomáš Csank, Vanda Hajdučková, Ján Király, Marián Maďar, Evelína Mochnáčová 2022

UNIVERZITA VETERINÁRSKEHO LEKÁRSTVA A FARMÁCIE V KOŠICIACH BIOINFORMATICKÉ A MOLEKULOVOBIOLOGICKÉ NÁSTROJE PRI ŠTÚDIU FAKTOROV PATOGENITY A VIRULENCIE MEDICÍNSKY VÝZNAMNÝCH BAKTERIÁLNYCH PATOGÉNOV Emil Pilipčinec, Mangesh Bhide, Ľudmila Tkáčiková, Jana Koščová, Radomíra Nemcová, Tomáš Csank, Vanda Hajdučková, Ján Király, Marián Maďar, Evelína Mochnáčová 2022

Autori: prof. MVDr. Emil Pilipčinec, PhD. prof. MVDr. Mangesh Bhide, PhD. prof. MVDr. Ľudmila Tkáčiková, PhD. doc. MVDr. Jana Koščová, PhD. doc. MVDr. Radomíra Nemcová, PhD. doc. MVDr. Tomáš Csank, PhD. MVDr. Vanda Hajdučková, PhD. RNDr. Ján Király, PhD. MVDr. Marián Maďar, PhD. MVDr. Evelína Mochnáčová, PhD. Recenzenti: prof. MUDr. Erik Dorko, PhD. doc. MVDr. Monika Pipová, PhD. Táto publikácia vznikla s podporou grantovej agentúry KEGA projekt č. 007UVLF-4/2021 Vydavateľ: Univerzita veterinárskeho lekárstva a farmácie v Košiciach Rok vydania: 2022 (elektronická forma) ISBN: 978 – 80 – 8077 – 768 – 5

POĎAKOVANIE Kolektív autorov vyjadruje svoje poďakovanie Natálii Rusnákovej, za zhotovenie obrázkov pre túto knižnú publikáciu. Naše poďakovanie patrí taktiež doc. MVDr. Zuzane Kosteckej, PhD., za jazykovú úpravu a cenné pripomienky pri príprave uvedenej knižnej publikácie. Vyjadrujeme taktiež svoje poďakovanie Bc. Ivane Báštiovej za redakčnú úpravu textu do tlače. Aby byli vzděláváni k vědění ne zdánlivému, nýbrž opravdovému, ne k povrchnímu, ale důkladnému. Ján Amos Komenský (1592 – 1670)

OBSAH PREDSLOV 13 I. PATOGENITA A VIRULENCIA BAKTÉRIÍ 16 A ICH ZÁKLADNÉ ZLOŽKY .................................................................. Emil Pilipčinec, Mangesh Bhide 16 18 II. ÚLOHA A VÝZNAM FAKTOROV PATOGENITY 22 A VIRULENCIE V PATOGENÉZE BAKTERIÁLNYCH INFEKCIÍ .................................................................................................... 25 Jana Koščová, Vanda Hajdučková 27 27 2.1 ADHEZÍNY ....................................................................................... 2.1.1 Fimbriálne adhezíny ........................................................................... 30 2.1.2 Afimbriálne adhezíny ........................................................................ 33 2.2 INVAZÍNY ........................................................................................ 35 2.2.1 Invázia fagocytujúcich buniek ........................................................... 2.2.2 Invázia primárne nefagocytujúcich buniek ........................................ 35 37 2.3 SIDEROFÓRY .................................................................................. 37 38 2.4 PUZDRO ........................................................................................... 38 2.4.1 Syntéza puzdra baktérií ..................................................................... 39 39 2.5 EXOTOXŃY ..................................................................................... 39 2.5.1 Toxíny typu I (Superantigény) ........................................................... 40 2.5.2 Toxíny typu II (Cytotoxíny) .............................................................. 41 2.5.2.1 Fosfolipázy ........................................................................................ 2.5.2.2 Perforíny ............................................................................................ 41 2.5.2.3 Toxíny s vlastnosťami detergentov ................................................... 2.5.3 Toxíny typu III (Intracelulárne toxíny) ............................................. 48 2.5.3.1 Toxíny inhibujúce proteosyntézu ...................................................... 2.5.3.2 Farmakologicky pôsobiace toxíny .................................................... 48 2.5.3.3 Neurotoxíny klostrídií ........................................................................ 51 2.6 ENDOTOXÍNY ............................................................................................. 52 53 III. SEKREČNÉ SYSTÉMY ............................................................................. 55 Jana Koščová, Vanda Hajdučková 3.1 SEKREČNÉ SYSTÉMY BAKTÉRIÍ A ICH VÝZNAM V PATOGENÉZE BAKTERIÁLNYCH INFEKCIÍ ......................... 3.2 SEKREČNÉ SYSTÉMY GRAM-NEGATÍVNYCH BAKTÉRIÍ .... 3.2.1 Sekrécia cez cytoplazmatickú membránu .......................................... 3.2.1.1 Sekrečná dráha Sec ............................................................................ 3.2.1.2 Sekrečná dráha Tat ............................................................................. 5

3.2.2 Sekrečný systém typu I ...................................................................... 56 3.2.3 Sekrečný systém typu II ..................................................................... 58 3.2.4 Sekrečný systém typu III .................................................................... 59 3.2.5 Sekrečný systém typu IV ................................................................... 62 3.2.6 Sekrečný systém typu V ..................................................................... 63 3.2.6.1 Sekrécia autotransportéra ................................................................... 63 3.2.6.2 Sekrécia pomocou dvoch partnerských zložiek ................................. 64 3.2.6.3 Sekrécia pomocou vodiacej bielkoviny a chaperónov ....................... 64 3.2.7 Sekrečný systém typu VI ................................................................... 65 3.2.8 Sekrečný systém typu VII – XI .......................................................... 66 3.3 SEKREČNÉ SYSTÉMY GRAM-POZITÍVNYCH BAKTÉRIÍ ...... 67 69 3.3.1 SecA2 ................................................................................................. 70 3.3.2 Sortázy ............................................................................................... 71 3.3.3 Extracelulárna sekrécia proteínov ...................................................... 72 3.3.3.1 Injektozóm ......................................................................................... 73 3.3.3.2 Sekrečný systém typu T7SS .............................................................. 74 3.4 HOSTITEĽSKÉ IMUNITNÉ ROZPOZNÁVANIE SYSTÉMOV BAKTERIÁLNEJ SEKRÉCIE .......................................................... IV. EVAZIVITA A JEJ MECHANIZMY ....................................................... 81 Ľudmila Tkáčiková, Mangesh Bhide, Evelína Mochnáčová 82 4.1 ODPOVEĎ IMUNITNÉHO SYSTÉMU NA BAKTERIÁLNU INFEKCIU ......................................................................................... 88 4.2 ÚNIKOVÉ STRATÉGIE BAKTÉRIÍ PRED VRODENOU 88 IMUNITNOU ODPOVEĎOU .......................................................... 89 89 4.2.1 Únikové stratégie využívané na ochranu pred pôsobením 93 antimikrobiálnych peptidov ............................................................... 94 95 4.2.1.1 Klasifikácia AMP .............................................................................. 95 4.2.1.2 Mechanizmus účinku AMP ............................................................... 96 4.2.1.3 Mechanizmy zabezpečujúce rezistenciu baktérií voči AMP ............. 97 4.2.1.3.1 Modifikácia povrchu baktérií ......................................................... 98 4.2.1.3.2 Tvorba kapsuly ............................................................................... 99 4.2.1.3.3 Alterácia štruktúry cytoplazmatickej membrány ........................... 4.2.1.3.4 Extracelulárne proteíny baktérií ..................................................... 100 4.2.1.3.5 Biofilm a exopolyméry .................................................................. 100 4.2.1.3.6 Efluxné pumpy ............................................................................... 108 4.2.1.3.7 Systémy identifikujúce antimikrobiálne peptidy ............................ 4.2.2 Únikové stratégie využívané na ochranu pred pôsobením 109 komplementu ..................................................................................... 110 4.2.2.1 Komplementový systém .................................................................... 4.2.2.2 Bakteriálne únikové stratégie pred komplementovým systémom ..... 4.2.2.2.1 Cielené zneškodnenie komplementu v klasickej (KC) a lektínovej ceste (LC): naviazanie C1-inh ....................................... 4.2.2.2.2 Cielené zneškodnenie komplementu v C3 konvertáze klasickej (KC) a lektínovej cesty (LC): naviazanie C4BP ............. 6

4.2.2.2.3 Inhibícia alternatívnej cesty (AC): Faktor H a Faktor H-like 113 proteín ................................................................................................ 120 4.2.2.2.4 Inhibícia cesty tvorby terminálneho komplexu: naviazanie 122 vitronektínu (Vn) a klusterínu ......................................................... 124 125 4.2.3 Únikové stratégie využívané na prežitie vo fagocytoch .................... 126 4.2.3.1 Extravazácia a migrácie fagocytov .................................................... 127 4.2.3.1.1 Ovplyvnenie migrácie fagocytov .................................................... 132 4.2.3.2 Rozpoznanie mikrobiálnych patogénov ............................................ 133 4.2.3.2.1 Únik pred rozpoznaním .................................................................. 135 4.2.3.3 Pohltenie a tvorba fagolyzozómu ...................................................... 138 4.2.3.3.1 Ovplyvnenie tvorby fagolyzozómu ................................................ 140 4.2.3.4 Deštrukcia .......................................................................................... 142 4.2.3.4.1 Únik pred deštrukciou .................................................................... 4.2.3.5 Autofágia ........................................................................................... 143 4.2.3.6 Extracelulárne pasce .......................................................................... 161 4.3 ÚNIKOVÉ STRATÉGIE BAKTÉRIÍ PRED ADAPTÍVNOU IMUNITNOU ODPOVEĎOU .......................................................... V. ÚČELOVÉ SPRÁVANIE BAKTERIÁLNEJ BUNKY ........................... Radomíra Nemcová, Marián Maďar, Ján Király 5.1 TVORBA BIOFILMU ....................................................................... 162 162 5.1.1 Biofilm ............................................................................................... 162 5.1.1.1 Výskyt biofilmov v prírode a na umelých materiáloch ..................... 163 164 5.1.1.2 Typy biofilmov .................................................................................. 165 166 5.1.2 Tvorba biofilmu ................................................................................. 166 5.1.2.1 Adhézia baktérií na povrch ................................................................ 167 5.1.2.2 Tvorba mikrokolónií .......................................................................... 168 168 5.1.2.3 Dozrievanie biofilmu ......................................................................... 168 169 5.1.2.4 Disperzia biofilmu ............................................................................. 169 5.1.2.5 Faktory ovplyvňujúce tvorbu biofilmu .............................................. 170 5.1.3 Ochorenia spojené s biofilmom ......................................................... 170 5.1.3.1 Zubný kaz a ochorenia paradontu ...................................................... 170 171 5.1.3.2 Rany ................................................................................................... 171 5.1.3.3 Periprotetické kĺbové infekcie ........................................................... 171 5.1.3.4 Urinárne infekcie ............................................................................... 172 5.1.3.5 Infekcie srdcových chlopní ................................................................ 175 5.1.4 Prevencia tvorby biofilmov a ich eliminácia ..................................... 5.1.4.1 Mechanické metódy regulácie tvorby biofilmu ................................. 5.1.4.2 Fyzikálne metódy regulácie tvorby biofilmu ..................................... 5.1.4.3 Chemické metódy regulácie tvorby biofilmu .................................... 5.1.4.4 Biologické metódy regulácie tvorby biofilmu ................................... 5.1.5 Využitie baktérií tvoriacich biofilm v priemysle ............................... 5.2 BIOFILM A QUORUM SENSING .................................................... 176 5.2.1 Quorum sensing .................................................................................. 177 7

5.2.1.1 Quorum sensing regulácia tvorby biofilmu 180 u Gram-negatívnych baktérií ............................................................. 181 5.2.1.2 Quorum sensing regulácia tvorby biofilmu 181 u Gram-pozitívnych baktérií .............................................................. 182 183 5.2.1.3 Medzidruhové quorum sensing signály ............................................. 183 5.2.2 Stratégie inhibície QS ........................................................................ 183 5.2.2.1 Syntéza derivátov QSI ....................................................................... 184 5.2.2.2 Modifikácia quorum zhášacích (QQ) enzýmov ................................. 5.2.2.3 Prírodné látky a lieky inhibujúce QS ................................................. 184 5.2.2.4 Využitie látok inhibujúcich QS pri kontrole tvorby biofilmu ............ 185 185 5.3 CHEMOTAXIA ................................................................................. 199 5.3.1 Typy aktívneho pohybu baktérií ........................................................ 204 5.3.1.1 Pohyb sprostredkovaný bičíkmi ......................................................... 206 5.3.1.2 Zášklbový pohyb (Twitching) ............................................................ 208 5.3.1.3 Kĺzavý pohyb (Gliding) ..................................................................... 208 5.3.1.4 Iné typy pohybu ................................................................................. 212 5.3.2 Mechanizmus bakteriálnej chemotaxie .............................................. 217 5.3.2.1 Reakcia baktérií s bičíkovým pohybom na chemické podnety .......... 220 5.3.2.2 Chemotaktická signálna dráha u Escherichia coli ............................. 224 5.3.2.3 Adaptačný proces ............................................................................... 224 5.3.2.4 Rozdiely v dráhach prenosu signálu u iných bakteriálnych druhov .. 225 5.3.3 Úloha pohybu a chemotaxie v kolektívnom správaní baktérií ........... 227 5.3.3.1 Expanzia populácie podmienená pohybom ........................................ 228 5.3.3.2 Autoagregácia chemotaktických baktérií ........................................... 229 5.3.3.3 Fyzikálne interakcie medzi pohyblivými bunkami ............................ 5.3.3.4 Úloha bičíka, pohybu a chemotaxie pri tvorbe biofilmu ................... 241 5.3.4 Úloha chemotaxie pri interakciách hostiteľ-mikroorganizmus .......... 242 VI. VÝZNAMNÉ BAKTERIÁLNE PATOGÉNY ČLOVEKA 243 246 A ZVIERAT A ICH FAKTORY PATOGENITY A VIRULENCIE ..... Emil Pilipčinec 247 6.1 VÝZNAMNÉ BAKTERIÁLNE PATOGÉNY ČLOVEKA 248 6.1.1 A ZVIERAT ...................................................................................... 248 6.1.2 Pôvodcovia nových a znovuobjavujúcich sa bakteriálnych nákaz .... 252 6.1.3 Pôvodcovia rezistentných foriem nákaz ............................................ 253 Pôvodcovia nákaz vyvolaných bakteriálnymi kmeňmi s novými 254 faktormi virulencie ............................................................................. 6.1.4 Pôvodcovia bakteriálnych zoonóz – chorôb prenosných zo zvierat 256 na človeka .......................................................................................... 6.1.4.1 Pôvodcovia bakteriálnych alimentárnych nákaz, alimentárnych intoxikácií alebo alimentárnych toxoinfekcií zoonotického charakteru .......................................................................................... 6.1.4.2 Pôvodcovia bakteriálnych zoonóz prenášaní vektormi ..................... 6.1.4.3 Nákazy s prírodnou ohniskovosťou ................................................... 6.1.4.4 Pôvodcovia bakteriálnych zoonóz prenášaní kontaktom alebo aerogénnou cestou .................................................................... 6.1.4.5 Pôvodcovia bakteriálnych zoonóz z poškrabania alebo pohryznutia psom, mačkou alebo iným zvieraťom .................. 8

6.1.5 Pôvodcovia nozokomiálnych infekcií ................................................ 257 6.1.6 Pôvodcovia nákaz ako súčasť biologickej hrozby (bioterorizmu) ..... 259 6.1.7 Pôvodcovia ostatných významných infekcií človeka ........................ 261 6.2. TAXONOMICKÉ ZATRIEDENIE VÝZNAMNÝCH 262 6.2.1 BAKTERIÁLNYCH PATOGÉNOV ČLOVEKA A ZVIERAT ...... 6.2.2 Taxonomické zatriedenie významných Gram-negatívnych 262 bakteriálnych patogénov .................................................................... Taxonomické zatriedenie významných Gram-pozitívnych 264 bakteriálnych patogénov .................................................................... 266 6.3 FAKTORY VIRULENCIE VÝZNAMNÝCH 266 GRAM-NEGATÍVNYCH BAKTERIÁLNYCH PATOGÉNOV 271 ČLOVEKA A ZVIERAT .................................................................. 279 283 6.3.1 Rod Borrelia ...................................................................................... 287 6.3.2 Rod Campylobacter ........................................................................... 294 6.3.3 Rod Helicobacter ............................................................................... 303 6.3.4 Rod Bartonella ................................................................................... 311 6.3.5 Rod Brucella ...................................................................................... 321 6.3.6 Rod Bordetella ................................................................................... 324 6.3.7 Rod Burkholderia ............................................................................... 329 6.3.8 Rod Neisseria ..................................................................................... 336 6.3.9 Rod Legionella ................................................................................... 339 6.2.10 Rod Pseudomonas .............................................................................. 364 6.3.11 Rod Francisella .................................................................................. 375 6.3.12 Rod Aeromonas .................................................................................. 381 6.3.13 Rod Escherichia ................................................................................. 398 6.3.14 Rod Salmonella .................................................................................. 402 6.3.15 Rod Shigella ....................................................................................... 6.3.16 Rod Yersinia ....................................................................................... 408 6.3.17 Rod Haemophilus ............................................................................... 408 6.3.18 Rod Vibrio .......................................................................................... 415 418 6.4 FAKTORY VIRULENCIE VÝZNAMNÝCH 427 GRAM-POZITÍVNYCH BAKTERIÁLNYCH PATOGÉNOV 433 6.4.1 ČLOVEKA A ZVIERAT ................................................................... 436 6.4.2 Rod Staphylococcus ........................................................................... 438 6.4.3 Rod Enterococcus .............................................................................. 455 6.4.4 Rod Streptococcus ............................................................................. 466 6.4.5 Rod Bacillus ....................................................................................... 6.4.6 Rod Listeria ....................................................................................... 495 6.4.7 Rod Erysipelothrix ............................................................................. 6.4.8 Rod Clostridium ................................................................................. 6.4.9 Rod Clostridioides ............................................................................. Rod Corynebacterium ........................................................................ VII. BIOINFORMATICKÉ DATABÁZY O FAKTOROCH PATOGENITY A VIRULENCIE A SPÔSOB ICH VYUŽITIA ............ Evelína Mochnáčová, Mangesh Bhide 9

7.1 BIOINFORMATIKA A PREHĽAD VÝVOJA 495 BIOINFORMATICKÝCH DATABÁZ ............................................ 497 7.1.1 Úložiská sekvencií ............................................................................. 500 7.2 PREHĽAD DATABÁZ A BIOINFORMATICKÝCH 500 NÁSTROJOV PRI ANALÝZACH FAKTOROV PATOGENITY 501 A VIRULENCIE ................................................................................ 501 7.2.1 Vyhľadávanie sekvencií kódujúcej faktory patogenity 505 a virulencie ......................................................................................... 507 7.2.2 Detekcia faktorov patogenity a virulencie s využitím 508 512 Basic Local Alignment Search Tool – BLAST .................................. 512 7.2.2.1 Homológny BLAST ........................................................................... 513 7.2.2.2 Ortológny BLAST ............................................................................. 514 7.2.3 Anotácia génovej ontológie pre určenie faktorov patogenity 516 518 a virulencie ......................................................................................... 7.2.4 Analýza biologických dráh (Pathway analysis) ................................. 527 7.2.5 Analýza mikrobiálneho genómu a odhalenie génov rezistencie ........ 7.2.5.1 Databázy génov rezistencie voči antibiotikám ................................... 528 7.2.5.2 Databáza génov rezistencie voči biocídom a kovom ......................... 7.2.5.3 Mapovanie toxín-antitoxín systému ................................................... 530 7.2.5.4 Mapovanie bakteriálnych toxínov ...................................................... 530 7.2.6 Predikcia subcelulárnej lokalizácie proteínov .................................... 531 533 VIII. SÚČASNÉ POKROKY PRI DIAGNOSTIKE FAKTOROV 534 538 PATOGENITY A VIRULENCIE .............................................................. 539 Ľudmila Tkáčiková, Tomáš Csank, Ján Király 539 540 8.1 IN VITRO DIAGNOSTIKA FAKTOROV PATOGENITY 541 A VIRULENCIE BAKTÉRIÍ ............................................................ 543 543 8.1.1 Identifikácia patogénnych baktérií na základe fenotypových 548 vlastností ............................................................................................ 550 552 8.1.1.1 Kultivačné vyšetrenie ........................................................................ 552 8.1.1.1.1 Chromogénne médiá ....................................................................... 554 8.1.1.2 Biochemické vyšetrenie ..................................................................... 558 8.1.1.3 Biotypizácia ....................................................................................... 8.1.1.4 Sérologické vyšetrenie ....................................................................... 8.1.1.4.1 Latexová aglutinácia ....................................................................... 8.1.1.4.2 Imunoenzymatická detekcia baktérií (ELISA) ............................... 8.1.2. Genetická identifikácia patogénnych baktérií .................................... 8.1.2.1 Hybridizačné metódy ......................................................................... 8.1.2.2 Amplifikačné metódy ......................................................................... 8.1.2.2.1 Kvantitatívna polymerázová reťazová reakcia ............................... 8.1.2.2.2 Slučkami sprostredkovaná izotermálna amplifikácia (LAMP) ...... 8.1.2.3 DNA mikročipy (DNA microarray) .................................................. 8.1.2.4 Využitie sekvenovacích technológií v klinickej mikrobiológii ......... 8.1.2.4.1 Sekvenovanie podľa Sangera .......................................................... 8.1.2.4.2 Sekvenovanie novej generácie ........................................................ 8.1.2.4.3 Sekvenovanie tretej generácie ......................................................... 10

8.2 IN VIVO DIAGNOSTIKA FAKTOROV PATOGENITY 562 A VIRULENCIE BAKTÉRIÍ ............................................................ 563 564 8.2.1 Identifikácia hostiteľských faktorov potrebných na infekciu ............ 564 8.2.1.1 Transgénne zvieracie modely ............................................................ 565 8.2.1.1.1 Imunodeficientné transgénne zvieratá ............................................ 565 8.2.1.1.2 Humanizované transgénne zvieratá ................................................ 566 8.2.2 In vivo zobrazovacie techniky zvierat počas infekcie ........................ 8.2.3 Komparatívna genomika hostiteľskej odpovede ................................ 566 8.2.3.1 Jednonukleotidový polymorfizmus 567 (SNP – Single Nucleotide Polymorphism) ......................................... 567 8.2.3.2 Celogenómové asociačné štúdie 568 569 (GWAS – Genome-Wide Association Studies) ................................. 8.2.4 Celogenómová analýza bakteriálnych genómov ................................ 576 8.2.4.1 Stíšenie génov prostredníctvom interferencie RNA (RNAi) ............. 8.2.4.2 Úprava génov ..................................................................................... 578 IX. ZÁVER ......................................................................................................... Emil Pilipčinec, Mangesh Bhide ODBORNÉ PROFILY AUTOROV ....................................................................... 11

PREDSLOV Bakteriálne patogény sprevádzajú človeka a zvieratá na našej planéte od prvopočiatku svojej existencie až po súčasnosť. Pritom pri vzájomnej interakcii patogén-hostiteľ zohrávali vždy dôležitú úlohu bakteriálne faktory patogenity a virulencie. Uvedené faktory môžu ovplyvniť nielen schopnosť bakteriálneho patogéna infikovať svojho hostiteľa, ale aj jeho schopnosť množiť a šíriť sa v jeho vnútornom prostredí a prenikať do jeho cieľových orgánov alebo dokonca uniknúť jeho obranným mechanizmom. I napriek tomu, že mnohé faktory patogenity a virulencie sú spoločné pre viaceré bakteriálne spoločenstvá (najčastejšie rody a čeľade), resp. druhy, každý bakteriálny patogén má svoju originálnu alebo unikátnu výbavu faktorov patogenity a virulencie, ktoré sú nevyhnutné pre jeho prežitie, patogenitu a virulenciu. Zámerom tejto monografie je poskytnúť najnovšie informácie o faktoroch patogenity a virulencie medicínsky významných Gram-negatívnych a Gram-pozitívnych bakteriálnych patogénov a v neposlednom rade prezentovať aj moderné bioinformatické a molekulovobiologické nástroje pri ich štúdiu. 12

I. PATOGENITA A VIRULENCIA BAKTÉRIÍ A ICH ZÁKLADNÉ ZLOŽKY Emil Pilipčinec, Mangesh Bhide Predmetom lekárskej mikrobiológie sú patogénne mikroorganizmy, pričom vzájomné vzťahy medzi nimi a makroorganizmom sú parazitické. Parazitizmus je jednou z troch foriem symbiotických vzťahov medzi organizmami. Medzi ďalšie dva patria komenzalizmus a mutualizmus. Parazitizmus je definovaný ako taká forma spolužitia, pri ktorej jeden z organizmov (symbiontov), nazývaný parazitický organizmus, druhému, nazývanému hostiteľ, škodí, či už priamo alebo nepriamo, napr. tým, že mu odoberá živiny1. Dôsledkom parazitizmu je patogenita, t. j. schopnosť patogénneho mikroorganizmu poškodzovať hostiteľa a vyvolať u neho ochorenie. I z uvedeného dôvodu vzájomný vzťah medzi patogénnym mikroorganizmom a makroorganizmom je obvykle označovaný termínom infekcia alebo nákaza. Stupeň alebo miera patogenity je vyjadrená virulenciou a je spájaná s faktormi patogenity, resp. faktormi virulencie. Virulencia je vlastnosť individuálna a vyjadruje sa ňou stupeň patogenity určitého kmeňa daného bakteriálneho druhu. Patogenita je vlastnosť druhová, ktorá sa týka daného bakteriálneho druhu vo vzťahu k určitému hostiteľovi1,2. Na základe prirodzenej patogenity, súčasťou ktorej je aj prenosnosť (kontagiozita), sa rozoznávajú bakteriálne druhy patogénne a nepatogénne (apatogénne). Patogénne bakteriálne druhy sa delia na patogény primárne (obligátne patogénne), ktoré vyvolávajú ochorenie aj u predtým zdravých jedincov a patogény oportunné (fakultatívne patogénne), ktoré vyvolávajú ochorenie len pri určitých príležitostiach, resp. za určitých podmienok, najmä však u jedincov so zníženou obranyschopnosťou. Patogenita, resp. virulencia, zahŕňa tri základné zložky: kontagiozitu, invazivitu a toxicitu. Kontagiozita alebo prenosnosť je schopnosť mikroorganizmu prenášať sa medzi jednotlivými hostiteľmi. Invazivita zahŕňa niekoľko schopností mikroorganizmu, a to schopnosť1: a) vstúpiť do hostiteľa, predpokladom čoho je adherencia (schopnosť priľnúť na jeho povrchy a množiť sa na nich) a penetrácia (schopnosť preniknúť do vnútorného prostredia); b) množiť sa vo vnútornom prostredí hostiteľa; c) šíriť sa v organizme hostiteľa a preniknúť do jeho cieľových orgánov. 13

Toxicita je schopnosť mikroorganizmu poškodzovať hostiteľa. Poškodenie hostiteľa nemusí byť spôsobené iba priamym pôsobením mikroorganizmu, ale k jeho poškodeniu môže dôjsť aj obrannými reakciami hostiteľa voči nemu. S každou z uvedených zložiek patogenity, resp. virulencie sa spájajú faktory virulencie jednotlivých bakteriálnych patogénov. Medzi najdôležitejšie faktory virulencie bakteriálnych patogénov patria tie, ktoré sú spojené s invazivitou a toxicitou. Patria medzi ne najmä2-5: a) adhezíny (fimbriálne i nefimbriálne), spájané s adherenciou k slizničným povrchom hostiteľa; b) invazíny, nevyhnutne potrebné na preniknutie intracelulárneho patogéna do organizmu; c) siderofóry, nízkomolekulové látky, ktoré sú dôležité z pohľadu replikácie baktérií v tkanivách hostiteľa; d) lipopolysacharidy, resp. lipooligosacharidy bunkovej steny Gram-negatívnych baktérií, ktoré zohrávajú dôležitú úlohu najmä pri ochrane bakteriálnej bunky pred účinkom komplementu; e) puzdro (kapsula), dôležité svojou antifagocytárnou aktivitou; f) sekrečné systémy, ktoré napomáhajú transportovať a vpravovať efektorové molekuly do hostiteľských buniek, buď pri ich priamom kontakte, prípadne tieto molekuly uvoľňujú v ich bezprostrednej blízkosti alebo k ich uvoľneniu dochádza v intracelulárnom prostredí hostiteľskej bunky, napr. na zabránenie vytvorenia fagolyzozómu; g) chemotaxia, ktorá im napomáha pohybovať sa v reakcii na chemický stimul; h) quorum sensing, ktorý poskytuje bakteriálnym bunkám možnosť monitorovať prítomnosť ostatných buniek v populácii a meniť expresiu génov, ako odpoveď na kolísanie populačnej hustoty; hrá dôležitú úlohu pri samotnom procese tvorby biofilmu; i) tvorba biofilmu, ktorý chráni mikroorganizmy pred pôsobením imunitného systému a tiež pred účinkom antimikrobiálnych a dezinfekčných látok; j) endotoxíny, ktoré sú súčasťou bunkovej steny a do prostredia sa uvoľňujú až po rozpade bakteriálnej bunky; organizmus na ne reaguje v závislosti od ich koncentrácie; k) exotoxíny, ktoré sa podľa mechanizmu svojho účinku rozdeľujú na toxíny typu I (superantigény), toxíny typu II (cytotoxíny) a toxíny typu III (intracelulárne toxíny). 14

LITERATÚRA 1. Votava, M., Lékařská mikrobiologie obecná. 2005: Neptun. 2. Kolářová, L., Obecná a klinická mikrobiologie. 2020: Galén. 3. Camilli, A. and B.L. Bassler, Bacterial small-molecule signaling pathways. Science, 2006. 311(5764): p. 1113-6. 4. Hurych, J., R. Štícha, and Ú.l.m. Univerzita Karlova. Lékařská fakulta, Lékařská mikrobiologie: repetitorium. 2020: Stanislav Juhaňák – Triton. 5. Murray, R.P., S.K. Rosenthal, and A.M. Pfaller, Medical microbiology. Elsevier, 2021. Ninth edition: p. 855 pp. 15

II. ÚLOHA A VÝZNAM FAKTOROV PATOGENITY A VIRULENCIE V PATOGENÉZE BAKTERIÁLNYCH INFEKCIÍ Jana Koščová, Vanda Hajdučková 2.1 ADHEZÍNY ....................................................................................... 16 2.1.1 Fimbriálne adhezíny ........................................................................... 18 2.1.2 Afimbriálne adhezíny ........................................................................ 22 2.2 INVAZÍNY ........................................................................................ 25 2.2.1 Invázia fagocytujúcich buniek ........................................................... 27 2.2.2 Invázia primárne nefagocytujúcich buniek ........................................ 27 2.3 SIDEROFÓRY .................................................................................. 30 2.4 PUZDRO ........................................................................................... 33 2.4.1 Syntéza puzdra baktérií ..................................................................... 35 2.5 EXOTOXŃY ..................................................................................... 35 2.5.1 Toxíny typu I (Superantigény) ........................................................... 37 2.5.2 Toxíny typu II (Cytotoxíny) .............................................................. 37 2.5.2.1 Fosfolipázy ........................................................................................ 38 2.5.2.2 Perforíny ............................................................................................ 38 2.5.2.3 Toxíny s vlastnosťami detergentov ................................................... 39 2.5.3 Toxíny typu III (Intracelulárne toxíny) ............................................. 39 2.5.3.1 Toxíny inhibujúce proteosyntézu ...................................................... 39 2.5.3.2 Farmakologicky pôsobiace toxíny .................................................... 40 2.5.3.4 Neurotoxíny klostrídií ........................................................................ 41 2.6 ENDOTOXÍNY ............................................................................................. 41 Ako už bolo uvedené v úvode, pri patogenéze bakteriálnych infekcií sa uplatňujú najmä tie faktory virulencie, ktoré sú spojené s ich invazivitou a toxicitou. Sú to predovšetkým adhezíny (fimbriálne i nefimbriálne), invazíny, siderofóry, puzdro, exotoxíny, endotoxíny a ďalšie. Pri bakteriálnych infekciách je dôležitá skutočnosť, že faktory virulencie, ktoré sú kódované na mobilných genetických elementoch a ostrovoch patogenity, zvyšujú riziko vzniku bakteriálnych kmeňov s novými virulentnými vlastnosťami1. 2.1 ADHEZÍNY Bakteriálna adherencia bola prvykrát popísaná v roku 1908, kedy sa zistilo, že Escherichia coli dokáže zhlukovať živočíšne bunky určitými výbežkami na svojom povrchu, ktoré sa neskôr 16

nazvali fimbriami2. Z patogénnych baktérií, ktoré v procese patogenézy fimbrie využívajú ako hlavné faktory virulencie, môžno uviesť Escherichia coli, Salmonella spp., Neisseria gonorrhoeae, Bordetella pertussis a mnohé ďalšie. Bakteriálna adhrencia môže byť nešpecifická a špecifická. Pri nešpecifickej adherencii sú využívané elektrostatické sily a hydrofóbne interakcie, ale uplatniť sa môžu aj komponenty, ktoré sú súčasťou primárej štruktúry bunkových stien Gram-negatívnych a Gram-pozitívnych baktérií, napr. lipopolysacharid alebo kyselina teichoová, prípadne manány u mykobaktérií alebo iné. Obr. 2.1 Adherencia baktérií k povrchom pomocou pilusov a adherenčných proteínov (https://basicmedicalkey.com/22-pathogenesis-of-bacterial-infections/).Bakteriálna bunka má na svojom povrchu adherenčné pilusy a adhezívne proteín(y). Pilusy a adherenčné proteín(y) sa viažu na rôzne receptory hostiteľskej bunky. Pri špecifickej adherencii sú bakteriálnymi bunkami využívané štruktúry, tzv. ahezíny, ktoré slúžia k špecifickej väzbe na určitý receptor hostiteľskej bunky. Bakteriálne patogény sú teda vybavené špecifickými, povrchovo exponovanými proteínmi, ktoré sa silne viažu na ligandy na hostiteľských bunkách (Obr. 2.1). Interakcie adhezín-ligand sú aktivované ťahovou silou a môžu byť desaťkrát silnejšie ako klasické nekovalentné biologické väzby. Táto skutočnosť sa v súčasnosti využíva aj pri príprave efektívnych liečiv, ktoré by napr. obsadili špecifické miesto adherencie bakteriálneho patogéna na cieľovej hostiteľskej bunke3. Okrem fimbriálnyh a afimbriálnyh adhezínov, sú bakteriálne bunky vybavené i ďalšími komponentmi, najčastejšie proteínového charakteru, ktoré majú funkciu adhezínov, nakoľko sa viažu na povrchové receptory hostiteľských buniek (Obr. 2.1)4. 17

Adhezíny sa líšia aj v závislosti od typu baktérií. Gram-pozitívne baktérie majú adhezíny najčastejšie proteínovej alebo polysacharidovej povahy. Niektoré z nich majú charakter kapsuly. U Gram-negatívnych baktérií sa adhezíny vyskytujú najmä vo forme fimbrií, (napr. FimH fimbrie u uropatogénnych kmeňov Escherichia coli). FimH proteín je dvojdoménový proteín, v ktorom sa N-terminálna (adhezívna) doména viaže na hostiteľský receptor, zatiaľ čo C-terminálna (integračná) doména slúži na integráciu do štruktúry fimbrie. V niektorých prípadoch je adhezín súčasťou viacúčelového proteínu, ktorý sa vyskytuje spolu s invazínom. Medzi takéto adhezívno-invazínové proteíny patrí napr. proteín TibA u enterotoxigénnych Escherichia coli a PagN proteín u Salmonella Typhimurium. Adhezíny sa môžu vyskytovať aj v podobe enzýmov ako enoláza alebo pyruvátdehydrogenáza. Baktérie rodov Lactobacillus, Weissella alebo Streptococcus obsahujú niekoľko proteínov ako je GroEL proteín, peptidáza C1, enoláza, formyl-CoA transferáza, fosfoglyceromutáza, triózafosfát-izomeráza, fosfofruktokináza a fosfoglycerátkináza, ktoré majú tiež funkciu adhezínov5. Adhezíny sa líšia tiež svojou architektúrou a receptorovými špecifickosťami, napríklad fimbrie typu FimH sa viažu na D-manózu glykoproteínov. U mnohých baktérií funkciu adhezínu môže plniť i niekoľko rôznych štruktúr. Napr. u Bordetella pertussis funkciu adhezínu nemajú iba fimbrie, ale taktiež filamentózny hemaglutinín (FHA) a pertaktín (PRN). Všetky tieto štruktúry umožňujú B. pertussis priľnúť k rôznym typom eukaryotických buniek, vrátane epiteliálnych buniek respiračného traktu6. Zaujímavé je, že v prípade niektorých klinických izolátov B. pertussis izolovaných v ostatných rokoch sa zistilo, že tieto kmene neprodukujú pertaktín. To môže byť i dôsledkom selekcie spôsobenej používaním viaczložkovej pertusovej vakcíny, ktorá PRN obsahuje a vyvoláva produkciu protilátok proti PRN v hostiteľskom organizme7. 2.1.1 Fimbriálne adhezíny Fimbriálne adhezíny sú vláknité duté štruktúry, zložené z rôznych proteínových podjednotiek, rozmiestnené po celom povrchu baktérie. Ich základnou stavebnou zložkou býva tzv. základná fimbriálna podjednotka (pilín), zatiaľ čo väzbu na špecifický receptor zaisťuje vlastný adhezín na koncovom výbežku (špičke) fimbrií. Špecificita väzby medzi bakteriálnym adhezínom a receptorom na hostiteľskej bunke je veľmi vysoká a pre každý druh baktérie špecifická. Napríklad v ústnej dutine sa Streptococcus salivarius viaže na slizničný epitel, kým Streptococcus mutans zase na povrch zubov. Fimbrie sú veľmi početné a na povrchu baktérie sú väčšinou pravidelne rozložené. Bývajú dlhé 100 a viac nm s priemerom ~ 5 nm. Vyskytujú sa predovšetkým u Gram-negatívnych baktérií, ukotvené najčastejšie vo vonkajšej membráne. 18

Bez ukotvenia adhezínov by baktérie neboli schopné tolerovať tzv. šmykové sily. Podobné štruktúry boli však identifikované aj u niektorých Gram-pozitívnych baktérií. Pre fimbrie sa často používa aj synonymum pilus(y), aj keď väčšina autorov tento pojem používa iba na označenie pre štruktúry slúžiace na bakteriálnu konjugáciu (tzv. sex pilus/y/). Tieto sex pilusy boli popísané len u Gram-negatívnych baktérií a v porovnaní s fimbriami, ktoré neslúžia na konjugáciu, sú dlhšie a s väčším priemerom (Obr. 2.2). Obr. 2.2 Fimbrie a sex pilus bakteriálnej bunky (https://microbiologynotes.com/differences-between- fimbriae-and-pili/). Genetická informácia pre syntézu sex pilusov je kódovaná F plazmidom (Fertility factor) Bunky vybavené F plazmidom sú tiež označované ako F+ bunky8. Jedným zo spôsobov horizontálneho prenosu genetickej informácie je konjugácia, čo je proces, pri ktorom si baktérie rovnakého druhu, prípadne i baktérie rôznych druhov, môžu vymieňať genetický materiál kódovaný na mobilných génových elementoch, ku ktorým plazmidy patria. Význam bakteriálnej konjugácie spočíva v získaní nových vlastností, ktoré recipientné bakteriálne bunky zvýhodňujú, napr. uľahčením ich adaptácie v prostredí, prípadne získaním nových virulentných vlastností, vrátane rezistencie na ťažké kovy alebo antimikrobiálne látky. Z uvedeného dôvodu sa niekedy uvádza, že konjugácia je hlavnou hnacou silou evolúcie bakteriálnych genómov9. 19

Zo skupiny Gram-negatívnych baktérií sú fimbrie najlepšie preštudované u Escherichia coli. E. coli exprimuje veľké množstvo rôznych fimbriálnych aj afimbriálnych adhezínov, ktoré bývajú často typické pre jednotlivé patotypy. U väčšiny kmeňov (vrátane komenzálnych) sa nachádzajú tzv. fimbrie typu 1 – F1, ktorých adhezín FimH viaže manózové zvyšky. Pomáhajú E. coli kolonizovať napríklad močový trakt. Fimbrie typu 1 boli pôvodne charakterizované a definované na základe ich schopnosti spôsobiť aglutináciu rôznych eukaryotických buniek citlivých na manózu. Fimbrie totiž možno rozdeliť podľa toho, či je ich adherencia inhibovaná D-manózou. Na základe uvedeného kritéria sa delia na manózasenzitívne (manóza je pre nich receptorom) alebo manózarezistentné. Sú najrozšírenejšími adhezívnymi organelami medzi zástupcami čeľade Enterobacteriaceae, čo naznačuje dôležitú úlohu v ekológii týchto baktérií. Až 80 % všetkých kmeňov E. coli má schopnosť exprimovať fimbrie typu 110. Vlastnosti FimH v procese bakteriálnej adherencie a tvorby biofilmu naznačujú zase úlohu fimbrií typu 1 v bakteriálnej patogenéze. Niekoľko štúdií v 90-tych rokoch potvrdilo ich význam ako faktorov virulencie pri infekciách močových ciest, predovšetkým pri cystitídach. Tieto infekcie, vyvolané tzv. uropatogénnymi kmeňmi E. coli (UPEC), postihujú ľudí a iné cicavce a predstavujú niekoľko miliónov prípadov ročne. Fimbrie typu 1 sú exprimované u viac ako 90 % všetkých uropatogénnych kmeňov E. coli a viažu sa na uroepiteliálny povrch11. Ďalšie fimbriálne varianty E. coli sa označujú väčšinou číslom a niekedy aj písmenom podľa príslušného subtypu (napr. F18ab), ale môžné sa stretnúť aj s ich starším značením (napr. K88 = F4; K99 = F5) alebo odlišným značením u ľudských kmeňov (CFA = kolonizačné faktory; CFA I a CFA II), čo môže byť pomerne zmätočné. Enterotoxigénne kmene E. coli (ETEC) sa od seba líšia expresiou rôznych variantov fimbrií, a tým tiež schopnosťou kolonizovať črevo rôznych druhov zvierat a ich rôznych vekových kategórií. Napríklad receptory pre F5 a F6 sa nachádzajú u prasiat (a teliat v prípade F5) len v prvom týždni života, potom sa mláďatá stávajú rezistentnými k infekcii týmito kmeňmi; naopak F4 pozitívne kmene spôsobujú závažné hnačky prasiat asi do dvoch mesiacov ich veku a F18 pozitívne kmene sú virulentné pre prasatá po odstave a v spojení s tvorbou shigatoxínu vyvolávajú tzv. edémovú chorobu. P fimbrie (F7-16) sa naopak uplatňujú u kmeňov, ktoré sú pôvodcami extraintestinálnych infekcií človeka a zvierat. Sú kódované tzv. ostrovom patogenity spolu s ďalšími faktormi virulencie, ktoré sa uplatňujú pri týchto infekciách. P fimbrie sa viažu na receptor, ktorý je súčasťou skupinového antigénu P, prítomného na povrchu erytrocytov a epiteliálnych buniek močového aparátu. Iným typom fimbriálnych štruktúr sú tzv. curli fimbrie, ktoré majú charakter tenkých, stočených vlákien (odtiaľ je aj ich označenie curli = kučeravý), ktoré sprostredkúvajú väzbu k 20

molekulám extracelulárneho matrixu, laminínu a fibronektínu. Svoju úlohu zohrávajú tiež pri tvorbe biofilmu12. Môžu byť prítomné aj u ďalších enterobaktérií, najmä u zástupcov z rodu Salmonella, Shigella, Citrobacter alebo Enterobacter, prípadne aj u iných Gram-negatívnych baktérií. Curli fimbrie sa pre svoju schopnosť agregácie buniek označujú aj ako agregačné fimbrie (alebo adhezívne amyloidy). Curli fimbrie majú širokú schopnosť viazať proteíny, čo prispieva k zvýšenej virulencii baktérií, ktoré ich majú na svojom povrchu. S curli fimbriami interaguje veľký počet ľudských proteínov, okrem už uvedeného laminínu, fibronektínu a plazminogénu, taktiež molekuly MHC triedy I13. Všeobecne sa predpokladá, že za sprostredkovanie týchto interakcií je zodpovedná proteínová podjednotka CsgA. Curli fimbrie prispievajú aj k vyššej virulencii aviárnych patogénnych kmeňov E. coli tým, že podporujú ich adherenciu k bunkám intestinálneho traktu14. U niektorých Gram-negatívnych baktérií bývajú často prítomné aj fimbrie typu IV. Fimbrie typu IV okrem funkcie adhezínu a čiastočne aj invazínu, plnia aj funkciu sekrečného systému typu IV a zabezpečujú tzv. twitching motility (trhaný pohyb, nazývaný aj ako zášklbový pohyb nezávislý na bičíku). Okrem enterotoxigénnych a enteropatogénnych E. coli boli popísané aj u Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Moraxella bovis, Pseudomonas aeruginosa, Francisella tularensis, Eikenella corrodens, Vibrio cholerae a cyanobaktérií Synechocystis spp. V roku 1980 bol charakterizovaný lokus na chromozóme E. coli K-12, ktorý zodpovedá za charakter mnohých povrchových vlastností baktérií, taktiež za morfológiu ich kolónií a autoagregáciu bakteriálnych buniek. Agregáciu bolo možné makroskopicky vizualizovať ako flokuláciu a usadzovanie buniek zo statických kvapalných suspenzií. Tento antigén vonkajšej membrány E. coli bol na základe agregačných vlastností označený ako antigén 43 (Ag43). Nachádza sa u väčšiny kmeňov E. coli a je zaujímavé, že je exprimovaný mnohými patogénnymi kmeňmi. Štúdium EPEC a UPEC kmeňov preukázal, že 77 % , resp. 60 % z nich bolo schopných expresie Ag43. Ag43 je členom rodiny autotransportérových proteínov. Tie sa vyznačujú tým, že genetická informácia potrebná na ich prechod bakteriálnym membránovým systémom a cieľové miesto ich pôsobenia je kódované v samotnom proteíne. Autotransportérové proteíny majú niektoré všeobecné vlastnosti: N-koncovú signálnu sekvenciu, tzv. doménu pasažierov (α), ktorá je vylučovaná na povrch bunky, a doménu transportéra (β), tvoriacu β-barelový pór, ktorý pomáha doméne pasažiera dostať sa na povrch bunky. Mnohé autotransportéry sú faktormi virulencie Gram-negatívnych baktérií. Najbližším homológom k Ag43α so známou terciárnou štruktúrou je P.69 pertaktín, autotransportérový toxín z Bordetella pertussis, ktorý vykazuje takmer 20 %- nú identitu aminokyselinovej sekvencie a 35 %-nú podobnosť s Ag43α10. 21

2.1.2 Afimbriálne adhezíny Afimbriálne adhezíny sú často prítomné u Gram-negatívnych aj Gram-pozitívnych baktérií. Na rozdiel od fimbrií sa skladajú obyčajne z jednej proteínovej podjednotky a netvoria zreteľné filamentózne štruktúry, preto tiež nimi sprostredkovaný kontakt je intímnejší. Táto skutočnosť je vyjadrená aj v názve jedného z afimbriálnych adhezínov enteropatogénnych kmeňov E. coli (EPEC) označeného ako intimín. Mimoriadnym ho činí najmä jeho spojenie so sekrečným systémom typu III (T3SS), štruktúrou pripomínajúcou injekčnú striekačku, ktorá slúži na transport efektorových molekúl do buniek hostiteľa. V tomto prípade sa okrem efektorových molekúl, indukujúcich prestavbu cytoskeletu, transportuje aj receptor označený ako Tir (Transported intimin receptor), ktorý je následne exprimovaný na povrchu bunky. Enteropatogénne kmene E. coli tak „vstrekujú“ do hostiteľskej bunky receptor pre svoj vlastný adhezín. Patogénni zástupcovia rodu Bordetella, najmä však B. pertussis, tvoria okrem fimbrií aj celý rad afimbriálnych adhezínov umožňujúcich úspešne kolonizovať riasinkový epitel respiračného traktu. Patrí k nim filamentózny hemaglutinín (FHA), tracheálny kolonizačný faktor (Tcf) a pertaktín, a tiež pertusický toxín (Ptx), ktorý funguje ako adhezín aj ako ADP- ribozylujúci toxín. Mnohé patogény využívajú afimbriálne adhezíny nielen na viazanie sa na hostiteľské bunky, ale aj na stimuláciu rôznych signálnych procesov15. Veľká časť bakteriálnych patogénov nesie navyše na svojom povrchu proteíny, ktoré sú známe ako MSCRAMM proteíny (Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules), ktoré sprostredkúvajú adherenciu k hostiteľským povrchom väzbou na rôzne proteíny extracelulárneho matrixu vrátane fibronektínu, laminínu, kolagénu a proteoglykánu. Jedná sa o adhezívne proteíny, ktoré sprostredkúvajú prvotnú väzbu a uchytenie baktérií na bunky hostiteľa. Napríklad proteín A Staphylococcus aureus viaže Fc fragment protilátok, čím inhibuje opsonizáciu, proteín M Streptococcus pyogenes má zvláštne postavenie v skupine adhezínov, keďže jeho funkcia ani nespočíva tak v adherencii na povrchy, ale skôr chráni baktérie pred pohltením fagocytujúcimi bunkami. Funkciu adhezínu u tohto patogéna preberá proteín F, viažuci sa na fibronektín, bielkovinu prítomnú v plazme a na povrchu rôznych buniek. Na fibronektín sa viažu pravdepodobne aj proteínové adhezíny Staphylococcus aureus a Treponema pallidum16. Bakteriálne adhezíny vo všeobecnosti zohrávajú dôležitú úlohu v interakciách patogéna s hostiteľskou bunkou. Hoci interakcie receptor-ligand, ktoré sa vyskytujú v procese adherencie, možno rozdeliť do dvoch všeobecných skupín, interakcie proteín-proteín a proteín- sacharid, je dôležité si uvedomiť rozmanitosť cieľov, ktoré mikroorganizmy používajú pre 22

hostiteľské receptory17. Medzi molekuly slúžiace ako hostiteľské receptory bakteriálnych patogénov, patria membránové proteíny, povrchový imunoglobulín, glykolipidy, glykoproteíny a proteíny extracelulárneho matrixu (ako je fibronektín a kolagén)1. Je tiež dôležité poznamenať, že je bežné, že jeden patogén exprimuje (a využíva) viac ako jeden adhezín18. V Tab. 2.1 sú uvedené proteíny bakteriálnych buniek s funkciou adhezínov. Tab. 2.1 Proteíny bakteriálnych buniek s funkciou adhezínov (Jeffery 2018)5 Proteín Baktéria Extracelulárna funkcia 6-fosfofruktokináza Lactococcus lactis Kvasinková invertáza Streptococcus oralis Plazminogén Aaa autolyzín Staphylococcus aureus Fibronektín Aae autolyzín Staphylococcus epidermidis Aspartáza Haemophilus influenzae Fibrinogén, fibronektín, vitronektín Plazminogén Atla autolyzín Streptococcus mutans Fibronektín AtlC autolyzín Staphylococcus caprae Fibronektín Hydroláza žlčových solí Bifidobacterium lactis Plazminogén C5a peptidáza Streptococcus agalactiae Fibronektín DNA-riadená RNA polymerázová β podjednotka Streptococcus gordonii Muc7 DnaK Bifidobacterium spp. Plazminogén EF-Tu Lactococcus lactis Kvasinková invertáza Mycobacterium tuberculosis Plazminogén Neisseria meningitidis Lactobacillus johnsonii Plazminogén Mycoplasma pneumoniae Bunky, mucíny Fibronektín, epitelové bunky, plazminogén, heparín, fetuín, aktín, fibrinogén, vitronektín, laminín Pseudomonas aeruginosa Plazminogén Elongačný faktor G Streptococcus gordonii Muc7 Streptococcus gordonii Muc7 Endopeptidáza O Streptococcus pneumoniae Plazminogén, fibronektín Enoláza Aeromonas hydrophila Plazminogén Bacillus anthracis Plazminogén, laminín Bifidobacterium lactis Plazminogén Borrelia burgdorferi Plazminogén Lactobacillus crispatus Plazminogén, laminín Lactobacillus johnsonii Plazminogén, laminín 23

Lactobacillus plantarum Fibronektín Leishmania mexicana Plazminogén Mycoplasma fermentans Plazminogén Mycoplasma suis Erytrocyty Mycoplasma synoviae Plazminogén, fibronektín Neisseria meningitidis Plazminogén Staphylococcus aureus Plazminogén, laminín Streptococcus canis Plazminogén Streptococcus gordonii Muc7 Streptococcus mutans Plazminogén Streptococcus oralis Plazminogén Streptococcus pneumoniae Plazminogén Streptococcus pyogenes Plazminogén Streptococcus suis Fibronektín, plazminogén Fruktóza-1,6-bisfosfátaldoláza Neisseria meningitidis Bunky GAPDH Bacillus anthracis Plazminogén (glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza ) Lactobacillus acidophilus Mucín Glukóza-6-fosfátizomeráza Glutamínsyntetáza Lactobacillus plantarum Mucín, Caco-2 bunky Hsp60 Lactococcus lactis Kvasinková invertáza Mycoplasma genitalium Mucín Staphylococcus aureus Transferín Streptococcus agalactiae Plazminogén Streptococcus oralis Plazminogén Streptococcus pneumoniae Plazminogén Streptococcus pyogenes uPAR/CD87 receptor na ľudských bunkách, plazminogén Streptococcus suis Plazminogén Lactobacillus crispatus Laminín, kolagén Lactobacillus crispatus Fibronektín, laminín, kolagén I, plazminogén Mycobacterium tuberculosis Bifidobacterium lactis Plazminogén, fibronektín Chlamydia pneumoniae Plazminogén Adhezín Lactococcus lactis Kvasinková invertáza Legionella pneumophila Adhezín 24

Clostridioides difficile Adhezín Haemophilus ducreyi Glykosfingolipidy Helicobacter pylori Adhezín Lactobacillus johnsonii Adhezín Listeria monocytogenes Adhezín Salmonella Typhimurium Sliznica Hsp65/Cpn60.2/GroEL2 Mycobacterium tuberculosis CD43 na povrchu makrofágov Leucylaminopeptidáza Malátsyntáza Mycoplasma hyopneumoniae Heparín Glutamylaminopeptidáza Leucylaminopeptidáza Mycobacterium tuberculosis Fibronektín, laminín, epitelové Ornitínkarbamoyltransferáza bunky Peroxiredoxín Mycoplasma hyopneumoniae Plazminogén, heparín Fosfoglycerát kináza Mycoplasma hyopneumoniae Plazminogén, heparín, DNA Fosfoglycerátmutáza Pyruvátdehydrogenáza Staphylococcus epidermidis Fibronektín Pyruvátkináza Neisseria meningitidis Plazminogén Superoxid dismutáza Streptococcus agalactiae Hém Triózafosfátizomeráza Streptococcus oralis Plazminogén Streptococcus agalactiae Plazminogén, aktín Streptococcus pneumoniae Plazminogén Bifidobacterium lactis Plazminogén Streptococcus oralis Plazminogén Mycoplasma pneumoniae Fibrinogén Lactococcus lactis Kvasinková invertáza Mycobacterium avium Adhezín Streptococcus oralis Plazminogén 2.2 INVAZÍNY Baktérie, ktoré nezostávajú na vonkajších povrchoch hostiteľa, prekonávajú epiteliálne bariéry a prenikajú do vnútorného prostredia hostiteľských buniek, sa nazývajú invazívne. Takéto baktérie kolonizujú tkanivá vytvorením určitých kompartmentov vo vnútri hostiteľských buniek, kde rastú buď v cytosóle alebo vo vnútri špecializovanej vakuoly. Tieto dva odlišné intracelulárne životné štýly prinášajú výhody, ale tiež predstavujú pre patogénne mikroorganizmy rôzne obmedzenia, pokiaľ ide o získavanie živín, priestorové požiadavky, vystavenie imunitným reakciám a schopnosť šíriť sa19. Vo vnútornom prostredí sa môžu teda vyskytovať v rôznych podobách, buď extracelulárne alebo intracelulárne. Okrem obligátne intracelulárnych baktérií, akými sú zástupcovia čeľadí Rickettsiaceae a Chlamydiaceae, ktoré sa nedokážu množiť mimo natívnych hostiteľských buniek, využívajú niektoré patogénne baktérie veľmi výhodný, fakultatívne intracelulárny spôsob života. Typickými príkladmi 25

fakultatívne intracelulárnych baktérií sú Salmonella spp., Shigella spp., niektoré patotypy E. coli, Yersinia spp., Listeria spp. a Mycobacterium spp. Navyše sa zistilo, že aj mnohé ďalšie baktérie považované za extracelulárne, využívajú v určitej fáze infekcie aj intracelulárny spôsob prežívania, prípadne sa vo vnútri hostiteľských buniek aj množia. Obr. 2.3 Schematické znázornenie mechanizmov bakteriálnej endocytózy a intravakuolárny alebo intracytosolický spôsob prežívania (Cossart a Helenius 2014; upravené)20. Listeria monocytogenes vstupuje do epitelových buniek cez dva internalíny; potom prechodne sídli vo vakuole, ktorá je následne lyzovaná, čo umoží jej replikáciu v cytosole a motilitu založenú na aktíne. Obligátne intracelulárna Chlamydia trachomatis prechádza celým životným cyklom v intracelulárnej vakuole (vezikule), pričom nedochádza k spojeniu s lyzozómami. Shigella spp. najskôr invaduje pomocou filopódií prítomných na povrchu epitelových buniek; následne pomocou sekrečného systému typu III injikuje do hostiteľskej bunky efektorové molekuly, ktoré spúšťajú jej samotný vstup, replikáciu a schopnosť aktívne sa pohybovať v hostiteľskej bunke pomocou aktínových vlákien. Patogénny potenciál Brucella spp. je založený na schopnosti invadovať cieľové hostiteľské bunky, replikovať sa v nich, intracelulárne prežívať a v neposlednom rade vyhnúť sa imunitnému systému hostiteľa. Coxiella burnetii je jediná baktéria, ktorá je schopná prežiť a replikovať sa vo vakuole odvodenej od lyzozómu. Bartonella henselae môže invadovať endotelové bunky jednotlivo alebo v skupinách, čo vedie k vytvoreniu tzv. invazómu. Legionella pneumophila a Mycobacterium tuberculosis prežívajú vo vakuolách makrofágov. Na Obr. 2.3 sú znázornené rôzne spôsoby prestupu invazívnych baktérií dovnútra hostiteľských buniek a následne rôzne spôsoby prežívania v nich20. 26

2.2.1 Invázia fagocytujúcich buniek Je niekoľko spôsobov, ktorými sa baktérie dostávajú do vnútra buniek21. Pre baktériu je najjednoduchšie nechať sa pohltiť prirodzene fagocytujúcou bunkou, následne v nej prežiť a replikovať sa. Fagocyty však disponujú veľkým množstvom mechanizmov, ktorými dokážu pohltené baktérie deštruovať. Relatívne veľké množstvo bakteriálnych patogénov je adaptovaných na prežívanie a replikáciu v makrofágoch, na rozdiel od neutrofilných granulocytov. A to i napriek množstvu ich antimikrobiálnych mechanizmov, ku ktorým patria degradačné enzýmy, okyslenie fagolyzozómov, oxidatívne vzplanutie, tvorba NO a ďalšie. Možným vysvetlením tohto tzv. makrofágového paradoxu je adaptácia niektorých baktérií na améby, ktoré sa bežne vyskytujú v prostredí22. Príkladom toho je Legionella pneumophila, patogén človeka, ktorý prirodzene prežíva v amébach, ale u človeka spôsobuje ťažkú formu zápalu pľúc, pretože sa dokáže množiť v pľúcnych makrofágoch. 2.2.2 Invázia primárne nefagocytujúcich buniek Ďalšou možnosťou, ako sa baktérie dostávajú dovnútra buniek, je invázia primárne nefagocytujúcich buniek. Existujú dva spôsoby ako sa dá indukovať vlastné pohltenie cieľovou bunkou. Prvým je interakcia s určitým bunkovým receptorom a vyslanie signálu, ktorý spustí kaskádu reakcií vedúcich k endocytóze baktérie tzv. zipsovým mechanizmom. Po adherencii baktérie na povrch bunky dochádza k zmene bunkového cytoskeletu, čo je spôsobené polymerizáciou a depolymerizáciou bunkového aktínu, čím dochádza k vytvoreniu pseudopódií, podobných ako pri fagocytóze. Povrchové bakteriálne proteíny, ktoré tieto zmeny spôsobia, sa všeobecne nazývajú invazíny. Každý invazín špecificky reaguje s niektorým z rodiny bunkových receptorov nazývaných integríny. U Shigella spp. sú to napríklad invazíny nazývané Ipa (Invasion plasmid antigen). U listérií za inváziu dovnútra buniek pravdepodobne zodpovedá proteín internalín a z fagocytárnej vakuoly sa listériám darí uniknúť vďaka listeriolyzínu O, ktorý je cytolytický a spôsobí ruptúru fagozómu23. Zipsový mechanizmus invázie zahŕňa vysokoafinitnú väzbu bakteriálnych povrchových adhezínov na ich príbuzné receptory na cicavčích bunkách, čo je potrebné na spustenie cytoskeletom sprostredkovaného zipsovania plazmatickej membrány hostiteľskej bunky okolo baktérie. Následne sa baktéria internalizuje do vakuoly. Niektoré baktérie si vyvinuli stratégie na prežitie v tomto kompartmente alebo na únik z neho24. Receptormi bývajú molekuly 27

zaisťujúce vzájomnú adhéziu hostiteľských buniek – kadheríny a integríny a signál vedie k štruktúrnym prestavbám, ktoré by za normálnych okolností viedli k tesnejšiemu vzájomnému pripojeniu buniek. Zipsový mechanizmus je typický pre Listeria spp., ktorých povrchové proteíny internalíny interagujú s E-kadherínmi na bazolaterálnych stranách epiteliálnych buniek25. Podobne proteín Yersinia spp., nazývaný priamo invazín, reaguje s bunkovými integrínmi. Tab. 2.2 Príklady intracelulárnych baktérií a spôsob ich prežívania (Cossart a Helenius 2014)20 Baktéria Bakteriálne faktory Intracelulárny spôsob Typy hostiteľských prežívania buniek Zipsový mechanizmus Listeria monocytogenes In1A, In1B Intracytosolický Epitelové bunky Yersinia Invazín pseudotuberculosis Intravakuolárny, pH=6 Epitelové bunky Spúšťací mechanizmus Shigella flexneri Sekrečný systém typu Sekrečný systém typu Epitelové bunky Salmonella Typhimurium Epitelové bunky III III Invazóm Sekrečný systém typu Intravakuolárny, pH 5 III Bartonella spp. Sekrečný systém typu Intravakuolárny, pH > 6 Endotelové bunky III Intravakuolárne baktérie Salmonella spp. Sekrečný systém typu Intravakuolárny, pH=5 Epitelové bunky III Epitelové bunky Chlamydia spp. Intravakuolárny, Makrofágy Sekrečný systém typu pH=7,25 Legionella spp. III Intravakuolárny, pH=6 Brucella spp. Sekrečný systém typu IV Intravakuolárny, pH=4 Epitelové bunky Coxiella spp. Mycobacterium Sekrečný systém typu Intravakuolárny, pH=5 Epitelové bunky tuberculosis IV Intravakuolárny, pH=6,4 Makrofágy Sekrečný systém typu IV Sekrečný systém typu VII Druhou možnosťou, ako indukovať pohltenie baktérie nefagocytujúcou bunkou, je využitie účinku efektorových molekúl, ktoré baktéria priamo injektuje do cytoplazmy cieľovej bunky sekrečným systémom typu III. Efektorové molekuly v cytoplazme bunky indukujú štruktúrne zmeny, ktoré vedú k tvorbe výrazných výbežkov, tzv. „panôžok“ na membráne (cytoskeletálna reorganizácia) a tie obklopia a pohltia baktériu ako pri fagocytóze. Tento spôsob sa nazýva tiež ako „mechanizmus spúšťača“. Najtypickejším príkladom je internalizácia Salmonella spp. s 28

využitím produktov ostrova patogenity SPI-1 SipB-D. Podobným spôsobom fungujú aj invazíny IpaB-D u Shigella spp.26 Mechanizmy vstupu baktérií do hostiteľských buniek a ich spôsoby intracelulárneho prežívania v hostiteľských bunkách, sú zhrnuté v Tab. 2.2. Aby sa baktérie dostali do vnútorného prostredia, či už je ich cieľom intracelulárne či extracelulárne prostredie, musia najskôr prekonať prirodzené bariéry, ku ktorým patrí napríklad črevná sliznica alebo hemoencefalická bariéra. Nepoškodenú slizničnú bariéru predstavuje celý rad epitelových buniek tesne k sebe pripojených, čo sa nazýva ako tzv. tight junctions (TJ) (Obr. 2.4). Prechod v mieste týchto spojení, často pri ich súčasnej dezintegrácii, sa nazýva paracelulárny. Prechod cez cytoplazmu epitelovej bunky (jedným zo spôsobov popísaných vyššie) sa nazýva transcelulárny27. Obr. 2.4 Znázornenie paracelulárneho a transcelulárneho prestupu baktérií (Hossain a Hirata 2008; upravené)28. Baktérie na vstup do buniek používajú mechanizmus „Trójskeho koňa“, čo vyjadruje, že sa nechajú zaniesť do vnútorného prostredia profesionálnymi fagocytmi. Na slizniciach sa vyskytujú rôzne typy antigén-prezentujúcich buniek, ktoré „vzorkujú“ prostredie a predávajú antigény k spracovaniu nižšie položenému slizničnému imunitnému tkanivu MALT (Mucosa Associated Lymphoid Tissue) alebo ich zanášajú do regionálnych lymfatických uzlín (predovšetkým dendritické bunky). Typickým príkladom prvého typu sú M-bunky nad Peyerovými plakmi čreva, ktoré sú cieľom salmonel, yersínií alebo Campylobacter jejuni29. Akokoľvek sú tieto mechanizmy sofistikované, zmeny sprevádzajúce bakteriálnu inváziu 29

bývajú často výrazné. Paracelulárny prechod je zväčša sprevádzaný destabilizáciou tight junctions, k čomu prispieva nielen priamo cielená prestavba cytoskeletu, ale aj jednoduchá indukcia zápalovej odpovede. Niektoré prozápalové cytokíny (napr. TNF-α) spôsobujú dokonca disrupciu tight junctions a zvyšujú permeabilitu kapilár. Neisseria meningitidis destabilizuje endoteliálne spoje a zvyšuje permeabilitu ciev, čo jej umožňuje preniknúť do cerebrospinálnej tekutiny30. Naopak, iný pôvodca meningitídy, kmene neonatálnej meningitídy Escherichia coli (NMEC), využívajú podľa všetkého transcelulárny prechod cez vakuolu potom, čo indukujú svoju endocytózu interakciou s bunkovým receptorom. Do skupiny invazínov môžno zaradiť aj faktory umožňujúce tzv. extracelulárnu inváziu. Mnoho rôznych enzýmov napomáha baktériám narušovať extracelulárny matrix a šíriť sa v tkanivách. Jedná sa o rôzne proteázy, lipázy aj nukleázy. Streptokináza a stafylokináza príslušných rodov aktivujú plazminogén na plazmín, ktorý následne spôsobuje degradáciu fibrínu. Hyaluronidáza, ktorú produkujú kmene Staphylococcus aureus alebo Erysipelothrix rhusiopathiae, štiepi kyselinu hyalurónovú obsiahnutú v spojivových tkanivách. Taktiež proteázy (napr. V8 proteáza Staphylococcus aureus alebo elastáza Pseudomonas aeruginosa) štiepia proteíny spojivového tkaniva ako elastín, laminín či fibronektín, čím napomáhajú ich rozpadu31. 2.3 SIDEROFÓRY Siderofóry patria k faktorom virulencie patogénnych baktérií a slúžia na vychytávanie železa z prostredia. Napriek tomu, že železo je jedným z najrozšírenejších prvkov v zemskej kôre, nie je biologicky ľahko dostupné. Vo väčšine aeróbnych prostredí existuje železo v železitom (Fe3+) stave, kedy má tendenciu vytvárať nerozpustné pevné látky. Patogénne aj nepatogénne baktérie musia byť schopné využívať živiny zo svojho prostredia, aby uspeli v konkurenčnom boji napríklad pri kolonizácii slizníc. Aby boli získané látky účinné, musia byť nielen dostupné, ale aj rozpustné. Železo je pre rast baktérií nevyhnutným prvkom, s výnimkou niektorých laktobacilov. Mnohé druhy mikroorganizmov sa vyvinuli tak, aby využívali železo vo viacerých fyziologických procesoch vrátane syntézy DNA, transkripcie a bunkového dýchania, pravdepodobne kvôli jeho vysokému zastúpeniu v mnohých prírodných prostrediach32. Mikroorganizmy sú preto schopné uvoľňovať malé zlúčeniny, ktoré sú schopné viazať železo a transformovať ho do rozpustnej formy a nazývajú sa siderofóry. Jedná sa o chelatačné činidlá, ktorých úlohou je akumulácia železa pre potreby bakteriálnej bunky, a to tvorbou rozpustných komplexov Fe3+, ktoré môžu byť absorbované aktívnymi transportnými mechanizmami. Schopnosť biosyntézy siderofórov zvyšuje virulenciu baktérií, patria k faktorom virulencie 30

a zúčastňujú sa procesu patogenézy pri infekcii hostiteľa33. Mnohé siderofóry sú neribozomálne peptidy33,34, hoci niektoré sú biosyntetizované aj nezávisle35. V cicavčích hostiteľoch je železo pevne viazané na proteíny, ako je hemoglobín, transferín, laktoferín alebo feritín. Striktná homeostáza železa vedie k jeho voľnej koncentrácii asi 10 – 24 mol/l36, preto je na patogénne baktérie vyvíjaný veľký tlak, aby nejakým spôsobom dokázali železo získavať z extracelulárneho prostredia, keďže koncentrácia využiteľného železa v organizme je pre rast baktérií nedostatočná. Napríklad Bacillus anthracis uvoľňuje dva siderofóry, bacillibaktín a petrobaktín, aby vychytali železitý ión z proteínov obsahujúcich železo37. Niektoré patogény môžu využívať aj iné spôsoby získavania železa, napríklad produkciou toxínov, ktoré lyzujú bunky a po ich rozpade dochádza k uvoľneniu živín vrátane železa do prostredia. Siderofóry sa zvyčajne klasifikujú podľa ligandov používaných na chelatáciu trojmocného železa. Z chemického hľadiska medzi hlavné skupiny siderofórov patria katecholáty (fenoláty), hydroxamáty a karboxyláty (napr. deriváty kyseliny citrónovej), ale vyskytujú sa aj v zmiešanej forme33. Široká škála siderofórov môže byť spôsobená evolučným tlakom vyvíjaným na mikroorganizmy, aby produkovali štruktúrne odlišné siderofóry, ktoré nemôžu byť transportované špecifickými aktívnymi transportnými systémami iných mikroorganizmov alebo v prípade patogénov deaktivovaných hostiteľským organizmom. Príkladom katecholátových siderofórov je napríklad enterobaktín, ktorý je vylučovaný mnohými enterobaktériami, ďalej salmochelín, korynebaktín, vibriobaktín či amonobaktín (Aeromonas hydrophila). Do skupiny hydroxamátových siderofórov patrí alkaligín (Alcaligenes spp., Bordetella spp.), aerobaktín (Escherichia coli) a cepabaktín (Burkholderia cepacia). Stafyloferín je zástupcom karboxylátových siderofórov. K iným typom patria pyoverdín a pseudobaktíny Pseudomonas aeruginosa. Niektoré bakteriálne druhy tvoria len jeden špecifický siderofór, iné ich kódujú väčšie množstvo. Prakticky všetky kmene Escherichia coli tvoria chromozomálne kódovaný enterobaktín, produkcia aerobaktínu je však asociovaná so zvýšenou virulenciou. Tento siderofór býva navyše kódovaný plazmidom a možno ho oprávnene považovať za faktor virulencie. Okrem toho u Escherichia coli možno detegovať aj salmochelín či yersiniabaktín. Yersinia spp. zase okrem proteínov viažucich hemín (Hms) produkuje aj siderofór yersiniabaktín, pričom oba sú kódované na tzv. HPI (High Pathogenicity Island), teda genomickom ostrove spojenom s vysokou patogenitou. Siderofóry sú vylučované baktériami do extracelulárneho prostredia, kde pôsobia na sekvestráciu a solubilizáciu železa a následne sú rozpoznávané bunkovo špecifickými receptormi na vonkajšej membráne bunky38. U Gram-negatívnych baktérií sú potom 31

transportované do periplazmy prostredníctvom TonB-dependentných receptorov a do cytoplazmy sú prenášané transportérmi ABC39. Keď sa Fe3+ siderofórový komplex dostane do cytoplazmy bunky, zvyčajne sa redukuje na Fe2+, aby sa železo uvoľnilo, najmä v prípade \"slabších\" siderofórových ligandov, akými sú hydroxamáty a karboxyláty (Obr. 2.5). Obr. 2.5 Získavanie železa prostredníctvom siderofórov (Vinuesa a McConnell 2021; upravené) 32. Schéma predstavuje generický systém získavania železa sprostredkovaný siderofórmi založený na spoločných znakoch u Gram-negatívnych druhov. Siderofóry sa syntetizujú a vylučujú z bakteriálnej bunky, kde zachytávajú voľné železo alebo vychytávajú železo v komplexe s hostiteľskými proteínmi. Komplex siderofór-železo viaže receptor špecifický pre siderofór na povrchu bakteriálnej bunky a je transportovaný cez extracelulárnu membránu. ABC transportér transportuje komplex siderofór-železo do cytoplazmy, kde je komplex disociovaný redukciou alebo enzymatickým štiepením siderofóru, čím sa uvoľní atóm železa do intracelulárnej zásoby železa. Vo všeobecnosti možno definovať, že patogénne baktérie si vyvinuli mechanizmy na získanie hostiteľského železa, ktoré môžu byť rozdelené do dvoch skupín; (i) získavanie železa sprostredkované siderofórmi a (ii) špecifické mechanizmy získavania železa z komplexných hostiteľských proteínov, ako je hém, transferín a laktoferín32. (i) Jedným z najčastejších spôsobov, akým baktérie získavajú železo, je redukcia jeho nerozpustnej Fe3+ formy na rozpustnú Fe2+ formu. Tak pôsobí napríklad farbivo pyocyanín u Pseudomonas aeruginosa. Niektoré baktérie sú schopné viazať priamo väzobné glykoproteíny hostiteľa a získavať zelezo priamo z nich. Táto väzba je zvyčajne špecifická, napríklad Neisseria meningitidis viaže len ľudský transferín a je preto špecifickým ľudským patogénom. Iné systémy sú schopné viazať a transportovať celú hémovú skupinu alebo celý 32

hemoglobín, ktorý sa uvoľní po lýze erytrocytov. Toho dôkazom je napríklad periodontálny patogén človeka Porphyromonas gingivalis, ktorý obsahuje dvojzložkový systém: HmuY, ktorý viaže hém a HmuR, ktorý ho transportuje cez vonkajšiu membránu. K uvoľneniu hému z hemoglobínu či methemoglobínu slúžia bakteriálne proteázy, tzv. gingipaíny. Schopnosťou viazať hém sa vyznačujú aj niektorí zástupcovia čeľade Yersiniaceae, napr. Yersinia spp. (ii) K získavaniu železa z hostiteľského transferínu a laktoferínu dochádza prostredníctvom interakcie medzi týmito proteínmi v komplexe s trojmocným železom a špecifickými receptormi na povrchu bakteriálnych buniek. Tieto receptory sú schopné odstrániť trojmocné železo z transferínu a laktoferínu a transportovať ho do vnútra bunky. V prípade hémového železa sa ukázalo, že viaceré vylučované bakteriálne efektory lyzujú erytrocyty, aby sa uvoľnil hém a s ním spojené dvojmocné železo. Okrem toho mnohé bakteriálne patogény vylučujú hemofóry (proteíny viažuce hém), ktoré sa viažu priamo na proteíny železa/hému z hemoglobínu hostiteľa a presúvajú ho k receptorom na vonkajšej membráne baktérií40. Špecifické receptory na povrchu bakteriálnej bunky viažu hemové komplexy, ktoré sú potom transportované do cytozolu. Bakteriálne enzýmy, ako je monooxygenáza, štiepia hémovú skupinu a uvoľňujú dvojmocné železo do intracelulárnej zásoby železa. Získavanie železa v tomto oxidačnom stave môže byť tiež uľahčené špecifickými systémami absorpcie, ako je Feo systém, ktorý je široko distribuovaný u rôznych Gram-negatívnych druhov41. Patria k nim Serratia marcescens alebo Yersinia pestis, ktoré vylučujú hemofóry viažuce voľné železo alebo železo uvoľnené z hemoglobínu a následne sa viažu na hemofórové receptory na povrchu bakteriálnej bunky42. Feo systém je transportný systém, ktorý sa nachádza u väčšiny enterobaktérií a je kódovaný operónom feoABC. FeoB je cytoplazmatický membránový proteín s regiónmi pre syntézu kanálu pre transport železa a FeoA je malý cytoplazmatický proteín potrebný pre transport železa sprostredkovaný FeoB43. 2.4 PUZDRO Glykokalyx je extracelulárna vrstva polysacharidov alebo proteínov, ktorá je organizovaná buď vo forme bakteriálneho puzdra (protektívne polysacharidy alebo proteíny) alebo slizovej vrstvy (agregatívne polysacharidy alebo proteíny). Vďaka lepkavej slizovitej vrstve adherujú baktérie k sebe navzájom, ale aj na rôzne povrchy a vytvárajú vrstvu nazývanú biofilm (Obr. 2.6). 33

Obr. 2.6 Bakteriálne puzdro, slizovitá vrstva a biofilm (https://www.labtestsguide.com/bacterial-capsule). Puzdro je ochranná vonkajšia vrstva niektorých Gram-negatívnych a Gram-pozitívnych baktérií, ktorá pevne prilieha k bunkovej stene a má vysoko organizovanú štruktúru. Puzdro je u väčšiny baktérií zložené z kyslých polysacharidov s vysokou molekulovou hmotnosťou kovalentne viazaných na povrch bunky. Niektoré baktérie, napr. Bacillus anthracis alebo Yersinia pestis tvoria puzdrá z proteínov44. Kapsulárne polysacharidy vytvárajú hrubý ochranný povlak okolo celej bakteriálnej bunky a môžu byť spojené s bakteriálnou bunkou v neprítomnosti membránovej kotvy, ale zvyčajne sa nachádzajú kovalentne pripojené k iným molekulám bunkového povrchu, ako je fosfolipid alebo lipid A45. Tieto štruktúry sa skladajú z opakujúcich sa monosacharidových jednotiek, ktoré sú navzájom spojené glykozidickými väzbami, čím sa vytvárajú homo- alebo heteropolyméry. Vzhľadom na to, že všetky hydroxylové skupiny prítomné v každom monosacharide sa môžu podieľať na tvorbe glykozidickej väzby, medzi monosacharidmi v polysacharidovom reťazci môže existovať väzba v mnohých konfiguráciách, čo vedie k veľkej štruktúrnej diverzite medzi bakteriálnymi kapsulami46,47. Napriek tejto veľkej rozmanitosti, môžu byť chemicky identické kapsulárne polysacharidy syntetizované aj rôznymi druhmi baktérií. Napríklad K1 antigén Escherichia coli (homopolymér kyseliny alfa-2,8-N-acetylneuramínovej), ktorý je hlavnou príčinou novorodeneckej meningitídy, je identický s kapsulou Neisseria meningitidis skupiny B48. Puzdru baktérií sa pripisuje mnoho funkčných úloh, zvyčajne spojených s kolonizáciou a perzistenciou. Tvoria ho len niektoré virulentné kmene, chráni ich pred fagocytózou. Jeho sieťovitá štruktúra prekrýva povrchové stenové antigény, ktoré síce môžu interagovať s opsonínmi, prenikajúcimi k nim cez riedku sieťovitú štruktúru puzdra, ale naviazané opsoníny sa už nemôžu pripojiť na receptory fagocytov, pretože im v tom priestorovo bráni polymérna hmota puzdra. Pre úspešnú fagocytózu je potrebná prítomnosť protilátok namierených proti 34

antigénom puzdra. Väčšina kapsulárnych polysacharidov sa považuje za slabé imunogény, čo je ďalším dôvodom jeho ochranných vlastností. Puzdro môže byť bariérou pre toxické hydrofóbne molekuly (detergenty), zabraňuje vysychaniu a čiastočne má úlohu aj v procesoch adhézie medzi baktériami navzájom a k povrchom hostiteľa44. Tvorba kapsuly je geneticky podmienená a jej syntéza závisí od podmienok vonkajšieho prostredia. Opuzdrené baktérie, izolované z biologických materiálov môžu prestať tvoriť puzdro po niekoľkých pasážach na kultivačných médiách, pretože ustal selekčný tlak imunitných mechanizmov pôsobiacich v organizme44. Baktérie zvyčajne organizujú sekvenciu kódujúcu kapsulárny syntetický mechanizmus v operónoch vrátane génov kódujúcich enzýmy syntetizujúce polysacharidy, ktoré definujú kapsulárny sérotyp, a sekrečného mechanizmu, ktorý ukladá polymér na vonkajší povrch bunky49. 2.4.1 Syntéza puzdra baktérií Existujú tri všeobecné mechanizmy biosyntézy bakteriálnej kapsuly. 1. Syntéza kapsuly sprostredkovaná dráhou závislou od Wzx/Wzy sa iniciuje vo vnútornej časti membrány spojením oligosacharidovej jednotky s akceptorom undekaprenylu pomocou glykozyltransferáz (GT), ktoré sú transportované cez membránu flippázou (Wzx) a polymerizované polymerázou Wzy50. 2. Polymerizácia oligosacharidov môže nastať v cytoplazme pred napojením na akceptor a transport cez membránu sa uskutočňuje dráhou závislou od transportéra tzv. ATP-binding cassette (ABC transportéry)51. 3. Niektoré baktérie využívajú Wzy polymerázu na syntézu kapsuly, ktorá je závislá od exportných systémov odlišných od Wzx (syntáza-dependentná dráha)52. Výkyvy v syntéze kapsulárnych polysacharidov sú závislé od vonkajších podmienok ovplyvňujúcich interakciu baktérií s inými baktériami alebo hostiteľmi. Baktérie si vyvinuli rôzne stratégie na reguláciu produkcie kapsúl, ktoré fungujú na transkripčnej úrovni53. 2.5 EXOTOXÍNY Bakteriálne toxíny sú často najdôležitejším faktorom virulencie baktérií, účinok toxínov v tele neutralizujú protilátky namierené proti tým častiam molekuly, ktoré sa zúčastňujú väzby na receptor cieľovej bunky. 35

Obr. 2.7 Znázornenie rozdielu pri pôsobení exotoxínu a endotoxínu (https://microbeonline.com/basic- properties-of-exotoxins-and-endotoxins-and-their-differences/). Exotoxíny sú proteíny produkované patogénnymi baktériami do okolitého prostredia bez poškodenia bakteriálnej bunky. Endotoxín je štruktúrnou zložkou bunkovej steny a je uvoľňovaný do prostredia až po rozpade bakteriálnej bunky. Exotoxíny sú skupinou rozpustných proteínov, ktoré sú extracelulárne uvoľňované a sú účinné vo veľmi malých množstvách. Väčšinou nepôsobia iba v mieste produkcie, ale prechádzajú aj do krvného obehu a pôsobia na citlivé bunky v celom organizme bez ohľadu na ich vzdialenosť od ložiska infekcie alebo miesta absorpcie toxínu. Produkujú ich Gram-pozitívne aj Gram- negatívne baktérie, ktoré produkujú buď jeden alebo viacero exotoxínov. Exotoxíny majú jedinečný mechanizmus účinku, ktorý je zodpovedný za vyvolanie špecifickej patológie, líšia sa svojou cytotoxickou účinnosťou a tiež sa líšia v závislosti od hostiteľa, ktorý môže byť intoxikovaný. Napríklad Exotoxín A (ETA) Pseudomonas aeruginosa može intoxikovať rôzne typy buniek, zatiaľ čo klostrídiové neurotoxíny vykazujú špecifický tropizmus a intoxikujú iba bunky neurónového pôvodu. Tvorba toxínov nie je pre rast a množenie baktérií nevyhnutná, ale môže byť užitočná pre jeho prežitie alebo šírenie. Bakteriálne exotoxíny sú prísne špecifické, interagujú s bunkovými receptormi, ktoré plnia dôležité biologické funkcie, napr. viažu hormóny alebo iné regulačné molekuly, prípadne slúžia ďalším typom medzibunkovej komunikácie. Katalyzujú mnohé špecifické chemické modifikácie komponentov hostiteľskej bunky, pričom tieto chemické modifikácie môžu buď inhibovať alebo stimulovať normálne pôsobenie cieľovej molekuly, čím sa dosiahne klinická patológia54 (Obr. 2.7). Exotoxíny sa líšia svojou molekulárnou štruktúrou, biologickou funkciou, mechanizmom sekrécie a imunologickými vlastnosťami. Bakteriálne exotoxíny sa môžu rozdeľovať podľa 36

rôznych hľadísk, z medicínskeho hľadiska sa rozdeľujú podľa miesta ich účinku (enterotoxíny, neurotoxíny, kardiotoxíny a iné) na bunku44,55,56. Podľa mechanizmu účinku na cieľovú bunku sa delia exotoxíny na tri skupiny, na toxíny typu I, II a III. 2.5.1. Toxíny typu I (Superantigény) Toxíny typu I interagujú s povrchovými receptormi na povrchu cieľovej bunky a stimulujú transmembránové signály, čo vedie k ovplyvneniu jej funkcie. Viažu sa na špecifické receptory cieľových buniek, čím aktivujú rôzne intracelulárne signalizačné dráhy a poškodzujú funkciu týchto buniek. Toxíny typu I sú malé proteínové toxíny, schopné sprostredkovať interakciu antigén- prezentujúcej bunke (makrofágu) s pomocným T-lymfocytom bez prítomnosti špecifického antigénu. Viažu sa k vonkajšej strane antigénového žliabku molekuly II. triedy hlavného histokompatibilného systému makrofágov a k variabilnému regiónu β-reťazca T-bunkového receptora. Výsledkom je polyklonálna aktivácia pomocných T-lymfocytov. Z uvedeného dôvodu sa toxíny typu I označujú aj ako superantigény. Aktivované T-lymfocyty začnú masívne produkovať prozápalové cytokíny, predovšetkým IL-2, IFN-γ, a TNF-β, čím nastane aj aktivácia makrofágov, ktoré začnú produkovať IL-1 TNF-α. Masívna produkcia týchto cytokínov v krvnom obehu vyvoláva horúčku, hypovolémiu s hypotenziou vyúsťujúcu do bakteriálneho toxického šoku po pôsobení TNF na cievny endotel. Známymi superantigénmi sú niektoré toxíny stafylokokov ako exfoliatín, toxín syndrómu toxického šoku a enterotoxíny. Streptokokové pyrogénne exotoxíny tiež patria k superantigénom57. Významným toxínom aktivujúcim povrchové receptory je termostabilný enterotoxín enterotoxigénnych kmeňov E. coli. Je to malý proteín, ktorého receptorom je guanylátcykláza C (GC-C) lokalizovaná v membráne apikálnej časti enterocytov. Po väzbe toxínu na receptor sa v enterocytoch aktivuje guanylátcykláza, čím sa v bunkách zvyšuje produkcia cyklického guanozínmonofosfátu (cGMP), naruší sa regulácia transportu elekrolytov a vody aktiváciou chloridového kanála CFTR, dochádza k zvýšenej sekrécii chloridových iónov, akumulácii sodných iónov a vody v čreve a vzniká vodnatá hnačka44,58,59. 2.5.2 Toxíny typu II (Cytotoxíny) Na základe mechanizmu účinku na bunkové membrány sa tieto exotoxíny rozdeľujú na fosfolipázy, toxíny vytvárajúce v membráne póry – perforíny a toxíny s vlastnosťami 37

detergentov. Výsledkom pôsobenia membranolytických toxínov je poškodenie tkaniva, tvorba abscesov alebo myonekróza55. 2.5.2.1 Fosfolipázy Fosfolipázy hydrolyzujú membránové fosfolipidy cieľových buniek, destabilizujú membránovú dvojvrstvu, čím spôsobia lýzu buniek. Príkladom toxínu je α-toxín produkovaný Clostridium perfringens. α-toxín je lecitinázou, patrí k metaloenzýmom vyžadujúcim pre svoju aktivitu zinok. Štiepi väzbu medzi glycerolom a fosfátom v molekule lecitínov. Produktom reakcie je lipid diacylglycerol, ktorý aktivuje bunkové signálne dráhy vyvolávajúce zápalovú odpoveď, ktorá vedie k zvýšenej permeabilite ciev, k opuchu a teplote. Hydrolyzuje membrány hostiteľských buniek a deštruuje tkanivo. Je hlavným toxínom pri vzniku plynovej gangrény človeka a zvierat. Fosfolipázovú aktivitu má aj β-hemolyzín (sfingomyelináza) Staphylococcus aureus, ktorý poškodzuje bunkovú membránu, je toxický pre leukocyty, makrofágy, fibroblasty a erytrocyty a spôsobuje ich lýzu44,58. 2.5.2.2 Perforíny Perforíny sú toxíny, ktoré vytvárajú póry v cytoplazmatickej memráne hostiteľských buniek. Tvoria najväčšiu skupinu doteraz známych bakteriálnych toxínov. Pórotvorné toxíny sú produkované v bakteriálnej bunke a sú sekretované do vonkajšieho prostredia ako rozpustné proteíny. Únik molekúl cez vzniknutý pór naruší homeostázu hostiteľskej bunky a vedie k jej smrti. Príkladom takto účinkujúceho toxínu je α-toxín (α-hemolyzín) Staphylococcus aureus, ktorý spôsobuje lýzu erytrocytov, rozpad lyzozómov fagocytujúcich leukocytov, účinkuje aj na epitelové a endotelové bunky. Je sekretovaný ako rozpustný monomér, ktorý po naviazaní na hostiteľskú membránu vytvorí heptamérny pór priepustný pre ióny vápnika a draslíka, ATP a iné malé molekuly. Pantonov-Valentinov leukocidín je toxín produkovaný niektorými kmeňmi Staphylococcus aureus, je to póry tvoriaci cytotoxín, spôsobuje nekrózu a lýzu leukocytov, predovšetkým monocytov a makrofágov60. Viaceré Gram-pozitívne baktérie tvoria navzájom príbuzné perforíny, nazývané cytolyzíny závislé na cholesterole. Pre aktivitu týchto perforínov je nevyhnutný cholesterol, ktorý je prítomný v membránach všetkých živočíšnych buniek. V membránach vytvárajú veľké póry a majú výrazný lytický účinok na eukaryotické bunky. Patrí sem perfringolyzín O Clostridium perfringens, streptolyzín O Streptococcus 38

pyogenes, pneumolyzín Streptococcus pneumoniae alebo listeriolyzín O Listeria monocytogenes56,58. 2.5.2.3 Toxíny s vlastnosťami detergentov Toxíny s vlastnosťami detergentov poškodzujú membránu povrchovo aktívnym pôsobením, menia jej povrchové napätie, destabilizujú a deštruujú ju. Patrí k nim δ-toxín produkovaný niektorými kmeňmi Staphylococcus aureus, δ-like toxín Staphylococcus haemolyticus alebo surfaktín Bacillus subtilis44. 2.5.3 Toxíny typu III (Intracelulárne toxíny) Toxíny typu III prenikajú do cieľovej bunky alebo do nej premiestňujú aktívnu enzymatickú zložku a modifikujú intracelulárnu cieľovú molekulu. Majú obvykle dve funkčne rozdielne časti. Jedna časť zodpovedá za vlastnú toxickú aktivitu (katalytická podjednotka A), druhá časť sa viaže na bunkovú membránu (väzbová zložka B). Toxíny tohto typu sa označujú ako A-B toxíny. Väzbová podjednotka sa špecificky viaže na receptor cieľovej bunky a sprostredkuje intracelulárnu translokáciu katalytickej podjednotky do cytoplazmy, ktorá interaguje s cieľovou molekulou. Tieto toxíny môžu mať na bunku cídny účinok. Patria sem toxíny inhibujúce proteosyntézu, farmakologicky pôsobiace toxíny a neurotoxíny klostrídií. 2.5.3.1 Toxíny inhibujúce proteosyntézu Tieto toxíny spôsobujú v bunke nedostatok proteínov potrebných nielen na rast, ale aj na udržanie bazálneho metabolizmu baktérie. K najvýznamnejším toxínom patrí difterický toxín vyvolávajúci klinické prejavy záškrtu. Je tvorený jedným polypeptidom obsahujúcim dve funkčné podjednotky. Väzbová podjednotka sa špecificky viaže na epitelové bunky respiračnej a genitálnej sliznice, na epitelové bunky poškodenej kože a po preniknutí do krvi aj na bunky srdca, obličiek a nervové bunky. Substrátom pre enzým je elongačný faktor 2, ktorý zohráva nezastupiteľnú úlohu v syntéze proteínov v eukaryotickej bunke. Toxín má za následok zástavu tvorby bielkovín a smrť bunky. Produkujú ho niektoré kmene Corynebacterium diphtheriae, baktérie nie sú invazívne, toxín produkujú lokálne na sliznici alebo v kolonizovanej rane. V mieste produkcie toxínu vzniká nekrotické poškodenie epitelových buniek sliznice alebo rany a pseudomembrána44,58. Šigatoxín produkujú kmene Shigella dysenteriae a šiga-like toxín 39

enterohemoragické kmene E. coli (EHEC). Zastavujú proteosyntézu v senzitívnych hostiteľských bunkách. Toxíny sú zložené z piatich identických väzbových a jednej katalytickej podjednotky. Väzbová časť molekuly sa viaže na membránový receptor Gb3, dostane sa do vnútra bunky endocytózou a katalytická podjednotka cez Golgiho aparát a endoplazmatické retikulum sa dostáva do cytoplazmy. Väzbová podjednotka štiepi rRNA na veľkej podjednotke ribozómu a výsledkom je zastavenie proteosyntézy. Receptory Gb3 sú pomerne časté na povrchu endotelových buniek ciev tráviacej sústavy, preto sú sprievodným javom ochorenia krvavé hnačky58. 2.5.3.2 Farmakologicky pôsobiace toxíny Farmakologicky pôsobiace toxíny patologicky menia funkciu bunky, ale zachovávajú jej životnosť. Mnohé toxíny tohto typu pôsobia tak, že ovplyvňujú hladinu cAMP, alebo cGMP, ktoré majú regulačné funkcie. Najviac preštudovaným toxínom je cholerový toxín. Patrí k enterotoxínom a produkuje ho Vibrio cholerae. Patrí medzi A-B toxíny. Pozostáva z piatich väzbových podjednotiek (B) a jednej katalytickej podjednotky (A). B podjednotka sa špecificky viaže na gangliozid GM1 prítomný na povrchu črevných epiteliálnych buniek. Endocytózou sa dostáva do cytoplazmy zložka A a dochádza k jej rozdeleniu na podjednotky A1 a A2. A1 prenáša ADP-ribozyl na enzým GTP-ázu, ktorý reguluje syntézu cAMP61. GTP-áza sa účinkom toxínu dostáva do stabilne aktivovanej formy a začnú sa tvoriť veľké množstvá cAMP, čím sa mení priepustnosť bunkovej steny enterocytov a do lúmenu tenkého čreva sú transportované chloridové ióny a voda a z lúmenu čreva je zablokované vstrebávanie sodných iónov. Výsledkom je profúzna vodnatá hnačka, s tým spojená strata veľkého množstva vody (silná dehydratácia) a elektrolytov, čo v konečnom dôsledku v neliečených prípadoch môže viesť k smrti. Vibrio cholerae nie je invazívnou baktériou a zostáva adherovaná na enterocyte, kde produkuje toxín, ktorý je hlavným faktorom virulencie. Toxínom postihnutý enterocyt už nemôže získať späť svoje funkcie, preto musí byť nahradený novým enterocytom počas fyziologickej obnovy buniek črevnej sliznice56,58. Termolabilný enterotoxín je ďalší z toxínov produkovaných ETEC. Je štruktúrne aj funkčne podobný choleratoxínu. Je zložený z piatich väzbových a jednej katalytickej podjednotky. Subjednotky B sú usporiadané do tvaru prstenca, pevne sa viažu ku gangliozidu GM1 a niektorým glykoproteínom epiteliálnych buniek čreva. Podjednotka A je zodpovedná za enzymatickú aktivitu toxínu a v hostiteľskej bunke je proteolyticky štiepená na A1 a A2 peptidy spojené disulfidickou väzbou. Aktivácia adenylátcyklázy má za následok 40

stúpanie cAMP v bunke. Tým sa aktivuje hlavný chloridový kanál CFTR črevných epiteliálnych buniek. Cez tento kanál sa začnú transportovať chloridové ióny z buniek do lumenu čreva44,56. 2.5.3.3 Neurotoxíny klostrídií Medzi toxíny, ktoré nezabíjajú cieľovú bunku, iba poškodzujú jej funkcie, patria aj neurotoxíny klostrídií. Tetanospazmín a botulotoxín patria k toxínom typu A-B, viažu sa na špecifické gangliozidy na povrchu nervových buniek a majú pomerne príbuzné aminokyselinové zloženie. Fungujú ako peptidázy a účinkujú v nervových synapsiách na bielkoviny zodpovedné za uvoľňovanie neurotransmiterov56. Tetanospazmín produkuje Clostridium tetani. Po axónoch periférnych nervov, krvou a lymfou sa prenáša do centrálnej nervovej sústavy až k neurónom miechy a mozgového kmeňa. Väzbová podjednotka toxínu sa viaže na gangliozidy (kyselinu sialovú) motorických neurónov a translokuje katalytickú podjednotku do cytoplazmy neurónu. Katalytická podjednotka proteolyticky štiepi synaptobrevíny na membráne sekrečných vezikúl v synapse a blokuje ich funkciu tým, že na synapsách zabráni uvoľneniu inhibičných neurotransmiterov, ktorými sú glycín a kyselina gama-aminomaslová. Inhibičné neurotransmitery tlmia prenos vzruchov medzi neurónmi a potom prenos vzruchov z neurónov na svaly. Výsledkom straty tohto tlmivého vplyvu je svalová hyperaktivita, ktorá sa prejaví kŕčmi, tuhosťou a strnulosťou, pretože stále pretrváva stimulácia neurónov excitačnými neurotransmitermi44,58. Botulotoxín je neurotoxín produkovaný Clostridium botulinum. Toxín sa vstrebáva do krvi, dostáva sa k receptorom na nervovom vlákne, preniká cez cytoplazmatickú membránu a proteolyticky štiepi synaptobrevíny, ktoré sú zodpovedné za uvoľňovanie acetylcholínu do synaptickej štrbiny na nervovo-svalovej platničke. Acetylcholín patrí do skupiny neurotransmiterov a je uchovávaný na konci axónu v malých vezikulách, z ktorých sa rýchlo uvoľňuje. Blokovanie uvoľňovania acetylcholínu má za následok zamedzenie prenosu vzruchov z nervových vlákien na svaly, dochádza k obrne a k smrti väčšinou dochádza po ochrnutí bránice56,58. 2.6 ENDOTOXÍNY Baktérie majú na svojom povrchu viacero štruktúr, ktoré sú jedinečné pre veľké skupiny baktérií, sú esenciálne pre ich fyziológiu a prežitie, ale nie sú súčasťou organizmu človeka 41

a zvierat. Tieto štruktúry sa nazývajú molekulárne vzory patogenity (PAMPs = Pathogen- Associated Molecular Patterns). Sú integrálnou súčasťou bakteriálnej bunky, uvoľňujú sa prevažne až po ich deštrukcii a nazývajú sa endotoxíny. Typickými PAMPs sú lipopolysacharidy Gram-negatívnych baktérií, podobné účinky má komplex lipoteichoovej kyseliny a peptidoglykánu Gram-pozitívnych baktérií, ale aj flagelín, lipoarabinomanán alebo bakteriálne lipopeptidy, proteoglykány a lipidy. Obr. 2.8 Bunková stena Gram-negatívnych baktérií (https://www.citeqbiologics.com/endotoxins/). Endotoxín, tiež označovaný ako lipopolysacharid (LPS), je hlavnou zložkou vonkajšej membrány Gram- negatívnych baktérií a uvoľňuje sa pri dezintegrácii intaktných baktérií. Endotoxín pozostáva z jadrového polysacharidového reťazca, O-špecifických polysacharidových bočných reťazcov (O-antigén) a lipidovej zložky, lipidu A. Lipid A je zodpovedný za toxický účinok endotoxínu. Tieto molekuly pôsobia ako všeobecný bakteriálny alarm signalizujúci ohrozenie organizmu infekciou a spôsobujúci všeobecnú mobilizáciu obranných mechanizmov hostiteľa. Rozpoznávajú ich receptory rozpoznávajúce vzory patogenity (PRRs = Pattern Recognition Receptors). Najlepšie preštudovanú skupinu PRRs tvoria receptory podobné Toll-TLRs (Toll- like receptors). TLRs sa exprimujú na povrchu väčšiny tkanív, najmä však na makrofágoch, dendritových a endotelových bunkách. TLRs pozostávajú zo signálneho peptidu bohatého na leucín, z transmembránovej a cytoplazmatickej domény. Po kontakte TLRs s PAMPs sa naštartuje kaskáda dejov, ktorá je sprostredkovaná vnútrobunkovými signálnymi molekulami a vedie k transkripcii DNA, výsledkom čoho je syntéza cytokínových a ďalších imunoaktívnych 42

molekúl62. PAMPs môžu okrem toho aktivovať aj ďalšie efektorové mechanizmy, medzi nimi napríklad komplementový a hemokoagulačný systém. Ak sa uvoľnia endotoxíny vo veľkom množstve do krvného obehu, stimulujú veľmi veľké množstvo reaktívnych buniek a vzniká nekontrolovaná zápalová odpoveď, ktorá môže vyústiť do septického šoku až k smrti44,63,64. Gram-negatívne baktérie majú dve odlišné membrány – vonkajšiu a vnútornú membránu. Lipopolysacharid (LPS) je integrálnou súčasťou vonkajšej membrány Gram-negatívnych baktérií. Štruktúrne sa LPS skladá z troch prepojených častí: toxická lipidová zložka (lipid A), oligosacharidové jadro a O-špecifický polysacharidový reťazec (O-antigén). Lipid A predstavuje hydrofóbnu zložku LPS, ktorá je ukotvená vo vonkajšej membráne, zatiaľ čo oligosacharidové jadro a O antigén sú lokalizované na povrchu bakteriálnych buniek (Obr. 2.8). Štruktúra LPS sa u jednotlivých baktérií líši, a táto variácia ovplyvňuje aj virulenciu baktérií. Lipid A zodpovedá za toxické účinky a stimulačnú aktivitu pri infekciách spôsobených Gram- negatívnymi baktériami. Lipid A pozostáva z β-1,6-disacharidu glukózamínu, ktorý je fosforylovaný a substituovaný nasýtenými hydroxylovanými acylovými reťazcami. Acylové skupiny lipidu A sú ukotvené vo vonkajšej membráne. Oligosacharidové jadro sa skladá z páru 8-uhlíkových cukrov známych pod názvom KDO spojených s lipidom A, ktoré sú spojené s ďalšími cukrami a tvoria rozvetvený reťazec. Opakujúce sa oligosacharidy alebo O antigén sú pripojené k oligosacharidovému jadru a vyznačujú sa veľmi veľkou variabilitou. LPS môže byť rozpoznaný Toll-like receptorom 4 (TLR-4), ktorý sa nachádza na povrchu rôznych hostiteľských buniek imunitného systému ako sú monocyty, makrofágy, neutrofily a dendritické bunky. TLR-4 funguje ako dimér a na rozpoznanie lipidu A je závislý od malého proteínu MD-2. Iné proteíny ako CD14 a hostiteľský proteín akútnej fázy LPS-väzbový proteín (LBP = LPS-Binding Protein) uľahčujú prezentáciu LPS na MD-2. Komplex TLR4/MD2 je kľúčový pre rozpoznanie LPS a väzbu lipidu A na receptor TLR4. Po väzbe lipidu A na TLR- 4, dochádza k aktivácii tvorby cytokínov (IL-1, TNF a ďalších)65. Cytokíny uvoľnené z aktivovaných buniek stimulujú rôzne mechanizmy prirodzenej imunity, vrátane zápalovej odpovede, ale stimulačne vplývajú aj na bunky špecifickej zložky imunity, t.j. na B a T- lymfocyty. LPS okrem toho spôsobuje aktiváciu komplementu alternatívnou cestou, aktivuje hemokoagulačný systém, trombocyty, polymorfonukleárne leukocyty, mastocyty a endotelové bunky. Aj napriek toxicite lipidu A je jeho rozpoznanie imunitným systémom kľúčové pre zahájenie imunitnej reakcie a následne jej zvládnutie. Až vo vyšších koncentráciách začína endotoxín pôsobiť škodlivo a môže vyvolať smrteľný septický šok. K uvoľňovaniu endotoxínu dochádza po fagocytóze a intracelulárnej deštrukcii baktérií, pri rozpade baktérií účinkom 43

vlastných autolytických enzýmov, v dôsledku cytolýzy komplementom alebo v dôsledku membránovo pôsobiacich antibiotík44,56,66. 44

ZOZNAM SKRATIEK ADP Adenozíndifosfát AMP Adenozínmonofosfát ATP Adenozíntrifosfát cAMP Cyklický adenozínmonofosfát CD14 Cluster of Differentiation 14 (Glykoproteín) CFA Kolonizačné faktory CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (Chloridový kanál) CsgA Proteínová podjednotka DNA Deoxyribonukleová kyselina EPEC Enteropatogénne kmene Escherichia coli ETEC Enterotoxigénne kmene Escherichia coli F+ Fertility factor (Faktor fertility donorovej bunky) feoABC Operón kódujúci transport železa FHA Filamentous hemagglutinin (Filamentózny hemaglutinín) FimH Fimbriálny proteín Gb3 Membránový receptor Globotriaosylceramide GM1 Gangliozid Adhezívny proteín GroEL Enzým glykozyltransferáza Guanozíntrifosfatáza GT GTP-áza HPI High Pathogenicity Island (Ostrov patogenity) IFN Interferón IL-1, IL-2 Interleukín 1, 2 KDO Kyselina 3-deoxy-D-manno-oktulozónová LPS Lipopolysacharid LBP LPS-Binding Protein (LPS-väzbový proteín) MALT Mucosa Associated Lymphoid Tissue (Slizničné lymfoidné tkanivo) MD-2 Myeolid Differentiation-2 proteín MHC Hlavný histokompatibilný komplex MSCRAMM Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules NMEC Neonatal Meningitis E. coli (Pôvodcovia neonatálnej meningitídy) PagN Adhezívny proteín Salmonella Typhimurium PAMPs Pathogen-Associated Molecular Patterns (Molekulové vzory patogenity) PRN Pertaktín PRRs Pattern Recognition Receptors (Receptory rozpoznávajúce vzory patogenity) Ptx Pertussis toxín (Pertusický toxín) spp. species (označenie pre druh v množnom čísle) Tcf Tracheal colonization factor (Tracheálny kolonizačný faktor) TibA Adhezívny proteín Escherichia coli Tir Transported intimin receptor (Receptor pre intimín) TJ Tight Junctions (Tesné spojenia) TLRs Toll-like receptors TNF Faktor nekrotizujúci tumory UPEC Uropatogénne kmene Escherichia coli Wzx Enzým flippáza Wzy Enzým polymeráza 45

LITERATÚRA 1. Finlay, B. B. & Falkow, S. Microbiol Mol Biol Rev 61, 136-69, (1997) 2. Kline, K. A. et al. Cell Host Microbe 5, 580-92, (2009) 3. Dufrene, Y. F. & Viljoen, A. Front Microbiol 11, 1457, (2020) 4. Patel, S. et al. Biomed Pharmacother 93, 763-71, (2017) 5. Jeffery, C. AIMS Microbiol 4, 362-76, (2018) 6. Melvin, J. A. et al. Nat Rev Microbiol 12, 274-88, (2014) 7. Pawloski, L. C. et al. Clin Vaccine Immunol 21, 119-25, (2014) 8. Virolle, C. et al. Genes (Basel) 11, (2020) 9. Ochman, H. et al. Nature 405, 299-304, (2000) 10. Klemm, P. & Schembri, M. EcoSal Plus 1, (2004) 11. Connell, H. et al. Int J Med Microbiol 290, 587-97, (2000) 12. Costerton, J. W. et al. Science 284, 1318-22, (1999) 13. Olsen, A. et al. Infect Immun 66, 944-9, (1998) 14. La Ragione, R.M. et al. J Med Microbiol 49, 327-38, (2000) 15. Mix, A. K. et al. Genes Immun 22, 247-54, (2021) 16. Foster, T. J. Trends Microbiol 27, 927-41, (2019) 17. Wilson, J. W. et al. Postgrad Med J 78, 216-24, (2002) 18. Kelly, C. G. & Younson, J. S. Expert Opin Investig Drugs 9, 1711-21, (2000) 19. Petit, T. J. P. & Lebreton, A. Trends Microbiol 30, 807, (2022) 20. Cossart, P. & Helenius, A. Cold Spring Harb Perspect Biol 6, (2014) 21. Ribet, D. & Cossart, P. Microbes Infect 17, 173-83, (2015) 22. Price, J. V. & Vance, R. E. Immunity 41, 685-93, (2014) 23. Kayal, S. & Charbit, A. FEMS Microbiol Rev 30, 514-29, (2006) 24. T, O. C. & Backert, S. Front Cell Infect Microbiol 2, 25, (2012) 25. Pizarro-Cerda, J. & Cossart, P. Annu Rev Cell Dev Biol 25, 649-70, (2009) 26. Schlumberger, M. C. & Hardt, W. D. Curr Opin Microbiol 9, 46-54, (2006) 27. Paradis, T. et al. Int J Mol Sci 22, (2021) 28. Hossain, Z. & Hirata, T. Mol Biosyst 4, 1181-5, (2008) 29. Elmi, A. et al. Cell Microbiol 18, 561-72, (2016) 30. Coureuil, M. et al. Science 325, 83-7, (2009) 31. Golovkine, G. et al. Front Cell Infect Microbiol 8, 52, (2018) 32. Vinuesa, V. & McConnell, M. J. Int J Mol Sci 22, (2021) 33. Hider, R. C. & Kong, X. Nat Prod Rep 27, 637-57, (2010) 34. Miethke, M. & Marahiel, M. A. Microbiol Mol Biol Rev 71, 413-51, (2007) 35. Challis, G. L. Chembiochem 6, 601-11, (2005) 36. Raymond, K. N. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 3584-8, (2003) 37. Abergel, R. J. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 18499-503, (2006) 38. Neilands, J. B. J Biol Chem 270, 26723-6, (1995) 39. Roosenberg, J. M., 2nd et al. Curr Med Chem 7, 159-97, (2000) 40. Krewulak, K. D. & Vogel, H. J. Biochim Biophys Acta 1778, 1781-804, (2008) 41. Lau, C. K. et al. FEMS Microbiol Rev 40, 273-98, (2016) 42. Letoffe, S. et al. J Bacteriol 186, 4067-74, (2004) 43. Kim, H. et al. Biochem Biophys Res Commun 423, 733-8, (2012) 44. Liptaková. Lekárska mikrobiológia, (2019) 45. Whitfield, C. V., M.A. . Adv. Microb. Physiol., 135-246, (1993) 46. Roberts, I. S. Annu. Rev. Microbiol., 285-315, (1996) 47. Merino, S. T., J.M. . Bacterial Capsules and Evasion of Immune Responses, (2015) 48. Mendoza. marine drugs Rew, (2021) 49. Rendueles O, G.-G. M., et.al. PLoS Pathog, ( 2017) 50. C. Whitfield. Annu. Rev. Biochem, 39-68, (2006) 51. Cuthbertson L, K. V. Microbiol. Mol. Biol. Rev, (2010)) 52. Peleg A, S. Y., et al. J. Bacteriol, 5259-66, (2005) 53. Rainer. Biochem J 14, 476, (2016) 54. Barbieri. Encyclopedia of Microbiology., (2009). 55. Ala’Aldeen D.A.A. , W. K. G., in Medical Microbiology Medical Microbiology, (2012) 56. Votava M. et al. Lekárska mikrobiologie obecná, (2005). 57. Kaempfer, R. Toxins (Basel) 10, (2018) 58. Pilipčinec E. Špeciálna bakteriológia, Gram-negatívne baktérie, (2019) 46

59. Dubreuil, J. D. et al. EcoSal Plus 7, (2016) 60. Tromp, A. T. et al. Toxins (Basel) 12, (2020) 61. Yoon, S. H. & Waters, C. M. Trends Microbiol 27, 806-07, (2019) 62. Kuchta M. et al. Probiotiká, ich miesto a využitie v medicíne, (2006) 63. Wang, X. & Quinn P.J. Progres in Lipid Research 49, 97-107, (2010) 64. Whitfield, C. et al. J Bacteriol 174, 4913-9, (1992) 65. Wang, X. & Quinn, P. J. Prog Lipid Res 49, 97-107, (2010) 66. Kawahara, K. Int J Mol Sci 22, (2021) 47

III. SEKREČNÉ SYSTÉMY Jana Koščová, Vanda Hajdučková 3.1 SEKREČNÉ SYSTÉMY BAKTÉRIÍ A ICH VÝZNAM 48 V PATOGENÉZE BAKTERIÁLNYCH INFEKCIÍ ......................... 51 3.2 SEKREČNÉ SYSTÉMY GRAM-NEGATÍVNYCH BAKTÉRIÍ .... 52 3.2.1 Sekrécia cez cytoplazmatickú membránu .......................................... 53 3.2.1.1 Sekrečná dráha Sec ............................................................................ 55 3.2.1.2 Sekrečná dráha Tat ............................................................................. 56 3.2.2 Sekrečný systém typu I ...................................................................... 58 3.2.3 Sekrečný systém typu II ..................................................................... 59 3.2.4 Sekrečný systém typu III .................................................................... 62 3.2.5 Sekrečný systém typu IV ................................................................... 63 3.2.6 Sekrečný systém typu V ..................................................................... 63 3.2.6.1 Sekrécia autotransportéra ................................................................... 64 3.2.6.2 Sekrécia pomocou dvoch partnerských zložiek ................................. 64 3.2.6.3 Sekrécia pomocou vodiacej bielkoviny a chaperónov ....................... 65 3.2.7 Sekrečný systém typu VI ................................................................... 66 3.2.8 Sekrečný systém typu VII – XI .......................................................... 67 3.3 SEKREČNÉ SYSTÉMY GRAM-POZITÍVNYCH BAKTÉRIÍ ...... 69 70 3.3.1 SecA2 ................................................................................................. 71 3.3.2 Sortázy ............................................................................................... 72 3.3.3 Extracelulárna sekrécia proteínov ...................................................... 73 3.3.3.1 Injektozóm ......................................................................................... 3.3.3.2 Sekrečný systém typu T7SS .............................................................. 74 3.4 HOSTITEĽSKÉ IMUNITNÉ ROZPOZNÁVANIE SYSTÉMOV BAKTERIÁLNEJ SEKRÉCIE .......................................................... 3.1 SEKREČNÉ SYSTÉMY BAKTÉRIÍ A ICH VÝZNAM V PATOGENÉZE BAKTERIÁLNYCH INFEKCIÍ Sekrečné systémy sú zariadenia na bunkových membránach, ktoré umožňujú vylučovanie bakteriálnych proteínov a rôznymi mechanizmami sa podieľajú na zvýšení virulencie daného bakteriálneho kmeňa – od uľahčenia spojenia s hostiteľskou bunkou až po priame toxické pôsobenie vedúce k narušeniu ich funkcií. Sekrécia proteínov je jedným z dôležitých procesov, ktorý slúži mikroorganizmom k transportu proteínov z cytoplazmy do vonkajšieho prostredia, do cytoplazmatickej membrány inej bunky alebo do jej cytosólu. Sekretované môžu byť tak membránové proteíny ako aj proteíny vykonávajúce svoju funkciu mimo bunky. Niektoré systémy sú evolučne konzervované u všetkých baktérií, iné sú zase špecifické len pre určité 48

druhy. Systémy produkcie/syntézy/vylučovania bielkovín sú nevyhnutné aj pre rast baktérií a využívané sú v rade procesov. Sekrečné systémy sa navzájom líšia štruktúrou a mechanizmom transportu proteínov. Štruktúra sekrečného aparátu súvisí nielen od stavby bunkovej steny a cytoplazmatickej membrány baktérie, ale aj od miesta určenia, kam má byť daný proteín sekretovaný. Niektoré sekrečné systémy sú pre baktérie esenciálne a zaisťujú životne dôležité funkcie, iné môžu svojmu hostiteľovi prinášať určitú výhodu, napr. pri symbióze alebo pri obsadzovaní danej ekologickej niky, resp. kolonizácii hostiteľa v prípade patogénnych baktérií. Patogénne mikroorganizmy môžu týmto spôsobom sekretovať faktory virulencie, ktorými môžu napr. navodiť zmeny chovania imunitného systému hostiteľa podľa aktuálnych potrieb. Medzi sekrečné systémy tohto typu patrí napríklad sekrečný systém typu 31. Vzhľadom k stavbe bunkovej membrány sa sekrečné systémy vyskytujú najmä u Gram- negatívnych baktérií. Podľa štruktúry, funkcie a špecificity ich môžeme rozdeliť do niekoľkých tried, v súčasnosti rozoznávame spolu jedenásť sekrečných systémov (T1SS – T11SS = Type 1 – 11 Secretion System). Niektoré sekrečné systémy sa nachádzajú takmer u všetkých baktérií a vylučujú širokú škálu substrátov, zatiaľ čo iné boli identifikované iba u niektorých bakteriálnych druhov a sú producentmi len jedného či niekoľkých proteínov. V určitých prípadoch sú tieto špecializované sekrečné systémy využívané bakteriálnymi patogénmi na manipuláciu hostiteľa alebo za účelom pomnoženia sa v určitom mieste. Za iných okolností potrebujú získať výhodu v prostredí, v ktorom sa pomnožujú, na čo využívajú sekrečné proteíny, ktoré im napomáhajú v kompetícii s inými mikroorganizmami prítomnými v danom prostredí. Model sekrečných systémov sa líši v závislosti od toho, či ich proteínové substráty prechádzajú cez jednoduchú fosfolipidovú membránu, dve membrány alebo dokonca tri membrány, kde dve z nich sú bakteriálne a jedna je hostiteľská membrána. Vzhľadom na špecificitu expresie niektorých sekrečných systémov bakteriálnych patogénov sa voči týmto systémom vyvíjajú antimikrobiálne látky na rozšírenie súčasného repertoáru antibiotík. Vo všeobecnosti možno bakteriálne sekrečné systémy rozdeliť na dve skupiny (jedno- a dvojkroková sekrécia), a to na základe cieľového miesta sekretovaného substrátu. Jednokrokový systém (patria sem T1SS, T3SS, T4SS a T6SS) sekretuje proteín z cytosólu priamo do extracelulárneho priestoru, kým dvojkrokový systém (patria sem T2SS a T5SS) exportuje proteín najskôr do periplazmy dráhou všeobecnej sekrécie (Sec = Secretion) alebo prostredníctvom dráhy dvojitej arginínovej translokácie (Tat = Two-arginine translocation). V druhom prípade proteín prekleňuje vonkajšiu membránu do extracelulárneho priestoru2. Najvýznamnejším a najviac preskúmaným sekrečným systémom je sekrečný systém typu III (T3SS), ktorý je dobre preštudovaný u niektorých Gram-negatívnych baktérií z rodov 49

Salmonella, Yersinia, Shigella, Bordetella a Pseudomonas. Baktérie používajú T3SS na preniknutie secernovaných produktov do buniek. Proteíny sú do bunky transportované pomocou ihlovitej štruktúry, ktorá „prepichne“ hostiteľskú bunku a vpraví do nej efektorové proteíny, ktoré ďalej ovplyvňujú (modulujú) jej správanie – „vynucujú“ si fagocytózu, podporujú intracelulárne prežívanie a replikáciu alebo indukujú apoptózu. Shigella spp. používa T3SS pre vstup do bunky a ďalej spúšťa polymerizáciu aktínu, ktorý šigelu vyložene “vtlačí“ do vedľajšej bunky – týmto spôsobom sa potom baktéria šíri sliznicou a zároveň je krytá pred imunitným systémom3. Moderné molekulárne fylogenetické analýzy porovnávajúce príbuznosť štrukturálnych proteínov T3SS pomohli rozdeliť baktérie nesúce gény pre T3SS do siedmich rodín. Tieto analýzy tiež naznačujú, že T3SS je štruktúra odvodená od T3SS nachádzajúceho sa v bazálnom teliesku bakteriálnych bičíkov. Navyše sa potvrdilo, že jeden bakteriálny kmeň môže niesť gény pre viac druhov T3SS naraz4. Gény, kódujúce T3SS, sa vyvinuli ako relatívne konzervované genetické štruktúry a sú prenášané medzi mikroorganizmami mechanizmom horizontálneho prenosu genetickej informácie. Tieto gény sú spravidla organizované v rámci jedného lokusu buď na mobilnom ostrove patogenity, ktorý je súčasťou chromozómu alebo na plazmide5. Sekrečný systém typu IV (T4SS) vykazuje schopnosť spojiť sa až s membránou hostiteľskej bunky iných baktérií a umožňuje tak transport substrátov, a to vrátane DNA, čím sa podieľa na systéme konjugácie. Často ho baktérie využívajú k translokácii efektorových proteínov počas infekcie, čo vedie k narušeniu obranných stratégií bunky. Tento typ sekrečného systému využívajú napríklad Neisseria gonorrhoeae, Brucella spp. alebo Helicobacter pylori. Na podobnom mechanizme spojenia s „treťou membránou“ funguje aj sekrečný systém typu VI (T6SS). Intracelulárny patogén Legionella pneumophila využíva T4SS k translokácii proteínov, ktoré jej potom v hostiteľskej bunke umožnia vytvoriť si akúsi ochrannú vakuolu, ktorá jej pomáha v bunke „nerušene“ sa replikovať. Sekrečné systémy typu I, II a III nemajú schopnosť spojiť sa s „treťou membránou“ a ich funkcia tak spočíva najmä vo vylučovaní látok do vonkajšieho prostredia. Napríklad hemolyzíny uropatogénnej Escherichia coli (T1SS), cholera-toxín Vibrio cholerae (T2SS) či IgA-proteáza Neisseria gonorrhoeae (T5SS). Sekrečný systém typu VII (T7SS) sa nachádza u mykobaktérií a niektorých Gram-pozitívnych baktérií, avšak nie vždy musí mať účinok zvyšujúci virulenciu. Význam sekrečných systémov pre bakteriálne bunky spočíva v tom, že niektoré bakteriálne produkty, medzi nimi aj mnoho faktorov virulencie, musí byť najskôr transportovaných v rámci bakteriálnej bunky, aby mohli byť využité ďalej. O spôsobe transportu rozhoduje miesto ich určenia. Niektoré molekuly, napríklad adhezíny, zostávajú pripojené na povrchu baktérie, iné 50