เรื่องเต็ม การประชุมวิชาการชมรม คปว. อพ.สธ. ครั้งที่ ๙

571 Win, L.L. &Saing, K.M. (2008). Effectiveness of http://www.eattheweeds.com/Sargassum Myanmar brown seaweed (Sargassum spp.) http://www.eattheweeds.com/Sargassum-not-just- extract as organicfertilizer in pot trial of rice. for-breakfast-any-more-2/ GMSARN International Conference on http://www.facebook.com /public/พเิ ชษฐ จันทร Sustainable Development: Issuesand Prospects พรหม for the GMS, 1-4. การประชมุ วิชาการชมรมคณะปฏบิ ัติงานวทิ ยาการ อพ.สธ. คร้ังท่ี 9 “ทรัพยากรไทย : ชาวบานไทยไดป ระโยชน”

572 ประสทิ ธภิ าพของเทายายมอมในการยบั ย้ังเช้ือกอโรคในระบบทางเดินอาหารบางชนิด EFFICACY OF ARROWROOT FOR INHIBITING OF SOME GASTROINTESTINAL PATHOGENIC BACTERIA อรลัดา เจอื จนั ทร* และ พัชราภรณ แสงโยจารย Onladda Juajun* and Pacharaporn Sangyojarn คณะเกษตรศาสตรแ ละเทคโนโลยี มหาวิทยาลยั เทคโนโลยีราชมงคลอสี าน วิทยาเขตสรุ นิ ทร จงั หวัดสรุ นิ ทร 32000 Faculty of Agriculture and Technology, Rajamangala University of Technology Isan, Surin Campus, Surin 32000 บทคดั ยอ เทา ยายมอม (Tacca leontopetaloides (L.) Kuntze) เปนพชื พนื้ ถ่ินทถ่ี ูกนํามาใชเ ปน ตาํ รับยารักษาโรคแบบพน้ื บา นมานาน แลวในประเทศไทย ตัวอยางเทายายมอมในงานวิจัยน้ีเก็บจากมหาวิทยาลัยเทคโนโลยีราชมงคลอีสาน วิทยาเขตสุรินทร ระหวางเดือนธันวาคม 2560 ถึงเดือนมีนาคม 2561 โดยมีวัตถุประสงคเพ่ือศกึ ษาประสิทธภิ าพของสารสกัดหยาบจากสวนใบ กา น และเปลือกของหวั เทา ยายมอ มท่มี ีผลตอ การยับยงั้ แบคทเี รียกอโรคในระบบทางเดนิ อาหาร ไดแ ก แบคทีเรีย Escherichia coli TISTR074, Bacillus cereus TISTR1449, Pseudomonas aeruginosa TISTR1287 และ Staphylococcus aureus TISTR2329 โดยใชตัวทําละลายอะซิโตน เมทานอล เอทานอล 50 และ 95 เปอรเซ็นต พบวา การใชสารสกัดหยาบจากสว น เปลอื กของหัวเทายายมอมท่ีทําการสกัดดว ยเมทานอลทรี่ ะดับความเขมขน 500 มิลลกิ รมั ตอมลิ ลลิ ติ ร สามารถยับยั้งการเจรญิ ของแบคทีเรีย E. coli ไดดีท่ีสุด โดยมีขนาดเสนผานศูนยกลางของบริเวณใสหรือบริเวณยับย้ังมีคาเทากับ 10 มิลลิเมตร คา ต่ําสุดในการยับย้ังแบคทีเรีย (Minimum inhibitory concentration; MIC) และคาตํ่าสุดในการฆาแบคทีเรีย (Minimum bactericidal concentration; MBC) เทากับ 62.5 และมากกวา 500 มิลลิกรัมตอมิลลิลิตร ตามลําดับ และควรทําการ วเิ คราะหส ารชนดิ อ่ืน ๆ เพอ่ื การประยกุ ตใชตอไป Abstract Arrowroot (Tacca leontopetaloides (L.) Kuntze) is a native plant that has been used as a remedy in folk medicinal preparation for a long time in Thailand. The samples were collected in Rajamangala University of Technology Isan, Surin campus during December 2017 to March 2018. The objective of this research was to investigate the efficacy of crude extracts from leaves, stalks and tuber peels of arrowroot affecting the gastrointestinal pathogenic bacteria such as Escherichia coli TISTR074, Bacillus cereus TISTR1449, Pseudomonas aeruginosa TISTR1287 and Staphylococcus aureus TISTR2329 using solvents; acetone, methanol, ethanol 50 and 95%. The extracts of tuber peels of arrowroot with methanol at a concentration of 500 mg/ml processed the most potential antimicrobial activity against E. coli with the diameter of the clear zone or inhibitory area of 10 mm. The minimum inhibitory concentration (MIC) and the minimum bactericidal concentration (MBC) were 62.5 and > 500 mg/ml, respectively. The other substances should be analyzed for the further application. คาํ สาํ คญั : สารสกัดหยาบ, เทายายมอม, บริเวณใส, คาต่าํ สดุ ในการฆา แบคทีเรีย (MBC) Keywords: crude extracts, arrowroot, clear zone, Minimum bactericidal concentration (MBC) *ตดิ ตอนักวิจัย: อรลดั า เจือจันทร (อีเมล [email protected]) *Corresponding author: Onladda Juajun (E-mail: [email protected]) บทนาํ ออสเตรเลียเหนือ นิวกินี ซามัว ไมโครนีเซีย และฟจิมีการใช เทายายมอม (Tacca leontopetaloides L. Kuntze) พืชชนิดน้ีในการรักษาอาการปวดทอง ทองเสีย สามารถชว ย หยดุ อาการตกเลือดและเลอื ดออกในกระเพาะอาหารได สวน จัดอยูในวงศ Taccaceae เปนพืชพ้ืนถิ่นเขตรอน พบใน ของหัวเทา ยายมอ มมีแปงท่ีใชเปนอาหารทีส่ ําคัญของชาวหมู ประเทศแถบอัฟริกา เอเซียใต เอเซียตะวันตกเฉียงใต การประชมุ วชิ าการชมรมคณะปฏบิ ตั งิ านวิทยาการ อพ.สธ. ครง้ั ท่ี 9 “ทรพั ยากรไทย : ชาวบา นไทยไดป ระโยชน”

573 เกาะแปซิฟก (Habila et. al., 2011) แปงท่ีไดจากหัว Cuminum cyminum ใหผลในการยับย้ัง S. aureus ไดดี เทายายมอมใชรักษาโรคบิดและใชเปนอาหารของเด็กทารก ตามลําดับ สวนสารสกัดหยาบจาก P. granatum และ S. (Ukpabi et. al., 2009) ซาโปนินท่ีพบในสวนเปลอื กของหัว aromaticum มีประสิทธิภาพดีในการยับยั้งและทําลายเชื้อ เทายายมอมมีคาประมาณ 32.6 มิลลิกรัมตอกิโลกรัม มี ก อ โ ร ค S. aureus แ ล ะ P. aeruginosa โ ด ย มี ค า MIC ประโยชนในการชวยลดการเสีย่ งตอ การเกดิ มะเรง็ ยบั ย้งั การ ระหวาง 2.5-5.0 มิลลิกรัมตอมิลลิลิตร และมีคา MBC เกิดเนื้องอกและการกลายพันธุ (Radostits et. al., 1997) ร ะ ห ว า ง 5.0-10 มิ ล ลิ ก รั ม ต อ มิ ล ลิ ลิ ต ร แ ต เ ช้ื อ P. สารละลายที่ใชในการสกัดสารสกัดหยาบจากพืช มีหลาย aeruginosa มีคาความไวตอสารสกัดนอยมากและมีคา ชนิด ตัวอยางการใชสารละลายชนิดตางๆ ในการสกัดสาร MBC เทากับ 12.5 มิลลิกรัมตอมิลลลิ ิตร แสดงใหเห็นวาสาร สกัดหยาบจากพืช ไดแก Ahmad et. al. (1998) ไดศึกษา สกัดจากพืชมีศักยภาพในการปองกันเชื้อกอโรคในระบบ สารสกดั จากสมนุ ไพรพื้นบา นของประเทศอินเดียทําการสกัด ทางเดินอาหารได ซึ่งสามารถนํามาประยุกตใชในการถนอม สารสกัดหยาบโดยใชน้ํา เฮกเซนละแอลกอฮอลในการยับยง้ั อาหาร และสารสกัดที่ไดจากพืชกอใหเกิดผลดีตอสุขภาพ การเจริญของเช้ือจุลินทรีย ไดแก Bacillus subtilis ATCC มากกวา การใชส ารเคมใี นการเกบ็ รกั ษาอาหาร (Mostafa et. 6051, Proteus vulgaris ATCC 6380, Salmonella al., 2018) สวนขอมูลการใชสารสกัดหยาบจากสวนตางๆ typhimurium ATCC 23564, Pseudomonas ของเทายายมอมในการยับย้ังแบคทีเรียกอโรคในระบบ aeruginosa ATCC 25619, Escherichia coli K-12 ทางเดินอาหารยังมีคอนขางนอย ดังนั้นจุดประสงคของการ และ Staphylococcus aureus ที่ระดับความเขมขน 200 ทดลองครั้งน้ีเพื่อศึกษาประสิทธิภาพของการใชสารสกัด มิลลิกรัมตอมิลลิลิตร พบวามีสารสกัดหยาบจากพืชทดสอบ หยาบจากสวนใบ กาน และเปลือกของหัวเทายายมอมใน สามารถยับย้ังเชื้อจุลินทรียไดหลายชนิด และพบวามีพืช 5 การยับย้ังแบคทีเรียกอโรคในระบบทางเดินอาหาร ซ่ึง ชนิด ไดแก Emblica officinalis, Terminalia chebula, งานวิจัยนี้เปนงานสนองพระราชดําริในโครงการอนุรักษ Terminalia belerica, Plumbago zeylanica แ ล ะ พันธกุ รรมพชื อันเนอื่ งมาจากพระราชดํารฯิ Holarrhena antidysenterica สามารถยับยั้งแบคทีเรีย อุปกรณและวธิ ีการทดลอง ไดมากทสี่ ุด มีขนาดเสน ผานศูนยกลางของการยบั ย้ังมากกวา วัตถุดบิ 20 มิลลิเมตร ที่ทําการสกัดดวยแอลกอฮอล โดยสามารถ ยับย้ังเช้ือท่ีใชทดสอบไดดีกวาสารสกัดดวยนํ้าและเฮกเซน ใบ กาน และสวนเปลือกของหัวเทายายมอม 3 สาย Lozano et. al. (2013) ไดศึกษาสารสกัดจากพืชที่ทําการ พันธุ ไดแก พนั ธเุ ทา ยายมอ มสเี ขียวใบใหญ พนั ธุเทายายมอ ม สกัดดวยแอลกอฮอลจํานวน 50 ชนดิ โดยทดสอบการยับยง้ั สีเขียวใบเล็ก และพันธุเทายายมอมสีมวง เก็บตัวอยาง แบคทีเรียท่ีมักมีปญหาการติดเช้ือ ไดแก Escherichia coli, ระหวางเดือนธันวาคม 2560 ถึงมีนาคม 2561 ภายใน Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีราชมงคลอีสาน วิทยาเขตสุรินทร Pseudomonas aeruginosa และยีสตCandida albicans อาํ เภอเมือง จังหวัดสรุ ินทร โดยใชวิธีทดสอบการยับยั้งเช้ือแบบ disc diffusion พบวา แบคทเี รียที่ใชทดสอบ สารสกัดจากพืชจํานวน 44 ชนิด สามารถยับย้ังการเจริญ ของเชอื้ จลุ นิ ทรยี ไ ดม ากกวา หน่ึงชนิดท่รี ะดับความเขม ขน 35 งานวิจัยนี้ใชแบคทีเรียสําหรับทดสอบจากสถาบันวิจัย ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร สารสกัดจากพืชท่ีใชในการควบคุม วิทยาศาสตรแ ละเทคโนโลยีแหงประเทศไทยแบคทเี รยี แกรม โรคอาหารเปนพิษและเพื่อการเก็บรักษาอาหาร โดยการใช บวก (Gram-positive) ไดแ ก Bacillus cereus TISTR1449 สารสกัดหยาบจากพืช 5 ชนิดทําการสกัดดวยเอทานอล และ Staphylococcus aureus TISTR2329 และแบคทีเรยี ส า ม า ร ถ ยั บ ย้ั ง แ บ ค ที เ รี ย Bacillus cereus, แ ก ร ม ล บ (Gram-negative) ไ ด แ ก Pseudomonas Staphylococcus aureus, Escherichia coli, aeruginosa TISTR1287 และ Escherichai coli TISTR074 Pseudomonas aeruginosa แ ล ะ Salmonella typhi ศึกษาการใชสารสกัดหยาบจากใบ กาน และเปลือกของ ดว ยวธิ ี agar disc diffusion technique พบวาการสกดั สาร หัวเทายายมอมในการยับย้ังแบคทีเรียกอโรคในระบบ สกัดหยาบจากตัวอยางพืชดวยเอทานอลมี Punica ทางเดนิ อาหารบางชนดิ granatum, Syzygium aromaticum, Zingiber 1. การเตรียมผงตัวอยางจากสวนใบ กา น และเปลอื กของหัว officinales แ ล ะ Thymus vulgaris ส า ม า ร ถ ใ ห เทายายมอ ม โดยการนาํ สวนของใบ กาน และเปลือกของหวั ประสิทธิภาพในการยับย้ังเชื้อไดดีที่สุดที่ระดับความเขมขน เทายายมอมมาลางใหสะอาด ห่ันเปนช้ินเล็กๆ ทําการ 10 มิลลิกรัมตอมิลลิลิตร ขณะท่ีสารสกัดหยาบจาก อบแหงดวยเคร่ืองอบแหงทอ่ี ุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส นาน การประชุมวิชาการชมรมคณะปฏบิ ัติงานวิทยาการ อพ.สธ. คร้ังท่ี 9 “ทรพั ยากรไทย : ชาวบานไทยไดป ระโยชน”

574 24 ชั่วโมง แลวบรรจุลงในถุงพลาสติก เมื่อจะใชจึงนํา ศึกษาคาความเขมขนตํ่าสุดในการยับยั้งแบคทีเรีย โดยวิธี ตัวอยา งมาบดใหละเอยี ด Minimum inhibitory concentration (MIC) แ ล ะ 2. การเตรียมสารสกัดหยาบจากใบ กาน และเปลือกของหัว ความเขมขนตํ่าสุดในการฆาแบคทีเรีย Minimum เทายายมอม โดยทําการสกัดสารสกัดหยาบจากสวนใบ กาน bactericidal concentration (MBC) และเปลือกของหัวเทายายมอมดวยตัวทําละลาย 4 ชนิด 1. การเตรียมแบคทีเรีย B. cereus, E. coli, S. aureus และ ไดแ ก เอทานอล 50 และ 95 เปอรเ ซน็ ต เมทานอล และอะซิ P. aeruginosa ทําการเขี่ยเชื้อทดสอบ 4-5 โคโลนี ลงใน โตน โดยชั่งผงจากสวนใบ กาน และเปลือกของหัว อาหารเหลว NB แลวเขยาเพื่อใหเช้ือกระจายในหลอด เทายายมอ มอยางละ 10 กรัม ผสมกับสารละลายแตละชนดิ ทดสอบ บม ทอ่ี ุณหภมู ิ 37 องศาเซลเซยี ส นานประมาณ 3-4 90 มิลลิลิตร (อัตราสวน 1 : 10 หรือความเขมขน 100 ชั่วโมง เจือจางดวยอาหารเล้ียงเชื้อเหลว NB แลวนํามานับ มิลลิกรัมตอมลิ ลลิ ิตร) เขยาในที่มดื โดยใชเครือ่ งเขยา ที่ 200 จํานวนเซลลดวย haemacytometer (ใหมีจํานวนเซลล รอบตอนาที นาน 24 ชั่วโมง นําสารสกัดมากรองเอากาก ประมาณ 105-107 เซลลตอมิลลิลิตร) หรือใชวิธีวัดคา OD ออกดวยกระดาษกรอง ถามีตะกอนละเอียดใหนําไปหมุน 600 ใหม ีคา การดูดกลนื คลน่ื แสงเทา กับ 0.1 เหวี่ยงดวยความเร็วรอบ 3000 รอบตอนาที นาน 15 นาที 2. การศึกษาความไวของแบคทีเรียตอสารสกัดหยาบจาก นําสวนใสไประเหยดวยเครื่อง rotary evaporator ท่ี จากใบ กาน และเปลือกของหัวเทายายมอม โดยวิธี Macro อณุ หภูมิ 60 องศาเซลเซียส เมื่อสารละลายระเหยออกไปจน broth dilution technique โดยการใชปเปตดูดอาหารเลยี้ ง เหลือปริมาตร 10 มิลลิลิตร จะไดความเขมขนสุดทายของ เช้ือเหลว ใสลงในหลอดที่ 1-12 หลอดละ 1 มิลลิลิตร ดูด สารสกัดหยาบเปน 1000 มิลลิกรัมตอมิลลิลิตร (เตรียมสาร สารสกดั หยาบจากสวนตางๆ ที่มีความเขมขน 500 มลิ ลิกรมั สกัดหยาบใหมีความเขมขนเปน 100, 200, 300, 400 และ ตอมิลลิลติ ร ใสลงในหลอดท่ี 1 และ 2 หลอดละ 1 มิลลลิ ิตร 500 มิลลิกรัมตอมิลลิลิตร) แลวเก็บในขวดสีชาท่ีอุณหภูมิ 4 ผสมสารแตละหลอดใหเขากัน ดูดสารในหลอดท่ี 2 จํานวน องศาเซลเซียส จนกวาจะทดลอง (ดัดแปลงจาก Abdullah 1 มิลลิลิตร ใสลงในหลอดที่ 3 ไปจนถึงหลอดที่ 11 ผสมให et. al., 2011) เขากันไดดีแลว ดูดสารละลายทิ้งไป 1 มิลลิลิตร หลอดท่ี 12 3. การทดสอบประสิทธิภาพของสารสกัดหยาบจากจากใบ จะมีแตอาหารเลี้ยงเช้ือเพียงอยางเดียวไมมีสารสกัดหยาบ กาน และเปลือกของหัวเทายายมอม โดยการเปรียบเทียบ จึงใชเปน positive control (สําหรับความเขมขนของสาร ฤทธ์กิ ารตา นแบคทเี รยี B. cereus, E. coli, S. aureus และ สกัดหยาบจากหลอดที่ 1-11 มีลําดับความเขมขนเปน 500, P. aeroginosa โดยวิธี Disc Diffusion ทําการเพาะเลี้ยง 250, 125, 62.5, 31.25, 15.63, 7.82, 3.91 แ ล ะ 1.96 แ บ ค ที เ รี ย B. cereus, E. coli, S. aureus แ ล ะ P. มิลลิกรมั ตอ มิลลลิ ติ ร ตามลาํ ดบั ) เติมเช้ือจุลินทรยี ท เ่ี ตรยี มไว aeruginosa ในหลอดทดสอบท่บี รรจุอาหารเหลว Nutrient ลงไปทุกหลอดๆ ละ 1 มิลลิลิตร นําไปบมท่ีอุณหภูมิ 37 broth (NB) จํานวน 4 หลอด บมที่อุณหภูมิ 37 องศา องศาเซลเซียส นาน 16-18 ชว่ั โมง เซลเซียส เปนเวลา 24 ชั่วโมง เจือจางแบคทีเรียที่เล้ียงใน การอา นคา Minimum inhibitory concentration อาหารเหลวใหไดระดับความเจือจาง 10-2 เทา ปเปตเช้ือท้ัง (MIC) 4 ชนิด อยางละ 0.1 มิลลิลิตร เล้ียงบนอาหาร NA โดยการ spread plate นํ า ส า ร ส กั ด ที่ ก ร อ งด ว ย syringe filter เมื่อบมเช้ือจนครบ 16-18 ชั่วโมง ใหสังเกตหลอดสุดทาย ปราศจากเชื้อ หยดลงบนกระดาษกรองรูปวงกลมปราศจาก ที่ไมมีเช้ือจุลินทรียเจริญหรืออาหารเล้ียงเช้ือในหลอดไมขุน เชื้อขนาดเสนผานศูนยกลาง 5 มิลลิเมตร ครั้งละ 20 อานปริมาณของสารทดสอบของหลอดนี้เปนคา MIC บันทึก ไมโครลิตร รอใหแผนกระดาษตาปลาแหงและทําซํ้าอีก 2 หนว ยเปนมลิ ลกิ รมั ตอมิลลลิ ิตร คร้ัง วางแผนกระดาษตาปลาที่ความเขมขนของสารสกัด การอานคา Minimum bactericidal concentration ตางๆ ลงบนจานเพาะเช้ือ ใชยาปฏิชีวนะเพนนิซิลนิ แอมพิซิ (MBC) ลิน และอะมอกซิซิลิน ปริมาณละ 10 ไมโครกรัม เปนตัว ควบคุม (positive control) ทุกตัวอยางทดลองอยางละ 3 จากคาความเขมขนตํ่าสุดท่ีไมมีเชื้อจุลินทรียเจริญใน ซ้ํา นําไปบมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 24 อาหารเหลว (MIC) นํามาหาคา MBC โดยการนําหลอด ช่ัวโมง วัดขนาดเสนผานศูนยกลางของบริเวณใส (clear อาหารเลี้ยงเชื้อที่ทําการทดสอบคา MIC ท่ีไมมีความขุนของ zone) บันทึกผลการทดลอง นําคาท่ีมากท่ีสุดไปทดสอบใน ทุกหลอดไปเล้ียงเชื้อโดยวิธี spread plate บนอาหาร ขัน้ ตอนตอไป Nutrient agar ถาที่ระดับความเขมขนของสารสกัดท่ี สามารถฆาเช้ือจุลินทรียได จะไมพบการเจริญของ การประชุมวิชาการชมรมคณะปฏบิ ัตงิ านวิทยาการ อพ.สธ. ครงั้ ท่ี 9 “ทรัพยากรไทย : ชาวบานไทยไดป ระโยชน”

575 เชื้อจุลินทรียบนอาหารเลี้ยงเชื้อ อานคาความเขมขนที่ตํ่า ท่ีสุดท่ีสามารถฆาเชื้อจุลินทรียไดเปนคา MBC บันทึกหนวย เปนมลิ ลิกรมั ตอ มิลลลิ ติ ร กข ค ภาพท่ี 1 ลักษณะใบเทา ยายมอม ก.) พันธสุ ีมว ง ข.) พันธุส ีเขยี วใบเลก็ ค.) พันธุส ีเขียวใบใหญ กข ค ง จ ภาพท่ี 2 ลักษณะเทายายมอม ก.) กา นพนั ธสุ มี ว ง ข.) กา นพันธสุ เี ขียวใบเลก็ ค.) กา นพนั ธสุ ีเขยี วใบใหญ ง.) หัวเทา ยายมอ ม จ.) เปลอื กจากหวั เทา ยายมอ ม ผลและวจิ ารณผลการทดลอง เปลือกของหัวเทายายมอมท่ีไดทําการสกัดดวยตัวทํา 1. ผลการทดสอบประสิทธิภาพของสารสกัดหยาบจากใบ ละลาย 4 ชนิด ไดแก เอทานอล 50 และ 95 เปอรเซน็ ต เม กาน และเปลือกของหัวเทายายมอมในการยับย้ังเชื้อ E. ทานอล และอะซิโตน ทดสอบประสิทธิภาพในการยับยั้ง coli, B. cereus, S. aureus และ P. aeruginosa โดยวิธี เชื้อ E. coli, B. cereus, S. aureus และ P. aeruginosa Disc Diffusion โดยวิธี Disc Diffusion พบวาสารสกัดหยาบจากใบ กาน และเปลือกของหัวเทายายมอม สามารถยับย้ังการเจริญ จากการศึกษาการใชสารสกัดหยาบจากใบ กาน และ ของแบคทีเรียไดแตกตางกัน โดยเปรียบเทียบจากขนาด เปลือกของหัวเทายายมอมในการยับย้ังแบคทีเรีย โดยเก็บ เสนผานศนู ยกลางของบรเิ วณใสของการยับยง้ั (ตารางท่ี 1) ตวั อยางจากภายในมหาวทิ ยาลยั เทคโนโลยรี าชมงคลอีสาน วิทยาเขตสุรินทร โดยการนําผงตัวอยางจากใบ กาน และ การประชุมวชิ าการชมรมคณะปฏบิ ตั ิงานวทิ ยาการ อพ.สธ. ครั้งท่ี 9 “ทรพั ยากรไทย : ชาวบา นไทยไดป ระโยชน”

576 ตารางที่ 1 ประสิทธภิ าพของสารสกัดหยาบจากเทา ยายมอ มในการยบั ยั้งแบคทีเรยี สารสกดั หยาบ ชนดิ ของแบคทเี รียทถ่ี กู ยับยั้งมากท่ีสุด สารละลาย ขนาดบรเิ วณใส (มม.) ใบเทายายมอ มสเี ขียวใบเล็ก E. coli เอทานอล 50% 9 9 ใบเทายายมอมสเี ขียวใบใหญ B. cereus เอทานอล 50% 8 ใบเทา ยายมอมสีมวง E. coli, B. cereus เอทานอล 50% 8 กานเทายายมอ มสเี ขยี วใบเล็ก E. coli, P. aeruginosa เอทานอล 95% 9 กานเทายายมอมสีเขียวใบใหญ B. cereus เอทานอล 50% 7 กา นเทา ยายมอ มสมี ว ง E. coli, B. cereus, เอทานอล 50% S. aureus, P. aeruginosa 10 เปลอื กของหัวเทายายมอม E. coli เมทานอล หมายเหต:ุ สารสกดั หยาบจากเทา ยายมอ มเขมขน 500 มลิ ลิกรมั ตอมลิ ลลิ ติ ร จากผลการทดลองนี้จะเห็นไดวาสารสกดั หยาบทไ่ี ดจาก ยับย้ังแบคทีเรียของสารสกัดหยาบจากเทายายมอมดวยวิธี ใบและกานของเทายายมอมสกัดดวยเอทานอล 50 Disc diffusion เปนการตรวจสอบเบือ้ งตน จงึ ไดนําสารสกัด เปอรเซ็นต ใหผลในการยับยั้งแบคทีเรียที่ใชทดสอบไดดี หยาบไปทดสอบความเขมขนต่ําสุดในการยับยั้งแบคทีเรีย แตกตางกันในเชื้อแตละสายพันธุ ซ่ึงมีขนาดเสนผาน (Minimum inhibitory concentration; MIC) แ ล ะ ค ว า ม ศูนยกลางของบริเวณใสอยูในชวง 7-9 มิลลิเมตร แตพบวา เขมขนต่ําสุดในการฆาแบคทีเรีย (Minimum bactericidal สารสกัดหยาบจากสวนเปลอื กของหวั เทา ยายมอมทสี่ กดั ดวย concentration; MBC) ข้นั ตอนตอ ไป เมทานอลท่ีระดับความเขมขน 500 มิลลิกรัมตอมิลลิลิตร 2. ผลของความเขมขนต่ําสุดในการยับย้ังเช้ือ (MIC) และ สามารถยับย้ังการเจริญของเช้ือ E. coli ไดดีกวาแบคทีเรีย ความเขมขนตา่ํ สุดในการฆาแบคทเี รีย (MBC) ชนิดอ่ืน โดยวัดขนาดเสนผานศูนยกลางของบริเวณใสได เทากับ 10 มิลลิเมตร และสามารถยับย้ังแบคทีเรียไดดีท่ีสุด จากการทดสอบสารสกัดหยาบจากสวนตางๆ ของ เมื่อเทียบกับสารสกัดหยาบจากเทายายมอมสวนอื่น ซึ่ง เ ท า ย า ย ม อ ม ที่ ผ า น ก า ร ท ด ส อ บ เ บื้ อ ง ต น ใ น ก า ร ยั บ ย้ั ง สอดคลองกับการทดลองของ Vu et al. (2018) ที่พบวา สาร แบคทีเรียดวยวิธี Disc diffusion โดยคัดเลือกจากผลของ สกัดจากสวนเปลือกของหัวเทายายมอมท่ีทําการสกัดดวยเม การยับย้ังแบคทีเรียบนจานอาหารแข็งที่ใหขนาดเสนผาน ทานอล ท่ีระดับความเขมขน 250 มิลลิกรัมตอมิลลิลิตร ใช ศูนยกลางของบริเวณใสของการยับยั้งสูงที่สุดคือ สารสกัด วิธีทดสอบแบบ agar well diffusion มีขนาดเสนผาน หยาบจากสวนเปลือกของหัวเทายายมอมที่สกัดดวยเมทา ศูนยกลางของการยับยั้งเทากับ 8 มิลลิเมตร สามารถยับยั้ง นอล โดยสามารถยับย้ังการเจริญของ E. coli ไดดีท่ีสุด การเจรญิ เติบโตไดทงั้ แบคทเี รยี นแกรมบวก ไดแกS . aureus ทดสอบคาความเขมขนต่ําสุดในการยับยั้งแบคทีเรีย (MIC) และ Enterococcus faecalis และแบคทีเรียแกรมลบ โดยการเจือจางระดับความเขมขนของสารสกัดหยาบจาก ไดแก E. coli และ P. aeruginosa นอกจากน้ียังพบวา สาร เปลือกของหัวทายายมอมเปน 500, 250, 125, 62.50, สกัดหยาบจากสวนใบของเทายายมอมไมสามารถยับย้ังการ 31.25, 15.63, 7.82, 3.91 และ 1.96 มิลลิกรัมตอมิลลิลิตร เจริญของแบคทีเรียท่ีใชทดสอบได ซ่ึงสอดคลองกับการ และทดสอบหาคาความเขมขนตํ่าสุดในการฆาแบคทีเรีย ทดลองน้ีที่พบวาสารสกัดหยาบจากใบของเทายายมอมสี พบวา สารสกัดหยาบจากสวนเปลือกของหัวเทายายมอมท่ี เขียวใบเล็กไมสามารถยบั ยั้งการเจริญของแบคทีเรยี ทุกชนิด คัดเลอื กสามารถยบั ยั้งการเจริญของแบคทีเรยี ทใ่ี ชทดสอบได ท่ีทําการทดสอบเชนกัน แตที่แตกตางจากการทดสอบของ Vu et. al. (2018) คอื สารสกดั หยาบจากสว นเปลอื กของหวั ตารางที่ 2 ความเขมขนต่ําสุดในการยับยั้งเชื้อ (MIC) และ เทายายมอมที่สกัดดวยเมทานอลสามารถยับย้ังเช้ือ S. ความเขมขนต่ําสุดในการฆาแบคทีเรีย (MBC) E. coli ของ aureus ไดดีกวาเชื้อ E. coli จะเห็นไดวา การใชแอลกอฮอล สารสกัดหยาบจากเปลือกของหัวเทายายมอมที่สกัดดวยเม ในการสกัดสารสกดั หยาบจากเทา ยายมอมใหผ ลดีกวาการใช ทานอล สารละลายอะซิโตน เชนเดียวกับงานวิจัยของ Ahmad et. al. (1998) ที่พบวาการใชแอลกอฮอลในการสกัดสารสกัด ระดบั ความเขมขน ของสาร MIC MBC หยาบจากพืชตัวอยางสามารถยบั ย้ังเชื้อท่ีใชทดสอบไดดกี วา สกัดหยาบ(มก./มล.) สารสกดั ดวยน้าํ และเฮกเซน ในการทดสอบประสทิ ธภิ าพการ 500 - + 250 - + 125 - + การประชมุ วิชาการชมรมคณะปฏบิ ัตงิ านวทิ ยาการ อพ.สธ. ครั้งที่ 9 “ทรพั ยากรไทย : ชาวบานไทยไดป ระโยชน”

577 ระดับความเขม ขน ของสาร MIC MBC เอกสารอางองิ สกดั หยาบ(มก./มล.) Ahmad, I., Mehmood, Z. and Mohammad, F. 1998. 62.50 - + Screening of some Indian medicinal plants for 31.25 + + their antimicrobial properties. Journal of 15.63 + + Ethnopharmacology. 7.82 + + 62(2): 183-193. 3.91 + + Habila, J.D., Bello, I.A., Dzikwe, A.A., Ladan, Z., and 1.96 + + Sabiu, M. 2011. Comparative evaluation of หมายเหต:ุ - ไมพบการเจริญของแบคทเี รีย, + พบการเจริญของ phytochemicals, antioxidant and antimicrobial แบคทเี รีย activity of four medicinal plants native to northern Nigeria. Australian Journal of Basic จากตารางท่ี 2 แสดงผลของการทดสอบความเขมขน and Applied Sciences. 5(5): 537-543. ต่ําสุดในการยับยั้งเชื้อ (MIC) และความเขมขนต่ําสุดในการ Lozano, C.M., Vasquez-Tineo, M.A., Ramirez, M. and ฆาแบคทีเรีย (MBC) ของสารสกัดหยาบจากเปลือกของหัว Jimenez, F. 2013. In vitro antimicrobial activity เทายายมอมท่ีสกัดดวยเมทานอลตอแบคทีเรีย E. coli screening of tropical medicinal plants used in พบวาคา MIC ของแบคทีเรีย E. coli เทากับ 62.5 มิลลิกรมั Santo Domingo, Dominican Republic. Part I. ตอมิลลิลิตร ซึ่งเปนระดับความเขมขนของสารสกัดหยาบท่ี Pharmacognosy Communications. 3(2): 64- ไมพบการเจริญของแบคทีเรีย E. coli แตที่ระดับความ 69. เขมขน 31.25, 15.63, 7.82, 3.91 และ 1.96 มิลลิกรัมตอ Mostafa, A.A., Al-Askar, A.A., Almaary, K.S., Dawoud, มิลลิลิตร พบวา มีการเจริญของแบคทีเรียดังกลาว และ T.M. and Sholkamy, E.N., Bakri, M.M. 2018. พบวาคา MBC ของแบคทีเรีย E. coli มีคามากกวา 500 Antimicrobial activity of some plant extracts มิลลิกรมั ตอมลิ ลิลติ ร จงึ จะสามารถฆาแบคทีเรยี E. coli ได against bacterial strains causing food poisoning diseases. Saudi Journal of สรุปผลการทดลอง Biological Sciences. 25: 361-366. การใชสารสกัดหยาบจากใบ กาน และเปลือกของหัว Radostits, O.M., Blood, D.C. and Gay, C.C. 1997. Veterinary Medicine: A Textbook of the เทายายมอมในการยับย้ังแบคทีเรียที่สกัดดวยตัวทําละลาย diseases of cattle, sheep, pigs, goats and ตางชนิดกัน สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของแบคทีเรีย E. horses. 8th edition, W.B. Saunders, London, coli, S. aureus, B. cereus แ ล ะ P. aeruginosa ไ ด England, pp. 207-278. โดยสารสกัดหยาบจากสวนเปลือกของหวั เทายายมอมทส่ี กดั Ukpabi, U.J., Ukenye, E. and Olojede, A.O. 2009. ดวยเมทานอล สามารถยับยั้งการเจริญของเชื้อ E. coli ได Raw-material potentials of Nigerian wild ดีกวาสารสกัดหยาบจากสวนกานและใบของเทายายมอมที่ polynesian arrowroot (Tacca ใชทดสอบ สวนการนําไปใชประโยชนอ่ืน ควรทําการศึกษา leontopetaloides) tubers and starch. Journal สารทเ่ี ปนองคป ระกอบในสวนตา งๆ ของเทายายมอมตอ ไป of Food Technology. 7: 135-138. Vu, Q.T.H., Le, P.T.K., Vo, H.P.H., Nguyen, T.T., and คาํ ขอบคุณ Nguyen, T.K.M. 2017. Characteristics of Tacca โ ค ร ง ก า ร วิ จั ย น้ี ไ ด รั บ ก า ร ส นั บ ส นุ น แ ห ล ง ทุ น จ า ก leontopetaloides L. Kuntze collected from An Giang in Vietnam. International โครงการอนุรักษพันธุกรรมพืชอันเนื่องมาจากพระราชดําริฯ Conference on Chemical Engineering, Food และไดรับความเอ้ือเฟอสถานที่และอุปกรณตลอดจน and Biotechnology (ICCFB2017) doi: เครื่องมือตางๆ ในการทํางานวิจัยนี้จากมหาวิทยาลัย 10.1063/1.5000190 เทคโนโลยีราชมงคลอีสาน วิทยาเขตสุรินทร คณะผูวิจัยจึง ขอขอบคณุ มา ณ โอกาสน้ี การประชมุ วิชาการชมรมคณะปฏบิ ัตงิ านวทิ ยาการ อพ.สธ. ครั้งท่ี 9 “ทรัพยากรไทย : ชาวบานไทยไดป ระโยชน”

578 การสํารวจความหลากหลายของแบคทเี รียในดนิ ปาสาธารณะ บรเิ วณตาํ บลนาสนี วน อาํ เภอกันทรวิชัย จังหวัดมหาสารคาม A SURVEY OF BACTERIAL DIVERSITY IN PUBLIC FOREST SOIL AT NA SI NUAN SUBDISTRICT, KANTARAWICHAI DISTRICT, MAHA SARAKHAM PROVINCE กรรณิการ ชเู กียรติวฒั นา* และ ฒาลศิ า ยวุ อมรพทิ กั ษ Kannika Chookietwattana* and Thalisa Yuwa-amornpitak ภาควชิ าเทคโนโลยีชวี ภาพ คณะเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยมหาสารคาม อ. กันทรวชิ ัย จ. มหาสารคาม 44150 Biotechnology, Faculty of Technology, Mahasarakham University, Kantarawichai, Maha Sarakham 44150 บทคัดยอ งานวิจัยนี้เปนการสํารวจความหลากหลายของแบคทีเรียในดินปาสาธารณะบริเวณตําบลนาสีนวน อําเภอกันทรวิชัย จังหวัด มหาสารคาม เก็บตัวอยางดิน 3 คร้ังตามฤดูกาลคือ รอน ฝน และหนาว แยกแบคทีเรียจากตัวอยางดินดวยอาหาร halobacteria medium ที่มีปริมาณเกลอื NaCl 0 3 และ 6% เลือกเกบ็ ทุกโคโลนีที่มีลกั ษณะแตกตา งกัน นําไปทําใหไดเช้อื บริสุทธิ์ ศึกษาคุณสมบัติของแตละไอโซเลทดานการติดสีแกรมและการเจริญที่ความเค็ม pH และอุณหภูมิตาง ๆ สายพันธุ แบคทเี รยี ทั้งหมดที่แยกไดจากตัวอยา งดินมจี ํานวน 56 ไอโซเลท แบคทเี รียสว นใหญเปนพวกแกรมบวก มรี ะดับความเค็มของ เกลือ NaCl ท่ีเหมาะสมตอการเจริญคือ 0% และมีชวงระดับความเค็มของเกลือ NaCl ท่ีสามารถเจริญไดคือ 0-3% pH ท่ี เหมาะสมตอการเจริญและชวง pH ท่ีสามารถเจริญไดของแบคทีเรียสวนใหญคือ 7 และ 5-9 ตามลําดับ สําหรับอุณหภูมิท่ี เหมาะสมตอการเจริญและชวงอุณหภูมิท่ีสามารถเจริญไดของแบคทีเรียสวนใหญคือ 37 °C และ 25-50 °C ตามลําดับ แบคทเี รยี เหลา นม้ี ศี ักยภาพสงู ในการนําไปใชป ระโยชนท างเทคโนโลยชี ีวภาพ เนื่องจากมชี ว ง pH และอุณหภมู ิที่สามารถเจรญิ ไดคอ นขา งกวา ง Abstract This research is a survey of bacterial diversity in a public forest soil at Na Si Nuan Subdistric, Kantarawichai District, Maha Sarakham Province. Soil samples were collected 3 times in hot, rainy, and winter seasons. Bacteria were isolated from soil samples using halobacteria medium containing NaCl at 0, 3, and 6%. All colonies with different morphologies were picked up and obtained for pure cultures. Characteristics of bacterial isolates in Gram staining and ability to grow in various salinities, pH and temperatures were determined. The 56 bacterial isolates were isolated from soil samples. Most bacterial isolates were Gram- positive bacteria. An optimum and range of salinity (NaCl) level for growth of most bacterial isolates were 0% and 0-3%, respectively. An optimum and range of pH for growth of most bacterial isolates were pH 7 and 5-9, respectively. An optimum and range of temperature for growth of most bacterial isolates were 37 °C and 25-50 °C, respectively. All bacterial isolates provide a high potential in biotechnological applications due to their abilities to grow in a wide range of pH and temperatures. คําสําคัญ: จลุ ินทรียสรางสารส,ี สารสี, การสกดั Keywords: pigment producing microorganism, pigment, extraction *ตดิ ตอ นักวิจัย: กรรณิการ ชเู กยี รติวัฒนา (อเี มล [email protected]) *Corresponding author: Kannika Chookietwattana (E-mail: [email protected]) บทนํา ท่ีดินเค็มสวนใหญเปนแบคทีเรียทนเค็มและแบคทีเรียชอบ ความเค็มของดินเปนหน่ึงในปญหาที่สําคัญท่ีสุดที่มีผล เ จ ริ ญ ใ น ท่ี เ ค็ ม (Ramos-Cormenzana, 1993) นั ก จุ ล - ชวี วิทยาหลายทานไดก ําหนดเกณฑใ นการแบงกลมุ แบคทเี รยี ตอการเจรญิ เตบิ โตของพืชและระบบนิเวศของพื้นท่ีแหงแลง ที่เจริญในท่ีเค็ม แตเกณฑท่ีไดรับการยอมรับมากที่สุดคือ และก่ึงแหงแลง (Chhabra, 1996) แบคทีเรียท่ีพบในพื้น การประชุมวิชาการชมรมคณะปฏบิ ตั ิงานวิทยาการ อพ.สธ. คร้งั ที่ 9 “ทรัพยากรไทย : ชาวบานไทยไดป ระโยชน”

579 เกณฑท่ีเสนอโดย Kushner (1985) ซ่ึงแบงกลุมของจุลินทรยี  ปาสาธารณะบริเวณตําบลนาสีนวน อําเภอกันทรวิชัย ตามระดับเกลือ NaCl ท่ีเจริญไดดีท่ีสุดเปน 5 กลุม คือ (1) จังหวัดมหาสารคาม มีเนื้อที่ 120 ไร แบงออกเปนแปลงเก็บ จุลินทรียไมชอบเค็ม (non-halophile) เจริญไดดีที่สุดใน ตัวอยางดิน 14 แปลง (ภาพที่ 1) ตามฤดูกาลคือ รอน (6 อาหารที่ไมมีเกลือหรือมีเกลือ NaCl <0.2 M (∼1%) (2) พฤษภาคม 2560) ฝน (27 กันยายน 2560) และหนาว (6 จุลินทรียชอบเค็มระดับต่ํา (slight halophiles) เจริญไดดี กุมภาพันธ 2561) ในแตล ะแปลงทาํ การเก็บตัวอยางดินแบบ ที่สุดในอาหารที่มีเกลือ NaCl 0.2-0.5 M (∼1-3%) (3) สุม 3 หลุม ในลักษณะสามเหล่ียมดานเทาที่ระดับความลึก จุลนิ ทรียชอบเคม็ ระดับปานกลาง (moderate halophiles) จากผิวดิน 30 เซนติเมตร โดยใช hand auger แตละหลุม เจริญไดดีท่ีสุดใน อาหารที่มีเกลือ NaCl 0.5-2.5 M (∼3- หางกันประมาณ 10 เมตร นําตัวอยางดินจากแตละแปลงที่ 15%) (4) จุลินทรียชอบความเค็มระดับคอนขางสูง สุมเก็บ 3 หลุม ผสมใหเขากันดีและใชเปนตัวแทนตัวอยาง (borderline extreme halophiles) เ จ ริ ญ ไ ด ดี ที่ สุ ด ใน ดินของแตละแปลง อาหารท่ีมีเกลือ NaCl 1.5-4.0 M (∼9-23%) (5) จุลินทรีย 2. การวิเคราะหตวั อยา งดินทางจลุ ชวี วิทยา ชอบความเค็มระดับสูง (extreme halophiles) เจริญไดดี ในอาหารท่ีมีเกลือ NaCl 2.5-5.2 M (∼15-32%) สําหรับ ภายในเวลา 24 ช่ัวโมงหลังจากเก็บตัวอยางดิน ทําการ จุลินทรียท่ีเจริญไดดีที่สุดในอาหารที่ไมมีเกลือหรือมีเกลือ แยกแบคทีเรียจากตวั อยางดินดว ยเทคนิคเกล่ียเช้ือ (spread NaCl <0.2 M และสามารถเจรญิ ไดในอาหารที่มีเกลอื NaCl plate technique) โดยใชอาหาร halo-bacteria medium สูงกวา 0.2 M ดว ย เรียกวา จุลินทรียท นเคม็ (halotolerant) (Atlas, 1997) ที่มีความเค็มจากเกลือ NaCl 0 3 และ 6% ในระบบนิเวศปาไม แบคทีเรียเปนกลุมจุลินทรียท่ีมีบทบาท สําหรับการแยกเชื้อแบคทีเรียกลุม non-halophiles, slight สําคัญย่ิง เพราะเปนจุลินทรียกลุมหลักท่ีมีบทบาทสําคัญใน halophiles และmoderate halo-philes ตามลําดับ บม การหมุนเวียนของคารบอน ไนโตรเจน และฟอสฟอรัส จานเพาะเชื้อท่ีอุณหภูมิ 37°C เปนเวลา 48 ช่ัวโมง ตรวจดู บทบาทเหลานี้เกิดขึ้นจากการท่ีแบคทีเรียมีเอนไซมท่ี และจดบันทึกลักษณะปรากฏท่ีแตกตางกันของแตละโคโลนี หลากหลาย ซ่ึงเอ้ือประโยชนตอส่ิงมีชีวิตตางๆ ในปา ไมวา หลังจากน้ันจึงคัดเลือกเชื้อท่ีมีลักษณะโคโลนีแตกตางกันไป จะเปนพชื หรือสัตว (Lladó et. al., 2017) มหาสารคามเปน ทาํ ใหบรสิ ุทธ์ิ และใชในการ ศึกษาความสามารถในการเจริญ จังหวัดท่ีประสบปญหาดินเค็มกระจายอยูทุกอําเภอ (นเรศ ที่ความเค็มของเกลือ NaCl ตางๆ (0 3 8 15 20 25 และ สัตยารักษ และคณะ, 2542) แตดินบริเวณปาชุมชนที่ตําบล 32%) ที่ pH ตางๆ (pH 4 5 7 9 และ 11) และท่ีอุณหภูมิ นาสนี วน อําเภอกนั ทรวิชัย จงั หวัดมหาสารคาม ซึง่ เปนพืน้ ที่ ตางๆ (10 25 35 45 และ 50°C) ดว ยอาหาร halobacteria ศึกษาน้ันเปนดินที่ไมมีปญหาความเค็ม เนื่องจากปาไมชวย medium ทม่ี กี ารเตมิ เกลอื NaCl หรือปรบั pH หรอื อุณหภูมิ ควบคุมไมใหความเค็มของชั้นหินเกลือแพรกระจายสูดินช้ัน ในการบมเชื้อตามแตละวัตถุประสงคของการศึกษา การ บน การที่แบคทีเรียในดินมีอันตรกิริยากับส่ิงมีชีวิตตางๆ ใน ตรวจสอบความสามารถในการเจรญิ อาศัยการวดั คาความขุน ปาไม องคความรูดานความหลากหลายของแบคทีเรียในดิน เซลล (optical density) ท่ีความยาวคล่ืน 600 นาโนเมตร จึงเปนขอมูลที่จําเปนอยางยิ่งสําหรับการจัดการพื้นที่ปา และคาความขนุ เซลลที่ต่าํ กวา 0.05 ถอื วา เช้อื ไมมีการเจริญ ชุมชนใหส ามารถยงั ประโยชนไดอยางย่ังยนื ภาพที่ 1 แปลงเกบ็ ตวั อยางดนิ ของพ้ืนทศี่ กึ ษา การวิจัยนม้ี ีวัตถปุ ระสงคเ พ่อื สาํ รวจความหลากหลายของ แบคทีเรียในดินบริเวณปาชุมชนท่ีตําบลนาสีนวน อําเภอ กันทรวิชัย จังหวัดมหาสารคาม และเพื่อแยกสาย-พันธุ แบคทีเรียทนเค็มหรือแบคทีเรียชอบเจริญในท่ีเค็มสาํ หรับใช เปนแหลงพันธุกรรมในการศึกษาแนวทางการนําไปใช ประโยชนทางเทคโนโลยชี ีวภาพตอไปในอนาคต “งานวิจัยน้ี เปนงานสนองพระราชดําริในโครงการอนุรักษพันธุกรรมพืช อันเนื่องมาจากพระราชดําริฯ” อปุ กรณและวิธีการทดลอง 1. การเกบ็ ตัวอยา งดิน การประชมุ วชิ าการชมรมคณะปฏบิ ตั ิงานวทิ ยาการ อพ.สธ. ครงั้ ที่ 9 “ทรพั ยากรไทย : ชาวบา นไทยไดป ระโยชน”

580 3. การเก็บรักษาสายพันธุเชอื้ จลุ นิ ทรีย โดยเก็บรกั ษาไวใ น เค็มน้ันสอดคลองกับการศึกษาของ Rodriguez-Valera et. กลเี ซอรอลเหลวท่ีอุณหภมู ิ -20°C al. (1981) Quesada, et. al. (1982) และ Zahran et. al. ผลและวิจารณผลการทดลอง (1992) 1. การศกึ ษาความหลากหลายของแบคทีเรยี ในดนิ จากการเก็บตัวอยางดินจากบริเวณพ้ืนท่ีปาสาธารณะ ตําบลนาสนี วน อาํ เภอกันทรวิชัย จงั หวัดมหาสารคาม ในแต ละฤดูกาลของปคือ รอน ฝน และหนาว เมื่อนํามาแยก แบคทีเรียดวยอาหารเลี้ยงเช้ือ halobacterium medium ท่ีมีความเขมขนของเกลือ NaCl 0 3 และ 6% สามารถแยก แบคทีเรียท่ีมีลักษณะโคโลนีแตกตางกันไดท้ังหมด 56 ไอโซ เลท ตัวอยา งโคโลนีแสดงดงั ภาพที่ 2 ภาพที่ 3 สัดสว นเปนรอยละของแบคทเี รยี ทีพ่ บดานการตดิ สี แกรมและรปู รา งของเซลล ภาพที่ 2 ตัวอยางลกั ษณะโคโลนขี องแบคทเี รยี ท่ีแยกจากดิน ภาพที่ 4 สดั สวนเปนรอยละของแบคทเี รยี ท่ีพบจาํ แนกตาม ดวยอาหาร halobacteria medium ทีม่ เี กลอื NaCl ความ ระดบั เกลือ NaCl ท่เี จรญิ ไดด ี เขมขนระดบั ตา งๆ ต้งั แต 0-6% ภาพที่ 5 สดั สว นเปนรอยละของแบคทีเรียดา นระดบั ความ เคม็ ทีเ่ หมาะสมตอการเจรญิ ตา งๆ จากการศึกษาคุณสมบัติดานการติดสีแกรมและรูปราง ของเซลลพบวา แบคทีเรียสวนใหญเปนแบคทีเรียแกรมบวก รูปรางแทง (ภาพที่ 3) ที่มีการสรางสปอร ความสามารถใน การสรางสปอรชวยใหแบคทีเรียกลุมน้ีทนทานและรอดชีวิต ในสภาพแวดลอมท่ีแหงแลงและมีธาตุอาหารสําหรับการ เจริญตาํ่ ไดด ี (Reynolds and Pepper, 2000) ผลการศกึ ษา ความสามารถในการเจรญิ ทคี่ วามเค็มของเกลือ NaCl ระดับ ตา งๆ พบวา แบคทีเรียสว นใหญเปน กลุมทนเค็ม รองลงไปคือ กลมุ ทชี่ อบเค็มระดบั ต่าํ และกลมุ ไมชอบเค็มตามลาํ ดับ (ภาพ ท่ี 4) ชวงความเค็มท่ีแบคทีเรียสวนใหญสามารถเจริญไดคือ 0-3% (ไมไดแสดงขอมูลไวในท่ีน้ี) และมีสัดสวนของ แบคทีเรียสูงถึงรอยละ 14.3 ที่มีระดับความเค็มของเกลือ NaCl ที่เหมาะสมตอการเจริญคือ 3% (ภาพที่ 5) การพบ แบคทีเรียกลุมที่ชอบเค็มระดับต่ําแมวาดินในพื้นที่ปา สาธารณะนี้เปน ดนิ ไมเคม็ อาจเน่ืองจากธรรมชาติของดินเคม็ ในภาคตะวันออกเฉียงเหนือมีลักษณะท่ีเค็มเปนหยอม และ ในพ้ืนท่ีจังหวัดมหาสารคามเปนดินเค็ม แบคทีเรียทนเค็ม หรือชอบเค็มในพื้นท่ีใกลเคยี งจึงสามารถแพรก ระจายสพู ้นื ที่ ปาสาธารณะนี้ ทั้งโดยปจจัยทางธรรมชาติ เชน ลม หรือ ปจจัยจากการกระทําของมนุษย เชน การเกษตรกรรม นอกจากน้ี การที่พบวาแบคทีเรียสวนใหญเปนแบคทีเรียทน การประชุมวิชาการชมรมคณะปฏบิ ัตงิ านวทิ ยาการ อพ.สธ. ครง้ั ที่ 9 “ทรพั ยากรไทย : ชาวบานไทยไดป ระโยชน”

581 ผลการศึกษาความสามารถของแบคทีเรยี ในการเจริญที่ สรปุ ผลการทดลอง pH และอุณหภูมิตางๆ แสดงดังภาพที่ 6 และ 7 ตามลําดับ จากการสํารวจความหลากหลายของแบคทีเรียในดนิ ปา โดยพบวาแบคทีเรยี สว นใหญเจริญไดด ที ่ี pH 7 และอุณหภูมิ 35°C สําหรับชวง pH และอุณหภูมิท่ีแบคทีเรียสวนใหญ สาธารณะบริเวณตําบลนาสีนวน อําเภอกันทรวิชัย จังหวัด สามารถเจริญไดค ือ 5-9 และ 25-50°C ตามลาํ ดบั มหาสารคาม โดยแยกแบคทีเรียจากตัวอยางดินดวยอาหาร halobacteria medium ท่ีมีปริมาณเกลือ NaCl 0 3 และ ภาพท่ี 6 สดั สว นเปนรอยละของแบคทีเรียท่พี บดา น pH ท่ี 6% ไดสายพันธุแบคทีเรียท้ังหมดจํานวน 56 ไอโซเลท เหมาะสมตอ การเจรญิ แบคทีเรียสวนใหญเปนพวกแกรมบวก รูปรางแทง สราง สปอร มีระดับความเค็มของเกลือ NaCl ท่ีเหมาะสมตอการ ภาพท่ี 7 สดั สว นเปน รอยละของแบคทีเรียท่ีพบดานอณุ หภมู ิ เจริญคือ 0% นอกจากนี้ แบคทีเรียสวนใหญมีชวงระดับ ท่เี หมาะสมตอ การเจรญิ ความเค็มของเกลือ NaCl ที่สามารถเจริญได คือ 0-3% มี ชวง pH ที่สามารถเจริญได คือ 5-9 และมีชวงอุณหภูมิที่ โดยท่ัวไปแบคทีเรียในดินปาไมมีการผลิตเอนไซมได สามารถเจริญได คือ 25-50°C จากผลการศึกษาวิจัยของ หลากหลายและการที่แบคทีเรียทนเค็มและชอบเจริญในท่ี คณะนักวิจัยตางๆ ท่ีพบวาแบคทีเรียทนเค็มและชอบเค็ม เค็มมีความสามารถผลิตสารตางๆ เชน สารตานจุลชีพ สาร ส า ม า ร ถ ผ ลิ ต ส า ร สํ า คั ญ ที่ มี ป ร ะ โ ย ช น ต อ ก า ร แ พ ท ย ออกฤทธ์ิทางชีวภาพ พอลิเมอรชีวภาพ และสารใหกล่ินรส เกษตรกรรม และอุตสาหกรรม สายพันธุแบคทีเรียที่แยกได ฯลฯ ท่ีมีประโยชนตอการแพทย การเกษตร และ จากการศึกษาน้ีจึงมีคุณคายิ่งสําหรับการนําไปใชประโยชน อุตสาหกรรม (Ramos-Cormenzana, 1990; Oren, 2002) ทางเทคโนโลยีชีวภาพตอไปในอนาคต ตลอดจนการท่ีแบคทีเรียท่ีแยกไดมีชวง pH และอุณหภูมิใน คําขอบคณุ การเจริญท่ีกวางเชนน้ี ทําใหสายพันธุแบคทีเรียที่ไดเปน แหลงพันธุกรรมท่ีมีคุณคาอยางย่ิงตอการนําไปใชประโยชน โครงการวิจัยน้ีไดรับการสนับสนุนจากเงินทุนอุดหนุน ทางเทคโนโลยชี วี ภาพในอนาคต การวิจัยจากงบประมาณแผนดิน ประจําป 2561 มหาวทิ ยาลยั มหาสารคาม ผูว จิ ยั ขอขอบคุณมา ณ ทนี่ ้ดี ว ย เอกสารอา งองิ นเรศ สตั ยารักษ, สมเกยี รติ จันทรม หา, เจตต จุลวงษ, ปกรณ สุวานิช, และ ธวชั จาปะเกษตร. 2542. อิทธพิ ล ของช้ันเกลือหินท่ตี อ นา้ํ ใตด ินในภาคอสี าน, นน. 145- 173. ใน : กรมพฒั นาทด่ี นิ เอกสารคมู ือเจาหนา ทขี่ อง รัฐเรอื่ งดินเคม็ .กระทรวงเกษตรและสหกรณ, กรุงเทพฯ. Atlas, M. 1997. Handbook of Microbiological Media. 2nd ed. CRC Press, Boca Raton. Chhabra, R. 1996. Soil Salinity and Water Quality. A.A. Balkema Publishers, Brookfield. Kushner, D.J. 1993. The Biology of Halophilic Bacteria. CRC Press, Boca Raton. Lladó, S., López-Mondéjar, R. and P. Baldrian. 2017. Forest soil bacteria: diversity, involvement in ecosystem processes, and response to global change. Microbiol Mol Biol Rev 81(2): e00063-16. Oren, A. 2002. Diversity of halophilic micro- organisms, environments, phylogeny, physiology, and applications. J Ind Microbiol Biotechnol 28(1): 56-63. การประชมุ วิชาการชมรมคณะปฏบิ ัตงิ านวทิ ยาการ อพ.สธ. ครัง้ ท่ี 9 “ทรพั ยากรไทย : ชาวบา นไทยไดป ระโยชน”

582 Quesada, E., Ventosa, A., Rodriguez-Valera, F. Rodriguez-Valera, F., Ruiz-Berraquero, F. and A. and A. Ramos-Cormenzana. 1982. Types and Ramos-Cormenzana. 1981. Characteristics of properties of some bacteria isolated from the heterotrophic bacterial populations in hypersaline soils. J Appl Microbiol 53: 155- hypersaline environments of different salt 161. concentrations. Microb Ecol. 7: 235-243. Ramos-Cormenzana, A. 1990. Biotechnology Zahran, H.H., Moharram, A.M. and H.A. applications of the halophilic bacteria. Eur Mohammad. 1992. Some ecological and Congr Biotechnol 5: 600-603. physiological studies on bacteria isolated from salt-affected soils of Egypt. J Basic Microbiol Ramos-Cormenzana, A. (1993). Ecology of 32(6): 405-413. moderately halophilic bacteria. pp. 55-86. In: Vreeland R.H. and Hochstein L.I. (eds.). The Biology of Halophilic Bacteria. Boca Raton: CRC Press. การประชมุ วิชาการชมรมคณะปฏบิ ัติงานวิทยาการ อพ.สธ. ครั้งที่ 9 “ทรัพยากรไทย : ชาวบานไทยไดป ระโยชน”

583 การคดั เลอื กและจาํ แนกแบคทเี รยี ท่ีมคี ุณสมบัติละลายฟอสเฟต จากดนิ ในปา อนุรกั ษน าสนี วน จังหวดั มหาสารคาม SCREENING AND IDENTIFICATION OF PHOSPHATE SOLUBILIZING BACTERIA FROM SOIL IN NA SI NUAN FOREST, MAHA SARAKHAM, THAILAND เกศรา สุวรรณภักด*ี , ศริ ิรัตน ดศี ลี ธรรม, วจิ ติ รา หลวงอิน และ เกศสคุ นธ มณวี รรณ Ketsara Suwunnapukdee*, Sirirat Deeseenthum, Vijitra Luang-In and Kedsukon Maneewan หนวยวิจยั นวตั กรรมสารตา นอนมุ ูลอิสระจากธรรมชาติ ภาควิชาเทคโนโลยชี วี ภาพ คณะเทคโนโลยี มหาวทิ ยาลัยมหาสารคาม ตาํ บลขามเรยี ง อําเภอกันทรวิชยั จังหวัดมหาสารคาม 44150 Natural Antioxidant Innovation Research Unit, Department of Biotechnology, Faculty of Technology, Mahasarakham University, Khamriang, Kantarawichai, Maha Sarakham 44150 บทคดั ยอ งานวิจยั นี้เปน การคัดแยกแบคทเี รียทีม่ คี ณุ สมบัตลิ ะลายฟอสเฟตจากดนิ ในปา สาธารณะนาสีนวน ตั้งอยูท ี่ ต.นาสีนวน อ.กนั ทร วิชัย จ.มหาสารคาม ซ่ึงเปนปา อนุรกั ษใ นโครงการสนองพระราชดาํ ริ อพ.สธ. มเี น้อื ท่ีประมาณ 120 ไร โดยคดั แยกแบคทีเรยี ท่ี เลี้ยงในอาหาร NBRIP agar (National Botanical Research Institute's phosphate growth) และทดสอบความสามารถ ในการยอยสลายฟอสเฟตโดยวิธี Spread ตัวอยางดนิ ท่ลี ะลายนํ้าลงบนจานอาหารเลยี้ งเช้ือแข็งแลว นํามา streak plate แลว ศึกษาลักษณะของโคโลนี ทําการศึกษาสัณฐานวิทยาของแบคทีเรีย และการจําแนกสายพันธุแบคทีเรียโดยวิธี PCR-based 16S rRNA จากผลการทดลองสามารถแยกแบคทีเรียที่มีคุณสมบัติละลายฟอสเฟตไดท้ังหมด 8 ไอโซเลท โดยแบคทีเรียท่ีคัด แยกไดสามารถยอ ยสลายฟอสเฟตไดด โี ดยใหค า Halo : colony ratio สูง มจี าํ นวน 4 ไอโซเลท ไดแ ก Serratia marcescens ZCL-01, Serratia marcescens C3, Escherichia coli 042 และ Serratia sp. XT-1 (3.39, 2.0, 1.85 และ1.74 ตามลําดบั ) Abstract This research aimed to screen the phosphate solubilizing bacteria from soil in Na Si Nuan Forest, Maha Sarakham. The forest conservation project in response to Plant Genetic Conservation Project Under The Royal initiative of Her Royal Highness Princess Maha Chakri Sirindhorn has occupied 120 rai. Isolation of bacteria from soil by NBRIP agar (National Botanical Research Institute's phosphate growth) and test the phosphate solubilizing bacteria by spread sample of dissolved soil onto plate then bring streak plate for test the morphology of bacteria and bacterial species classification by PCR-based 16S rRNA gene. The results showed that 8 isolates select with the highest Halo: colony ration 4 isolates is Serratia marcescens ZCL-01, Serratia marcescens C3, Escherichia coli 042 and Serratia sp. XT-1. Halo : ratio colony is equal to 3.39, 2.0, 1.85 and 1.74 respectively. คําสําคญั : แบคทีเรยี ละลายฟอสเฟต, ปา อนรุ ักษนาสีนวน Keywords: phosphate solubilizing bacteria, Na Si Nuan Forest *ติดตอนกั วจิ ยั : เกศรา สุวรรณภกั ดี (อีเมล [email protected]) *Corresponding author: Ketsara Suwunnapukdee (E-mail: [email protected]) การประชมุ วิชาการชมรมคณะปฏบิ ตั ิงานวทิ ยาการ อพ.สธ. คร้ังท่ี 9 “ทรัพยากรไทย : ชาวบานไทยไดป ระโยชน”

584 บทนาํ คุณสมบัติทางกายภาพของดินโดยการวัดการนําไฟฟา คา พ้ืนท่ีปาอนุรักษนาสีนวนซึ่งเปนปาชุมชนเขตตําบล ความเปนกรด-ดาง ปริมาณไนโตรเจน โพแทสเซียม ฟอสฟอรัส (Mendpara et. al., 2013) นาสีนวน อําเภอกันทรวิชัย จังหวัดมหาสารคาม เปนปา 2. การคดั แยกจลุ นิ ทรียจากตัวอยา งดนิ อนุรักษในโครงการสนองพระราชดําริ อพ.สธ. มีเน้ือที่ ประมาณ 120 ไร ลักษณะของดินในพ้ืนที่ปาแหงน้ีเปนดิน ช่งั ดินมา 10 กรมั ละลายใน 0.85% NaCl ปลอดเชื้อ 90 เคม็ ปานกลางและเคม็ มาก (กรมทรัพยากรธรณี, 2557) พบ มลิ ลลิ ิตร เขยา ใหเขากันโดยเคร่ือง vortex จากนัน้ นาํ มาเจือ ดินเค็มบริเวณในแองท่ีลุมหรือตามเชิงเนินพ้ืนที่ตอเนื่อง จางดวย 0.85% NaCl ปลอดเชื้อใหไดสารละลายเจือจาง ระหวางพื้นทแ่ี บบลูกคลื่น โดยพน้ื ที่ดินในปาอนรุ ักษนาสนี วน หลายระดับ 10-2- 10-6 กอนท่ีจะปเปต 0.1 มิลลิลิตรลงบน น้ีจัดเปนดินเค็มบก คือดินที่มีเกลือละลายอยูในดินมาก อาหารเล้ียงเช้ือแข็งแตละชนิดตามคุณสมบัติของจุลินทรียท ่ี เกินไป แหลงเกลือที่ละลายในดินมาจากหินเกลือใตพื้นดิน ตองการศึกษา โคโลนีทีเ่ จริญบนจานเลี้ยงเช้อื นาํ ไปทําใหเปน น้ําในดินเค็มหรือหินทราย หินดินดานท่ีอมเกลืออยู โดย เชื้อบรสิ ุทธ์บิ นจานอาหารเลย้ี งเชือ้ แข็งจานวน 5 รอบ ศึกษา ลักษณะดินมีปริมาณความเค็มแตกตางออกไปในแตละ ลักษณะทางสัณฐานวทิ ยา ลกั ษณะของโคโลนี สณั ฐานรูปราง ระดับชั้นความลึกของดิน ซึ่งมีผลกระทบตอ การเจรญิ เตบิ โต การจัดเรียงตัวและชนิดของแกรมแบคทีเรียภายใตกลอง ของพืช แตมีพืชบางบางชนิดก็สามารถทนเค็มไดและ จุลทรรศน (กําลังขยาย 1,000 เทา) และทดสอบคุณสมบัติ สามารถใหผลผลิตไดดี นอกจากน้ียังพบเห็ดท้ังชนิดท่ีกินได ทางชวี เคมีของแตล ะเชือ้ และกินไมไดอยูหลายสายพันธุ จึงมีประชาชนในเขตพ้ืนท่ี ใกลเคียงเขามาใชประโยชนในปาแหงน้ี การคัดเลือก คัดแยกเช้ือจุลินทรียท่ีเปนประโยชนตอการเกษตร แบคทีเรียจากดินในปานาสีนวนเน่ืองจากปาสาธารณะ ข้ันตอนแรกในอาหารแข็ง (Primary screening) โดยช่ังดิน ประโยชนนาสีนวนแหงนี้ มีความหลากหลายทางชีวภาพและ มา 10 กรัมละลายใน 0.85% NaCl ปลอดเชื้อ 90 มิลลิลิตร ยังมีรายงานวาปาแหงนี้เปนพ้ืนท่ีดินเค็มแตภายในปามีพืช เขยาใหเขากันโดยเครื่อง vortex จากน้ันนํามาเจือจางดวย หลายชนิดท่ีเจริญเติบโตไดอยางดีและยังพบเห็นหลาย 0.85% NaCl ปลอดเช้ือใหไดสารละลายเจอื จางหลายระดบั ประเภททั้งกินไดและกินไปได จึงสนใจที่จะศึกษาแบคทีเรีย 10-2-10-6 เพื่อทําการทดสอบแยกแบคทีเรียที่มีคุณสมบัติ ในดนิ ท่ีเปนประโยชนดานการเกษตร อกี ทงั้ พน้ื ทปี่ า นาสีนวน ละลายฟอสเฟต จังหวัดมหาสารคามยังไมมีรายงานความหลากหลายของ 3. แยกจลุ ินทรยี ล ะลายฟอสเฟต (Phosphate เอนไซมจากจุลินทรีย ดังนั้นจึงตองการที่จะคัดแยกและ solubilization) จํ า แ น ก แ บ ค ที เ รี ย ท่ี พ บ ใ น พื้ น ท่ี ป า น า สี น ว น แ ล ะ ศึ ก ษ า คุณสมบัติทางชีวเคมีของแบคทีเรียเหลานี้เพื่อนําไปใช Spread เชื้อแบคทีเรียลงบนจานอาหารเล้ียงเชื้อแข็ง ประโยชนทางการเกษตรตอไปในอนาคต ปจจุบันจึงมี NBRIP ( National Botanical Research Institute's การศึกษาคุณสมบัติตางๆ ของแบคทีเรียเพื่อนํามาใช phosphate growthagar ) (Nautiyal, 1999) นําไปบมที่ ประโยชนในดานตางๆ เนื่องจากแบคทีเรียมีชวงการเจริญที่ 37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 7 วัน สังเกตเคลียรโซนรอบๆ รวดเรว็ สะดวกตอการเลีย้ ง สามารถผลิตสารปฐมภมู แิ ละสาร โคโลนีท่ีสามารถละลายฟอสเฟตได จากนั้น เก็บโคโลนีของ ทุติยภูมิไดเร็ว ด้ังน้ันงานวิจัยนี้จึงเลือกท่ีจะศึกษาคุณสมบัติ แบคทีเรียท่ีมีคุณสมบัติละลายฟอสเฟตมาทําใหเปนเช้ือ ตางๆของแบคทีเรียท่ีมีประโยชนทางการเกษตรและศึกษา บริสุทธ์ิบนจานอาหารเลี้ยงเช้ือ LB agar ดวยวิธี streak หาแบคทีเรียท่ีสามารถละลายฟอสเฟตเปนหนึ่งในธาตุท่ี plate แลวศึกษาลักษณะของโคโลนี ลักษณะทางสัณฐาน สําคัญตอพืช ถาพืชไมไมไดรับธาตุฟอสฟอรัสพืชก็จะไม วิทยาของเซลล สัณฐานรูปรางการจัดเรียงตัวและชนิดของ สามารถเจรญิ เติบโตและไมสามารถใหผลผลิตได แกรมแบคทีเรียภายใตกลองจุลทรรศน (กําลังขยาย 1,000 อุปกรณแ ละวิธีการทดลอง เทา ) และ ใชไ มจ ม้ิ ฟน แตะเช้อื มาทํา point inoculation บน 1. การเกบ็ ตวั อยางดินจากพื้นทดี่ นิ เค็ม อาหารเล้ยี งเช้ือแขง็ บม ที่ 37 องศาเซลเซียส เปน เวลา 2 วัน สังเกตเคลียรโซนรอบๆ โคโลนี แลวทําการวัดรัศมีของ สถานท่ีเก็บขอมูล : ปาสาธารณะประโยชนนาสนี วน ต. บริเวณใสและรศั มีของโคโลนี เพ่ือนํามาคํานวณหาคา Halo: นาสีนวน อ.กันทรวิชัย จ.มหาสารคาม ประเทศไทย เก็บ Colony ดงั สตู รตอไปนี้ Halo : Colony ratio = รัศมีบรเิ วณ ตัวอยางดิน ท่ีความลึก 10-15 เซนติเมตรจากผิวหนาดิน วงใสรอบโคโลนี/รัศมีโคโลนี Halo : Colony ratio สูงสุด บริเวณ rhizosphere ในถุง polythene ที่ปลอดเช้ือและ แสดงวามีกิจกรรมเอนไซมนี้ดีที่สุด (Edi Premono et. al., เก็บไวท่ีอุณหภูมิหองจนกวาจะวิเคราะห ทําการวิเคราะห 1996) เก็บเชื้อไวทําการทดลองโดยการคดั เลือกแบคทีเรยี ท่ี การประชุมวชิ าการชมรมคณะปฏบิ ตั ิงานวิทยาการ อพ.สธ. คร้ังท่ี 9 “ทรัพยากรไทย : ชาวบา นไทยไดป ระโยชน”

585 มีคา Halo : Colony ratio สูงสุดมาทํากราฟมาตรฐานการ นาที และเก็บ PCR product ไวที่ -20 องศาเซลเซียส เจริญของเชื้อท่ีคัดเลือกเพ่ือทําใหแบคทีเรียท่ีคัดเลือกมี จากน้ันตรวจสอบดีเอ็นเอดวยเทคนิคอะกาโรสเจลอิเล็กโทร จาํ นวนเซลลใ กลเ คียงกันเพอื่ ทาํ การทดลองตอ ไป โฟรีซีส โดยเตรียม 0.8% Agarose gel ละลายใน1X TBE 4. การจําแนกสายพันธุแบคทีเรียโดยวิธี PCR-based 16S bufferpH 8.0 ปริมาตร 40 หรือ 100 มิลลิลิตร ดวยความ rRNA gene รอนจากนั้นทําใหเย็นท่ีอุณหภูมิ 55 องศาเซลเซียสเติมสี SYBR Safe dye (Invitrogen) ในอัตราสวน 0.5ไมโครลติ ร/ เลี้ยงเชื้อแบคทีเรียบริสุทธ์ิจาก 20% glycerol stock สารละลายเจล 40 มิลลิลิตร เขยาใหผสมในสารละลายเจล ในอาหารเล้ยี งเชื้อเหลว 1 มลิ ลิลิตร ขา มคนื เพอ่ื การสกดั จโี น โดยทั่วแลวเทเจลลงในถาดเจล (gel chamber) ทิ้งใหเจ มิกดีเอ็นเอ โดยใช Bacterial Genomic DNA extraction ลแข็งตัวที่อุณหภูมิหองผสมสารละลายจีโนมิกดีเอ็นเอ 1 kit (Vivantis, Malaysia) เพิ่มปริมาณชิ้นสวนดีเอ็นเอ ไมโครกรัม กับ 6X Loading dye ในอัตราสวน 2:1 โดย เปาหมาย 16S rRNA gene จากจีโนมิกดีเอ็นเอดวยเทคนิค ปริมาตร ใช lambda DNA 100 นาโนกรัม เปนดีเอ็นเอ PCR โดยใชไพรเมอรสากลที่จําเพาะกับแบคทีเรีย (Wang มาตรฐานเม่ือเทียบขนาดดีเอ็นเอใชกระแสไฟฟาที่มีความ et. al. , 1996) Forward primer คื อ AmpF 5’ -GAGA ตางศักยไฟฟา 80 โวลตเปน เวลา 30 นาทีตรวจแถบดีเอน็ เอ GTTTGATYCTGGCTCAG- 3’ และReverse primer คือ ผ า น เ ค รื่ อ ง Gel documation ( SYNGENE) ส กั ด PCR AmpR5’-AAGGAGGTGATCCARCCGCA -3’เทคนคิ PCR 1 product บริสุทธ์ิโดยใช PCR purification kit (Vivantis, ปฏิกิรยิ ามีปริมาตรรวม 25 ไมโครลิตร ประกอบดว ย จโี นมิก Malaysia) จากน้ันสง PCR product ไปวิเคราะหลําดับนิว- ดีเอ็นเอความเขมขน 0.5 นาโนกรัม สารละลาย 1X Master คลีโอไทดที่ บริษัท Macrogen วิเคราะหความเหมือนของ Mix Buffer A 500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 9.1), ลําดับนิวคลีโอไทดกับฐานขอมูลวามีคาความเหมือนหรือ 0.1% Triton TMX-100, 200 mM dNTP, 1.5 mM MgCl2 คลายคลึงกับดีเอ็นเอของแบคทีเรียชนิดใดในฐานขอมูลโดย 0 . 2 µM forwaed and reverse primer, 0 . 0 0 5 U Taq ใชโปรแกรม BLASTN (Basic Local Alignment Search DNA Polymerase และปรับปริมาตรดวยน้ํากลั่นท่ีผานการ Tools) จากฐานขอมลู NCBI (Altschul et. al., 1990) เพอ่ื ฆาเช้ือแลวจนไดปริมาตร 25 ไมโครลิตร ใชเครื่อง PCR ใชในการหาคาเปอรเซ็นตความคลายคลึงหรือเหมือน (% thermocycler (ThermoScientific Hybaid Px2) ในการ Identity) โดยเลอื กเชื้อทมี่ คี า Max score สงู สุด ผลของการ เพ่ิมจํานวน 16S rRNA gene ซึ่งมีสภาวะดังนี้ ข้ันตอนการ จัดลําดับเบส partial 16S rRNA จะถูกสงไปเก็บไวท่ีฐาน แยกสาย DNA สายคูออกจากกัน (denaturation) ท่ี ขอมูลสากล NCBI สรางแผนภมู ิวิวัฒนาการ (Phylogenetic อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส 2 นาที 1 รอบ ตั้งจํานวนรอบ tree) ดวยวิธี Neighbour-joining method ของ Tamura- 32 รอบ อุณหภูมิ 94 องศาเซลเซียส 45 วินาที ขั้นตอนไพ Nei model (Tamura and Nei, 1993) โดยใชโปรแกรม เมอรจับดีเอ็นเอที่อุณหภมู ิ 54 องศาเซลเซยี ส 45 วินาที การ MEGA7 (www.megasoftware.net) Bootstrap จํานวน สงั เคราะหดเี อน็ เอท่ีอุณหภูมิ 72 องศาเซลเซียส 1 นาที และ 1,000 ซํ้า เพิม่ จาํ นวนลาํ ดับนิวคลีโอไทดสุดทา ยท่ี 72 องศาเซลเซียส 7 การประชุมวชิ าการชมรมคณะปฏบิ ัตงิ านวิทยาการ อพ.สธ. ครงั้ ที่ 9 “ทรพั ยากรไทย : ชาวบา นไทยไดป ระโยชน”

58 ตารางที่ 1 แหลงท่ีมาของดนิ และการวเิ คราะหคณุ สมบัติทางกายภาพของดนิ Longitude/Latitude Soil descript Area พกิ ดั ลักษณะดิน สีด 1.1 N 16 20 17.945, E 103 12 14.731 ใตต น สะเดา มตี น ข้ีเหลก็ อยใู กล 1.2 N 16 20 17.945, E 103 12 14.731 ใตตนสมอไทย ตน ตอง และโคน 1.3 N 16 20 6.619, E 103 11 0.985 Unknown (ปา) 1.4 N 16 20 23.547, E 103 12 35.244 ตระกลู สัก พบปลวก 2.1 N 16 20 36.882, E 103 12 32.315 ดินโลง แจง พบตนสาบแรง สาบ 2.2 N 16 20 36.863, E 103 12 32.416 ปา สะแบง 2.3 N 16 19 39.152, E 103 12 33.655 ใตตนยูคาลปิ ตสั ใกลต นทบั ทมิ 2.4 N 16 20 37.157, E 103 12 33.579 ใตตน หมากผีผวน 3.1 N 16 20 36.44, E 103 12 34.072 ใตต นไมยราบ ลกั ษณะเปนดนิ เ 3.2 N 16 20 35.406, E 103 12 35.157 หนามแทง (ลกั ษณะ : หนามให 3.3 N 16 20 35.405, E 103 12 35.154 ใกลต นพอก 3.4 N 16 20 35.425, E 103 12 35.178 ใตต นครก 3.5 N 16 20 36, E 103 12 36 บรเิ วณเห็ดไคลเกดิ (ขดุ ลึก 15 3.6 N 16 20 36, E 103 12 36 ผิวดินทพ่ี บเหด็ ไคลเจรญิ การประชมุ วิชาการชมรมคณะปฏบิ ตั ิงานวิทยาการ อพ.ส

86 EC (µS) Temperature (°C) pH 36.2 31.6 8.69 tion/Surrounding 19.9 31.0 7.72 ดนิ ตน ไม สิง่ แวดลอ ม 22.3 31.0 7.06 ลๆ 20.9 31.0 6.40 นปลวก 28.8 31.0 6.27 27.7 30.9 5.77 บกาเจริญอยรู อบๆ 184 31.0 4.49 ม 24.1 31.0 5.39 เหนยี ว ในเว้งิ นาํ้ เกา 23.4 31.0 5.66 หญ) ตดิ ทางเดิน 22.4 31.4 5.46 26.3 32.0 5.40 cm) 24.2 33.8 5.26 23.5 32.5 5.39 30.2 31.3 5.25 สธ. ครั้งที่ 9 “ทรพั ยากรไทย : ชาวบานไทยไดป ระโยชน”

587 ผลและวิจารณผลการทดลอง 2.2 PS1 (G-, rod shaped) 1. การเกบ็ ตัวอยางดินจากพื้นทดี่ นิ เค็ม Halo : Colony ratio = 3.39 จากตัวอยางดินที่เก็บจากพ้ืนท่ีปาอนุรักษนาสีนวนซ่ึง 2.3 PS2 (G-, rod shaped) เปนปาชุมชนเขตตําบลนาสีนวน อําเภอกันทรวิชัย จังหวัด Halo : Colony ratio = 2.0 มหาสารคาม มาทําการวิเคราะหคุณสมบัติทางกายภาพของ ดนิ โดยการวดั การนาํ ไฟฟา คาความเปนกรด-ดา ง 2.4 PS1 (G-,rod shaped) Halo : Colony ratio = 1.85 2. แยกจลุ ินทรยี ล ะลายฟอสเฟต (Phosphate solubilization) 2.4 PS3 (G-, rod shaped) Halo : Colony ratio = 1.74 การคัดแยกคัดแยกแบคทีเรียละลายฟอสเฟต ที่ละลาย 3. การจําแนกสายพันธุแบคทีเรียโดยวิธี PCR-based 16S ฟอสเฟสจากดินบริเวณปาอนุรักษนาสีนวนซ่ึงเปนปาชุมชน rRNA gene เขตตําบลนาสีนวน อําเภอกันทรวิชัย จังหวัดมหาสารคาม การจําแนกสายพันธุของแบคทีเรียท่ีมีคุณสมบัติละลาย โดยวิธี Spread เช้ือแบคทีเรียลงบนจานอาหาร เลี้ยงเชื้อ ฟอสเฟตตามวิธี PCR-based 16S rRNA gene จากน้ันสง แ ข็ ง NBRIP (National Botanical Research Institute's PCR product ไปวิเคราะหลาดับนิวคลีโอไทดที่ บริษัท phosphate growth) agar พบวามี แบคทเี รยี 8 ไอโซเลทที่ Macrogen วิเคราะหความเหมือนของลําดบั นิวคลีโอไทดกับ สามารถละลายฟอสเฟตไดโดยสังเกตจากวงใสที่เกิดข้ึน ดัง ฐานขอมูลวามีคาความเหมือนหรือคลายคลึงกับดเี อ็นเอของ ตารางท่ี 2 แบคทีเรียชนิดใดในฐานขอมูลโดยใชโปรแกรม BLASTN (Basic Local Alignment Search Tools) จากฐานขอมูล ตารางที่ 2 ดินในพื้นที่ปานาสีนวนและจํานวนไอโซเลทของ NCBI (Altschul et. al., 1 9 9 0 ) เ พื่ อ ใ ช ใ น ก า ร ห า ค า แบคทีเรยี ละลายฟอสเฟต เปอรเซ็นตความคลายคลึงหรือเหมือน (% Identity) ไดผล จุดที่ บรเิ วณท่ีเก็บดิน จาํ นวนไอโซเลท ดงั ตารางท่ี 3 2.2 ปา สะแบง 2 2.3 ใตต นยูคาลิปตัส ใกลต นทับทิม 2 2.4 ใตต นนมควาย (หมากผผี วน) 3 3.2 หนามแทง ตดิ ทางเดิน 1 รวม 8 ศึกษาลักษณะสัณฐานวิทยาของเช้ือแบคทีเรียที่ละลาย ฟอสเฟตท่ีแยกได โดยเก็บโคโลนีของ แบคทีเรียท่ีได มาทํา ใหเปนเชื้อบริสุทธิ์บนจานอาหารเล้ียงเช้ือ LB agar ดวยวิธี streak plate แลว ศึกษาลักษณะของโคโลนี ลักษณะทาง สัณฐานวิทยาของเซลล สัณฐานรูปรางการจัดเรียงตัวและ ชนิดของ แกรมแบคทเี รียภายใตกลอ งจลุ ทรรศน (กาํ ลงั ขยาย 1,000 เทา) แลวนําแบคทีเรียที่ไดมาจุดบนอาหาร NBRIP แลวสังเกตเคลียรโซนรอบๆ โคโลนี แลวทําการวัดรัศมีของ บริเวณใสและรัศมีของโคโลนี เพ่ือ นํามาหาคา Halo: Colony แบคทีเรียที่มีคา Halo : Colony ratio สูงสุด คือ 3.39 จากเชื้อ 2.2 PS1 (2.2 คือ ดินจุดท่ี2.2, PS คือ phosphate solubilizing, 1 คอื แบคทเี รียตัวที่ 1) การประชุมวิชาการชมรมคณะปฏบิ ตั งิ านวทิ ยาการ อพ.สธ. ครงั้ ที่ 9 “ทรพั ยากรไทย : ชาวบานไทยไดป ระโยชน”

588 ตารางที่ 3 สายพันธุแ บคทเี รยี ทม่ี คี ณุ สมบตั ลิ ะลายฟอสเฟสจากดนิ ในปา นาสีนวน Accession No. Closest speciesa no.b % identityc Origin of closest relatived MF179549.1 Serratia marcescens, 2.2PS1 Serratia marcescens ZCL-01 MH251251 99% fermented tofu whey, China KY287771.1 Serratia marcescens, 2.3PS1 Serratia marcescens C3 KX002010 85% fermentation of Mezcal in Oaxaca, Italy 2.4PS1 Escherichia coli 042 X81423 98% KX424632. Escherichia coli 042, 99% palm sap, Germany 2.4PS2 Serratia sp. XT-1 KR063532 96% AB906418.1 Serratia sp., santol, China 2.4PS3 Serratia marcescens XG1S-1 MF716676 KX424631.1 Serratia marcescens, palm sap, China 3.2PS1 Bacillus stratosphericus KF477155 98% KU892402.1 Pediococcus TY0340 pentosaceus PPOF134, traditional cereal-based fermented food, Nigeria สรุปผลการทดลอง 2.4 PS3 คื อ Serratia marcescens XG1S-1 แ ล ะ ดินในปาอนุรักษนาสีนวนมีลักษณะของดินในพ้ืนที่ปา แบคทเี รีย 3.2 PS1 คอื Bacillus stratosphericus TY0340 กิตติกรรมประกาศ แหงน้ีเปนดนิ เคม็ ปานกลางและเคม็ พบดินเค็มบรเิ วณในแอง ที่ลุมหรือตามเชิงเนินพ้ืนที่ตอเนื่องระหวางพื้นท่ีแบบลูกคลนื่ คณะผูวิจัย ขอขอบคุณ กํานัน ผูใหญบาน ผูนําชุมชน แตภายในปายังอุดมสมบูรณของพืช พืชมีการผลิตสารทุติย และชาวบาน ต.นาสีนวน อ.กันทรวิชัย จ.มหาสารคาม ท่ีให ภูมิเพ่ือปองกันความเครียดมากเพ่อื การอยูรอด การคัดแยก ความรวมมือในการนําเดินปา ติดตอประสานงาน จน แบคทีเรียท่ีมีคุณสมบัติละลายฟอสเฟตคัดแยกไดท้ังหมด 8 งานวจิ ัยนีส้ ําเรจ็ ลลุ วง ไอโซเลท คอื ดินในจดุ ที่ 2.2 บรเิ วณปา สะแบงได 2 ไอโซเลท ดินในจุดที่ 2.3 บริเวณใตตนยูคาลิปตัส ใกลตนทับทิมได 2 งานวิจัยน้ี ไดรับทุนจากมหาวิทยาลยั มหาสารคาม ท่ีให ไอโซเลท ดินในจุดท่ี 2.4 บริเวณใตตนนมควาย (หมากผี ทุนอุดหนุนการวิจัยงบประมาณเงินแผนดิน (อพ.สธ.) ผวน)ได 3 ไอโซเลทและดนิ ในจดุ ที่ 3.2 บรเิ วณหนามแทง ติด ประจาํ ปง บประมาณ 2561 ทางเดินได 1 ไอโซเลท การศึกษาลักษณะสัณฐานวิทยาของ เอกสารอา งองิ เชื้อแบคทีเรียท่ีละลายฟอสเฟตที่แยกไดและวัดคา Halo : กรมทรัพยากรธรณ.ี (2557), สถานการณธ รณีวิทยาและ Colony ratio คือ แบคทีเรีย 2.2 PS1 (G-, rod shaped) คา Halo : Colony ratio = 3.39, แบคทีเรีย 2.3 PS2 (G-, ทรัพยากรธรณ.ี กระทรวงทรัพยากรธรรมชาตแิ ละ rod shaped) คา Halo : Colony ratio = 2.0 , แบคทีเรยี ส่งิ แวดลอ ม, น.47-105 2 . 4 PS1 ( G-,rod shaped) ค า Halo : Colony ratio = กระทรวงทรัพยากรธรรมชาติและสิง่ แวดลอ ม. (2546). การ 1.85 และแบคทีเรยี 2.4 PS3 (G-, rod shaped) คา Halo : จดั การสงิ่ แวดลอม. กรงุ เทพฯ:กระทรวงทรพั ยากร Colony ratio = 1.74 และสายพันธุแบคทีเรียท่ีมีคุณสมบตั ิ ธรรมชาตแิ ละสิ่งแวดลอม ละลายฟอสเฟสไดผลดังน้ี แบคทีเรีย 2.2 PS1 คือ Serratia เกตนณ นภิ า วนั ชยั และ สมาพร เรอื งสงั ฃ, 2557, ผลของ marcescens ZCL-01, แบคทีเรีย 2.3 PS1 คือ Serratia แบคทเี รียละลายฟอสเฟตท่ีตรึงอยูบ นข้เี ถา แกลบตอ marcescens C3, แบคทเี รีย 2.4 PS1 คอื Escherichia coli การเจรญิ เติบโตของขาวพันธุ กข47, วารสาร 042, แบคทีเรีย 2.4 PS2 คือ Serratia sp. XT-1 แบคทีเรีย วทิ ยาศาสตรเ กษตร, 513-516. การประชุมวิชาการชมรมคณะปฏบิ ัติงานวทิ ยาการ อพ.สธ. ครัง้ ที่ 9 “ทรพั ยากรไทย : ชาวบานไทยไดป ระโยชน”

589 จิตมา ยถาภธู านนธแ ละคณะ. (2545). Development on Resources Profite. Oxford University Press. Analytical System of Agricultural Production Oxford, New York, 431 pp. Inputs. กรมวิชาการเกษตร, 26-39 Arnoldus, H.M.J. (1977).Predicting Soil Loss Due to Sheet and Rill Erosion. Food and Agriculture จรุ ยี รตั น ลสี มทิ ธ์.ิ (2548), ปฏิบตั กิ ารจลุ ชีววิทยาท่วั ไป. Organization ( FAO ) Conservation Guide (พมิ พครง้ั ที1่ ).กรุงเทพ: สํานักพมิ พ มหาวทิ ยาลยั Volume I, p.88-98 เกษตรศาสตร, น.142 Edi Premono M., Moawad A. M., and Vlek P. L. G. (1996), Effect of phosphate solubilizing ไตรธานี เยย่ี มออน, นันทวัน ฤทธ์เิ ดช, โสภณ บุญลือและ Pseudomonas putidaon the growth of maize คณะ. (2555). การสงเสรมิ การเจริญเตบิ โตของออย and its survival in the rhizosphere. Indones. J. ดว ยแบคทเี รยี ละลายฟอสเฟตในสภาพเรือนทดลอง. Crop Sci. 11,13-23. [ฉบบั พิเศษ] แกนเกษตร. 185-193 Lowry O. H., Rosebrough N. J., Farr A. L., and Randall R. J. (1998), “Protein measurement นงลักษณ สุวรรณพานิจและปรชี า สุวรรณพานิจ. (2550). with the Folin phenol reagent,” The Journal of จลุ ชีววทิ ยาทั่วไป. ครง้ั ท่ี 6. สํานกั พิมพแ หง Biological Chemistry, vol. 193, no. 1, pp. 265– จฬุ าลงกรณมหาวทิ ยาลัย, กรงุ เทพ. 735 น. 275, 1951. Mendpara J., Parekh V., Vaghela S., Makasana A., ปานใจ สารพันโชตวิ ิทยา และคณะ. (2556). พัฒนาพน้ื ท่ีดนิ Kunjadia P.D., Sanghvi G., Vaishnav D. and เค็มในภาคตะวนั ออกเฉียงเหนอื จงั หวดั รอ ยเอ็ด.สํานัก ‘Dave G.S. (2013), Isolation and ทรพั ยากรแร กรมทรัพยากรธรณี , น. 8-13. characterization of high salt tolerant bacteria from agricultural soil. European Journal of สมศกั ดิ์ วังใน. (2524), จุลินทรยี และกจิ กรรมในดนิ . Experimental Biology, 3(6):351-358. ภาควิชาปฐพวี ทิ ย, มหาวิทยาลยั เกษตรศาสตร, Murphy, J. and J.P. Riley. (1985). A single solution กรงุ เทพฯ, 119 น. method for the determination of soluble phosphate in sea water. J. Mar. Biol. Assoc. UK. สพุ ตั รา รกั ษว งษ. (2558). การคดั เลือกเชือ้ แบคทเี รยี ละลาย 37:9-14. ฟอสเฟตประสทิ ธิภาพสงู จากดนิ รอบรากขา วไรที่ปลกู Nautiyal C. S. (1999), An efficient microbiological ในตําบลปรงั เผล อาํ เภอสังขละบุรี จงั หวดั กาญจนบรุ ี. growth medium for screening phosphate 4-61 solubilizing microorganisms. FEMS Microbiol, Lett.170, 265-270. สภุ าพร จนั รุง เร่อื ง เบญจมาส รสโสภา และกรรณกิ าร สจั จา Rodríguez H, Fraga R. (1999), Phosphate solubilizing พันธ. (2553). ผลของแบคทเี รยี ละลายฟอสเฟต bacteria and their role in plant growth Burkholderia sp. สายพันธุ Rs01 ตอ การเจรญิ เติบโต prootion. Biotechnol Adv;17:319. ของขาวโพดหวานพนั ธอุ นิ ทรยี  2. วทิ ยาสาร Norman, B.W. (1984), Report on the Comparison กําแพงแสน. 8: 1-14. of New and Old Development Areas.Thai- Australia-World Bank Land Development องคการบรหิ ารสว นตาํ บลนาสีนวน. (2554), สภาพและ Project, Chiang Mai, Thailand 339. ขอ มลู พนื้ ฐานของตาํ บลนาสนี วน. องคก ารบรหิ ารสวน Smith, R.F and R. van den Bosch . (1967), ตําบลนาสนี วน จังหวัดมหาสารคาม Integrated ontrol. Pest Control. Edited by W. Kilgoreand R. doutte. Academic Prees, 298-299 อานัฐ ตันโช. 2550, เกษตรธรรมชาตปิ ระยกุ ต บทบาทและ p. ความสาํ คญั ของจลุ ินทรียในการเกษตร. ศนู ยขอมลู Tamura, K., Nei, M. (1993). Estimation of the เกษตรธรรมชาติแมโจ มหาวิทยาลัยแมโจ number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990). Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology, 215, 403–410. APHA-AWWA-WEF (1995) Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 19th Edition, Washington DC. Arbhabhirama, A., D, Phantunvanit, J.Elklngton, Phaitoon Jngkasuwan. (1988). Thailand Natural การประชมุ วชิ าการชมรมคณะปฏบิ ัตงิ านวิทยาการ อพ.สธ. ครง้ั ที่ 9 “ทรัพยากรไทย : ชาวบานไทยไดป ระโยชน”

590 humans and chimpanzees. Molecular Biology predominant anaerobic bacteria in human and and Evolution, 10, 512-526. animal fecal samples. Appl. Environ. Microbiol, Wang, R.F., Cao, W.W., and Cerniglia, C.E. (1996), 62: 1242-1247. PCR detection and quantitation of การประชมุ วชิ าการชมรมคณะปฏบิ ัตงิ านวทิ ยาการ อพ.สธ. ครง้ั ที่ 9 “ทรพั ยากรไทย : ชาวบา นไทยไดป ระโยชน”

591 การคัดเลอื กและการหาสภาวะที่เหมาะสมตอการผลิตเอนไซมอะไมเลสของแบคทีเรยี ที่แยกจากดนิ ในปา นาสีนวน ตําบลนาสีนวน อาํ เภอกนั ทรวิชยั จังหวดั มหาสารคาม SCREENING AND OPTIMIZATION OF AMYLASE PRODUCING BACTERIA ISOLATED FROM SOIL IN NASINUAN FOREST, KANTARAWICHAI DISTRICT, MAHA SARAKHAM PROVINCE มนัสชนก โยชนช ยั สาร*, ศิริรตั น ดีศลี ธรรม, เกศสคุ นธ มณวี รรณ และ วจิ ิตรา หลวงอนิ ทร Manatchanok Yotchaisarn*, Sirirat Deeseenthum, Kedsukon Maneewan and Vijitra Luang-In หนวยวิจยั นวัตกรรมสารตานอนมุ ูลอิสระจากธรรมชาติ ภาควชิ าเทคโนโลยีชวี ภาพ คณะเทคโนโลยี มหาวทิ ยาลยั มหาสารคาม ตําบลขามเรยี ง อําเภอกันทรวชิ ัย จังหวัดมหาสารคาม 44150 Natural Antioxidant Innovation Research Unit, Department of Biotechnology, Faculty of Technology, Mahasarakham University, Khamriang, Kantarawichai, Maha Sarakham 44150 บทคดั ยอ อัลฟา-อะไมเลส (α-amylase, E.C. 3.2.1.1) พบไดทั้งในพืช สัตวและจุลินทรีย เปนเอนไซมที่ทําหนาท่ียอยโมเลกุลแปงที่มี ขนาดใหญบริเวณตําแหนงพันธะ α-1,4-glycosidic เพ่ือใหไดน้ําตาลโมเลกุลขนาดเล็ก จัดเปนหน่ึงในกลุมเอนไซมท่ีทาง อุตสาหกรรมมักนํามาใชอยางแพรหลาย เชน อุตสาหกรรมอาหาร เคร่ืองด่ืม ผลิตลูกกวาด ผลิตเวชสําอาง เปนตน ปา สาธารณะนาสีนวนเปนปาท่ีสภาพดนิ คอนขางเค็มแตม ีความอุดมสมบูรณท างพืชพรรณจึงทําใหสามารถพบความหลากหลาย ของจุลนิ ทรยี ท่ีสามารถผลิตเอนไซมชนดิ ตางๆ ไดรวมถึงเอนไซมอะไมเลสท่ีจะศกึ ษาคร้ังนี้ งานวจิ ัยครง้ั น้จี ึงมงุ ศึกษาแบคทีเรีย ท่ีผลิตเอนไซมอะไมเลสและสภาวะที่เหมาะสมตอการผลิตเอนไซมอะไมเลสจากดินที่แยกไดจากปานาสีนวน ผลการคัดเลอื ก แบคทีเรียที่ผลติ เอนไซมอะไมเลสไดบนอาหาร Starch agar และระบสุ ายพันธแุ บคทีเรียทั้งหมด 32 สายพันธุ โดยสังเกตจาก บริเวณสวนใสรอบโคโลนี ที่พบไดแก Bacillus cereus 3.5AL2 > Bacillus thuringiensis 3.4AL4 > Bacillus cereus 1.4AL3 ตามลําดับ ผลการศึกษาสัณฐานวิทยาของแบคทีเรียทั้ง 3 โอโซเลท คือ แกรมบวกและมีรูปรางทอน ผลการศึกษา ลําดับนิวคลิโอไทดแบคทีเรียทั้ง 3 ไอโซเลทดวยเทคนิคยีน 16S rRNA ใกลเคียงกับ Bacillus cereus และ Bacillus thuringiensis การทดสอบกิจกรรมเอนไซมจากแบคทีเรียท้ัง 3 ไอโซเลท พบวา Bacillus cereus 3.5AL2 มีคากิจกรรม เอนไซมอะไมเลสสงู ท่ีสุด และสภาวะทเ่ี หมาะสมตอการผลิตและการทํางานของเอนไซมอะไมเลส คือ pH 7.0 อณุ หภมู ิ 65 °C มีคา กจิ กรรมเอนไซมอ ะไมเลสสงู ทีส่ ดุ เทากบั 47.15 ± 0.82U/mL Abstract Alpha-amylase (α-amylase, E.C. 3.2.1.1) found in both plants, animals and microorganisms, is an enzyme that acts as a large starch digestion in the α-1,4-glycosidic bond to small molecules of sugar. This enzyme is one of the most widely used in the industry such as food industry, beverages, candy, cosmetic production etc. Nasinuan Forest is a quite salinity but has abundant of vegetation and several of bacteria that can be amylase production. This research aimed to study the amylase producing bacteria and the appropriate conditions for enzyme production of amylase isolated from the soil in Nasinuan Forest. The results of the selection of amylase-producing bacteria on starch agar and identified 32 strains of bacteria found that 3 isolates with the highest Halo : colony ratios by visualized degrading zone around colony including Bacillus cereus 3.5AL2 > Bacillus thuringiensis 3.4AL4 > Bacillus cereus 1.4AL3, respectively. The morphology of all 3 bacterial isolates were gram positive and rod-shaped. Our results of nucleotide sequencing of all 3 isolates with 16S rRNA gene analysis were closest to Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis. In this study, Bacillus cereus 3.5AL2 was exhibited highest amylase activity with the optimum conditions for the production and of amylase were pH 7.0 at 65 °C and show highest amylase activity value of 47.15±0.82 U/mL. คาํ สาํ คัญ: แบคทีเรยี ปานาสนี วน ยีน 16S rRNA อะไมเลส อุตสาหกรรม Keywords: Bacteria, Nasinuan Forest, 16S rRNA gene, Amylase, Industry การประชุมวชิ าการชมรมคณะปฏบิ ัตงิ านวทิ ยาการ อพ.สธ. ครงั้ ที่ 9 “ทรพั ยากรไทย : ชาวบานไทยไดป ระโยชน”

592 *ติดตอ นักวจิ ยั : มนสั ชนก โยชนชัยสาร (อีเมล [email protected]) *Corresponding author: Manatchanok Yotchaisarn (E-mail: [email protected]) บทนํา ไมเลสที่แยกจากแหลงดินบริเวณปานาสีนวนและศึกษาหา แปงประกอบดวยโมเลกุลของอะไมโลสและพอลิเมอร สภาวะทีเ่ หมาะสมตอการผลิตและการทํางานของเอนไซมอะ ไมเลสเพื่อนําไปประยุกตใชในเชิงอุตสาหกรรมตอไป และ ของอะไมโลเพคติน โดยอะไมโลสประกอบดวยสายนํ้าตาล งานวิจัยนี้เปนงานสนองพระราชดําริในโครงการอนุรักษ กลูโคสท่ีเช่ือมกันดวยพันธะไกลโคไซดท่ี α-(1 → 4) พนั ธกุ รรมพืชอนั เนื่องมาจากพระราชดาํ รฯิ ในขณะท่ีอะไมโลเพคตินมี α- (1 → 4) glycosidic bond อุปกรณและวิธีการทดลอง และยงั มี α- (1 → 6) glycosidic branch ซงึ่ อะไมเลสเปน 1. การเกบ็ ตวั อยา งดิน หน่ึงในเอนไซมหลักที่ใชในอุตสาหกรรม โดย α-อะไมเลส (E.C.3.2.1.1) เปนเอนไซมที่ทําหนาที่เรงปฏิกิริยาการยอย เก็บตัวอยางบริเวณปานาสนี วน ตําบลนาสีนวน อําเภอ แปงภายในตําแหนง α-1,4-glycosidic linkages และให กันทรวิชัย จังหวัดมหาสารคาม ประเทศไทย โดยเก็บ โมเลกุลน้ําตาลท่ีมีขนาดเล็กลง คือ นํ้าตาลกลูโคส มอลโตส รวบรวมตัวอยางดินแบบสุมท่ีไดจากพื้นที่ 60 ไร ภาพที่ 1 และมอลโตไตรโอสเปนผลผลิตหลัก (Goyal et. al., 2005) ทําการศึกษาหาคา pH และคาการนําไฟฟาซึ่งสัมพันธกับ เอนไซมอะไมเลสพบไดทั้งในพืช สัตว และจุลินทรีย ความเค็มของดิน โดยละลายตวั อยา งดิน 10 กรัม ในนํ้ากลั่น (Kandra, 2003) เชน แบคทีเรีย และรา (Tanyildiz et. al., ปลอดเชอ้ื ปริมาตร 90 มิลลลิ ิตร 2005) แบคทีเรียสามารถผลติ เอนไซมอะไมเลสท่ีปลดปลอ ย ภายในเซลลหรือปลดปลอยออกนอกเซลลขณะเจริญเติบโต ภาพที่ 1 ตําแหนงเก็บตวั อยา งดิน (A) แผนท่ีตําบลนาสนี วน ทําหนาท่ีเปล่ียนแปงหรือไกลโคเจนใหเปนน้ําตาลซึ่งเปน อําเภอกันทรวิชัย จังหวัดมหาสารคาม (B) ตําแหนงเก็บ แหลงพลังงานและคารบอนท่ีเซลลนําไปใชไดงาย (Mojsov, ตัวอยางดินในเฟสท่ี 1 ซึ่งมพี ้นื ท่ี 60 ไร 2012) เ ช น Bacillus sp. ไ ด แ ก B. subtilis, B. amyloli- 2. การคดั แยกและคัดกรองแบคทเี รยี ที่ผลิตเอนไซมอะไมเลส quefaciens, B. licheniformis, B. coagulans, B. poly- myxa, B. mesentericus, B. vulgaris, B. megaterium, ละลายตัวอยางดิน 10 g ใน 0.85% NaCl ปลอดเช้ือ B. cereus, B. halodurans, และ Bacillus sp. ปริมาตร 90 ml ทํา serial dilution แลวปเปตสารละลาย ดินปริมาตร 100 µL เกลี่ยลงบนอาหาร starch agar เอนไซมอะไมเลสแบง ออกเปน 2 ประเภท ไดแ ก endo- ประกอบดวย (g/L) 3.0 Beef extract, 10.0 Soluble amylases และ exo-amylases โดย endo-amylases เรง Starch, 15.0 Agar บมที่อุณหภูมิ 37 °C เปนเวลา 72 ปฏิกิริยาไฮโดรไลซแบบสุมบริเวณภายในของโมเลกุลแปง ชั่วโมง จากนั้นเติม 0.3% I2 ที่ผสม 0.6% KI solution ให สงผลใหไดน้ําตาลกลุม oligosaccharides ประกอบดวย ทวมจานเพาะเชื้อและสังเกตบริเวณสวนใสรอบๆ โคโลนี โมเลกุลของนํ้าตาลประมาณ 2-10 หนวย สวน exo- amylases จะเรงปฏิกริ ิยาไฮโดรไลซบ ริเวณ non-reducing sugar จงึ ทาํ ใหไ ดน ้ําตาลที่มีโมเลกุลหนวยเล็กๆ (Naidu and Saranraj, 2013) เอนไซมอะไมเลสเปนหน่ึงในเอนไซมท่ี สําคัญที่สดุ และบทบาททางเทคโนโลยชี วี ภาพประมาณ 25% ของตลาดเอนไซมทั่วโลก (Rao and Satyanarayana, 2007) ซึ่งการประยุกตใชเอนไซมอะไมเลสสามารถนําไปใช ในทางอุตสาหกรรมอาหารสามารถนาํ ไปผลติ ขนมหวาน การ ผลติ ลูกกวาด การผลติ เคก น้ําผลไมและนาํ้ เช่อื ม เปนตน ปาสาธารณนาสีนวน ตั้งอยูท่ีตําบลนาสีนวน อําเภอ กันทรวิชัย จังหวัดมหาสารคาม ประเทศไทย เปนปาท่ี คอนขางมีความอุดมสมบูรณทางพรรณไมแตบริเวณดิน ดังกลา วเปน ดินคอนขา งเคม็ เพราะมีคา ความเค็มอยูประมาณ 1-1.15 % NaCl เร่ิมสงผลตอการเจริญของพืชท่ีเจริญใน บริเวณดังกลาว (กรมชลประทาน, 2554) ดังนั้น งานวิจัยนี้ จึงมุงศกึ ษาแบคทเี รียทมี่ ีความสามารถในการผลติ เอนไซมอะ การประชุมวชิ าการชมรมคณะปฏบิ ตั ิงานวิทยาการ อพ.สธ. ครง้ั ท่ี 9 “ทรัพยากรไทย : ชาวบา นไทยไดป ระโยชน”

593 จากนน้ั ทําการวัดคา Halo : colony ratio ตามวธิ ีของ Haq มาตรฐาน ผลการทดลองมีความแตกตางอยางมีนัยสําคัญ et. al. (2003) คดั เลอื กโคโลนีทมี่ ีคา Halo : colony ratios เม่ือ p<0.05 สูงที่สุดเปน 3 อันดับแรก มาทําใหบริสุทธ์ิและเพาะเลี้ยง 6. การจําแนกสายพันธุแบคทีเรียโดยวิธี PCR-based 16S แบคทีเรียไอโซเลทในอาหารแข็ง (g/L) 10.0 yeast rRNA gene extract, 5.0 tryptone, 5.0 NaCl แ ล ะ 15.0 agar บ ม ท่ี อุณหภูมิ 37 °C เปนเวลา 18 ช่ัวโมง บันทึกคุณสมบัติทาง เล้ียงเช้ือแบคทีเรียบริสุทธ์ิจาก 20% glycerol stock สัณฐานวิทยาของแตละไอโซเลท ไดแก สี รูปราง ผิวสัมผัส ในอาหารเลย้ี งเชอื้ เหลว 1 มิลลลิ ิตร ขา มคืนเพือ่ การสกัดจีโน ความนูน ขอบของโคโลนี และผลการยอ มแกรม มิกดีเอ็นเอ โดยใช Bacterial Genomic DNA extraction 3. การศึกษาหาสภาวะท่ีเหมาะสมตอการผลิตเอนไซมอะ kit (Vivantis, Malaysia) ทาํ การเพิ่มปริมาณช้ินสว นดเี อน็ เอ ไมเลส เปาหมาย 16S rRNA gene จากจีโนมิกดีเอ็นเอดวยเทคนิค 3.1 การเตรียมหวั เช้ือและการคัดกรองแบคทีเรีย PCR โดยใชไพรเมอรสากล Forward primer คือ 27F 5’- GAGAGTTTGATTCTGGCTCAG- 3’ และ Reverse primer ปรับเช้ือดวยอาหารเหลวใหมีเชื้อเรม่ิ ตน 108 CFU/mL คือ 1524R 5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA -3’ เทคนิค เ ที ย บ กั บ 0.5 McFarland (Franklin et. al., 2012) PCR 1 ปฏกิ ริ ยิ ามีปรมิ าตรรวม 25 µL ประกอบดวย จีโนมกิ เพาะเล้ียงแบคทีเรียท้ัง 3 ไอโซเลท ในอาหารเหลว starch ดีเอ็นเอความเขมขน 0.5 ng สารละลาย 1X Master Mix soluble อิงวิธีการของ Bhaskar et. al. (2011) บมเปน Buffer A 500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 9.1), 0.1% เวลา 24 48 และ 72 ช่วั โมง จากนน้ั ทดสอบหากจิ กรรมของ TritonTMX-100, 200 mM dNTP, 1.5 mM MgCl2 0.2 µM เอนไซมตามวิธีของ คํานวณกิจกรรมของเอนไซมอะไมเลส forward and reverse primer, 0.005 U Taq DNA โดยอางองิ วิธขี อง Haq et. al. (2003) Polymerase และปรับปริมาตรดวยนํ้ากลั่นปลอดเชื้อจนได 3.2 การหาสภาวะที่เหมาะสมตอการทํางานของเอนไซมอะ ปริมาตร 25 µL ใชเครื่อง PCR thermocycler (Thermo ไมเลส Scientific Hybaid Px2) ในการเพิ่มจํานวน 16S rRNA gene ซึง่ มสี ภาวะดังน้ี ขน้ั ตอนการแยกสาย DNA สายคอู อก นํ า crude extract จ า ก ส ภ า ว ะ ท่ี มีกิ จ กร รม ของ จากกัน (denaturation) ที่อุณหภูมิ 94 °C 2 นาที 1 รอบ เอนไซมอะไมเลสสูงที่สุดมาหาสภาวะท่ีเหมาะสมตอการ จากนั้นต้ังจํานวนรอบ 32 รอบ อุณหภูมิ 94 °C 45 วินาที ทํางานของเอนไซมอ ะไมเลส ข้ันตอนไพรเมอรจ บั ดเี อน็ เอที่อณุ หภูมิ 54 °C 45 วนิ าที การ สังเคราะหด ีเอ็นเอท่ีอุณหภูมิ 72 °C 1 นาที และเพิ่มจาํ นวน 1) ผลของ pH ตอ การทาํ งานของเอนไซมอ ะไมเลส ลําดับนิวคลิโอไทดสุดทายที่ 72 °C 7 นาที และเก็บ PCR นํา crude extract ของแบคทเี รยี ท่ีคัดเลอื กไวแลว จาก product ไวท่ี-20 °C จากนั้นตรวจสอบดีเอ็นเอดวย ขอ 3.2 แปรผัน pH ของบัฟเฟอรเปน 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, เทคนิคอะกาโรสเจลอิเล็กโทรโฟรีซีส โดยเตรียม 0.8% 7.0, 8.0, 9.0 และ 10.0 บมที่อุณหภูมิ 37 °C เปนเวลา 30 agarose gel ละลายใน 1X TBE buffer pH 8.0 ปริมาตร นาที จากนน้ั วิเคราะหกจิ กรรมของเอนไซมอ ะไมเลส 40 หรอื 100 ml ดวยความรอ นจากนนั้ ทําใหเ ยน็ ทีอ่ ุณหภูมิ 2) อุณหภมู ติ อ การทาํ งานของเอนไซมอะไมเลส 55 °C เติมสี SYBR Safe dye (Invitrogen) ในอัตราสวน นําสวนใสของแบคทีเรียที่คัดเลือกไดแลวใน pH ที่ 0.5 µl/สารละลายเจล 40 ml เขยาและผสมในสารละลาย เหมาะสมจากขอ 1) บมแปรผันอุณหภูมิตั้งแต 4, 25, 35, เจลโดยทั่วแลวเทเจลลงในถาดเจล (gel chamber) ท้ิงใหเจ 45, 55, 65, 75, 85 และ 95 °C เปนเวลา 30 นาที จากนั้น ลแข็งตัวที่อุณหภูมิหองผสมสารละลายจีโนมิกดีเอ็นเอ 1 µg วเิ คราะหกิจกรรมของเอนไซมอะไมเลส กับ 6X Loading dye ในอัตราสวน 2:1 โดยปริมาตร ใช 4. การวเิ คราะหหาปรมิ าณโปรตีน lambda DNA 100 ng เปนดีเอ็นเอมาตรฐานเมื่อเทียบ วิเคราะหหาปริมาณโปรตีนดวยวิธี Lowry’s method ขนาดดีเอ็นเอใชกระแสไฟฟาท่ีมีความตางศักยไฟฟา 80 (Lowry et. al., 1951) โดยอาศัยกราฟมาตรฐาน ขอ ง โวลต เปนเวลา 30 นาที ตรวจแถบดีเอ็นเอผานเคร่ือง Gel Bovine Serum Albumin (BSA) documation (SYNGENE) สกัด PCR product บริสุทธ์ิโดย 5. การวิเคราะหทางสถิติ ใช PCR purification kit (Vivantis, Malaysia) จากนั้นสง ทําการทดลองซํ้า 3 ครั้ง และวิเคราะหขอมูลทางสถิติ PCR product ไปวเิ คราะหล ําดับ นวิ คลโี อไทดท บ่ี ริษัท First โดยดําเนินการในรูปแบบของการวิเคราะห One-Way BASE Co. Ltd. (ประเทศมาเลเซีย) วิเคราะหความเหมือน Analysis Of Variance (One-way ANOVA) ต า ม วิ ธี ของลาํ ดับนิวคลโี อไทดก ับฐานขอ มลู วามคี าความเหมือนหรือ Duncan Multiple Range’s Test อาศัยโปรแกรม SPSS คลายคลึงกับดีเอ็นเอของแบคทีเรียชนิดใดในฐานขอมูลโดย Statistics Ver. 17.0 แสดงผลในคาเฉลี่ย ± สวนเบ่ียงเบน การประชมุ วิชาการชมรมคณะปฏบิ ัตงิ านวทิ ยาการ อพ.สธ. ครัง้ ที่ 9 “ทรัพยากรไทย : ชาวบา นไทยไดป ระโยชน”

594 ใ ช โ ป ร แ ก ร ม BLAST (Basic Local Alignment Search phoresis (1,500 bp) ผลการทดลองพบวา Bacillus Tools) จากฐานขอมูล NCBI (Altschul et. al., 1990) โดย cereus 1.4AL3 ใ ก ล เ คี ย ง กั บ Bacillus cereus B1 9 เลือกเชือ้ ที่มีคาเปอรเซน็ ตค วามเหมือนสงู ทส่ี ุด (% Identity) (accession no. MK229038.1) รอยละ 99 จากธัญพืชใน และคา Max score สูงที่สุด ผลของการจัดลาํ ดบั เบส partial ประเทศอิสราเอล Bacillus thuringiensis 3.4AL4 ใกลเคียง 16S rRNA sequence จะนําไปสรางแผนภูมิวิวัฒนาการ กับ Bacillus thuringiensis BD17-E12 (accession no. ( Phylogenetic tree) ด ว ย วิ ธี Maximum Likelihood HF584771.1) รอยละ 99 จากรากพืชในประเทศอติ าลี และ method ข อ ง Tamura-Nei model (Tamura and Nei, Bacillus cereus 3.5AL2 ใกลเคียงกับ Bacillus cereus 1993) โ ด ย ใ ช โ ป ร แ ก ร ม MEGA 7.0 (www.megasoft SP1-AB4 (accession no. MH013307.1) รอยละ 99 จาก ware.net) โดยใช Bootstrap จํานวน 1,000 ซ้ํา ฟองนาํ้ ในประเทศแอฟรกิ าใต (ตารางที่ 3) ผลและวจิ ารณผลการทดลอง 1. ขอมูลตัวอยางดินที่เก็บจากบริเวณปานาสีนวน ตําบล เทคนิคการแยกสารประเภทโปรตีนดวย Agarose gel นาสนี วน อาํ เภอกันทรวิชยั จงั หวดั มหาสารคาม electrophoresis เปนวิธีที่มีประสิทธิภาพและประสิทธิผล ในการแยกกรดนิวคลีอิก โดยทั่วไปยิ่งความเขมขนของ ผ ล ก า ร ศึ ก ษ า ค า pH แ ล ะ ค า ก า ร นํ า ไ ฟ ฟ า ท่ี มี agarose สูงมากเทาใดขนาดของรูพรุนก็จะยิ่งเล็กลงเทาน้ัน ความสัมพันธกับความเค็มของตัวอยางดินท่ีเก็บมาจาก อะกาโรสเจลแบบด้ังเดิมนั้นมีประสิทธิภาพสูงสุดเมื่อแยก บริเวณปา นาสนี วน ตําบลนาสีนวน อาํ เภอกันทรวชิ ยั จงั หวัด ช้ินสวนดีเอ็นเอระหวาง 100 bp และ 25 kb สวนช้ินสวนดี มหาสารคาม พบวา แบคทีเรียท่ีคัดเลือกไดทั้ง 3 สายพันธุ เอ็นเอที่มีขนาดเล็กกวา 100 bp จะถูกแยกออกไดอยางมี มาจากจุดดินที่ 1.4 3.4 และ 3.5 ซ่ึงมีคา pH ประมาณ 5-6 ประสิทธิภาพยิ่งข้ึนโดยใช polyacrylamide gel electro- ถือวาคอนขางมีความเปนกรดคอนมาทางดาง สงผลใหมีคา phoresis (Lee et. al., 2012) การนําไฟฟา 2-3 µS/m และมีคาความเค็มประมาณ 0.1 % NaCl ถือวาดนิ ทเ่ี กบ็ จากจุดดนิ ดังกลาวดงั กลาวมีระดบั ความ แผนภูมิวิวัฒนาการของส่ิงมชี ีวิต (Phylogenetic tree) เคม็ เลก็ นอ ย แตเ ร่ิมมีผลตอ พืชไมท นเคม็ ตารางที่ 1 ที่แสดงความสัมพันธระหวางยีน 16S rRNA เนื่องจากยีน 16S rRNA เปนยีนท่ีมีขนาดใหญและมีการเปลี่ยนแปลงของ ดิน เปนแหลงอาศัยและมีความหลากหลายของ วิวัฒนาการในแตละชวงนอยมากจึงทําใหเปนที่นิยมในการ จุลินทรียที่สามารถผลิตเอนไซมตางๆ ปาสาธารณนาสีนวน นํามาระบุสายพันธุของสิ่งมีชีวิตและสามารถนําไปเชื่อมโยง ตําบลนาสีนวน อําเภอกันทรวิชัย จังหวัดมหาสารคาม หาวิวัฒนาการของสง่ิ มชี ีวิตได (Janda and Abbott, 2007) จัดเปนพ้ืนที่ปาท่ีดินคอนขางเค็ม (คา EC ต่ํากวา 0.2 % ผลการหาวิวัฒนาการของเชื้อทั้ง 3 ไอโซเลท กับเชื้อ NaCl) แตมีความอุดมสมบูรณ โดยปกติคาการนําไฟฟาของ แบคทีเรีย Bacillus sp. อีก 3 สายพันธุ โดยใชโปรแกรม ดิน (Electrical Conductivity : EC) มีคาตํ่ากวา 2 กระท่ัง MEGA 7.0 พบวาทั้ง 3 ไอโซเลท มีวิวัฒนาการใกลเคียงกับ มากกวา 16 µS/m เปนตนไป (กรมชลประทาน, 2554) คา แบคทีเรียท่ีผลิตเอนไซมอะไมเลสทั้งสิ้น 3 สายพันธุ (ภาพท่ี การนําไฟฟาของดินต้ังแต 2 ขึ้นไป เร่ิมสงผลตอพืชที่เจริญ 2) โดย Bacillus cereus 1.4AL3 มีวิวัฒนาการใกลเ คียงกับ รอบๆ เพราะจะทําใหพืชดูดซึมและเกิดการสะสมแรธาตุทํา Bacillus cereus gp-8 (NCBI accession no.MK6428 ใหพชื ขาดนาํ้ และสรางความเสยี หายตอ การเกษตร 86.1) จ า ก ดิ น ใ น ป ร ะ เ ท ศ จี น Bacillus thuringiensis 2. การคดั แยกแบคทเี รยี ท่ีผลติ เอนไซมอ ะไมเลส 3.4AL4 มีวิวัฒนาการใกลเคียงกับ Bacillus thuringiensis BD17-E12 (NCBI accession no. HF584771.1) จากราก จากการคัดแยกแบคทีเรียที่ผลิตเอนไซมอะไมเลสบน องุนในประเทศอิตาลี และ Bacillus cereus 3.5AL2 มี อาหารแข็ง Starch agar บมเปน เวลา 3 วัน พบแบคทเี รีย 3 วิวัฒนาการใกลเคียงกับ Bacillus cereus 20.SH.1 (NCBI ไอโซเลท ไดแก 1.4AL3 3.4AL4 และ 3.5AL2 มีคา Halo: accession no. MG776355.1) จากรากพืชในปร ะ เ ท ศ colony ratio สูงที่สุดเปน 3 อันดับแรก สังเกตจากบริเวณ อิหราน สวนใสรอบโคโลนีหลังทดสอบดวยการหยดสารละลาย I2-KI โดย 3.5AL2 > 3.4AL4 > 1.4AL3 ตามลําดับ และทดสอบ ลกั ษณะสัณฐานวทิ ยาของโคโลนีเบ้ืองตนที่คดั เลอื กได พบวา ทั้ง 3 ไอโซเลท (1.4AL3 3.4AL4 และ 3.5AL2) มีรูปราง ทอนและติดสีแกรมบวกตารางท่ี 2 ผลการระบุสายพันธุของ แบคทีเรียท้ัง 3 ไอโซเลท โดยอาศัยเทคนิคยีน 16S rRNA และวิเคราะหgene product บน agarose gel electro- การประชมุ วิชาการชมรมคณะปฏบิ ัตงิ านวิทยาการ อพ.สธ. ครั้งท่ี 9 “ทรพั ยากรไทย : ชาวบา นไทยไดป ระโยชน”

595 B. cereus 1.4AL3 B. cereus gp-8 6 2 B. cereus 20.SH.1 B. thuringiensis BD17-E12 B. cereus 3.5AL2 B. thuringiensis 3.4AL4 0.00050 ภาพท่ี 2 แผนภูมิวิวฒั นาการของแบคทีเรียทงั้ 6 สายพนั ธุ ตารางที่ 1 ขอ มูลตวั อยางดนิ ทีเ่ กบ็ จากบรเิ วณปา นาสนี วน ตาํ บลนาสีนวน อาํ เภอกนั ทรวิชยั จังหวดั มหาสารคาม สภาพแวดลอมบรเิ วณ คา การนําไฟฟาของดนิ ตาํ แหนงทเี่ กบ็ ตัวอยางดนิ ตาํ แหนง ท่ีเก็บตัวอยา งดิน (โมโครซเี มนส/เซนติเมตร) 1.4 ตระกลู สัก พบปลวก 2.09 (N 16 20 23.547, E 103 12 35.244) เค็มเลก็ นอย (0.1% NaCl) 3.4 ใตต นครก 2.42 (N 16 20 35.425, E 103 12 35.178) เค็มเล็กนอย (0.1% NaCl) 3.5 บริเวณเหด็ ไคลเกดิ 2.35 (N 16 20 36, E 103 12 36) (ขดุ ลกึ 15 cm) เคม็ เลก็ นอ ย (0.1% NaCl) การประชมุ วชิ าการชมรมคณะปฏบิ ตั งิ านวิทยาการ อพ.สธ. คร้งั ท่ี 9 “ทรพั ยากรไทย : ชาวบา นไทยไดป ระโยชน”

596 ตารางที่ 2 สณั ฐานวทิ ยาของแบคทีเรยี ท่ผี ลติ เอนไซมอ ะไมเลส 3 ไอโซเลท สณั ฐานวิทยาของเชอ้ื ไอโซเลท สัณฐานวทิ ยาโคโลนี Halo : colony ratio 1.4AL3 Filamentous Effuse Contoured Entire Dull 1.60 แกรมบวก ทอนสัน้ 3.4AL4 Irregular Flat 1.78 แกรมบวก ทอนสัน้ Smooth Erose Opaque Irregular Pulvinate 3.5AL2 Rougose Erose Dull 1.86 แกรมบวก ทอน ตารางที่ 3 สายพันธุข องแบคทีเรยี ทผ่ี ลติ เอนไซมอ ะไมเลส 3 ไอโซเลท ไอโซเลท Closest relative* Accession No.* %Identity* แหลง ทพี่ บ 1.4AL3 Bacillus cereus B19 MK229038.1 99 Wheat grain, Israel 3.4AL4 Bacillus thuringiensis HF584771.1 99 Grapevine root system, BD17-E12 3.5AL2 Bacillus cereus MH013307.1 99 Italy SP1-AB4 Unidentified marine หมายเหตุ * BLAST search บนฐานขอ มูล NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) sponge 1, South Africa 3. สภาวะทเ่ี หมาะสมตอการทํางานของเอนไซมอ ะไมเลส ทํางานของเอนไซมอะไมเลส พบวา pH ที่เหมาะสมตอการ จากการศึกษาหาสภาวะท่ีเหมาะสมตอการทํางานของ ผลิตเอนไซมอะไมเลสและมีคากิจกรรมของเอนไซมอะไมเล สสูงที่สุดคือ pH 7.0 เทากับ 35.84±0.33 U/mL และ เอนไซมอะไมเลสท่ีใหคากิจกรรมของเอนไซมอะไมเลสสูง อุณหภูมิท่ีเหมาะสม คือ 65 °C มีคา กิจกรรมเอนไซมอะไมเล ท่ีสุด โดยเหน่ียวนําการผลิตเอนไซมอะไมเลสดวยสารตั้งตน สสูงท่สี ุดเทา กับ 47.15±0.82 U/mL หลังบม crude extract 1% สารละลายแปงบมท่ีอุณหภูมิ 37 °C ท่ีระยะเวลาตางๆ กับสารต้ังตน 1% สารละลายแปงเปนเวลา 30 นาที เพื่อ ไดแก 24 48 และ 72 ช่ัวโมง ตามลําดับ พบวา Bacillus กระตุนใหเอนไซมอะไมเลสเรงปฏิกิริยายอ ยสลายสารตั้งตน cereus 3.5AL2 ใหคากิจกรรมเอนไซมอะไมเลสสูงที่สุด 1% สารละลายแปง (ภาพท่ี 3B) แหลงท่ีพบเอนไซม อะ เทากับ 38.98 ± 3.11 U/mL หลังบมท่ีอุณหภมู ิ 37 °C เปน ไมเลสนั้นสามารถพบไดท้ังใน พืช สัตว หรือจุลินทรีย จาก เวลา 72 ช่ัวโมง (ภาพท่ี 3A) เม่ือนํา crude extract ของ บริเวณแหลงดินจุดท่ี 3.5 (N 16 20 36, E 103 12 36) ซ่ึง Bacillus cereus 3.5AL2 ไปหาสภาวะท่ีเหมาะสมตอการ การประชมุ วชิ าการชมรมคณะปฏบิ ตั ิงานวทิ ยาการ อพ.สธ. ครั้งที่ 9 “ทรัพยากรไทย : ชาวบานไทยไดป ระโยชน”

597 เปนบรเิ วณทพี่ บเห็ดไคลเกดิ (ขุดลึก 15 cm) คา pH เทา กบั sp. นี้มักนิยมใชกันท่ัวไปในการผลิตอะไมเลสท่ีอุณหภูมิ 37- 5.39 ซ่ึงเอื้อตอการเจริญและผลิตเอนไซมข องจุลินทรียกลมุ 65 °C (Asghar et. al., 2007) และใชกันอยางแพรหลายใน แบคทเี รีย เชิงพาณิชย และทางอุตสาหกรรม ไดแก อุตสาหกรรมผลิต เคร่ืองด่ืมท่ีมีแอลกอฮอล อุตสาหกรรมผลิตช็อคโกแลต จากการรายงานกอนหนานี้ของ Gebreyohannes อุตสาหกรรมผลิตส่ิงทอ เปนตน (Naidu and Saranraj, (2015) ศึกษาสภาวะที่เหมาะสมของแบคทีเรียท่ีแยกไดจาก 2013) นอกจากนี้อัตราการกวน กระบวนการหมักท่ี ดินบริเวณมหาวิทยาลัย โดยเพาะเล้ียง Bacillus spp. ใน เหมาะสม แหลงพลังงานท่ีเหมาะสม หรือแมกระท่ัง อาหารเหลวที่มี 0.1% สารละลายแปง บมที่อุณหภูมิตางๆ กระบวนการทําใหเอนไซมบริสุทธ์ิก็จะยิ่งสงเสริมใหเกิดการ ตั้งแต 25-45 พบวา Bacillus spp. มีกิจกรรมของเอนไซม กระตุนการผลิตเอนไซมอะไมเลสทีม่ ี ประสิทธิภาพได สูงท่ีสุดเทากับ 3.5 U/mL ที่อุณหภูมิ 40 °C คา pH 7 สรุปผลการทดลอง ทํานองเดียวกับการรายงานของ Vaidya and Rathore (2015) รายงานถึงสภาวะท่ีเหมาะสมของแบคทเี รยี ทค่ี ัดแยก งานวิจัยคร้ังนี้เปนการรายงานคร้ังแรกที่ศึกษาการคัด ไดจากดิน โดยสภาวะที่เหมาะสมคืออุณหภูมิ 40 °C คา pH แยกและหาสภาวะที่เหมาะสมของแบคทีเรียท่ีผลิตเอนไซม 7 ซึ่งผลการศึกษาครงั้ นี้กลับใหคา ที่มากกวา ณ อุณหภูมิ 65 อะไมเลสจากตัวอยางดินในพน้ื ที่ปา สาธารณนาสีนวน ตําบล °C pH 7.0 เทากับ 47.15±0.82 U/mL จะเห็นไดวาความ นาสีนวน อําเภอกันทรวิชัย จังหวัดมหาสารคาม ประเทศ เขมขนของสารตั้งตน pH และอุณหภูมิมักมีอิทธิพลตอการ ไทย แบคทีเรียท่ีคัดแยกไดมีท้ังหมด 3 ไอโซเลท หลังศึกษา เจรญิ ของเชือ้ แบคทีเรยี ที่ผลิตเอนไซมอ ะไมเลส หากยิง่ มีสาร สัณฐานวิทยาของโคโลนีท้ัง 3 ไอโซเลท พบวามีรูปรางทอน ตง้ั ตน จาํ นวนมากเทา ไรกย็ ง่ิ เรงใหเ อนไซมสามารถเขาไปยอย แกรมบวกทั้งหมด และผลวิเคราะหลําดับนิวคลีโอไทดของ สลายสารตั้งตนไดดีมากเทาน้ันสงผลใหคากิจกรรมของ แบคทีเรียท่ีผลิตเอนไซมอะไมเลสเหลาน้ันพบวาสวนใหญมี เอนไซมอะไมเลสสูงข้ึนตามไปดวย รวมถึงการเพาะเลี้ยง สายพันธุใกลเคียงกับ Bacillus sp. โดย Bacillus cereus แบคทีเรยี ในสภาวะท่เี ออ้ื ตอการเจรญิ 3.5AL3 มคี ากจิ กรรมของเอนไซมอ ะไมเลสหลังคดั กรองผาน อาหารเหลว และจากการศึกษาสภาวะที่เหมาะสมตอการ ปจจุบันจึงนิยมศึกษาสภาวะท่ีเหมาะของการผลิตและ ทํางานของเอนไซม อะไมเลสพบวา สภาวะท่ีเหมาะสมตอ การทํางานของเอนไซมอะไมเลสควบคูกันไป เนื่องจากหาก การทาํ งานของเอนไซมอ ะไมเลสคือ pH 7.0 อณุ หภมู ิ 65 °C ตองนําไปประยุกตใชในงานดานอุตสาหกรรมตางๆ มักจะ เพราะฉะนั้นเอนไซมอะไมเลสที่ไดจากแบคทีเรียเหลาน้ี ตองทราบขอมูลที่ถูกตองและสามารถนําไปใชไดจริงเพื่อ สามารถนําไปใชในการผลิตเครื่องด่ืมที่มีแอลกอฮอลโดย ปอ งกนั มใิ หเกิดการสูญเสียมลู คา หรอื ตน ทนุ การผลิต อาศัยการเปลยี่ นโมเลกุลแปงที่มขี นาดใหญใหไดเปน โมเลกลุ ของน้าํ ตาลท่ีมีขนาดเล็กทีเ่ ปนสารตั้งตน ในการผลติ เครื่องดื่ม ขอไดเปรียบของการนําแบคทีเรียมาเหนี่ยวนําใหผลิต การนําไปใชในทางอุตสาหกรรมผลิตขนมเคกเพื่อเพ่ิมความ เอนไซมอะไมเลส คือ สามารถเพาะเล้ียงไดในอาหารท่ีมี หวาน การผลิตนํ้าเช่ือมหรือไซรัปท่ีไดจากผลไม แมกระท่ัง ตนทุนต่ํา การนําวัสดุเหลือท้ิงทางการเกษตร เชน ชานออย สามารถนําไปใชในทางการแพทยเพื่อผลิตเวชสําอางสําอาง กากนํ้าตาล มาใชเปนสารต้ังตน ในการผลิตเอนไซมอะไมเลส ตา งๆ ตวั อยางเชอื้ แบคทเี รียทางการคาทนี่ ิยมนํามาผลติ เอนไซมอะ ไมเลส เชน Bacillus amyloliquefaciens B. subtilis B. licheniformis และ B. stearothermophilus ซ่งึ Bacillus การประชุมวิชาการชมรมคณะปฏบิ ตั ิงานวิทยาการ อพ.สธ. ครงั้ ท่ี 9 “ทรัพยากรไทย : ชาวบา นไทยไดป ระโยชน”

598 A Amylase activity (U/ml) 24 h 48 h 50 72 h 40 30 20 10 0 1.4AL3 B. cereus 3.5AL2 3.4AL4 B. cereus thuringiensis B B. 40Amylase activity (U/ml) 30Amylase activity (U/ml) 20 10 0 3 4 5 6 7 8 9 10 pH C 80 60 40 20 0 4 25 35 45 55 65 75 85 95 Temperature (°C) ภาพท่ี 3 กิจกรรมของเอนไซมอ ะไมเลสจากแบคทีเรยี ทค่ี ัดเลอื กได (A) กิจกรรมของเอนไซมไลเปสของแบคทีเรีย 3 ไอโซเลท ท่ีบมในระยะเวลา 24 48 และ 72 ช่ัวโมง ตามลําดับ (B) กิจกรรมของเอนไซมอะไมเลสของ B. cereus 3.5AL2 บมในสารละลายบัฟเฟอรท่ี pH ตางๆ และ (C) กิจกรรมของเอนไซมอะไมเลสของ B. cereus 3.5AL2 บมในอุณหภมู ติ างๆ ในสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอรทม่ี ี 1% สารละลายแปง ท่ี pH 7.0 คําขอบคณุ Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. and โครงการวิจัยน้ีไดรับการสนับสนุนจากโครงการอนุรกั ษ Lipman, D.J. (1990). Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology, พนั ธุกรรมพืชอันเน่ืองมาจากพระราชดําริฯ ผูวิจยั ขอขอบคุณ 215(3), 403–410. มา ณ ทน่ี ดี้ วย อางองิ Naiduand, M. A. and Saranraj, P. (2013). Bacterial กรมชลประทาน (2554). EC : คาการนําไฟฟาของดิน. Amylase: A Review. International Journal of Pharmaceutical & Biological Archives 2013, สืบคน เมอ่ื วันที่ 15 กุมภาพันธ 2562, จาก 4(2), 274 -287. http://www.ilab.asia/print.aspx?content=00413. Asghar, M., M.J. Asad, S.U. Rahman and R.L. Legge Lee, P.Y., Costumbrado, J., Hsu, C.Y. and Kim, Y.H. (2007). A thermostable α-amylase from a (2012). Agarose Gel Electrophoresis for the moderately thermophilic Bacillus subtilis strain Separation of DNA Fragments. Journal of for starch processing. J. Food. Eng., 79: 950– visualized experiments, 62, 3923. 955. Haq, I.U., Ashraf, H., Iqbal, J. and Qadeer, M.A. (2003). Production of alpha amylase by การประชมุ วิชาการชมรมคณะปฏบิ ัติงานวทิ ยาการ อพ.สธ. ครั้งท่ี 9 “ทรพั ยากรไทย : ชาวบา นไทยไดป ระโยชน”

599 Bacillus licheniformis using an economical methodology. Process Biochemistry, 40(7), medium. Bioresource Technology, 87(1), 57– 2291–2296. 61. Mojsov, K. (2012). Microbial α-amylases and their Tamura, K. and Nei, M. (1993). Estimation of the industrial applications: a review. International number of nucleotide substitutions in the Journal of Management, IT and Engineering, control region of mitochondrial DNA in 2(10), 583-609. humans and chimpanzees. Molecular Biology Gebreselema, G. (2015). Isolation and optimization and Evolution, 10(3), 512–526. of amylase producing bacteria and Janda, J.M. and Abbott, S.L. (2007). 16S rRNA gene actinomycetes from soil samples of Maraki sequencing for bacterial identification in the and Tewedros campus, University of Gondar, diagnostic laboratory: Pluses, perils, and North West Ethiopia. African Journal of pitfalls. Journal of Clinical Microbiology, 45(9), Microbiology Research, 9(31), 1877–1882. 2761–2764. Bhaskar, R., Gaurav, K. and Ashwini, K. (2011). Franklin, R. Cockerill III, Wikler, M.A., Alder, J., Optimization, production and partial Dudley, M.N., Eliopoulos, G.M., Ferraro, M.J., purification of extracellular α-amylase from Hardy, D.J., Hecht, D.W., Hindler, J.A., Patel, Bacillus sp. Marini. Archives of Applied Science J.B., Powell, M., Swenson, J.M., Thomson, R.B., Research, 2011, 3(1), 33-42. Traczewski, M.M., Turnidge, J.D., Weinstein, Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, L. and Randall, M.P. and Zimmer, B.L. (2012). Methods for R.J. (1951). The folin by oliver. The Journal of Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Biological Chemistry, 193(1), 265–275. Bacteria That Grow Aerobically; Approved Vaidya, S., and Rathore, P. (2015). Isolation, Standard—Ninth Edition. Clinical and Screening and Characterization of Amylase Laboratory Standards Institute, 12, 1-88. Producing Bacteria From Soil of Potato Dump Goyal, N., Gupta, J. K., and Soni, S. K. (2005). A Sites From Different Regions of Madhya novel raw starch digesting thermostable α- Pradesh, Life Science International research amylase from Bacillus sp. I-3 and its use in the journal, International conference on recent direct hydrolysis of raw potato starch. Enzyme trends in agriculture, veterinary and life and Microbial Technology, 37(7), 723–734. sciences, 1-7. Kandra, L. (2003). α-Amylases of medical and Rao, J.L.U.M. and Satyanarayana, T. (2007). industrial importance. Journal of Molecular Improving production of hyperthermostable Structure: THEOCHEM, 666–667, 487–498. and high maltose-forming α-amylase by an Tanyildizi, M. S., Özer, D. and Elibol, M. (2005). extreme thermophile Geobacillus Optimization of α-amylase production by thermoleovorans using response surface Bacillus sp. using response surface methodology and its applications. Bioresource Technology, 2007(98), 345–352. การประชุมวิชาการชมรมคณะปฏบิ ัตงิ านวิทยาการ อพ.สธ. ครง้ั ที่ 9 “ทรัพยากรไทย : ชาวบา นไทยไดป ระโยชน”

600 การคดั เลือกจุลนิ ทรียที่มปี ระโยชนใ นพื้นทปี่ กปก พนั ธกุ รรมพืช อพ.สธ. – หนองระเวียง : แบคทเี รยี สรางสารพิษฆาแมลง SCREENING OF BENEFICIAL MICROORGANISMS FROM CONSERVE FORESTS, RSPG - NONGRAWIANG CENTER : INSECTICIDAL PROTEIN PRODUCING BACTERIA รสาภริ ส สมวัชรจติ * และ จดิ าภา สงิ สาธร Rasapirose Somwatcharajit* and Jidapa Singsathorn สาขาชวี วิทยาประยกุ ต คณะวิทยาศาสตรและศลิ ปศาสตร มหาวทิ ยาลยั เทคโนโลยรี าชมงคลอสี าน จังหวดั นครราชสมี า 30000 Department of Applied Biology, Faculty of Science and Liberal Art, Rajamangala University of Technology Isan, Nakhon Ratchasima, 30000 บทคดั ยอ ไดแบคทีเรียสรางสปอรจากพ้ืนท่ีปาปกปกพันธุกรรมพืช มทร. อีสาน ภายใตโครงการโครงการอนุรักษพันธุกรรมพืชอัน เนื่องมาจากพระราชดําริ สมเด็จพระเทพรัตนราชสุดาฯ สยามบรมราชกุมารี (อพ.สธ.) ต. หนองระเวียง จ. นครราชสีมา โดยนําตัวอยา งมาเพิม่ ปริมาณแบคทเี รียในอาหารกระตนุ การสรางสปอร (NYSM) เปน เวลา 2-3 วัน ใหค วามรอ นเพื่อกําจดั เช้ือท่ีไมสรางสปอร คัดเลือกเชื้อได 364 ไอโซเลต ตรวจหา crystal และ cytotoxic toxin gene (cry และ cyt) ดวยวิธี PCR โดยใชไพรเมอร 7 คู ตรวจสอบยีน 8 ยีน (ไพรเมอรท่ีจําเพาะตอยีน cry1 cry2 cry3 cry4 cry7-8 cry11 และ cyt1A) พบวา มี 4 ไอโซเลตท่ีพบยีน cry1 และ cry2 (IP001 IP002 IP003 และ IP007) มี 10 ไอโซเลตท่ีพบยีน cry3 (II015 II017 II018 II099 และ IR035) และ cyt1A (IS009 IR033 IR040 II014 และ II020) จากการสังเกตภายใตกลอง จลุ ทรรศน พบวา มเี พยี งไอโซเลต IP001 IP002 IP003 และ IP007 ที่แสดงลักษณะผลึกรูปพรี ะมิดคแู ละสเี่ หลีย่ มลกู บาศก ท่ีชัดเจน จากลําดับนิวคลีโอไทดของ 16s rDNA พบวา ไอโซเลตที่ตรวจพบยีนสรางสารพิษเหมือนกับ Bacillus sp. B. cereus B. thuringiensis Lysinibacillus fusiformis L. xylanilyticus L. sphaericus แ ล ะ Brevibacillus brevis นอกจากน้ี จากการวิเคราะหรูปแบบโปรตีนท้ังหมดของไอโซเลต IP001 ดวยวิธี SDS-PAGE พบ โปรตีนขนาด 130 kDa และ 65-70 kDa ซ่ึงตรงกับขนาดของโปรตีนฆาแมลง Cry1 และ Cry2 แสดงใหเห็นวา มีความเปนไปไดท่ีไอโซเลต IP001 จะสรา งสารพษิ ฆา แมลงท้ัง 2 ชนิดนี้ Abstract Spore forming bacteria were isolated from conserve forests belonging to the Plant Genetic Conservation Project under the Royal Initiative of Her Royal Highness Princess Maha Chakri Sirindhorn (RSPG), Nongrawiang subdistrict, Nakhon Ratchasima province. The samples were enrich in sporulation medium (NYSM) for 2-3 days. Non-spore forming bacteria were killed by heating. The 364 bacterial isolates were selected. Crystal and cytotoxic toxin gene (cry and cyt) were detected by PCR. Seven pairs of primers specific to 8 IP genes were used (cry1, cry2, cry3, cry4, cry7-8, cry11 and cyt1A gene specific primers). The result showed that cry1 and cry2 were detected in 4 isolates (IP001, IP002, IP003 and IP007). Ten isolates showed PCR products amplified with cry3 (II015, II017, II018, II099 and IR035) and cyt1A (IS009, IR033, IR040, II014 and II020) specific primer, respectively. Crystal toxin production was observed under light compound microscope (1,000X). IP001, IP002, IP003 and IP007 clearly presented crystal toxin with bipyramidal and cuboidal shape. According to 16s rDNA nucleotide sequence, the isolates harboring IP genes had high homology with Bacillus sp., B. cereus, B. thuringiensis, Lysinibacillus fusiformis, L. xylanilyticus, L. sphaericus and Brevibacillus brevis. Moreover, total protein profile of IP001 was analyzed by SDS-PAGE. The 130 kDa and 65-70 kDa protein bands corresponding to 2 insecticidal proteins (Cry1 and Cry2) were detected. The result indicated that this isolate may produce both insecticidal proteins. การประชมุ วชิ าการชมรมคณะปฏบิ ัตงิ านวทิ ยาการ อพ.สธ. ครงั้ ท่ี 9 “ทรัพยากรไทย : ชาวบานไทยไดป ระโยชน”

601 *ติดตอนักวิจัย: รสาภิรส สมวตั รจติ (อเี มล [email protected]) *Corresponding author: Rasapirose Somwatcharajit (E-mail: [email protected]) บทนํา อุปกรณและวธิ กี ารทดลอง ในยุคท่ีมีการเปลี่ยนแปลงสภาพเศรษฐกิจและสังคม 1) การแยกเช้อื แบคทีเรยี ที่สรา งสปอร อยางตอเน่ือง จํานวนประชากรโลกเพิ่มข้ึนอยางรวดเร็ว ทํา สมุ เกบ็ ตวั อยางแหลงแบคทีเรียในพื้นที่ปกปกพันธุกรรม ใหค วามตอ งการในการใชสาธารณูปโภคเพง่ิ สงู ขึ้นตามไปดว ย พืช มทร. อีสาน ตําบลหนองระเวียง อําเภอเมือง จังหวัด ประกอบกับความสามารถทางการผลิตที่ไมสมดุลตอความ นครราชสีมา ไดแก ตัวอยางดิน ซากพืช และซากแมลง คัด ตองการของมนุษย จุลินทรียไดเขามามีบทบาทท่ีสําคัญใน แยกเชื้อแบคทีเรียโดยนําตัวอยางที่เก็บมาจํานวน 1 g เลี้ยง การตอบสนองความตองการของมนุษย โดยเฉพาะอยางยิ่ง ในอาหารเหลว NYSM (Nutrient broth medium 13 g/l, ในดานการเกษตรกรรม เน่ืองจากความตองการในการเพ่ิม MgCl26H2O 203.3 mg/l, MnCl2 9.9 mg/l, CaCl22H2O ผลผลิตทางการเกษตรมีมากขน้ึ ทาํ ใหมกี ารใชสารเคมใี นการ 10.3 g/l) ใหเขา สูชว งสรา งสปอร (ประมาณ 2-3 วนั ) จากนน้ั ควบคุมแมลงศัตรูพืชมีปริมาณเพิ่มขึ้นไปดวย ซึ่งสงผล ใหความรอนในอางนํ้าควบคุมอุณหภูมิ 80°C เปนเวลา 15 กระทบอยางมากตอสิง่ แวดลอม ดังน้ันการลดการใชส ารเคมี นาที เพื่อทําลายเชื้อที่ไมสรางสปอร จากนั้นนําเชื้อมาเจือ จึงเปนสิ่งที่สําคญั ท่ีตองคํานงึ ถึง การนําเชื้อจลุ ินทรยี มาใชใ น จางดวย 0.85% NaCl ปลอดเช้ือและเกลี่ยบนอาหารแข็ง การควบคุมทางชีวภาพเปนอีกทางเลือกหน่ึงท่ีมีการใชอยาง NYSM ที่เติมยาปฏิชีวนะ cycloheximide เพ่ือยับยั้งการ แพรหลาย เนื่องจากเชื้อจุลินทรียเปนส่ิงมีชีวิตท่ีพบไดทั่วไป เจริญของเช้ือรา นําไปบมท่ีอุณหภูมิ 30°C เปนเวลา 24 ในสิ่งแวดลอม จึงไมสงผลกระทบตอสุขภาพและสงิ่ แวดลอ ม ชว่ั โมง คัดแยกโคโลนีทข่ี นึ้ นํามาทําใหบ ริสุทธิ์และจัดเกบ็ เชอ้ื เชน การนําเชื้อแบคทีเรีย Bacillus thuringiensis ควบคุม เพ่ือนํามาทดสอบตอไป แมลงศัตรูพืชจําพวกหนอนผีเส้ือ ไร หรือแมแต ไสเดือฝอย (de Maagd et. al., 2003; Arthurs and Dara, 2018) การ 2) การเตรียมดีเอ็นเอและการตรวจหายีนสรางผลึกสารพิษ นําเช้ือรา Beauveria bassiana มาใชในการควบคุมแมลง ดว ยปฏิกิรยิ าลูกโซพ อลเิ มอรเรส หรือ พีซอี าร (Polymerase ศัตรูพืชจําพวกเพล้ยี และหนอนเจาะสมอฝาย (Ruiu et. al., chain reaction, PCR) 2013; Bamisile et. al., 2018) เลี้ยงเช้ือบริสุทธ์ิในอาหารเหลว NYSM 5 ml ที่ 30°C อ ย า ง ไ ร ก็ ต า ม ข อ จํ า กั ด ใ น ก า ร ใ ช จุ ลิ น ท รี ย ยั ง มี อ ยู เปนเวลา 24 ช่ัวโมง นําเช้ือ 1 ml ใสหลอดปนเหว่ียงขนาด โดยเฉพาะอยางยิ่งในดานประสิทธิภาพในการออกฤทธิ์ 1.7 ml นําไปปนเหวี่ยงที่ความเร็วรอบ 8,000 rpm เปน ควบคุมยังมีนอยกวาเม่ือเปรียบเทียบกับสารเคมี ดังนั้นการ เวลา 10 นาที ดดู สว นใสทิง้ แลวนาํ ตะกอนเซลลไปสกัดดีเอ็น ใชจุลินทรียในการควบคุมทางชีวภาพจึงตองคํานึงถึง ตามวิธีของชุดสกัดดีเอ็นเอ เม่ือไดดเี อ็นเอ นําดีเอ็นเอท่ีไดไป ประสิทธภิ าพของจุลินทรียนน้ั ๆ เปน หลกั จลุ นิ ทรียท ่ีนาํ มาใช วัดปริมาณและความบริสุทธ์ิดวยเคร่ืองนาโนดรอปตรวจหา ในการควบคุมทางชีวภาพควรเปนสายพันธุที่สามารถ ยีนสรางผลึกสารพิษ 8 ยีน ไดแก ยีน cry1, cry2, cry3, เจริญเติบโตไดดีในสิ่งแวดลอมและสภาพภูมิอากาศของแต cry4, cry7, cry8, cry11 และ cyt1a โดยใชไพรเมอร 7 คู ละทองถิ่นเพราะจะสง ผลตอโดยตรงตอ ความสามารถในการ (Ben-Dov et. al., 1997) ดังแสดงในตารางที่ 1 เตรียม สรางสารออกฤทธ์ิ ทั้งยังตองเปนเชื้อที่ไมกอโรคในมนุษย ปฏิกิริยาพีซีอารปริมาณ 50 µl โดยผสมสารตางๆ ใหได และสัตว งานวิจัยน้ีจึงมีวัตถุประสงคเพื่อการคัดเลือกสาย ความเขม ขนสดุ ทายดงั น้ี 1X PCR buffer, 0.1 mg/ml BSA, พันธุจุลินทรียท่ีสรางสารพิษฆาแมลงศัตรูพืชไดจากพื้นที่ปา 0.1 mM dNTP, 1.25 U Taq DNA polymerase, 0.2 µm ปกปกพันธุกรรมพืช มทร. อีสาน โดยแยกเช้ือแบคทีเรียท่ี forward และ reverse primers เติมดีเอ็นเอแมแบบ 5 µl สรางสปอรจากแหลงธรรมชาติ ตรวจหายีนท่ีสรา งสารพิษฆา นาํ ไปทําปฏิกริ ิยาดว ยเครือ่ ง Thermal cycler โดยใชส ภาวะ แ ม ล ง ไ ด crystal toxin gene (cry1, cry2, cry3, cry4, ดั ง น้ี Initial denaturation 95°C เ ป น เ ว ล า 5 น า ที , cry7, cry8 แ ล ะ cry11) แ ล ะ cytolytic toxin (cyt1a) Denaturation 95°C เ ป น เ ว ล า 60 วิ น า ที , Annealing สังเกตลักษณะสารพิษผลึกของไอโซเลตท่ีนาสนใจภายใต 55°C เปนเวลา 45 วินาที, Extension 72°C เปนเวลา 60 กลองจลุ ทรรศนแ ละเจลอิเลคโตรโฟรซี ีส วินาที และ Final extension 72°C 5 นาที ท้ังหมด 30 รอบ จากน้ันตรวจสอบผลิตภัณฑพีซีอารดวยวิธีอะกาโรส เจลอเิ ล็กโตรโฟรซิ สิ โดยใชอะกาโรสเจล 1.5% การประชมุ วชิ าการชมรมคณะปฏบิ ัติงานวิทยาการ อพ.สธ. ครัง้ ท่ี 9 “ทรพั ยากรไทย : ชาวบา นไทยไดป ระโยชน”

602 ตารางท่ี 1 รายละเอยี ดของไพรเมอรท ใี่ ชในการตรวจสอบหายนี ทสี่ รา งผลึกสารพิษ Tm (°C) ขนาดผลติ ภณั ฑ (bp) ยนี ชอ่ื ไพรเมอร ลาํ ดับนวิ คลีโอไทด cry1 Un1(F) 5’ CAT GAT TCA TGC GGC AGA TAA AC 3’ 61.1 274 หรอื 277 Un1(R) 5’ TTG TGA CAC TTC TGC TTC CCA TT 3’ 61.1 cry2 Un2(F) 5’ GTT ATT CTT AAT GCA GAT GAA TGG G 3’ 60.9 689 หรอื 701 Un2(R) 5’ CGG ATA AAA TAA TCT GGG AAA TAG T 3’ 59.2 cry3 Un3(F) 5’ CGT TAT CGC AGA GAG ATG ACA TTA AC 3’ 61.1 589 595 หรอื 604 Un3(R) 5’ CAT CTG TTG TTT CTG GAG GCA AT 3’ 64.7 cry4 Un4(F) 5’ GCA TAT GAT GTA GCG AAA CAA GCC 3’ 63.5 439 Un4(R) 5’ GCG TGA CAT ACC CAT TTC CAG GTC C 3’ 69.1 cry7-8 Un7,8(F) 5’ AAG CAG TGA ATG CCT TGT TTA C 3’ 58.4 420 หรือ 423 Un7,8(R) 5’ CTT CTA AAC CTT GAC TAC TT 3’ 52.3 cry11 EE-11A(F) 5’ CCG AAC CTA CTA TTG CGC CA 3’ 60.5 445 EE-11A(R) 5’ CTC CCT GCT AGG ATT CCG TC 3’ 62.5 cyt1a Gral-cyt(d) 5’ AAC CCC TCA ATC AAC AGC AAG G 3’ 62.1 522 หรอื 525 Gral-cyt(r) 5’ GGT ACA CAA TAC ATA ACG CCA CC 3’ 62.9 3) การศกึ ษาลักษณะของแบคทีเรยี ภายใตกลอ งจลุ ทรรศน เทคนิค SDS–PAGE โดยใช 10% separating gel และ 4% สังเกตลักษณะผลึกสารพิษ โดยเล้ียงเชื้อจนเขาสูชวงที่ stacking gel (Laemmli, 1970) โดยใหกระแสไฟฟา 80 โ ว ล ต ด ว ย omniPAGE Mini Vertical Protein Electro- สรางสปอร เกลี่ยและตรึงเชื้อบนสไลดแกว หยดสี phoresis System(Cleaver Scientific, United Kingdom) coomassie brilliant blue (coomassie brilliant blue R- ยอ มดว ย coomassie brilliant blue R-250 250 0.133%, acetic acid 50%) ท้ิงไว 10 วินาที ลางออก ผลและวิจารณผ ลการทดลอง ดวยน้ําสะอาดแลวทิ้งไวใหแหง สังเกตลักษณะดวยกลอง 1) การแยกเช้อื แบคทเี รยี ทส่ี รางสปอร จลุ ทรรศนท ่กี ําลงั ขยายรวม 1,000 เทา ไดคัดแยกเชื้อจุลินทรียจากแหลงจุลินทรียทั้งหมด 20 4) การสกัดโปรตีนและการแยกโปรตีนดวยเทคนิค SDS ตัวอยาง (ดิน 5 ตัวอยาง ดินบริเวณรอบรากพืช 6 ตัวอยาง Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) ซากแมลง 7 ตัวอยาง และ ซากพืช 2 ตัวอยาง พบวาในแต ละตัวอยางมีปริมาณแบคทีเรียอยูในชวง 6.25x104 ถึง 7.00 เก็บตัวอยางเช้ือจุลินทรีย 1 มิลลิลิตร นํามาปนเหวี่ยง x106 cfu/g ของดิน ไดเช้ือแบคทีเรียที่สรางสปอรท้ังหมด และนําตะกอนที่ไดละลายดวย lysis buffer 200 µl (8 M 364 ไอโซเลต โดยแสดงในตารางที่ 2 เมอ่ื สังเกตภายใตกลอง urea, 2% CHAPS, 0.2% DTT, 0.002% bromophenol จุลทรรศนดวยวิธียอมแกรม พบวา แบคทีเรียท้ังหมดเปน blue) กระจายเช้ือใหเขากับสารละลาย ทําใหเ ซลลแตกดวย แบคทีเรียแกรมบวก จํานวนไอโซเลตท่ีแยกไดจากแตละ เครื่อง TissueLyser LT (QIAGEN, Netherlands) นําไปให ตัวอยางแสดงในตารางที่ 2 ความรอนในน้ําเดือด 10 นาที แลวแชนํ้าแข็งทันที ปน เหวี่ยงท่ี 10,000 rpm นําสวนใส 10 ไมโครลติ รมาแยกโดย ตารางท่ี 2 ตารางแสดงแหลงแบคทีเรียและจํานวนแบคทเี รยี ทแ่ี ยกได ตวั อยาง จํานวนไอโซเลต ตวั อยา ง จํานวนไอโซเลต รหัสไอโซเลต 25 รหัสไอโซเลต ซากแมลง 1 25 II001-025 ดนิ รอบรากตนรัง 16 IR003-027 ซากแมลง 2 25 II026-050 ดินรอบรากตน มะคา แต 34 IR028-043 ซากแมลง 3 8 II051-058 ดนิ รอบรากตน นมวัว 24 IR044-077 ซากแมลง 4 11 II059-069 ดนิ รอบรากตนมะเค็ง 25 IR078-101 ซากแมลง 5 25 II070-094 ดินรอบรากตนพนั ชาด 7 IR102-126 ซากแมลง 6 10 II094-104 ตัวอยางดนิ 1 2 IS001-007 ซากแมลง 7 25 II105-129 ตัวอยางดนิ 2 IS008-009 การประชุมวชิ าการชมรมคณะปฏบิ ัตงิ านวิทยาการ อพ.สธ. ครัง้ ท่ี 9 “ทรัพยากรไทย : ชาวบานไทยไดป ระโยชน”

603 ตวั อยา ง จาํ นวนไอโซเลต รหัสไอโซเลต ตวั อยาง จํานวนไอโซเลต รหัสไอโซเลต เปลอื กไม 1 16 IP001-016 ตวั อยางดิน 3 14 IS010-023 เปลอื กไม 2 20 IP017-036 ตัวอยางดนิ 4 25 IS024-048 ดินรอบรากตน หนามหนั 2 IR001-002 ตวั อยางดิน 5 25 IS049-073 2) การตรวจหายีนสรางผลึกสารพิษฆาแมลงจากไอโซเลต al., 2012) พบวา มีเชื้อท่มี ียีน cry1 และ cry2 จํานวน 4 ไอ และการบง ช้ีเชอื้ ดว ยลําดับนิวคลโี อไทดของ 16s rDNA โซเลต (IP001, IP002, IP003 และ IP007) เชื้อทม่ี ยี นี cry3 จํานวน 5 ไอโซเลต (II015 II017 II018 II099 และ IR035) เมื่อตรวจหายีนทสี่ รา งสารพษิ ฆาแมลงดวยวิธีพซี อี าร เช้อื ทีม่ ยี นี cyt1a จาํ นวน 5 ไอโซเลต ไดแก (IS009 IR033 ทําการตรวจสอบทง้ั หมด 8 ยีน ไดแก cry1, cry2, cry3, IR040 II014 และ II020) ผลิตภณั ฑพ ซี ีอารแสดงในรปู ที่ 1 cry4, cry7, cry8, cry11 และ cyt1A ซึ่งเปน ยีนควบคมุ การ สรา งโปรตีนสารพิษ Cry1, Cry2, Cry3, Cry4, Cry7, Cry8, เมื่อบงช้ีสายพันธุเชื้อดวยลําดับนิวคลีโอไทดของ 16s Cry11 และ Cyt1A ทพี่ บในเช้ือ Bacillus thuringiensis rDNA โดยเปรียบเทียบกับฐานขอมูล NCBI (https://www. และ Bacillus sphaericus โดย Cry1 และ Cry2 จะทาํ ลาย ncbi.nlm.nih.gov) พบวา 14 ไอโซเลตท่ีตรวจพบยีนสราง ตวั ออ นแมลงในอันดับ Lepidoptera (จาํ พวกผเี สื้อ) Cry3, สารพษิ เหมือนกบั Bacillus sp. B. cereus B. thuringiensis Cry7และCry8จะทําลายตัวออ นแมลงในอันดับ Coleoptera Lysinibacillus fusiformis L.xylanilyticus L. sphaericus (จําพวกดวง เตาทอง) Cry11 และ Cyt1a จะทาํ ลายตัวออ น และ Brevibacillus brevis โดยมีเปอรเซ็นตความเหมือน แมลงในอันดบั Diptera (จําพวกยุง แมลงวนั ) (Bravo, et อยูในชว ง 90-100% (ตารางที่ 4) รปู ที่ 1 แถบดีเอ็นเอของผลติ ภัณฑพีซีอาร (ลูกศร) ท่ีเพิม่ จาํ นวนดว ยไพรเมอรท ีจ่ าํ เพาะตอยนี cry1 (A) cry2 (B) cyt1a (C) และ cry3 (D) โดย (A) และ (B) เลน M และ 1-5 คือ DNA marker, ผลิตภณั ฑพ ีซีอารจ าก positive control IP001 IP002 IP003 และ IP007 ตามลาํ ดบั ; (C) เลน M และ 1-5 คือ DNA marker, ผลติ ภัณฑพีซีอารจาก IS009 IR033 IR040 II014 และ II020; (D) เลน M และ 1-5 คือ DNA marker, ผลิตภณั ฑพีซอี ารจาก II015 II017 II018 II099 และ IR035 ตารางที่ 4 ความเหมอื นของลาํ ดบั นวิ คลโี อไทดข องยีน 16s rDNA ของไอโซเลตท่ีแยกได ไอโซเลต ยีนที่พบ % Identity Microorganisms GenBank No. IP001 cry1, cry2 95 Bacillus sp. KM875437.1 IP002 cry1, cry2 98 Bacillus cereus MH542323.1 IP003 cry1, cry2 99 Bacillus cereus MF360078.1 IP007 cry1, cry2 98 Bacillus thuringiensis MF079334.1 IS009 cyt1A 100 Lysinibacillus fusiformis MF614909.1 IR033 cyt1A 99 Lysinibacillus xylanilyticus KY038681.1 IR040 cyt1A 100 Lysinibacillus sphaericus KF598850.1 II014 cyt1A 94 Bacillus sp. LC412926.1 II020 cyt1A 90 Bacillus cereus KX950685.1 II015 cry3 97 Bacillus thuringiensis JF899289.1 II017 cry3 97 Bacillus thuringiensis MF581432.1 II018 cry3 98 Bacillus sp. MH536252.1 การประชมุ วชิ าการชมรมคณะปฏบิ ตั งิ านวทิ ยาการ อพ.สธ. ครัง้ ท่ี 9 “ทรัพยากรไทย : ชาวบานไทยไดป ระโยชน”

604 II099 cry3 99 Bacillus sp. MG025784.1 IR035 cry3 99 Brevibacillus brevis CP030117.1 3) การศึกษาลกั ษณะทางสัณฐานวิทยาและความสามารถใน ส่ีเหล่ียมลกู บาศกส าํ หรับไอโซเลตทีไ่ มสามารถสงั เกตลกั ษณะ การสรา งผลึกสารพษิ ของไอโซเลต ผลึกสารพิษไดนั้น เปนไปไดวาเช้ือสรางโปรตีนสารพิษไดใน ปริมาณนอย จึงทําใหผลึกสารพิษมีขนาดเล็กมากจนไม พบวาเช้ือทีต่ รวจพบยีนสรา งสารพิษที่ไดท ้ังหมดทเ่ี จริญ สามารถสังเกตไดดว ยกลอ งจลุ ทรรศนเ ลนสป ระกอบ บนอาหาร NYSM แสดงลักษณะโคโลนีดังรูปที่ 2 หลังจาก เล้ียงเชื้อประมาณ 2-3 วัน เม่ือยอมดวยสี coomassie เม่ือนําไอโซเลต IP001 มาวิเคราะหรูปแบบโปรตีน brilliant blue พบวา ทุกไอโซเลต สามารถสรางสปอรได ท้ังหมดดวยวิธี SDS-PAGE พบ แถบโปรตีนขนาด 130 kDa แตม ีเพยี งไอโซเลต IP001, IP002, IP003 และ IP007 ท่ีสรา ง และ 65-70 kDa (รูปที่ 4) ซึ่งตรงกับขนาดของโปรตีนฆา ผลึกสารพิษใหญจ นสามารถสังเกตไดภ ายใตกลอ งจลุ ทรรศน แมลง Cry1 และ Cry2 ซึ่งมีปริมาณเพิ่มข้ึนชัดเจนในวันท่ี 2 กําลังขยาย 1,000 เทา (ภาพที่ 3) ลักษณะผลึกสารพิษของ และ 3 ตามลําดับ ท้ังนี้เนื่องจาก โปรตีน Cry1 และ Cry2 ทั้ง 4 ไอโซเลต เปนแบบพีระมิดคูท้ังหมด แตมีความแหลม จะถูกสรา งจากยีนท่คี วบคุมดวยโปรโมเตอรที่ทาํ งานในชวงที่ ความกวาง และความยาวของผลึกตางกันเล็กนอย จงึ เปน ไป เช้ือสรางสปอร เมื่อเล้ียงเชอ้ื จนเขา สูช วงที่สรา งสปอรจ ึงเหน็ ไดวาท้งั 4 ไอโซเลต จะมคี วามสามารถในการสรา งสารพษิ ได โปรตนี ทั้งสองชนดิ ชัดเจนขนึ้ (Deng, et al., 2014) แสดงให แตกตางกัน โดยปกติโปรตีน Cry1 จะสรางผลึกสารพิษ เหน็ วา มีความเปน ไปไดทไ่ี อโซเลต IP001 จะสรา งสารพิษฆา รูปรางพีระมิดคูและโปรตีน Cry2 สรางผลึกสารพิษรูปราง แมลงทั้ง 2 ชนดิ น้ี การประชุมวิชาการชมรมคณะปฏบิ ัตงิ านวทิ ยาการ อพ.สธ. คร้งั ท่ี 9 “ทรพั ยากรไทย : ชาวบานไทยไดป ระโยชน”

605 รูปที่ 2 ลกั ษณะโคโลนีของไอโซเลตที่ตรวจพบยนี ทส่ี รา งผลกึ สารพษิ ท่เี จรญิ บนอาหารแขง็ NYSM การประชมุ วิชาการชมรมคณะปฏบิ ัติงานวิทยาการ อพ.สธ. คร้งั ที่ 9 “ทรัพยากรไทย : ชาวบานไทยไดป ระโยชน”

606 รปู ที่ 3 แสดงลักษณะของผลึกสารพษิ ของไอโซเลต IP001 IP002 IP003 และ IP007 ภายใตก ลอ งจลุ ทรรศนเลนสป ระกอบ กาํ ลงั ขยาย 100X สัญลกั ษณล กู ศรช้ี ผลกึ สารพิษ (C) สปอร (S) และ เซลลแ บคทเี รีย (V) ไอโซเลต (IS009 IR033 IR040 II014 และ II020) ท่ีพบยีน cyt1a ทั้ง 10 ไอโซเลตไมสามารถสังเกตเห็นผลึกสารพิษได ภายใตก ลอ งจุลทรรศน อยา งไรกต็ าม ไอโซเลต IP001 IP002 IP003 และ IP007 พบยีน cry1 และ cry2 ท้ัง 4 ไอโซเลต สรางผลึกสารพิษขนาดใหญที่สังเกตไดชัดเจนภายใตกลอง จุลทรรศน แสดงใหเห็นวาท้ัง 4 ไอโซเลต อาจนําไป ประยกุ ตใชในการควบคมุ แมลงศตั รพู ชื ที่มปี ระสิทธิภาพสูงได เน่ืองจากขนาดของผลึกสารพิษที่ใหญจะสะทอนปริมาณ โปรตีนสารพิษทเี่ ช้อื สรางได รูปที่ 4 รปู แบบโปรตีนท้งั หมดวิเคราะหด วยวิธี SDS-PAGE คําขอบคุณ ของเชอ้ื IP001 ทเี่ จรญิ ในอาหาร NYSM เปน เวลา 1 วัน (D1) งานวิจัยนี้ไดรับการสนับสนุนจากโครงการอนุรักษ 2 วัน (D2) และ 3 วนั (D3) ตามลาํ ดับ สรุปผลการทดลอง พันธุกรรมพืชอันเนื่องมาจากพระราชดําริ สมเด็จพระเทพ รัตนราชสุดาฯ สยามบรมราชกุมารี ผูวิจัยขอขอบคุณมา ณ สามารถแยกแบคทีเรียที่สรางสปอรไดจากพ้ืนท่ีปกปก ที่น้ดี ว ย พันธุกรรมพืช มทร.อีสาน จํานวน 364 ไอโซเลต พบวา 14 เอกสารอา งองิ ไอโซเลต ที่ตรวจพบยีนสรางผลกึ สารพิษ โดย มี 5 ไอโซเลต Arthurs, S. and Dara, S. K. 2018. Microbial (II015 II017 II018 II099 และ IR035) ท่ีพบยีน cry3 และ 5 biopesticides for invertebrate pests and their การประชมุ วชิ าการชมรมคณะปฏบิ ตั งิ านวิทยาการ อพ.สธ. คร้ังท่ี 9 “ทรัพยากรไทย : ชาวบา นไทยไดป ระโยชน”

607 markets in the United States. J. Invertbr. M., 2012. Evolution of Bacillus thuringiensis Cry Pathol. 106: 13-21. toxins insecticidal activity. Microb. Biotechnol. Bamisile, B. S., Dash, C. K., Akutse, K. S., Keppanan, 6: 17–26. R., Afolabi, O. G., Hussain, M., Qasim, M. and de Maagd, R. A., Bravo, A., Berry, C., Crickmore, N., Wang, L. 2018. Prospects of endophytic fungal and Schnepf, H. E. 2003. Structure, diversity, entomopathogens as biocontrol and plant and evolution of protein toxins from spore- growth promoting agents: An insight on how forming entomopathogenic bacteria. Annu. Rev. artificial inoculation methods affect Genet. 37: 409-433. endophytic colonization of host plants. Deng, C., Peng Q., Song F., and Lereclus D. 2014. Microbiol. Res. 217: 34-50. Regulation of cry Gene Expression in Bacillus Ben-Dov, E., Zaritsky, A., Dahan, E., Barak, Z., Sinai thuringiensis. Toxins. 6: 2194-2209. R., Manasherob, R., Khamraev, A., Troitskaya, Laemmli, U. K. 1970. Cleavage of structural E., Dubitsky, A., Berezina, N., and Margalith, Y. proteins during the assembly of the head of 1997. Extended screening by PCR for seven bacteriophage T4. Nature 227: 680-685. cry-group genes from field-collected strains of Ruiu, L., Satta, A., and Floris, I. 2013. Emerging Bacillus thuringiensis. Appl. Environ. Microbiol. entomopathogenic bacteria for insect pest 63: 4883–4890. management. Bull. Insectology. 66: 181-186. Bravo, A., Gómez, I., Porta H., García-Gómez B. I., Rodriguez-Almazan, C., Pardo, L., and Soberón การประชมุ วิชาการชมรมคณะปฏบิ ัติงานวิทยาการ อพ.สธ. ครง้ั ท่ี 9 “ทรพั ยากรไทย : ชาวบา นไทยไดป ระโยชน”

608 ความหลากหลายทางชีวภาพของไลเคนในพ้ืนทีเ่ กาะกูด จังหวัดตราด BIODIVERSITY OF LICHENS ON KUD ISLANDS, TRAD PROVINCE กวนิ นาถ บวั เรือง*, เวชศาสตร พลเยี่ยม, สัญญา มสี มิ , วสนั ต เพิงสูงเนิน, พมิ พศิ า พระภจู ํานงค, สภุ ัทรา โพธิแ์ กว , พิมพา นริ งคบุตร, ภมุ รนิ ท โพนทอง, เสรี นาคนลิ ทอง, พชร มงคลสขุ และ กัณฑรยี  บญุ ประกอบ Kawinnat Buaruang*, Wetchasart Polyiam, Sanya Meesim, Vasan Poengsungnoen, Phimpisa Phraphuchamnong, Supattara Phokaeo, Phimpha Nirongbut, Pumarin Ponthong, Seree Naknilthong, Pachara Mongkolsuk and Kansri Boonpragob หนวยวิจยั ไลเคน ภาควชิ าชวี วิทยา คณะวทิ ยาศาสตร มหาวิทยาลยั รามคาํ แหง บางกะป กรงุ เทพฯ 10240 Lichen Research Unit, Department of Biology, Faculty of Science, Ramkhamhaeng University, Bangkok, 10240 บทคดั ยอ ความหลากหลายทางชีวภาพของไลเคนในเกาะกูด จังหวัดตราด จากการเก็บตัวอยางระหวางวันท่ี 2-4 ธันวาคม พ.ศ. 2549 ได 434 ตัวอยาง นํามาวิเคราะหชนิดตามหลักอนุกรมวิธาน โดยการศึกษาลักษณะทางสัณฐานวิทยา กายวิภาควิทยา และ สารไลเคน สามารถระบุชนิดได 246 ตัวอยาง ได 116 ชนิด จาก 30 สกุล โดยจัดเปนไลเคนแบบครัสโตส รอยละ 86 ประกอบดวย 100 ชนิด 26 สกุล (Anomomorpha Anthracothecium Arthopyrenia Bacidia Carbacanthographis Chapsa Cresponea Diorygma Dyplolabia Fissurina Graphis Hemithecium Laurera Lecanora Malmidea Myriotrema Ocellularia Opgrapha Pallidogramme Phaeographa Platygramme Porina Pyrenula Sarcographa Thelotrema Trypethelium) และไลเคนแบบแผนใบ รอยละ 14 ประกอบดวย 16 ชนิด จาก 4 สกุล (Bulbothrix Coccocarpia Dirinaria Pyxine) จัดเปนไลเคนท่ีรายงานคร้งั แรกในประเทศไทย 11 ชนดิ และ 58 ชนดิ คาดวา จะเปนชนิดใหม Abstract Biodiversity of lichen in the area of Kud islands, Trad province was explored and 434 specimens were collected from bark and rock during 2-4 December 2006. All 434 samples were identified by morphological, anatomical and chemical characters into 116 species from 30 genera. Eighty-six percent were crustose lichen comprised of 100 species with 26 genera (Anomomorpha Anthracothecium Arthopyrenia Bacidia Carbacanthographis Chapsa Cresponea Diorygma Dyplolabia Fissurina Graphis Hemithecium Laurera Lecanora Malmidea Myriotrema Ocellularia Opgrapha Pallidogramme Phaeographa Platygramme Porina Pyrenula Sarcographa Thelotrema Trypethelium). Fourteen percent were foliose lichen with 16 species and 4 genera (Bulbothrix Coccocarpia Dirinaria Pyxine). Eleven species were new record to Thailand and 58 species were expected to be new species. คําสาํ คญั : ไลเคน, ความหลากหลายทางชีวภาพ, เกาะกูด Keywords: Lichen, biodiversity, a group of Kud Islands *ติดตอ นักวิจยั : กวนิ นาถ บวั เรือง (อเี มล [email protected]) *Corresponding author: Kawinnat Buaruang (E-mail: [email protected]) การประชมุ วชิ าการชมรมคณะปฏบิ ตั งิ านวทิ ยาการ อพ.สธ. คร้ังท่ี 9 “ทรัพยากรไทย : ชาวบา นไทยไดป ระโยชน”

609 บทนํา แ ล ะ Upreti (2005), Homchantara (1999), McCarthy โ ค ร ง ก า ร อ นุ รั ก ษ พั น ธุ ก ร ร ม พื ช อั น เ น่ื อ ง ม า จ า ก (2001), Purvis et. al. (1992), Rogers (1992), Swinscow and Krog (1988), Thrower (1998) และ Vongshewarat พระราชดําริฯ สมเด็จพระเทพรตั นราชสุดาฯ สยามบรมราช (2000) เปน ตน กุมารี ดําเนินการศึกษาทรัพยากรธรรมชาติรวมท้ังไลเคนใน ผลและวิจารณผลการศึกษา พ้ืนท่ีเกาะตางๆในประเทศไทย ซึ่งเปนพ้ืนท่ีอนุรักษ มี การศึกษาทรัพยากรไลเคนมาอยางตอเนื่อง โดยการสํารวจ จากการสํารวจและรวบรวมไลเคน บนเกาะกูด จังหวัด แ ล ะ เ ก็ บ ตั ว อ ย า ง จ า ก ย อ ด เ ข า ถึ ง ช า ย ฝ ง ท ะ เ ล ข อ ง เ ก า ะ ตราด พบตวั อยาง 434 ตัวอยาง ทร่ี วบรวมจากบนเปลือกไม แสมสารระหวางมกราคม 2548 – มีนาคม 2549 พบไลเคน และบนหิน จาก 2 สภาพปา คอื ปาดิบและ และปา ชายหาด 40 สกุล 92 ชนิด (กัณฑรีย บุญประกอบ และกวินนาถ บัว วิเคราะหชนิดตามหลักอนุกรมวิธาน โดยการศึกษาลักษณะ เรือง, 2550) จากรายงานการศึกษาไลเคนเริ่มมีการศึกษา ทางสัณฐานวิทยา กายวิภาควิทยา และสารไลเคน ดวยวิธี โดยนักไลเคนชาวตา งประเทศตงั้ แตป  พ.ศ. 2452 ถึง ป พ.ศ. ห ย ด สี ( spot test) แ ล ะ ร ง ค เ ล ข ผิ ว บ า ง ( thin layer 2540 สว นการศึกษาไลเคนโดยนกั วจิ ัยชาวไทย สว นใหญ จะ chromatography, TLC) สามารถจําแนกได 116 ชนิด จาก ศึกษาในพ้ืนที่ศึกษาในเขตภาคเหนือและภาคตะวันออก 30 สกุล (ตารางที่ 1) เมื่อเปรียบเทียบจากรายงานใน เฉียงเหนือ ตั้งแตป พ.ศ. 2537-2545 ปจจุบันพบรายงานไล ประเทศไทย (Buaruang, K. et. al., 2017) โดยจัดเปนไล เคนรวม 1,292 ชนิด (Buaruang et. al., 2017) ดังน้ัน เคนที่คนพบเปนคร้ังแรกในประเทศไทย 11 ชนิด และคาด รายงานการศึกษาในคร้ังนี้ จึงเปนการทบทวนขอมูลชนิด วานาจะเปนการคนพบชนิดใหมทางวิทยาศาสตร 58 ชนิด ของไลเคนและเพ่ิมองคความรูท ่ีสาํ คญั ดา นความหลากหลาย จากขอมูลขางตนหากมีการศึกษาดานการศึกษาประชากร ทางชวี ภาพของไลเคนในประเทศไทย และสังคมของไลเคนเพมิ่ เตมิ จะทาํ ใหส ามารถคาดการณก าร อปุ กรณและวิธกี ารศกึ ษา เปลี่ยนแปลงของประชากร และการเปล่ียนแปลงของ ส่งิ แวดลอมในอนาคต สํารวจและเก็บตัวอยางไลเคนบนเปลือกไมและบนหิน สรปุ ผลการศึกษา จากพ้ืนท่ีเกาะกูด จังหวัดตราด ระหวางระหวางวันที่ 2-4 ธันวาคม พ.ศ. 2549 นํามาวิเคราะหชนิดตามหลัก ความหลากหลายทางชีวภาพของไลเคน บนเกาะกูด อนุกรมวิธาน โดยการศึกษาทางสัณฐานวิทยา กายวิภาค จังหวัดตราด วิเคราะหชนิดตามหลักอนุกรมวิธาน โดย วิทยา และศึกษาสวนประกอบทางเคมีเบื้องตน ดวยการ การศึกษาลักษณะทางสัณฐานวิทยา กายวิภาควิทยา และ ทดสอบแบบหยดสี (spot test) (Elix, 1994) และวธิ กี ารรงค สารไลเคน สามารถจําแนกได 116 ชนิด จาก 30 สกุล เลขผิวบาง (Thin Layer Chromatography: TLC) (White จัดเปนไลเคนที่คนพบเปนครั้งแรกในประเทศไทย 11 ชนิด and James, 1985) นําขอมูลดังกลาว มาวิเคราะหและระบุ และคาดวานาจะเปนการคนพบชนิดใหมทางวิทยาศาสตร ชนดิ โดยใชร ูปวธิ านของ กณั ฑรยี  บญุ ประกอบ และกวนิ นาถ 58 ชนิด บวั เรอื ง (2550), Archer (2006), Awasthi (1991), Divakar การประชุมวิชาการชมรมคณะปฏบิ ตั งิ านวิทยาการ อพ.สธ. ครัง้ ที่ 9 “ทรัพยากรไทย : ชาวบา นไทยไดป ระโยชน”

610 ตารางที่ 1 แสดงชนิดของไลเคน สกุลตา งๆ ที่พบในพื้นทีเ่ กาะกูด CACAFDCCBBADDiสuannrharoyiisorteกplcsiaotcrhnbrsbhuicลุlypmodpaooarrogsapiiorlt(oancmcaiahGcynaamaaborraeenerixitopanatnhhriuaiepaoschg)iauramphis TADCACBFFDCCBASHGGGGHDSSTPmPMMLLLPPOPOMOPOmPMP.ia.aeearuahyyohoylannrhaoryi..r.ie.pccpsaayyroayaatearrxscptrrupleasc.rlioatcldsrmz.eh.r.ep.en.lbccrrtlisemxubhipuaciitcanrlmtlneiiymppliyoodtpgpoosnideacvopoeooplebarrihrnomagalogtercusiyaiptioiesoutggorartlilltgttpoaahnccimorcardrurhilgoaoasrlhrrrocyrsaaanilemgozadaectamepaaeuaaarriaeteacsobrraccaariaa,aemmaonnnenacsmhrernimcppoaahcluuaxtiobicp,auOnpcliciauctaattenaihhhodujmueamsbgpuireaharGuiicabrfhbgnlcr,tatpiepaiunaemimpreoaoamrxainaoul,onrb.ydmi.egaaafPeacabhasolfdstlmeifeauaPegsagoesildpiduckyialaccze,*sia,bupufecprtrbhccynrdblentriuueeerec,aaa*e*nGagfOoieiamr.uiiuruonnlnrefprnslsnnyllcGelnpc,.sit.noinoemieovpdyhucn,ae,lalihcaleusscPs.ohliocseartcpsisdn.ibOiasn,M,touttna,mclaa,yd,siiaausnuunuaahosveiPtsFnabcppcOxiBsDcuato,lelimdli,iitpr.ot.t.scgarzesmouaea.paac..GrunoiCi,rc,ia.actd,rqrnmrdi,ts.cedplssem.vpiaoaoPoSaiinpsOiusLaoemciissiiarchds,gyl.*,.acn,,dos.ea,euunrp*a,itrtToihGdunapHsnirzcbMn.,utmama.deCao.eraimso.laaoช.eArsmsihlasry,cc,zatob,s*silt,riน.li.feme*.itiaaaeaPtGeettGoriaBpasiิดnrtapmalhn,pl,gc.oru..pnellr,aamh,taa.Poior(gvcbsriltCah*naPnSiody,ari,lxlecni,d,aeoiiusopr,sisGetPtzanme.Fe,Cn.,raapt.Ooeny.tti.xusuMsmooP,,ourIaxccdducanedilmy.sGS.cromiaut.raab*t,eaueraoo.ec.lem.l.,irmTsna,,manorIiscsrDnkLd)y.OHsan,,tntepau.atteuirrdGisM.ksprheeegrrcsspi,icgazi.crll.bret,ymylaaiaeGoiiearnomianliP.,u,ntnnox.npnamsnhmaPFsysodscisisltme.tst,yl.iai,azaiyciuis*isicr,Pd,anrSrmi,,r,.cmtapigCouP.mtouOPGeli,reaao.ynm,lpymni.cabcrxlm.aTrossd.uaab..i,p.etc.rmecpnvsayHoaatlcitserlrsud,ia.oil,aqoid,onmlrMarsOra,ucgePiotasdiaitGahapshvdacplae,rli..ma.o.ulcipisdoMgrIipslal,nna.eeauanury,Fftl,sromngblur.a.ScaPiosudccr.erotyeiuamii,ansdvrdcbtu.O,sia,aledi*bugc,,a,etis.n,rnuiocsmosa,sa, , Graphis Hemithecium LLLMeeaacpulatrmeonrigodaiureama Myriotrema Ocellularia Opegrapha PPPPolhaaarltlineiydaogorgagrramapmmhmies e Pyrenula SPayxrcinoegrapha TSTarhyrepcloeotgthrreaemplihuaimna *แสดงชนดิ ท่ีไมเ คยมีรายงานการพบในประเทศไทยมากอ น คาํ ขอบคณุ เอกสารอางองิ งานวิจัยนี้เปนสวนหนึ่งของการสํารวจท่ีรวมสนอง กณั ฑรยี  บญุ ประกอบ และกวินนาถ บวั เรอื ง. 2550. ไลเคน พระราชดํารใิ นโครงการอนุรักษพนั ธกุ รรมพืชอนั เนื่องมาจาก แหงเกาะแสมสารจากยอดเขาถึงชายทะเล. สาํ นกั พิมพ พระราชดําริ สมเด็จพระเทพรัตนราชสุดาฯ สยามบรมราช มหาวทิ ยาลยั รามคําแหง. กรุงเทพฯ. กุมารี (อพ.สธ.) ซ่ึงไดรับการสนับสนุนในการสํารวจจาก Archer, A.W. 2002. The Lichen Family Graphidaceae หนวยสงครามพิเศษทางเรือ กองเรือยุทธการ (กองทัพเรือ) in Australia. Bibliotheca Lichenologica 94: 1– คณะผวู จิ ยั ขอขอบคุณทุกทานทใ่ี หก ารสนบั สนนุ 191. การประชุมวชิ าการชมรมคณะปฏบิ ัติงานวทิ ยาการ อพ.สธ. ครั้งท่ี 9 “ทรัพยากรไทย : ชาวบา นไทยไดป ระโยชน”

611 Awasthi, D.D. 1991 Key to microlichen. Bibliotheca McCarthy, P.M. 2001. Trichotheliaceae. Flora of Lichenologica 40: 66-75. Australia Vol. 58A: 105-152. Buaruang, K., Boonpragob, K., Mongkolsuk, P., Purvis, O.W., Coppins, B.J., Hawksworth, D.L. and Sangvichien, E., Vongshewarat, K., Polyiam, W., Moore, D.M. 1992. The Lichen Flora of Great Rangsiruji, A., Saipunkaew, W., Naksuwankul, K., Britain and Ireland. London, Natural History Kalb, J., Parnmen, S., Kraichak, E., Museum. Phraphuchamnong, P., Meesim, S., Luangsuphabool, T., Nirongbut, P., Rogers, R.W. 1992. Key to Australian Lichen Genera. Poengsungnoen, V., Duangphui, N., Sodamuk, Flora of Australia Vol.54: 65-94. M., Phokaeo, S., Molsil, M., Aptroot, A., Kalb, K., Lücking, R. and H. T. Lumbsch. 2017 A new Swinscow T.D.V. and Krog H. 1988 Macrolichen of checklist of lichenized fungi occurring in East Africa. British Museum, London. Thailand. MycoKeys 23: 1-91. Thrower, S.L. 1998. Hong Kong Lichens. Department Divakar, P. K. and D. K. Upreti 2005. Parmelioid of Biology, The Chinese University of Hong lichens in India (A revisionary study). Dehra Kong, 61 pp. Dun, India, Bishen Singh Mahendra Pal Singh. Vongshewarat, K. 2000. Study on Taxonomy and Elix, J. A. 1994. Lichen chemistry and simple Ecology of the Lichens Family Trypetheliaceae procedures for its application in the in Thailand. Master’s Thesis, Ramkhamhaeng Parmeliaceae. Flora of Australia 55: 2-3. University, Bangkok, Thailand. 216 pp. Homchantara N, Coppins BJ 2002 New species of White, F. J. and P. W. James 1985. A new guide to the lichen family Thelotremataceae in SE Asia. microchemical techniques for the Lichenologist 34: 113–140. identification of lichen substances. Bull. Brit. Lichen Soc. 57: 1-41. การประชุมวิชาการชมรมคณะปฏบิ ตั งิ านวทิ ยาการ อพ.สธ. คร้งั ที่ 9 “ทรัพยากรไทย : ชาวบา นไทยไดป ระโยชน”

612 ความหลากหลายของไลเคนบนตนเต็ง (Shorea obtusa Wall.) และตนรงั (Shorea siamensis Miq.) รอบพื้นที่มหาวทิ ยาลัยรามคําแหง สาขาวทิ ยบริการเฉลิมพระเกยี รติ จงั หวดั หนองบวั ลาํ ภู DIVERSITY OF LICHEN ON Shorea obtusa Wall. AND Shorea siamensis Miq. AROUND RAMKHAMHAENG UNIVERSITY REGIONAL CAMPUS IN HONOUR OF HIS MAJESTY THE KING, NONGBUALAMPHU PROVINCE ขจรศักดิ์ วงศช วี รตั น*, กวินนาถ บัวเรือง, วสนั ต เพงิ สงู เนนิ , สัญญา มสี มิ , สุภทั รา โพธิ์แกว และ จฑุ ามาศ พระภูจํานงค Kajonsak Vongshewarat*, Kawinnat Buaruang, Vasun Poengsungnoen, Sanya Meesim, Supattara Phokaeo and Chutamas Praphuchamnong หนวยวจิ ยั ไลเคน ภาควชิ าชวี วิทยา คณะวทิ ยาศาสตร มหาวิทยาลยั รามคาํ แหง บางกะป กรุงเทพมหานคร 10240 Lichen Research Unit, Biology Department, Faculty of Science, Ramkhamhaeng University, Bangkapi, Bangkok 10240 บทคดั ยอ การสํารวจและรวบรวมตัวอยางไลเคนบนตนเต็ง (Shorea obtusa Wall.) และตนรัง (Shorea siamensis Miq.) จาก 20 พ้ืนท่ีศึกษา รอบมหาวิทยาลยั รามคําแหง สาขาวิทยบริการเฉลิมพระเกียรติ จังหวัดหนองบัวลาํ ภู ระหวางเดือนตลุ าคม 2559 ถงึ เดอื นกรกฎาคม 2560 พบไลเคน 136 ตัวอยา ง จําแนกได 17 วงศ 28 สกลุ โดยอาศยั ลกั ษณะทางสณั ฐานวทิ ยา กายวภิ าค วิภาค และสารเคมี ไดแก Acarospora, Arthonia, Bacidia, Bulbothrix, Chapsa, Chrysothrix, Coccocarpia, Collema, Diorygma, Diplotomma, Dirinaria, Eschatogonia, Glyphis, Graphis, Heterodermia, Lecanora, Leptogium, Letrouitia, Opegrapha,Parmotrema, Pertusaria, Phaeographis, Physcia, Pyrenula, Pyxine, Sarcogyne, Thelotrema และ Trypethelium พบไลเคน 8 ชนิด บนพรรณไมท้ังสอง ไดแก Bulbothrix isidiza (Nyl.) Hale, Diplotomma alboatrum (Hoffm.) Flot., Dirinaria papillulifera (Nyl.) D. D. Awasthi, D. picta (Sw.) Schaer. ex Clem, Heterodermia flabellate (Fée) D. D. Awasthi, Lecanora argentata (Ach.) Malme., Parmotrema tinctorum (Despr. ex Nyl.) Hale และ Pertusaria pertusa (Weigel) Tuck. Abstract The survey of lichens on Shorea obtusa Wall. and Shorea siamensis Miq. around 7 study sites at Nongbua Lumphu Regional Campus in Honour of His Majesty the King of Ramkhamhaeng University was done during September 2016 to June 2017 and 136 specimens were collected. They were classified into seventeen families, twenty eight genera based on morphological, anatomical and chemical chracteristics, which consisted of Acarospora, Arthonia, Bacidia, Bulbothrix, Chapsa, Chrysothrix, Coccocarpia, Collema, Diorygma, Diplotomma, Dirinaria, Eschatogonia, Glyphis, Graphis, Heterodermia, Lecanora, Leptogium, Letrouitia, Opegrapha, Parmotrema, Pertusaria, Phaeographis, Physcia, Pyrenula, Pyxine, Sarcogyne, Thelotrema and Trypethelium. In addition, eight species of lichens, Bulbothrix isidiza (Nyl.) Hale, Diplotomma alboatrum (Hoffm.) Flot., Dirinaria papillulifera (Nyl.) D. D. Awasthi, D. picta (Sw.) Schaer. ex Clem, Heterodermia flabellate (Fée) D. D. Awasthi, Lecanora argentata (Ach.) Malme., Parmotrema tinctorum (Despr. ex Nyl.) Hale and Pertusaria pertusa (Weigel) Tuck, were found on both Shorea species. คําสําคญั : ไลเคน, จงั หวัดหนองบวั ลําภ,ู มหาวิทยาลยั รามคาํ แหง Keywords: Lichen, Nongbualamphu province, Ramkhamhaeng University *ตดิ ตอ นกั วิจยั : ขจรศักด์ิ วงศชีวรัตน (อเี มล [email protected]) *Corresponding author: Kajonsak Vongshewarat (E-mail: [email protected]) การประชมุ วชิ าการชมรมคณะปฏบิ ัติงานวทิ ยาการ อพ.สธ. ครงั้ ที่ 9 “ทรัพยากรไทย : ชาวบานไทยไดป ระโยชน”

613 บทนาํ อปุ กรณและวธิ กี ารศึกษา หนวยวิจัยไลเคน ภาควิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร ขั้นตอนการศึกษา ประกอบดว ย 1. พนื้ ทศ่ี กึ ษา มหาวิทยาลยั รามคําแหง เร่ิมทําการสํารวจความหลากหลาย ทางชีวภาพของไลเคน ตั้งแตป พ.ศ. 2537-ปจจุบัน จาก กําหนดพื้นท่ีศึกษาภายในและภายนอกมหาวิทยาลัย พ้ืนท่ีตางๆ ท่ัวประเทศไทย เชน สวนพฤกษศาสตรสมเด็จ รามคําแหง สาขาวิทยบริการเฉลิมพระเกียรติ อําเภอเมือง พระนางเจาสริ ิกิต์ิ ปาภูตีนสวนทราย ในเขตอุทยานแหง ชาติ จังหวัดหนองบัวลําภู โดยมีขอบเขตพื้นที่ศึกษารัศมี 50 นาแหว อุทยานแหงชาติเขาใหญ อุทยานแหงชาติภูหินรอง กิโลเมตร จากศูนยกลาง ระหวา งเดือนตุลาคม 2559 - เดือน กลา เขตรักษาพันธุสัตวปาภูหลวง เปนตน (กัณฑรีย บุญ กรกฏาคม 2560 โดยวิธีการสุมพ้ืนที่ศึกษา ครอบคลุมทุก ประกอบ และ กวินนาถ บัวเรือง. 2550; พิบูลย มงคลสุข อําเภอในจงั หวัดหนองบัวลําภู และพน้ื ทีใ่ กลเ คียง และคณะ 2539, 2540; หนวยวิจัยไลเคน ภาควิชาชีววิทยา 2. การสํารวจและรวบรวมตัวอยางไลเคน คณะวิทยาศาสตร มหาวิทยาลัยรามคําแหง, 2545, 2446, 2547) ปจจุบันพบสายพันธุไลเคนในประเทศไทย มากกวา สํารวจและเกบ็ รวบรวมตัวอยางไลเคนจากแหลงที่เกาะ 1,20 0 ช นิ ด (Boonpragob, Kotphab, and Pornprom, อาศัยตางๆ เชน เปลือกไม หิน หรือวัสดุอื่นๆ เชน พลาสตกิ 2003; Homchantara, and Coppins, 2002; Papong, ขวดแกว สายไฟ คอนกรีต เปนตน ตามวิธีการของ กัณฑรีย Boonpragob, and Lucking, 2007). บุญประกอบ และ กวินนาถ บัวเรือง (2550) พรอมบันทึก ขอมูลพื้นฐานที่เกี่ยวขอ งกับสภาพพนื้ ทท่ี ่พี บไลเคน เชน ชนิด สําหรับในปงบประมาณ 2560 คณะนักวิจัย ไดสํารวจ พรรณไม ชนิดปาไม ความสูงจากระดับนํ้าทะเล พิกัด และรวบรวมตัวอยางไลเคน ในพื้นที่รอบมหาวิทยาลัย ภูมศิ าสตร สภาพพื้นท่ี สภาพภมู อิ ากาศ เปนตน รามคําแหง สาขาวิทยบริการเฉลิมพระเกียรติ จังหวัด 3. การจัดเตรยี มตวั อยา งไลเคนเขา หองปฏบิ ตั ิการ หนองบัวลําภู ซึ่งพ้ืนท่ีสวนใหญเปนพื้นท่ีปาธรรมชาติที่มี อาณาเขตติดตอกับชุมชน โดยพื้นที่เหลาน้ีอยูทามกลางการ นําตัวอยางไลเคนท้ังหมดท่ีรวบรวมจากพื้นท่ีศึกษา มา เปล่ียนแปลงของสภาพแวดลอมและการพัฒนาพื้นที่ของ ผ่ึงใหแหงประมาณ 1-2 สัปดาห ณ หองปฏิบัติการ หนวย ชุมชน ประกอบกับการสํารวจและศึกษาความหลากหลาย วิจัยไลเคน คณะวิทยาศาสตร มหาวิทยาลัยรามคําแหง ทางชีวภาพของไลเคนในพ้ืนที่ดังกลาวซ่ึงอยูในพ้ืนที่ติดตอ จากนั้นแยกกลุมตัวอยางไลเคนเบ้ืองตน จากลักษณะ หรืออยูกลางแหลงชุมชนยังมีนอยมาก จึงยังไมมีองคความรู ภายนอกที่สามารถมองเห็นไดดวยตาเปลา เพ่ือความสะดวก ทจี่ ะเช่อื มโยงความสัมพนั ธของมนุษยก บั ทรัพยากรธรรมชาติ ในการจําแนกสายพันธุในหองปฏิบัติการ ตามวิธีการของ เหลานี้ การเขา ไปศึกษาในพ้นื ท่ีเหลา นี้จะกอใหเกิดประโยชน พชร มงคลสุข และสัญญา มสี มิ (2555) เปนแหลงศึกษาและเรียนรูทรัพยากรธรรมชาติที่มีคุณคาตอ 4. การศึกษาขอ มลู เพ่ือการจําแนกสายพนั ธุไลเคน ชุมชนและพ้ืนท่ีใกลเคียง และชวยกันปกปองทรัพยากร ธรรมชาติเหลาน้ี อีกทั้งเปนการสํารวจทรัพยากรในพื้นท่ีๆ แบงไดเปน 3 ข้ันตอน ถูกรบกวนโดยกิจกรรมของมนุษยม ากอน เปนขอมูลพ้ืนฐาน 4.1 ก า ร ศึ ก ษ า ลั ก ษ ณ ะ ท า ง สั ณ ฐ า น วิ ท ย า เพ่ือศึกษาการฟนตัวของธรรมชาติและส่ิงมีชีวิตในระยะยาว โดยตอไปอาจสํารวจซาํ้ ทกุ 5-10 ป (Morphological characteristics) ตรวจสอบลักษณะทาง สณั ฐานของไลเคน เชน รปู แบบและสีของ แทลลัส โครงสรา ง ก า ร ศึ ก ษ า ค ร้ั งนี้ มี วั ต ถุ ปร ะส งค เพื่ อ 1) ส น อง สืบพันธุแบบอาศัยเพศและไมอาศัยเพศ เชน เเอโพทิเซีย พระราชดําริ ในโครงการอนุรักษพันธุกรรมพืชอันเนื่องมา (apothecia) พิกนิเดีย (pycnidia) เปนตน ดวยกลอง จากพระราชดําริฯ (อพ.สธ.) 2) สํารวจและรวบรวมตัวอยาง จุลทรรศนแบบ stereo ตามวิธีของ พชร มงคลสุข และ ไลเคนรอบพ้ืนท่ีศึกษา มหาวิทยาลัยรามคําแหง วิทยบริการ วสันต เพิงสูงเนิน (2555) พรอมทั้งบันทึกภาพและขอมูลท่ี เฉลิมพระเกียรติ จังหวัดหนองบัวลําภู 3) รวบรวมตัวอยาง เกยี่ วของ ของไลเคนจากพ้ืนที่ศึกษา ในระบบการเก็บตัวอยางที่เปน มาตรฐานสากล 4) วิเคราะหความหลากหลายทางชีวภาพ 4.2 การศึกษาลักษณะทางกายวิภาค (Anatomical และการแพรกระจายของไลเคนที่พบในพ้ืนที่ศึกษา และ 5) characteristics) โดยตรวจสอบลักษณะทางกายวิภาค คน หาไลเคนชนิดใหม (New species) หรอื ชนดิ ท่ียังไมเ คยมี ของไลเคน ดวยการตัดชิ้นสวนตัวอยางไลเคน แบบ free รายงานในประเทศไทย (New record) เพ่ือเปนขอมูล hand section เชน สวนประกอบของแทลลัส สวนสืบพันธุ พ้ืนฐานในการศึกษาไลเคนขั้นตอ ไป แบบอาศัยเพศและไมอาศัยเพศ รวมท้ังจํานวน และรูปราง การประชมุ วิชาการชมรมคณะปฏบิ ตั งิ านวทิ ยาการ อพ.สธ. ครั้งท่ี 9 “ทรัพยากรไทย : ชาวบา นไทยไดป ระโยชน”

614 ของสปอร (spore) ดวยกลองจุลทรรศน ตามวิธีของ เคนวงศที่มีความหลากหลายชนิดมากบนตนไมทั้งสองชนิด Vongshewarat (2000) โดยไลเคนวงศ Graphidaceae พบ 12 ชนิดประกอบดวย Chapsa leprocarpoides (Hale) M. Cáceres & Lücking, 4.3 การศึกษาสวนประกอบทางเคมี (Chemical Diorygma junghuhnii (Mont. & Bosch) Kalb, Staiger & characteristics) โดยตรวจสอบสารเคมีหรือสารธรรมชาตทิ ี่ Elix., Diorygma sp. 1, Glyphis scyphulifera (Ach.) พบในไลเคนดวยวิธีหยดสี (spot test) และวิธรี งคเลขผวิ บาง Staiger, Graphis filiformis Adaw. & Makhija, G. librata (Thin layer chromatography) ตามวิธีของ White และ C. Knight., G. pinicola Zahlbr., G. subinsulana V. James (1895) Poengsungnoen & K. Kalb., G. tenuirima ( Shirley) 5. การจําแนกและวเิ คราะหสายพนั ธไุ ลเคน A.W.Archer., G. upretii S. Joshi & Hur, Phaeographis sp. แ ล ะ Thelotrema mongkolsukii Homchant. & นําขอมูลจากการศึกษาท้ังหมด ใชประกอบในการ Coppins. แ ล ะ ไ ล เ ค น ว ง ศ Physciaceae 9 ช นิ ด วิเคราะหและจําแนกสายพันธุไลเคน โดยใชคูมือการจัด ประกอบดวย Diplotomma alboatrum (Hoffm.) Flot., จําแนกชนิดไลเคนของ Awasthi (1991), Homchantara Dirinaria aegialita (Afzel.) B.J. Moore, D. papillalifera (1999), Makhija and Patwardhan (1988), Makhija and (Nyl.) D. D. Awasthi., D. picta (Swartz) Clem. & Shear, Patwardhan (1993), Purvis et. al. (1992), Rogers Heterodermia flabellate ( Fée) D.D. Awasthi., (1992), Thrower (1998), Vongshewarat et. al., (1999) Physcia undulate Moberg, Pyxine coccifera ( Fée) และ Vongshewarat (2000) พรอมท้ังเทียบเคีย งกั บ Nyl., P. cocoes ( Sw.) Nyl.แ ล ะ P. retirugella Nyl. ตัวอยางไลเคนที่จําแนกอยางถูกตองตามหลักอนุกรมวิธาน ตามลําดับ โดยไลเคน Dirinaria picta (Swartz) Clem. & แลวในพพิ ิธภณั ฑไลเคน ภาควชิ าชีววิทยา คณะวทิ ยาศาสตร Shear เปนไลเคนท่ีพบการแพรกระจายสงู สุด 5 พื้นที่ศึกษา มหาวทิ ยาลัยรามคําแหง จากทงั้ หมด 8 พืน้ ท่ีศกึ ษาที่พบไลเคนเจรญิ บนตน เต็งและรัง ผลและวจิ ารณผลการศกึ ษา 1. พ้นื ท่ศี ึกษา ไลเคนที่สามารถเจริญบนพรรณไมท้ังสอง จํานวน 8 ชนดิ ไดแ ก Bulbothrix isidiza (Nyl.) Hale, Diplotomma สํารวจพ้ืนท่ีศึกษา โดยรอบมหาวิทยาลัยรามคําแหง alboatrum ( Hoffm.) Flot., Dirinaria papillulifera สาขาวิทยบริการเฉลิมพระเกียรติ อําเภอเมือง จังหวัด ( Nyl.) D. D. Awasthi, D. picta ( Sw.) Schaer. ex Clem, หนองบัวลําภู (17°16'21.92\" N, 102°19'52.32\" E) Heterodermia flabellate ( Fée) D. D. Awasthi, ขอบเขตพื้นที่ศึกษารัศมี 50 กิโลเมตร จํานวนทั้งส้ิน 20 Lecanora argentata ( Ach.) Malme., Parmotrema พ้ืนที่ศึกษา ครอบคลุมพื้นที่ 3 จังหวัด ไดแก 1) จังหวัด tinctorum ( Despr. ex Nyl.) Hale แ ล ะ Pertusaria หนองบัวลําภู จํานวน 4 อําเภอ ประกอบดวย อําเภอเมือง pertusa (Weigel) Tuck. ซึ่งสวนใหญเปนโฟลิโอสไลเคน อําเภอนากลาง อําเภอโนนสัง และอําเภอสุวรรณคูหา 2) (foiliose) จํานวน 5 ชนิด ซ่ึงมีลักษณะแบบคลายใบไม ยึด จังหวัดอุดรธานี จํานวน 3 อําเภอ ไดแก อําเภอหนองวัวซอ เกาะบนผิวของเปลือกไมเทาน้ัน ไมไดแทรกเสนใยราเขาไป อําเภอกมุ ภวาป และอาํ เภอบา นผอื และ 3) จงั หวัดขอนแกน ในเปลอื กไมเหมือนกับครสั โตสไลเคน (crustose) จํานวน 1 อําเภอ คือ อําเภออุบลรัตน โดยพ้ืนที่สํารวจและ รวบรวมตัวอยางไลเคนเปนปาเต็งรัง (Dry dipterocarp เ มื่ อ เ ป รี ย บ เ ที ย บ ก า ร ศึ ก ษ า ค ว า ม ส า ม า ร ถ ใ น ก า ร forest) และปาดิบแลง (Dry evergreen forest) ท่ีระดับ แพรกระจายพันธุของไลเคนบนตนเต็งและรังในพื้นท่ีอ่ืน ความสูงจากระดับน้ําทะเลระหวาง 190 - 500 เมตร และ (ขจรศักดิ์ วงศชีวรัตน และคณะ, 2560) พบวาไลเคน พบไลเคนท่ีเจริญบนตนเต็งและตนรัง จํานวน 8 พื้นที่ศึกษา Dirinaria picta (Sw.) Schaer. ex Clem และ Lecanora ประกอบดวย อําเภอเมือง, อําเภอนากลาง, อําเภอสุวรรณ argentata (Ach.) Malme เปนไลเคนที่มีความสามารถใน คูหา จังหวัดหนองบัวลําภู และ อําเภอหนองวัวซอ จังหวัด การแพรกระจายสูงมาก เพราะพบในจังหวัดนครพนม ซ่ึง อดุ รธานี ระยะทางระหวา งท้งั สองจังหวดั มีมากกวา 300 กิโลเมตร ซึง่ 2. การจําแนกสายพันธุไลเคน ในอนาคตหากมีการศึกษาเพิ่มมากข้ึน อาจพบประสิทธิภาพ ในการดํารงเผาพันธุของไลเคนทง้ั สองชนิดนี้ รวบรวมตัวอยางไลเคนจากตนเต็ง (Shorea obtusa Wall.) และตนรัง (S. siamensis Miq.) จาํ นวน 136 ตวั อยาง สําหรับพ้ืนท่ีศึกษาท่ีไดรับการดูแลรักษาอยางดีจาก จําแนกชนิดไลเคน ได 17 วงศ 28 สกุล 51 ชนิด (ตารางที่ ชุมชนและหนวยงานภาครัฐ พบความหลากหลายทาง 1) ไลเคนวงศ Graphidaceae และ Physciaceae เปนไล ชีวภาพชนิดของไลเคนสูง เชน แหลงทองเที่ยวเชิงนิเวศภู พานนอย ตําบลหนองบัว อําเภอเมือง จังหวัดหนองบัวลําภู การประชุมวิชาการชมรมคณะปฏบิ ตั งิ านวทิ ยาการ อพ.สธ. ครั้งที่ 9 “ทรัพยากรไทย : ชาวบานไทยไดป ระโยชน”

615 และภูหินลาดชอฟา ตําบลน้ําพน อําเภอหนองวัวซอ จังหวัด เคนเพียง 1 ชนิด เน่ืองจากในอดีตพ้ืนที่ปาไมดังกลาว มีการ อุดรธานี พบไลเคน 21 และ 20 ชนิด ตามลําดับ ซ่ึงพ้ืนท่ี เขาไปใชประโยชนเปนจํานวนมาก เชน การตัดไม การหา ดังกลาวมีสภาพปาไมที่มีความอุดมสมบูรณ และถูกรบกวน ของปา ทําใหระบบนิเวศปาไมถูกรบกวน จนกระทั่ง จากมนุษยคอนขางนอย เมื่อเปรียบเทียบกับพื้นที่ท่ีถูก ประชาชนในพื้นทม่ี องเห็นความสําคัญ จึงจัดตงั้ เปนปาชุมชน รบกวนจากมนุษยอยางตอเนื่อง เชน ปาชุมชนโคกโนนเสา ในป พ.ศ. 2559 เฮือน ตาํ บลนาคําไฮ อาํ เภอเมือง จงั หวดั หนองบวั ลําภู พบไล ภาพท่ี 1 พนื้ ทศ่ี กึ ษาความหลากหลายทางชวี ภาพของไลเคน บริเวณรอบพ้นื ท่มี หาวทิ ยาลยั รามคาํ แหง สาขาวทิ ยบริการเฉลิมพระเกยี รติ จงั หวัดหนองบัวลาํ ภู ภาพท่ี 2 การสํารวจและการรวบรวมตัวอยางไลเคน บริเวณรอบพนื้ ท่มี หาวทิ ยาลัยรามคาํ แหง สาขาวิทยบริการเฉลมิ พระเกียรติ จงั หวดั หนองบัวลาํ ภู การประชมุ วิชาการชมรมคณะปฏบิ ัติงานวิทยาการ อพ.สธ. ครงั้ ท่ี 9 “ทรัพยากรไทย : ชาวบานไทยไดป ระโยชน”

616 ตารางที่ 1 ความหลากหลายทางชีวภาพของไลเคนทพี่ บบนตนเต็งและรัง รอบพ้ืนทม่ี หาวทิ ยาลยั รามคําแหง สาขาวทิ ยบริการเฉลมิ พระเกยี รติ จังหวดั หนองบวั ลําภู และพนื้ ที่ใกลเคยี ง จํานวนไลเคน ลําดับ ชนิดไลเคน วงศไ ลเคน ตนเตง็ ตนรงั รหสั พนื้ ที่ศกึ ษา 1 Acarospora sp.1 Acarosporaceae 1 - 11 2 Arthonia ilicinella Nyl. Arthoniaceae -1 11 3 Bacidia rubella (Hoffm.) A. Massal Bacidiaceae 2- 19 4 Bulbothrix isidiza (Nyl.) Hale Parmeliaceae 11 15 5 B. queenslandica (Elix & G.N. Stevens) Elix Parmeliaceae 1 15 6 Chapsa leprocarpoides (Hale) M. Cáceres & Graphidaceae -2 2, 11 Lücking 7 Chrysothrix candelaris (L.) Laundon Chrysothricaceae - 1 8 8 Coccocarpia dissecta Swinscow & Krog Coccocarpiaceae 3 - 15, 19 9 C. pellita (Ach.) Müll.Arg. Coccocarpiaceae 1 - 19 10 Collema coilocarpum (Müll.Arg.) Zahlbr Collemataceae 2 - 15, 19 11 C. kauaiense H. Magn. Collemataceae - 2 1 12 Diorygma junghuhnii (Mont. & Bosch) Kalb, Graphidaceae -9 1, 11, 15 Staiger & Elix. 13 Diorygma sp. 1 Graphidaceae 1- 15 14 Diplotomma alboatrum (Hoffm.) Flot. Physciaceae 12 1, 3, 15 15 Dirinaria aegialita (Afzel.) B.J. Moore Physciaceae -4 1 16 D. papillulifera (Nyl.) D. D. Awasthi. Physciaceae 13 1, 2, 15 17 D. picta (Swartz) Clem. & Shear Physciaceae 4 3 2, 11, 14, 15, 19 18 Eschatogonia prolifera (Mont.) R. Sant. Ramalinaceae 2 - 19 19 Glyphis scyphulifera (Ach.) Staiger Graphidaceae -1 11 20 Graphis filiformis Adaw. & Makhija Graphidaceae -1 11 21 G. librata C. Knight. Graphidaceae -2 1 22 G. pinicola Zahlbr. Graphidaceae -1 3 23 G. subinsulana V. Poengsungnoen & K. Kalb. Graphidaceae -5 1, 15 24 G. tenuirima (Shirley) A.W.Archer. Graphidaceae -2 1, 2 25 G. upretii S. Joshi & Hur Graphidaceae 4- 15, 19 26 Heterodermia flabellate (Fée) D.D. Awasthi. Physciaceae 14 1, 15 27 Lecanora achroa Nyl. Lecanoraceae -- 2 2, 11 28 L. argentata (Ach.) Malme. Lecanoraceae 2 4 1, 2, 11, 15 29 L. helva Stizenb. Lecanoraceae - 1 2 30 L. tropica Zahlbr. Lecanoraceae 1 1 31 Lecanora sp.1 Lecanoraceae - 1 1 32 Leptogium cyanescens (Rabenh.) Körb. Collemataceae 3 - 19 33 L. gelatinosum (With.) J.R. Laundon Collemataceae 2 - 15 34 Letrouitia leprolytoides S.Y.Kondr. Letrouitiaceae 1 - 19 35 L. transgressa (Malme) Hafellner & Bellem. Letrouitiaceae 1 - 19 36 Opegrapha vulgate (Ach.) Ach. Opegraphaceae - 1 2 37 Parmotrema praesorediosum (Nyl.) Hale Parmeliaceae 1- 19 38 P. saccatilobum (Taylor) Hale. Parmeliaceae -1 1 39 P. tinctorum (Despr. ex Nyl.) Hale. Parmeliaceae 24 1, 15, 19 การประชุมวิชาการชมรมคณะปฏบิ ัตงิ านวทิ ยาการ อพ.สธ. คร้งั ท่ี 9 “ทรพั ยากรไทย : ชาวบา นไทยไดป ระโยชน”

617 ลําดบั ชนดิ ไลเคน วงศไลเคน จํานวนไลเคน รหสั พื้นที่ศึกษา ตนเตง็ ตน รงั 40 Pertusaria cicatricose Müll. Arg., Pertusariaceae - 3 1 41 P. nahaeoensis Jariangpr. & A.W. Archer Pertusariaceae - 2 11, 15 42 P. pertusa (Weigel) Tuck. Pertusariaceae 2 10 1, 2, 15 43 Phaeographis sp. Graphidaceae -4 1, 2 44 Physcia undulate Moberg Physciaceae 1- 15 45 Pyrenula immissa (Stirt.) Zahlbr. Pyrenulaceae -1 14 46 Pyxine coccifera (Fée) Nyl. Physciaceae -2 15 47 P. cocoes (Sw.) Nyl. Physciaceae 1 3 48 P. retirugella Nyl. Physciaceae -3 1, 3, 15 49 Sarcogyne sp1 Acarosporaceae - 1 1 50 Thelotrema mongkolsukii Homchant. & Graphidaceae -1 1 Coppins. 51 Trypethelium tropicum (Ach.) Müll.Arg. Trypetheliaceae - 1 1 52 ไมส ามารถระบุสกลุ หรือชนิด 3 5 1, 11, 14, 15 รวม 45 91 หมายเหตุ : 1* : แหลงทองเท่ียวเชิงนิเวศภูพานนอย ต.หนองบัว อ.เมือง จ.หนองบัวลําภู, 2* : ปาหลังสํานักสงฆวรพจนปรีดา ต.หนองบัว อ.เมือง จ. หนองบัวลําภู, 3* : ปาชาบานสนามชัย ต.กุดแห อ.นากลาง จ.หนองบัวลําภู, 4 : ปาขางทาง ถนนหมายเลข 2146 ต.บานดง อ.อุบลรัตน จ. ขอนแกน, 5 : ปาขางทาง ถนนหมายเลข 2146 ต.บานคอ อ.โนนสัง, 6 : วัดปาถํ้าพระภูเกา ต.หัวนา อ.เมือง จ.หนองบัวลําภู, 7 : ปาดานหลัง มหาวทิ ยาลยั รามคําแหง สาขาวทิ ยบริการเฉลิมพระเกียรติ จ.หนองบวั ลาํ ภู ต.นาคาํ ไฮ อ.เมือง จ.หนองบัวลาํ ภู, 8* : ปาชมุ ชนโคกโนนเสาเฮอื น ต. นาคาํ ไฮ อ.เมือง จ.หนองบัวลาํ ภ,ู 9 : วนอุทยานน้าํ ตกเฒาโต ต.ลําภู อ.เมอื ง จ.หนองบวั ลําภู, 10 : ปา ตรงขาม สาํ นกั งานโครงการปฏบิ ตั กิ ารคันคู น้ําที่ 5 ต.โนนทัน อ.เมือง จ. หนองบัวลําภู, 11* : ปาหลังอางเก็บน้ํา สวนสาธารณะภูพานทอง ต.โนนทัน อ.เมือง จ.หนองบัวลําภู, 12 : ปา ภายใน มหาวิทยาลัยรามคําแหง สาขาวิทยบริการเฉลิมพระเกียรติฯ จ.หนองบัวลําภู ต.นาคําไฮ อ.เมือง จ.หนองบัวลําภู, 13 : ปาภายใน มหาวิทยาลัยรามคําแหง สาขาวิทยบริการเฉลิมพระเกียรติฯ จ.อุดรธานี ต.ปะโค อ.กุมภวาป จ.อุดรธานี, 14* : สวนพฤกษศาสตรโรงเรียน โรงเรียนบานหวยขาโนนสมบรู ณ ต.นาคําไฮ อ.เมอื ง จ.หนองบวั ลําภู, 15* : ภหู ินลาดชอฟา จดุ 1 ต.นํ้าพน อ.หนองววั ซอ จ.อุดรธานี, 16 : ภู หนิ ลาดชอ ฟา จดุ 2 ต.น้าํ พน อ.หนองววั ซอ จ.อดุ รธาน,ี 17 : ภูหินลาดชอฟา จดุ 3 ต.นา้ํ พน อ.หนองวัวซอ จ.อุดรธานี, 18 : ปา หลงั วดั ปารองนาํ้ ใส ต.กุดดนิ จี่ อ.นากลาง จ.หนองบัวลําภ,ู 19* : ปาชมุ ชนบา นพิทักษพัฒนา ต.นาสี อ.สุวรรณคูหา จ.หนองบัวลาํ ภู, 20 : ปาขางทาง ถนนหมายเลข 2097 ต.หนองแวง อ.บา นผอื จ.อุดรธานี หมายเลขทมี่ ี * = พน้ื ท่ที ่ีพบไลเคนเจรญิ บนตน เต็งและรงั สรปุ ผลการทดลอง หนวยงานรฐั พบวา มีความหลากหลายทางชวี ภาพของไลเคน การสํารวจความหลากหลายทางชีวภาพของไลเคนบน สงู เชน แหลงทอ งเท่ียวเชิงนเิ วศภพู านนอย และภูหินลาดชอ ฟา ตนเต็งและรัง โดยรอบพ้ืนที่มหาวิทยาลัยรามคําแหง สาขา คาํ นิยม วิทยบริการเฉลิมพระเกียรติ จังหวัดหนองบัวลําภู รัศมี 50 งานวิจัยนี้เปนงานสนองพระราชดําริในโครงการอนุรักษ กิโลเมตร จํานวน 20 พื้นท่ีศึกษา รวบรวมตัวอยาง ไลเคน พันธุกรรมพืชอันเนื่องมาจากพระราชดําริฯ สมเด็จพระเทพ จํานวนท้ังสิ้น 136 ตัวอยาง จําแนกชนิดไลเคน ได 17 วงศ รัตนราชสุดาฯ สยามบรมราชกุมารี โดยไดรับการสนับสนุน 28 สกุล 51 ชนิด พบไลเคนท่ีเจริญบนตนเต็งและตนรัง 8 เงินวิจัยจากงบประมาณแผนดิน ประจําป 2560 คณะผูวิจัย พ้ืนท่ีศึกษา สําหรับไลเคนวงศ Graphidaceae และ ขอขอบคุณมา ณ ที่น้ีดวย และขอขอบคุณ คุณฤทธิเกียรติ์ Physciaceae เปนไลเคนวงศที่มีความหลากหลายชนิดมาก ไชยแสง คุณพิมพา นิรงคบุตร และคุณสัมฤทธ์ิ เส็งเล็ก และ ที่พบบนตนไมท้ังสองชนิด และไลเคน Dirinaria picta ผูที่มีสวนเก่ยี วของทุกทาน ท่ีเสียสละเวลาในการสาํ รวจ เก็บ (Swartz) Clem. & Shear เปนไลเคนท่ีพบการแพรก ระจาย สูงสุด 5 พ้ืนท่ีศึกษา จากทั้งหมด 8 พื้นท่ีศึกษา สําหรับไล เคนท่ีสามารถเจริญบนพรรณไมทั้งสอง พบจํานวน 8 ชนิด ซึ่งสวนใหญเปนโฟลิโอสไลเคน (foiliose) จํานวน 5 ชนิด นอกจากน้ีพ้ืนที่ปาไมที่ไดรับการดูแลอยางดีจากชุมชนและ การประชุมวชิ าการชมรมคณะปฏบิ ตั ิงานวิทยาการ อพ.สธ. คร้งั ท่ี 9 “ทรพั ยากรไทย : ชาวบานไทยไดป ระโยชน”

618 ขอมูลและรวบรวมตัวอยางไลเคนในพ้ืนท่ีศึกษาดังกลาวโดย Makhija, U. and P. G. Patwardhan. 1988. The lichen ดียิ่งตลอดเวลาระยะการศึกษาวจิ ัย genus Laurera (family Trypetheliaceae) in เอกสารอา งองิ India. Mycotaxon. 31: 565-590. กณั ฑรยี  บญุ ประกอบ และ กวินนาถ บัวเรือง. 2550. ไล Makhija, U. and P. G. Patwardhan. 1993. A เคนแหง เกาะแสมสาร: จากยอดเขาถงึ ชายทะเล. distribution to our knowledge of the lichen สํานักพมิ พม หาวิทยาลัยรามคาํ แหง, กรงุ เทพมหานคร. genus Trypethelium (family Trypetheliaceae). ขจรศกั ดิ์ วงศช วี รตั น และคณะ. 2560. ความหลากชนดิ Journal of the Hattori Botanical Laboratory. ของไลเคนบนตน เตง็ (Shorea obtusa Wall.) และ 73: 183-219. ตนรัง (S. siamensis Miq.) รอบพ้นื ที่มหาวทิ ยาลัย รามคําแหง สาขาวิทยบรกิ ารเฉลมิ พระเกียรติ จงั หวดั Mongkolsuk, P., Boonpragob, B., Buaruang, K., นครพนม. การประชมุ อนุกรมวิธานและซสี เทมาตคิ ส Polyiam, W., Vongshewarat, K. and Sangwisut, แหง ประเทศไทย ครัง้ ท่ี 7 มหาวิทยาลัยรามคําแหง T. 2011. Lichen in Mangrove forest at Trat กรุงเทพมหานคร province, Thailand. พบิ ูลย มงคลสุข ณฐั สุรางค หอมจนั ทร และ กัณฑรีย บญุ ประกอบ. 2539. รายงานโครงการวจิ ยั ฉบบั สมบรู ณ Pomphueak, K. 2005. Use of lichens as เรื่อง “การเก็บรวบรวมและจาํ แนกสายพันธุไ ลเคน bioindicator for air quality monitoring in ในปาภตู ีนสวนทราย อําเภอนาแหว จงั หวัดเลย”. Amphoe Mueang Lampang. M.S. thesis, ภาควิชาชีววิทยา คณะวทิ ยาศาสตร มหาวทิ ยาลัย Chiang Mai University. Thailand. รามคาํ แหง. พบิ ูลย มงคลสุข ณัฐสุรางค หอมจนั ทร และ กณั ฑรยี  บญุ Purvis, O. W., B. J. Coppin, D. L. Hawksworth, P. W. ประกอบ. 2540. รายงานโครงการวิจัยฉบบั สมบูรณ James, and D. M. Moore. 1992. The Lichen เรอ่ื ง “ความหลากหลายของสายพนั ธุไ ลเคน ณ สวน Flora of Great Britain and Ireland. London: พฤกษศาสตรสมเดจ็ พระนางเจาสิรกิ ิติ์ อาํ เภอแมริม Natural History Museum Publications. จงั หวดั เชยี งใหม”. ภาควชิ าชีววิทยา คณะ วทิ ยาศาสตร มหาวทิ ยาลัยรามคาํ แหง. Roger, R. W. 1992. Key to Australian Lichen Genera. พชร มงคลสุข และ วสนั ต เพงิ สูงเนิน. 2555. ไลเคนวงศก Flora of Australia Vol. 54 : 65-94. ราฟด าซอิ ิ : ศิลปกรรมตามธรรมชาต.ิ โนเบ้ิล พร้ินต. กรงุ เทพมหานคร. Subsri, P. 2001. Lichens as bioindicators for air พชร มงคลสุข และ สัญญา มสี มิ . 2555. ไลเคนวงศฟ ส เซีย pollution monitoring in urban and ซอิ ใิ นประเทศไทย. โนเบลิ้ พริน้ ต. กรุงเทพมหานคร. suburban of Chiang Mai City in 2001. M.S. Awasthi, D. D. 1991. A key to the microlichen of thesis, Chiang Mai University. Thailand. India, Napal and Sri Lanka. Bibliotheca Lichenologica. 40: 1-360. Swinscow, T.D.V. and H. Krog. 1988. Macrolichens Boonpeng, C. 2011. Using transplanted lichen as of East Africa. British Museum. London. bioindicator of air quality of public parks in Bangkok. M.S. thesis, Ramkhamhaeng Thrower, S. L. 1998. Hong Kong Lichens. University. Thailand. Department of Botany, The Chinese University Homchantara, N. 1999. The taxonomic and of Hong Kong. ecological aspects of the Thelotremataceae in Southeast Asia. Ph.D. Vongshewarat, K., McCarthy, P.M., Mongkolsuk, P. & Thesis, Liverpool John Moores University, UK. Boonpragob, K. 1999. Additions to the Lichen Flora of Thailand. Mycotaxon. Vol70:227-236. Vongshewarat, K. 2000. Study in taxonomy and ecology of the lichens family Trypetheliaceae in Thailand. M.S. thesis, Ramkhamhaeng University. Thailand. White, F. J. and James, P. W. (1985). A new guide to microchemical techniques for the identification of lichen substances. British Lichen Society Bulletin. 54 (suppl.): 1-41. การประชุมวิชาการชมรมคณะปฏบิ ัตงิ านวิทยาการ อพ.สธ. ครั้งที่ 9 “ทรัพยากรไทย : ชาวบานไทยไดป ระโยชน”

619 ความหลากหลายของไพรีโนไลเคนในพน้ื ทโี่ ดยรอบมหาวิทยาลัยรามคาํ แหง สาขาวิทยาการเฉลิมพระเกียรติ จงั หวัดแพร BIODIVERSITY OF THE PYRENOLICHENS IN RAMKHAMHAENG UNIVERSITY REGIONAL CAMPUS IN HONOUR OF HIS MAJESTY THE KING, PHRAE PROVINCE สุภทั รา โพธิแ์ กว *, ขจรศักด์ิ วงศชีวรตั น, สมั ฤทธิ์ เสง็ เลก็ , สัญญา มสี มิ , พมิ พา นิรงคบ ุตร, วสันต เพงิ สงู เนิน และ กวินนาถ บัวเรอื ง Supattara Phokaeo*, Kajonhsak Vongshewarat, Sumrit Senglek, Sanya Meesim, Phimpha Nirongbut, Vasun Poengsungnoen and Kawinnat Buaruang หนวยวจิ ยั ไลเคน ภาควิชาชวี วทิ ยา คณะวทิ ยาศาสตร มหาวิทยาลัยรามคาํ แหง บางกะป กรุงเทพฯ 10240 Lichen Research Unit, Department of Biology, Faculty of Science, Ramkhamhaeng University, Bangkok, 10240 บทคดั ยอ จากการสํารวจความหลากหลายและเก็บตัวอยางของไพรีโนไลเคน (Pyrenolichens) บริเวณรอบพ้ืนท่ีของมหาวิทยาลัย รามคําแหง สาขาวิทยบริการเฉลิมพระเกียรติ จังหวัดแพร ภายใตโครงการอนุรักษพันธุกรรมพืชอันเนื่องมาจากพระราชดําริ สมเด็จพระเทพรตั นราชสดุ าฯ สยามบรมราชกมุ ารี ในเดือนตลุ าคม ป พ.ศ. 2560 จาํ นวน 185 ตวั อยาง สามารถจัดจําแนกได 5 ว งศ 11 ส กุ ล 15 ชนิ ด ป ร ะ ก อบ ด ว ยสกุ ล Anisomeridium, Bathelium, Campylothelium, Celothelium, Lithothelium, Laurera, Marcelaria, Nigrovothelium, Porina, Pyrenula และ Trypethelium โดยใชลักษณะทาง สัณฐานวิทยา และกายวิภาควิทยา เชน ลักษณะของแทลลัส ขนาด สปอรสีใส สีนํ้าตาลเทาถึงนํ้าตาลเขม แบบมีผนังก้ันตาม ขวาง ถึงแบบมูริฟอรม รูปรางทรงรี กระสวยถึงเสนดาย ไลเคนที่พบไดทั่วไปคือชนิด Marcelaria benguelensis และ Pyrenula anomala Abstract Pyrenolichens was surveyed on biodiversity and samples were collected at Phrae Regional Campus in Honour of His Majesty the King of Ramkhamhaeng University during on October 2017. One hundred and eighty-five specimens of lichens were identified which comprised of 5 family 11 genera 15 species including genus Anisomeridium, Bathelium, Campylothelium, Celothelium, Lithothelium, Laurera, Marcelaria, Nigrovothelium, Porina, Pyrenula and Trypethelium based on morphological and anatomical character as thallus, spore color (hyaline or grey brown to dark brown), spore shape (ellipsoidal or fusiform to filiform), transeptate to muriform types. Common lichen in this study were Marcelaria benguelensis and Pyrenula anomala. คําสําคญั : ไพรโี นไลเคน, จังหวดั แพร, สัณฐานวทิ ยา Keywords: Pyrenolichens, Phrae province, morphological *ติดตอ นักวิจยั : สภุ ทั รา โพธแิ์ กว (อีเมล [email protected]) *Corresponding author: Supattara Phokaeo (E-mail: [email protected]) การประชมุ วชิ าการชมรมคณะปฏบิ ตั งิ านวิทยาการ อพ.สธ. ครง้ั ท่ี 9 “ทรัพยากรไทย : ชาวบานไทยไดป ระโยชน”